Introducción
Los microscopios se han convertido en una pieza fundamental para la verificación y resultados de
pruebas de laboratorio; estos instrumentos están diseñados para la observación y examinación de
seres imperceptibles a simple vista, lo que mejoró considerablemente el conocimiento de seres
vivos, sus estructuras y fisiología, así como también contribuir positivamente en la calidad de vida.
Existen numerosos tipos de microscopios, siendo los más conocidos los Simples, Compuestos y
Binocular estereoscopio. Sin embargo, uno de los más revolucionarios es el microscopio
electrónico.
En el presente informe de detallará la estructura del microscopio, así como las diferentes
clasificaciones, uso y la preparación de la muestra para poder estudiarla bajo este instrumento.
1. Descripción general del microscopio
Los microscopios se distinguen por poseer una parte mecánica y una parte óptica descritas a
continuación:
1.1. Sistema mecánico:
Tubo: conecta el ocular con los
objetivos. Por la parte inferior, el
revolver con los objetivos y por la parte
superior, el ocular.
Revólver: es una pieza que lleva
diferentes objetivos intercambiables y
permite adaptarlos al tubo del
microscopio.
Platina: plataforma para colocar
preparaciones que se desea observar.
Pinzas: se utilizan para mantener sujeta
la muestra situada en la platina.
Brazo: conecta todas las partes.
Tornillo macrométrico (enfoque grosero): se ajusta a la posición vertical de la muestra, lo
que permite desplazamientos amplios.
Tornillo micrométrico (enfoque fino): se utiliza para conseguir un enfoque más preciso de
la muestra.
Base: es la parte inferior del microscopio. Ayuda al equilibrio del instrumento, soportando
toda la estructura.
2.2 Sistema óptico
Ocular: formados por dos lentes que se encuentran separados por un diafragma. Para que la
observación sea más cómoda, existen microscopios que poseen dos oculares.
Objetivos: constan de un sistema de lentes; los objetivos secos (aquellos en los que entre el
objetivo y la preparación solo existe aire) y los objetivos de inmersión (cuando es necesario
colocar entre la lente y la preparación un líquido que permite una mayor luminosidad).
Condensador: es una lente o sistema de lentes situadas debajo de la platina. Permite
concentrar la luz en la muestra.
Lámpara (foco, fuente de luz): es de vital importancia, puesto que sin una correcta
iluminación, no se puede realizar una buena observación.
Diafragma: situado debajo de la platina y del condensador, siendo el encargado de regular
la entrada de luz al condensador. En algunos modelos, acciona por medio de una palanca, y
en otros, mediante una rueda con orificios de distintos diámetros.
2. Clasificación de microscopios
2.1 Microscopía óptica: también conocido como “de campo luminoso”. Normalmente alcanzan
hasta unos 1000 aumentos, aunque con unos oculares potentes, esta cifra puede duplicarse. El límite
de aumento es de 2000 y la razón se debe al poder de resolución (capacidad de distinguir dos puntos
adyacentes como distintos y separados). Este poder de resolución se da en función a la longitud de
onda de la luz utilizada y de la apertura numérica que posee el sistema de lentes empleado. Así, se
puede afirmar que no siempre las amplificaciones mayores son las de más utilidad, ya que pueden
no ser tan claras como otras menores.
2.1.1. Microscopio simple: La ampliación de este microscopio es bastante limitada; suele utilizarse
para la disección de pequeños animales o para la disociación de piezas histológicas.
- monocular
- binocular
2.1.2 Microscopio compuesto: Existen distintos tipos de cabezales en este microscopio;
monoculares (constan de un solo ocular, lo que provoca fatiga visual en observaciones
prolongadas), binoculares (constan de dos oculares, siendo importante una adecuada fusión de la
imagen) y los triloculares (posibilita fotografiar el objeto de estudio)
Estereomicroscopio Posee dos objetivos y dos oculares con un doble prisma, el cual
permite enderezar las imágenes y conservar el relieve (3D). La
iluminación es por transparencia o incidencia, siendo esta última la
más frecuente. Dotados de accesorios de investigación como: equipo
microfotográfico, doble dispositivo de observación para poder
trabajar con dos observadores simultáneamente, cámaras claras y
microdisectores.
