AISLAMIENTO Y ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

EN GELES DE AGAROSA
César Garcés, Arturo Narváez, Hamilton Anillo, Alfonso Luis Alfaro, Carlos castro
Universidad del Atlántico Km 7 Antigua vía Puerto Colombia, Departamento de Química,
Ciudadela Universitaria.
Programa de Química
Resumen

En esta práctica se desarrollo el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una

muestra de sangre humana a la cual se le aplicaron ciertas pruebas químicas como fue
la empleacion de una mezcla de buffer de tris a pH 8 + SDS + NaCl el cual permitió la
ruptura de las membranas evitar que las moléculas de ADN se desnaturalizaran,
seguidamente se realizaron los siguientes pasos los cuales consistieron en llevar la
mezcla resultante a la centrifugadora y así obtener las respectivas fases formadas,
luego de esto se realizaron las respectivas separaciones para obtener un precipitado
blanco donde se encontraba el ADN. Posteriormente a ese precipitado se le practico la
técnica de electroforesis, en el cual se desplazamiento de dichas moléculas debido a
un campo eléctrico

Palabras claves: elecroforesis, ácidos nucleicos , separación, centrifugación

Abstract
In this practice the isolation of nucleic acids was developed from a sample of human
blood which were applied as certain chemical tests empleacion was a mixture of tris
buffer at pH 8 + SDS + NaCl which allowed the break membranes prevent denature
DNA molecules, then the following steps which were to carry the resulting mixture into
the centrifuge is carried out and obtain the respective phases formed after this the
respective separations were performed to obtain a white precipitate where the DNA is
located. This precipitate subsequently underwent electrophoresis technique, in which
displacement of these molecules due to an electric field

Keywords:
elecroforesis, nucleic acid separation, centrifugation

1. INTRODUCCIÓN.

Las moléculas que más migran hacia el polo positivo son la superenrolladas, ya que
pueden atravesar más fácilmente la red de agarosa (al ser más compactas) porque
siempre chocan con ésta de igual forma. La banda intermedia que se revela al exponer
el gel a luz UV corresponde generalmente a las moléculas lineales ya que en solución
éstas rotan todo el tiempo y dependiendo de cómo atraviesan el gel se va a dar la
migración. Por último, las moléculas que migran con menor intensidad hacia el polo
positivo son las de círculo abierto ya que estas moléculas son mas laxas y presentan
por ello mayor dificultad para atravesar la malla del gel.  

Extracción de ácidos nucleicos

Los ácidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son polímeros de nucleótidos

formados por un azúcar de cinco carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN),
una base nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o uracilo) y
una molécula de fosfato. El ADN es la macromolécula que contiene la información
genética de las células procariontes, eucariontes y de los adenovirus. El ARN está
involucrado en la síntesis de proteínas y constituye el material genético de los
retrovirus (Madigan et al., 2000). La expresión de los genes es la base del metabolismo
celular, y por ésta se entiende que el ADN se transcribe en ARN, que a su vez se
traduce en proteínas. Esta secuencia ADN-ARN-proteínas constituye el dogma central
de la biología molecular. Hay tres tipos de ARN:

 El ARN mensajero (mARN), que se sintetiza durante la transcripción gracias a la

ARN polimerasa, está conformado por codones, que son secuencias de tres
pares de bases que codifican un aminoácido en específico.

 El ARN de transferencia (tARN) permite el vínculo entre el tARN y los

aminoácidos, ya que en un extremo cuenta con un aminoácido y en el otro, con
una secuencia de tres pares de bases llamada anticodón, a la que se une el
codón del mARN.

 El ARN ribosomal (rARN), que constituye la mayor parte del ARN en las células,
forma junto con proteínas a los ribosomas, que facilitan el acoplamiento
específico entre el mARN y los tARN para la traducción; los ribosomas están
compuestos por tres subunidades de rARN de diferentes tamaños en los
eucariontes (23S, 18S y 5S) y procariontes (23S, 16S y 5S).
Los estudios contemporáneos de ecología molecular se han esforzado en entender las
funciones metabólicas de los diferentes componentes biológicos presentes en el
ambiente y en conocer la diversidad biológica mediante el uso y aplicación de técnicas
moleculares basadas en la amplificación de diversas regiones del ADN y ARN. La
detección de la expresión de los genes o la
presencia de mARN específicos nos permitirá acercarnos a temas como el impacto de
los diferentes componentes físicos y biológicos del ambiente en la expresión del ADN
(ya que la simple presencia de ADN no nos indica la actividad de los genes), así como a
la regulación metabólica de las enzimas que son esenciales en el papel ecológico que
juegan los organismos dentro de su ecosistema (ciclos biogeoquímicos,
bioremediación, reciclaje de nutrientes), entre otros.