De luz ultravioleta La longitud de onda más corta corresponde al espectro ultravioleta
(180-400nm). Por esta razón y teniendo presente que el poder de
resolución está en razón inversa a la longitud de onda utilizada, éste
será mayor en una preparación con radiación ultravioleta que con
radiación visible. Las muestras no necesitarán de una tinción. Para
este microscopio se necesitan lentes de cuarzo. La imagen
ultravioleta solo es visible a través de fotografías, fluorescencia o
fotoemisión.
De contraste de fases Se utiliza para estudiar preparaciones de densidad homogénica y
transparentes (como bacterias, células) en las que la baja capacidad
de absorción hace que la imagen obtenida no presente diferencia de
luminosidad entre sus elementos, permaneciendo prácticamente
invisibles los detalles. Este microscopio consiste en un dispositivo
de iluminación por el cual, una parte del haz luminosos es tratada de
modo diferente al resto. Estas variantes en el tratamiento se
combinan posteriormente y producen por interferencia grandes
aumentos en contraste de células y estructuras intracelulares, cuyo
índice de refracción es diferente al de su entorno.
De campo oscuro Producen un efecto consistente en un fondo
oscuro sobre el que se ven los objetos
intensamente iluminados. El poder ver un
objeto depende del contraste existente entre
él y el medio que lo rodea. El condensador
común es sustituido por uno de campo
oscuro, a través del cual pasa solamente un
cilindro hueco de luz. Se utiliza especialmente para observar
microorganismos sin teñir suspendidos en líquidos.
De polarización Se construyen a partir de un microscopio ordinario, colocando un
polarizador entre la fuente de luz y el condensador, y un analizador
entre el objetivo entre el objetivo y el ocular. Se utiliza para la
observación de sustancias birrefrigerentes. Al hacer rotar el objeto
birrefrigerentes con relación a los filtros cruzados, este se verá
brillante sobre un campo oscuro. Normalmente se utilizan en
petrografía y mineralogía.
Por luz reflejada Se utiliza para el estudio de minerales metálicos u opacos. Por este
motivo los microscopios especiales que requieren esta técnica
reciben el nombre de metalográficos. Se necesita un foco de luz
polarizada que incida de manera perpendicular sobre la superficie
finamente pulida, con brillo intenso y sin interposición de
cubreobjetos. Además, se requiere un iluminador de opacos
acoplado adecuadamente al microscopio, para que a través de un
polarizador, los rayos de luz se dirijan perpendicularmente sobre la
superficie del mineral, siendo reflejados entonces en sentido opuesto
al ocular.
De fluorescencia La luz ultravioleta, excita radiaciones visibles en los materiales
fluorescentes, por eso los materiales expuestos a este tipo de luz se
perciben como brillantes sobre un fondo oscuro. Para este
microscopio se necesitan: una fuente de luz que emite en una banda
de longitudes de onda desde el ultravioleta al infrarrojo, un filtro que
delimita la banda de excitación (normalmente la ultravioleta) y una
muestra fluorescente.
Este tipo de microscopía puede ser: primaria (la propia muestra
posee fluorescencia), segundaria (la muestra está marcada con
colorantes fluorescentes) y de inmunofluorescencia (la fijación del
colorante se realiza con un anticuerpo marcado).
2.2 Microscopio electrónico
De barrido (MEB) En este tipo de microscopio, los electrones inciden desde arriba
sobre la preparación, por ello la muestra puede ser de cualquier
grosor o tamaño. Para preparar la muestra se emplean dos técnicas
preparatorias: secado por congelación y secado por punto crítico.
Después se cubre con una capa de metal (oro o platino).
No tiene la resolución que se alcanza con el microscopio electrónico
de transmisión, pero su ventaja es una excelente impresión
tridimensional. Este microscopio se basa en el principio de la
amplificación electrónica de señales que se generan al irradiar la
superficie de las muestras con un haz muy estrecho de electrones.
De transmisión En este tipo de microscopio, el haz de electrones atraviesa el
material que se desea observar, a través de unas lentes
electromagnéticas que dan lugar a una imagen amplificada. Esta
imagen pasa a su vez por una lente proyectora hasta una pantalla de
material fluorescente, que brilla al recibir el impacto de los
electrones. Debajo de la pantalla se sitúa la cámara para fotografiar
la imagen.
Las técnicas que más se utilizan para este tipo de microscopio son:
tinción negativa, microtomía y congelación.
Confocal de barrido láser Es uno de los últimos avances en microscopía. Permite la
observación de secciones finísimas dentro de una espesa muestra
fluorescente, así como digitalizar y reconstruir a una gran velocidad
las imágenes de alta resolución en tres dimensiones.