Métodos de extracción
En la extracción de los ácidos nucleicos, éstos se separan de cualquier otro compuesto
proveniente de las células o del ambiente del cual se tomaron las muestras (p. ej. en
muestras de suelos debemos considerar la alta concentración de ácidos húmicos, que
son materia orgánica parcialmente degradada que no es soluble en agua a pH bajo y
tiene un poder quelante muy alto, por lo que interfieren con la amplificación del ADN).
Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular,
para lo cual se utilizan los buffers de extracción que contienen 1) detergentes, como
sodio dodecilo sulfato (SDS) a una concentración final del 1% o Triton X al 0.5%; 2) una
molécula quelante (p. ej. EDTA, ácido etileno amino tetra acético, 50mM), que tiene
cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma completamente de
protonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución, quitando a los
cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las ADNasas;
3) sales (p.ej. cloruro de sodio, NaCl 20mM), que forman una capa iónica suave que
recubre al ADN protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación; 4) Tris-HCl 20mM
con pH entre 7.5 y 8.2 para mantener el pH de la solución estable; 5) proteinasa K
(concentración
final 0.5 ml ml) para degradar proteínas o enzimas. Durante este paso con buffer de
extracción es común someter la muestra a tres o cuatro ciclos de incubación a
temperaturas entre los 50ºC y 70ºC alternados con agitación de la muestra (manual,
con vórtex o en homogenizadores celulares utilizando micro esferas) e incubación a 4
ºC. La temperatura de incubación no puede ser mayor a los 80ºC, ya que a esta
temperatura se comienza a degradar el ADN.
ELECTROFORESIS

Es el movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico; las

partículas con carga negativa migran al ánodo (aniones) y las cargadas positivamente
migran al cátodo (cationes).
La electroforesis es el sistema estándar utilizado para separar, identificar y purificar
moléculas. La separación de las moléculas se realiza mediante el uso de soluciones
iónicas amortiguadoras (buffers) que confieren carga eléctrica a las moléculas y las
obliga a desplazarse hacia el extremo del gel que posee la carga opuesta.
Algunas partículas tienen cargas tanto negativas como positivas debido a la existencia
de diferentes grupos funcionales en las moléculas. La carga de estas partículas es la
carga neta y depende de la solución en la que se encuentre disuelta. Las partículas que
pueden tener cargas positivas y negativas se denominan “Switer Iones” entre los que
se encuentran aminoácidos, proteínas, alcaloides, etc. Existen sustancias las cuales
están exclusivamente cargadas positivamente o negativamente, lo que facilita su
separación como lo son los ácidos nucleicos, ácidos o bases orgánicas y fenoles entre
otros.
En el caso particular de la Biología Molecular, la electroforesis es utilizada para el
análisis de ácidos nucleicos. La técnica permite la separación de fragmentos de DNA
que no pueden ser separados adecuadamente mediante otros procedimientos como la
centrifugación en gradiente de densidad.

Dependiendo del objetivo de la electroforesis se pueden utilizar diferentes soportes,

siendo los más utilizados los geles de agarosa y los de poliacrilamida.

Hay varios factores que afectan la tasa de migración del DNA durante la electroforesis,
estos son:
· Tamaño de la Molécula
· Concentración del Soporte (Agarosa, Poliacrilamida etc.)
· Conformación del DNA
· Voltaje aplicado
· Dirección del campo eléctrico
· Composición en bases del DNA y temperatura del sistema
· Presencia de colorantes intercalantes
· Composición del buffer de electroforesis

Para un determinado medio, a mayor voltaje, más rápidamente se mueven las

partículas y menos tiempo se requiere para la separación de éstas, pero hay valores
óptimos de voltaje que dependen de la naturaleza de cada medio. Voltajes altos
generan mucho calor, lo cual podría deshidratar el medio y perder su fluidez.
En cuanto a la composición del buffer de electroforesis, medios con bastante absorción
o interacción con las sustancias a separar y medios con poca o ninguna interacción con
dichas sustancias. La retención disminuye la velocidad de las partículas lo que conlleva
el uso de voltajes altos o tiempos muy largos para que ocurra la separación.
Geles de Agarosa