3. Preparación de la muestra para microscopía óptica
La preparación de una muestra, es necesaria para poder estudiarla bajo un microscopio.
3.1 Estudio “in vivo”
Se desarrolló cuando la tinción y fijación todavía no se habían implementado. En la actualidad, se
siguen utilizando gracias al desarrollo de técnicas de contraste de fases y contraste interferencial.
Estas técnicas solo se pueden utilizar en preparaciones finas, se suelen emplear en el estudio de
protozoos y hongos.
Un estudio “in vivo” es aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten las células, como la
fijación o inclusión.
3.1.1 Examen en fresco:
- Preparaciones húmedas: para el análisis de organismos acuáticos como larvas y algas.
Se coloca una gota del líquido que los contiene sobre el portaobjetos y se coloca el
cubreobjetos con cuidado para que no aparezcan burbujas de aire.
- Gota pendiente: se utiliza un portaobjetos excavado sobre los que se coloca el cubreobjetos,
el cual lleva adherido la gota del líquido que ha de ser observado. De esta manera, se puede
observar el movimiento de microorganismos en medio líquido, sin que estén sometidos a la
presión entre portaobjetos y cubreobjetos.
- Examen en fresco con nigrosina: esta técnica consiste en agregar nigrosina al objeto de
estudio. Con dicho método se puede distinguir bacterias incoloras sobre fondo negro. Se
utiliza sobre todo para observar estructuras como cápsulas y flagelos.
3.1.2 Coloración vital:
Permite colocar de relieve detalles estructurales sin matar al organismo. En general, no tiñen, sino
que se acumulan en zonas específicas de la célula. Como cualquier colorante, es una sustancia
tóxica, por lo que se deben emplear bajas concentraciones del mismo. Se utilizan: el colorante azul
metileno, rojo neutro, rojo congo y verde jannus. Existen dos maneras de realizar coloración en
vivo:
- Por difusión en el espacio entre el portaobjetos y cubreobjetos de una preparación en fresco,
se pone una gota de colorante que penetra en muestra por capilaridad.
- Mezclando una gota de colorante con el material que ha de ser examinado en el
portaobjetos y colocando posteriormente el cubreobjetos.
3.1.3. Estudio “in vitro”
Consiste en el estudio de células y tejidos muertos. Para ello se realizan una serie de procesos como:
la fijación, inclusión, corte (microtomía), tinción y montaje.
a) Fijación: consiste en matar a la célula lo más rápido posible, para permitir conservar la fisiología
y morfología del organismo. Los fijadores solidifican el coloide protoplasmático mediante
coagulación o precipitación, convirtiéndolo en un gel insoluble. La fijación evita la putrefacción y
desintegración del organismo, produciendo puentes entre proteínas y diferentes materiales de los
tejidos.
La muestra a fijar no debe tener más de 3 milímetros de espesor. Después de 24 horas, se procede a
la inclusión.
b) Insclusión: para poder endurecer la pieza, se incluye un material que llega a todas las estructuras
celulares, esta debe ser una sustancia con plasticidad como la parafina, el colodión o la gelatina.
Esto permite conservar la muestra durante un largo tiempo. Pasando por el proceso de
deshidratación, aclaración, impregnación en parafina e inclusión definiva.
c) Corte: se realiza mediante micrótomos, éstos se eligen dependiendo de la textura del material a
estudiar. Además de obtener diferentes grosores de cortes; como los finos (5-10um) y semifinos
(0.5-5um) de grosor.
d) Tinción: para teñir los cortes, no deben contener parafina. Una vez eliminada la parafina o
utilizando cortes que no habían sido incluidos en ella, se procede a la tinción. Para lo cual se deberá
escoger el tinte adecuado según el origen (naturales, artificiales) y la naturaleza (ácidos, básicos,
neutros).
e) Montaje: existen tres tipos (gota pendiente, extensión o frotis y aplastamiento). Gracias al medio
de montaje, la preparación se conservará durante mucho tiempo.
[Link] del microscopio
- Quitar la funda protectora del microscopio.
- Enchufar y encender el microscopio.
- Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto.
- Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente.
- Colocar el preparado sobre la platina, con el cubreobjetos hacia arriba y sujetarla con las pinzas.
- Enfoque el preparado mirando a través del ocular y lentamente mueva el tornillo macrométrico.
- Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe seguir observando.
- Cambie al objetivo a un mayor aumento y para lograr el enfoque siga moviendo lentamente el
tormillo macrométrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar ligeramente enfocada.
- Realice la observación y haga sus anotaciones. Determine cuál es la estructura que va a observar
a mayor aumento y colóquela en el centro del campo.
- Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta con el objetivo
anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar girando única y
lentamente el tornillo
- Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observación moviendo
constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abra
o cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste.
- Una vez finalizada la observación, aleje la platina y coloque nuevamente el objetivo de menor
aumento.
- Retirar la muestra.
- Limpie la lente objetivo si usó medio de inmersión, apague la/s lámpara/s.
- Cubra el microscopio con la funda protectora.
Resultados
Durante la práctica realizada en la plataforma Zoom, los profesores nos explicaron la función
conjunta de los lentes, los diferentes conceptos técnicos sobre microscopía, las características de la
imagen que deseamos estudiar, el rol de la ampliación, resolución y contraste. Posteriormente se
enviaron preguntas que teníamos que desarrollar y enviar al profesor por medio del correo
electrónico G-mail para obtener una calificación.
Discusión y conclusiones
En conclusión, para la observación de una muestra al microscopio, ésta debe ser preparada con
anticipación de acuerdo al tipo de microscopio que deseamos utilizar y el tipo de muestra. Este
instrumento es extremadamente delicado y costoso, por lo que su traslado siempre debe ser con
ambas manos, sosteniéndolo por la base y el brazo; asimismo, la eficacia del mismo está muy ligada
a la parte óptica que depende de una buena limpieza de sus lentes y buen ajuste de cada una de sus
partes.
Cuestionario
1.- Cuál es la diferencia entre un microscopio simple y un microscopio compuesto?
El microscopio simple está provisto de una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas de
manera que proporcionan una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto, que a su vez está
situado entre la lente y el foco. Por otro lado, el microscopio compuesto, se combinan dos lentes o
sistemas de lentes convergentes de amplificación de imagen colocados en los extremos del tubo: el
objetivo (situado más cerca del objeto a observar) y el ocular (más cerca al ojo del observador).
2.- ¿Cuál es la diferencia entre un microscopio binocular y un microscopio estereoscópico?
El microscopio binocular, la imagen observada es la misma en los dos oculares, de modo que se
observa una imagen en dos dimensiones; mientras que en el microscopio estereoscópico, utiliza dos
objetivos y dos oculares, de modo que la imagen observada en cada ocular es diferente y se produce
una imagen en tres dimensiones.
3.- ¿Cuál es la diferencia entre los microscopios de luz transmitida y los de luz reflejada?
En los microscopios de luz transmitida, la luz atraviesa la muestra desde debajo de la platina, la
preparación de esta muestra hace que sea semitransparente y parte de la luz pueda atravesarla hasta
llegar al objetivo para ser observada a través del ocular; por otro lado, los microscopios de luz
reflejada, la luz ilumina la muestra desde la parte superior de la platina y es utilizada para observar
materiales opacos como estructuras metálicas
4.- ¿Qué es un microscopio invertido?
Tiene el mismo principio de funcionamiento que el microscopio óptico
convencional pero montado de forma opuesta. En estos microscopios, la luz
proviene desde arriba de la platina y el objetivo se encuentra debajo de ella.
Tienen la ventaja de observar muestras situadas en el fondo de un recipiente,
lo que lo hace útil para mantener las muestras hidratadas y permite hacer
observaciones que no son posibles con microscopios convencionales.
Además, permiten la observación de muestras vivas por largos periodos de
tiempo, lo que permite analizar procesos biológicos que tienen lugar a una
escala de tiempo de horas y hasta días.
5.- ¿Cómo funciona un microscopio electrónico?
Utiliza electrones con una alta energía para la observación, manejada por una unidad denominada
electronvoltio (eV). Tiene el principio que nos dice que cuanto mayor sea la velocidad de
aceleración de electrones, menor es la longitud de onda y, por tanto, el poder de resolución será
mayor.
Consta de una fuente emisora de electrones y un tubo que contiene 3 lentes (bobinas
electromagnéticas), condensador, objetivo y la lente proyectora. Este sistema debe funcionar a un
alto vacío, debido a que la presencia de moléculas de gases interferiría en la trayectoria de los haces
de electrones y esto ocasionaría dificultades en la observación. La fuente emisora de electrones por
lo general es un filamento de tungsteno (cátodo), al que se le aplica un alto voltaje (entre 40.000 a
100.000 voltios) con lo cual emite electrones fuertemente acelerados y atraídos por el ánodo. En
este punto, el haz de electrones sigue una trayectoria recta con una longitud de onda menor a 0.05
nm.