La electroforesis en gel de agarosa es un método estándar usado para separar,

identificar y purificar fragmentos de DNA. La agarosa extraída de las algas es un
polímero linear compuesto básicamente por D y L- galactosa. La agarosa forma una
matriz que sirve o actúa como un cedazo molecular para separar fragmentos de DNA
de diferentes tamaños. La agarosa se encuentra comercialmente disponible con
variaciones en su pureza. Se recomienda un grado de agarosa ultra-pura que esté libre
de DNAsas. El tamaño de los fragmentos analizados está en el rango de los 150 bp a
2500 bp. Para la separación de fragmentos de alto peso molecular se debe usar bajas
concentraciones de agarosa, para la separación de fragmentos pequeños se usan altas
concentraciones de agarosa.
Los fragmentos pequeños migran más rápido que los fragmentos grandes.
La forma del DNA determina el patrón de migración; DNA circular cerrado>DNA
linear>DNA circular abierto.
La migración del DNA es directamente proporcional al voltaje aplicado.
Voltajes muy altos o muy bajos no son recomendados. El voltaje normal debe ser 5-10
voltios /cm. La distancia en cm está referida a la longitud del gel entre los electrodos
negativo y positivo. Voltajes altos generan mucho calor lo que puede alterar los geles.

Normalmente se adiciona 10 ul de bromuro de etidio (10 mg/ml) para 100 ml de

solución de agarosa, (esperar a que la temperatura descienda a los 50 – 60°C).
El bromuro de etido es mutagénico por lo cual se deben usar guantes cuando se
trabaje con este material y debe ser colectado en un contenedor especial.
El bromuro de etidio se utiliza para colorear moléculas de DNA o RNA, el cual se
intercala entre las cadenas complementarias de la doble hélice o en las regiones de
estructuras secundarias del DNA de cadena sencilla o del RNA. Su color es naranja
fluorescente cuando se ilumina con luz UV. La ventaja de adicionar bromuro de etidio
al gel de agarosa es que las bandas de DNA pueden ser coloreadas y monitoreadas con
luz UV. La desventaja es que tanto el gel como el aparato de electroforesis son
contaminados con bromuro, entonces alternativamente se puede realizar el corrido sin
coloración y el gel es coloreado después del corrido 10 – 30 minutos en un tanque con
agua y bromuro de etidio en la oscuridad ( 5 ul por 50 ml de agua destilada).
Buffer de Carga: es un buffer contiene sucrosa o glicerol, lo cual da peso a la muestra
para que el DNA se precipite al fondo de los pozos de siembra y los colorantes (azul de
bromofenol, cylen xyanol, naranja de acridina, etc) permiten identificar el frente de
corrido. Se usan marcadores de peso molecular para tener una referencia del tamaño
de los fragmentos por separar e identificar.

2. OBJETIVOS

 Conocer los principios de la migración electroforética

 Familiarizarse con métodos de separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en geles de agarosa.
 Reconocer la función que cumple cada uno de los reactivos utilizados en el
proceso de extracción de ácidos nucleicos