6.- ¿Cuál es la diferencia entre los objetivos acromático, planar acromático, semiapocromático y
apocromático?”
Acromático Planar acromático Semiacromático Apocromático
Con pocas Corrigen los errores de Ofrecen una calidad Ofrecen una imagen
aberraciones esféricas colores. El campo de de imagen media, a más nítida en
y cromáticas. Posee un visión es plano. diferencia de los dos comparación con los
campo plano de anteriores. Se usan en acromáticos, gracias a
enfoque en el centro microscopios de una región espectral
del 65% del campo de fluorescencia. amplificada.
visión.
Las diferencias se encuentran en la calidad de imagen, tipo de microscopía con el cual se utilizan y
el diseño.
7.- Por qué es importante iniciar la observación con una ampliación de 4 (objetivos) aumentos?"
Porque de esta manera podemos observar un área grande de la muestra. Esto nos permite identificar
el área exacta que queremos observar, colocándola en el centro del campo de visión, para
posteriormente cambiar el objetivo por uno de ampliación mayor.
8.- Describa brevemente cada de los siguientes microscopios y explique el uso de cada uno de
ellos.
Descripción Uso
Campo claro Emplea luz natural o luz artificial El microscopio es de gran utilidad
como energía luminosa para formar en cualquier laboratorio,
las imágenes del objeto que se especialmente en el área de
observa. La imagen muestra puntos hematología para el análisis de frotis
o áreas iluminadas (generalmente sanguíneos, conteo de glóbulos
coloreados) sobre un fondo claro o rojos, leucocitos, plaquetas, recuento
transparente. de reticulocitos, entre otros.
Campo oscuro La imagen que se forma está Se usan muestras no teñidas en
constituida por una serie de muestras biológicas como frotis de
estructuras brillantes sobre un sangre, cultivo de tejidos u
fondo oscuro. Se requiere en primer organismos unicelulares.
lugar que la apertura numérica del
condensador sea mayor que la
apertura numérica del objetivo
De contraste de fase Es el microscopio fotónico más Permite la observación de muestras
utilizado para el estudio de objetos vivas sin usar técnicas de tinción, la
o estructuras transparentes sin principal dificultad es que las células
necesidad de teñir. Facilita la son prácticamente transparentes.
observación de células vivas para
distinguir y analizar sus
componentes morfológicos y ciertas
funciones que ellas puedan
desarrollar (mitosis, movimientos
ameboideos, ciliares o flagelares).
De fluorescencia Ciertas sustancias poseen la Permite determinar la distribución
propiedad que cuando son de una sola especie de molécula, su
estimuladas por energía de cierta cantidad y su ubicación dentro de
longitud de onda, absorben esta una célula.
energía y emiten fotones que
integran ondas visibles de luz, de
longitudes de onda siempre
mayores que las ondas con las que
fueron excitadas. Este fenómeno se
denomina fluorescencia. La luz
emitida se observa en forma de
destellos coloreados sobre un fondo
oscuro.
Confocal Se obtienen imágenes, Permite seccionar ópticamente una
preferentemente fluorescentes, muestra de forma no invasiva en
sumamente nítidas, con una gran cultivos celulares, especímenes,
capacidad de resolución y sin que tejidos.
se produzca la fotooxidación del
fluorocromo
Ultravioleta Es bastante similar a un Para su uso son necesarios unos
microscopio óptico convencional, lentes de cuarzo o fluorita. Para la
con la diferencia de que el observación de muestras biológicas
microscopio ultravioleta utiliza luz como proteínas y aminoácidos.
ultravioleta en lugar de luz visible.
De luz polarizada B La microscopia de luz polarizada es Se utiliza para Identificar sustancias
una técnica basada en la cristalinas o fibrosas intracelulares y
observación y reconocimiento de extracelulares (sustancia amiloide,
las propiedades ópticas que tienen asbesto, colágeno, cristales de uratos
los objetos que se van a estudiar y otras de origen exógeno).
cuando la luz los atraviesa. Una de
las formas de obtener esta luz es
utilizando un filtro al que se
denomina polarizador.
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