MATERIALES Y REACTIVOS  Lámpara de UV y máscara

protectora para ojos.
 Pipetas graduadas de 1 y 5 mL.  Agitador con plancha de
 Tubos de ensayo de 7 mL. calentamiento.
 Tubos de ensayo de 15 mL.  Balanzas analíticas.
 Gradilla para tubos de ensayo  Pesa sustancia
 Baño termostato  Micropipetas de 100 μL y 20 μL
 Tris HCl 0,5M.  Puntas desechables para
 EDTA 0,5M. micropipetas.
 SDS (Sodio dodesil sulfato) 10%  Gradillas para tubos eppendorf
p/v.  Tubos eppendorf de 1,5 mL
 Etanol Absoluto frío.  Tubos Falcon de 50 mL
 NaCl 0.1 M  Vaso de precipitado de 200 mL.
 Acetato de sodio 3 M pH 5.2  Matraces aforados de 1000 mL.
 Acetato de amonio 5 M.  Agitador de vidrio.
 Cloroformo  Tris Base
 Fenol  Ácido acético glacial
 Agua destilada  EDTA
 Frasco Lavador  Ácido bórico
 Sangre humana  Azul de bromofenol
 Cámara de electroforesis  Xylene cyanol FF
horizontal.  Ficoll Type 4000
 Fuente de poder.  Bromuro de Etidio
 Regulador de voltaje.  Agarosa
 Guantes desechables.
3. Procedimiento  Centrifugue a 3000 r.p.m. durante 5
Parte 1. Aislamiento De Ácidos minutos. Transfiera el sobrenadante
Nucleicos: a un tubo limpio, cuidando de no
 Agregue 2 mL de buffer de tocar la interface.
extracción (Tris HCl 10mM (pH 8),  Agregue 1.3 ml de etanol absoluto
EDTA 50 mM y NaCl 1,4 M) a un frío por las paredes del tubo y
volumen de 3 mL de muestra observe la precipitación del ADN en
previamente homogenizada. la interface.
Mezcle vigorosamente.  Con el precipitado obtenido se
 Agregue 0,4 mL de SDS 10% p/v. procede a realizar la técnica de
Caliente en baño de agua a 65 º C electroforesis.
durante 90 minutos, invirtiendo el
tubo cada 15 minutos. Parte 2. Electroforesis en geles de
 Centrifugue por 10 minutos a 5.000 agarosa:
r.p.m. y reparta el sobrenadante en  Se preparó 100 mL de agarosa al
tubos de ensayo de 7 mL (máximo 2 0.7% en un vaso de precipitado de
mL por tubo). Agregue igual vidrio. Se pesaron 0.7 g de agarosa
volumen (2 mL) de la mezcla y se adicionó 100 mL del tampón
fenol:cloroformo (25:24) y agite por TBE Tampón tris-borato-EDTA (TBA)
inversión, suavemente, durante 5 a 1X o TAE (Tris-acetato-EDTA) 1X.
10 minutos.  Se disolvió la solución (agarosa)
sobre una plancha de
 calentamiento, hasta que la
solución se observara clara. 4. Resultados y análisis de
 Se adicionó bromuro de etidio a la Resultados.
solución de agarosa a una En la práctica se desarrolló la obtención
temperatura cercana de 55º C (El del ADN a partir de sangre, en primer
Bromuro de Etidio puede lugar se utilizó una mezcla de Tris HCl
adicionarse a la solución de agarosa (pH 8), EDTA y NaCl esta se adiciono
en este punto a una concentración con fin de romper las células, el EDTA
de 0.5 μg /mL. PRECAUCIÓN: EL se une a cationes divalentes (Ca2+ y
BROMURO DE ETIDIO ES Mg2+), esto evita la coagulación de la
CANCERIGENO. muestra. Dado que estos iones ayudan
 Se preparó la cubeta de geles a mantener la integridad de la
sellando los extremos con cinta de membrana celular, cuando son
enmascarar, luego se colocó el eliminados por el EDTA desestabiliza la
peine sobre la cubeta de geles membrana, ahí después actúa la
dejando un espacio de 1 cm entre el solución Tris que protege el ADN
extremo final y el peine. manteniendo el pH de buffer en un
 Se adicionó la solución de agarosa a punto estable, ya que el ADN es muy
la cubeta de geles y se esperó sensible a los cambios bruscos de pH. El
aproximadamente 30 minutos a NaCl desprende la cromatina, las
que solidificara a temperatura cromatinas del núcleo celular y ayuda
ambiente. Se remueve suavemente en la precipitación de proteínas y
el peine y se coloca en la cámara de cromosomas desnaturalizados.
electroforesis, seguidamente se Posteriormente se le adiciono el
adiciona el buffer de corrida (el detergente iónico Dodecil Sulfato de
mismo buffer utilizado para Sodio (SDS) al 10% que es un
preparar el gel), hasta que el gel detergente aniónico que ayuda a
este totalmente sumergido. romper la membrana nuclear y además
 Las muestras se prepararan de la actúa como agente solubilizaste de
siguiente forma: Adicionar 1 μL de proteínas y de componentes de tejidos
buffer muestra 6x por cada 5 μL de y membranas para así separarlos del
solución de ADN. Mezclar bien. ADN, esto se llevó a calentamiento
Cargar 5-12 μL de ADN en cada durante 40 minutos a una temperatura
carril (para un mini gel). de 65 ºC para que la reacción sea más
 Se corrió la electroforesis a 50-150 eficiente, posteriormente se llevó a
voltios, hasta que los marcadores centrifugar durante 10 minutos
hayan migrado a una distancia aproximadamente y se observó en ella
apropiada, esto dependiendo del dos fases. Una fase traslucida en donde
tamaño del ADN a visualizarse. Si el se encontraba los glóbulos blancos y la
bromuro de Etidio no fue agregado una fase de color rojo en donde se
previamente al gel, teñirlo con una encontraba los glóbulos rojos y además
solución de 0.5 μg /mL de Bromuro los otros componentes del interior de la
de Etidio disuelta en el buffer de célula como se muestra en la siguiente
corrida. Por último se visualizó las figura No 1.
bandas de ADN en un
transiluminador con luz UV.
 sobrenadante se le agrego 1,3 mL de
etanol absoluto frio que actúa para
separar bien el ADN de los demás
componentes, se llevó a centrifugar
durante 10 minutos en donde no se
observó ningún precipitado.

La electroforesis es una técnica para la
separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo
Figura 1 eléctrico.[1]La separación puede
Posteriormente se separó la fase realizarse sobre la superficie hidratada
traslucida y se le agrego una mezcla de de un soporte sólido como se ilustra a
``cloroformo y fenol´´ a una relación de continuación.
25:24, que es un desnaturalizador de
proteínas y sirve también para tener .
una buena separación de los diferentes
componentes que se encuentran en la
muestra (proteínas, lípidos
carbohidratos y por supuesto el ADN),
al adicionarle la mezcla se colocó de un
coloración gris esto indica que hubo
presencia de hemoglobina en la
muestra, en el proceso de ruptura de la
membrana contenía hierro libre, este al
Figuran 4 montajes de la técnica de
interactuar con el oxígeno se oxido a electroforesis
Fe3+ dando como resultado el color gris
como se muestra en la figura. En la práctica de electroforesis se
preparó la solución de agarosa con el
tampón TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBE
(Tris-borato-EDTA), esto con el fin de
aplicar una carga eléctrica a la muestra
de ADN (buffer de corrida), el gel de
agarosa debe estar saturado con una
solución tampón que contiene sal. Esto
mantenía desprotonado el ADN. Luego
se le adiciono cuidadosamente
Figura 2. Adición de cloroformo-fenol a la bromuro de etidio a la solución de
muestra de ADN
agarosa a una temperatura cercana a
55 ºC este es un agente fuertemente
Posteriormente se centrifugo
mutágeno y cancerígeno que tiene
observándose dos fases, el
como función de marcador (colorante)
centrifugado se llevó a cabo para la
del ADN y ARN. En la gráfica siguiente
separación de los componentes polares
observamos la estructura de este
de los no polares, a la fase
agente.
Figura 3 estructura del bromuro de etidio
La solución de agarosa se adiciono a la
cubeta de geles y se esperó 30 minutos
a que esta se solidificara a temperatura
baja , posteriormente se removió el
peine y se llevó a la cámara de
electroforesis y se le adiciono más del Figura 6. Gradillas y tubos de eppendorf de 1.5
ml
tampón, que fue el mismo para
preparar el gel, hasta que el gel
Después de agregar la solución de ADN
estuviera totalmente sumergido
a el carril de un mini gel se encendió la
fuente de poder y se regulo el voltaje a
Después de tener el montaje de la
100 voltios durante 15 min luego lo
electroforesis (figura 4) se preparó la
subió hasta 150 voltios durante 15
solución de ADN adicionando 5 μL de
minutos hasta que los marcadores
muestra de ADN a pequeños tubos de
migraran a una distancia apropiada
eppendorf de 1.5 ml, con 3 μL de azul
(figura 6).
de bromofenol-glicerina que es una
buffer de carga, que además permite
que las muestras adquieran mayor
densidad y se depositen en el fondo de
los pocillos del gel.

Figura 7. Corrida de la solución de ADN

Figura 5. Montaje de la electroforesis Hay que tener en cuenta que en el caso

de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato
es el responsable por la fuerte carga
negativa en condiciones de pH neutro,
haciendo que los fragmentos migren
hacia el polo positivo (ánodo) durante
la electroforesis.
La agarosa funciona como un filtro en
el que los fragmentos de menor
tamaño migran más rápidamente hacia Conclusiones
el ánodo que aquellos de mayor
tamaño.
El incremento del voltaje aumenta  en este experimento se logro
proporcionalmente la velocidad de separar los ácidos nucleicos que
migración de los fragmentos en el gel. se encontraban en la sangre por
Después de la migración, se distintas pruebas químicas,
además de esto se logro
visualizaron las bandas de ADN en un
entender la implementación de
transiluminador con luz UV, Cuando las los distintos reactivos utilizados.
moléculas cargadas son sometidas a un  se logro comprender el
campo eléctrico, migran hacia el polo funcionamiento de distintos
positivo (ánodo) como es el caso de los dispositivos empleados en la
ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de separación de los ácidos
acuerdo a sus cargas. Como se observa nucleicos, como lo es el método
de electroforesis.
a continuación

Bibliografía
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una movilidad inversamente rodriguez/electroforesis-de-
proporcional al log10 de su masa acidos-nucleicos-en-geles-de-
molecular, situándose los más agarosa-unah-microbiology-
pequeños más cerca del polo positivo, 27425983
adoptando una apariencia similar a un
código de barras. 
Cada barra contiene un fragmento de
ADN de un tamaño determinado más o
menos cada 23 pares de bases. 
Entre los diferentes factores que
afectan la movilidad de los fragmentos
de ADN en el gel de agarosa que
pueden optimizarse para la separación
de los fragmentos está la concentración
de agarosa.