UNIVERSIDAD LOS ANGELES DE CHIMBOTE 1 FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CURSO : BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
UNIDAD : SEGUNDA
TEMAS : LA REPLICACION DEL ADN
El principio transformador.
Naturaleza química del principio transformador.
El experimento de Meselson y Sthal.
La replicación del ADN: etapas.
EL PRINCIPIO TRANSFORMADOR
El experimento de Frederick Griffith
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En 1928, el microbiólogo Frederick Griffith, que investigaba varias cepas de pneumococcus,
inyectó ratones con la cepa S y la cepa R de la bacteria. La cepa S era dañina, mientras que la
rugosa (R), no lo era. Cuando, inactiva por calor, la cepa S era inyectada, no había secuelas y
el ratón vivía. Sorprendentemente, al combinar cepa R (no letal), con cepa S inactivada por
calor (no letal), el ratón murió. Además, Griffith encontró células de cepa S vivas. En apariencia
la cepa R se convirtió en cepa S. Este hallazgo no se pudo explicar, hasta que en 1944 Avery,
Mc Leod, y Mc Carty, cultivaron cepa S y:
1. Produjeron extracto de lisado de células (extracto libre de células).
2. Luego que los lípidos, proteínas y polisacaridos se removieron, el estreptococo aun
conservó su capacidad de replicar su ADN e introducirlo en neumococo R.
La inactivación por calor de Griffith habría dejado intacto el ADN de los cromosomas de las
bacterias, que era el causante de la formación del gen S, y podía ser liberado por las células
destruidas e implantarse en cultivos sucesivos de cepa R.
¿En qué consistió su experimento?
En el año 1928 Frederick Griffith investigando una enfermedad infecciosa mortal la neumonía,
estudió las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus peumoniae que producía la
enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de
una cápsula (también se la conoce como cepa S, del ingles smooth, o sea lisa, que es el
aspecto de la colonia en las placas de Petri). La otra cepa (la R, de rugosa, que es el aspecto
de la colonia en la placa de Petri) no tiene cápsula y no causa neumonía. Griffith inyectó las
diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la
cepa R no lo hacía. Luego comprobó que la cepa S, muerta por calentamiento, no causaba
neumonía cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando combinaba la cepa S muerta por
calentamiento, con la cepa R viva, es decir con componentes individuales que no mata a los
ratones e inyectaba la mezcla a los ratones, los ratones contraían la neumonía y morían; en la
sangre de estos ratones muertos Griffith encontró neumococos vivos de la cepa S. Es decir que
en las bacterias S muertas había “algo” capaz de transformar a las bacterias R, antes inocuas,
en patógenas y este cambio era permanente y heredable. Este "algo" fue aislado; luego se
encontró que era ADN Las bacterias que se aislaban de los ratones muertos poseían cápsula y,
cuando se las inyectaba, mataban otros ratones. Frederick Griffith fue capaz de inducir la
transformación de una cepa no patogénica Streptococcus pneumoniae en patogénica. Griffith
postuló la existencia de un factor de transformación como responsable de este fenómeno.
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El problema que quería investigar con su experimento
Frederick Griffith estaba interesado en la virulencia (capacidad de infectar y producir
enfermedad) de las bacterias causantes de la neumonía, llamadas Pneumonococcus. Por este
experimento se pudo alcanzar a llegar a la conclusión de la existencia del ADN.
¿Por qué utilizó células muertas?
Porque necesitaba comprobar que era lo que ocurría si éstas se ponían en contacto con células
vivas, trato de probar si volvían a ser peligrosas para el organismo de las ratas.
¿Qué transformación experimentan las cepas al estar en contacto con células muertas?
Estas cepas se infectaron con la enfermedad y causaron la muerte de las ratas a las cual se les
inyectó.
Conclusiones
Con el experimento de Griffith se pudo concluir que el ADN de las bacterias inactivadas
(muertas) con temperatura, había sido en insustancial, ya que éste era el causante de la
formación del gen S (viruela), y podía ser liberado por las células destruidas e implantarse en
cultivos sucesivos de cepa R (cepas sanas), es decir, demostró con sus experimentos que el
ADN era necesario para adquirir la virulencia.
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NATURALEZA QUIMICA DEL PRINCIPIO TRANSFORMADOR
Los datos de Griffith acerca de esta transformación rápidamente fueron confirmados por varios
laboratorios en todo el mundo, incluyendo el de Oswald Avery, inmunólogo en el Rockefeller
Institute. Al principio, Avery dudó que una sustancia liberada por una célula muerta pudiera
alterar el aspecto de la célula viva, pero se convenció cuando Martín Dawson, su joven
ayudante, confirmó los mismos resultados en su laboratorio.
El siguiente paso lo dio J. Lionel Alloway, otro miembro del laboratorio de Avery, quien pudo
solubilizar el agente transformador. El extracto soluble así filtrado mostró la misma capacidad
transformadora que las células originalmente muertas por calor. En los siguientes diez años,
Avery y sus colegas enfocaron su atención en purificar la sustancia causante de la
transformación y en determinar su identidad. Tan sorprendente puede parecer ahora, en aquel
tiempo ningún otro laboratorio del mundo se dedicó a identificar el “principio transformador”,
como lo llamó Avery. Los avances en este problema fueron lentos. Con el tiempo, Avery y sus
colaboradores, Colin MacLeod y Maclyn McCarty, lograron aislar una sustancia activa del
extracto soluble capaz de causar la transformación de apenas una parte en 600 millones.
Todas las pruebas sugerían que la sustancia activa era ADN: 1.- mostraba muchas de las
propiedades químicas características del ADN; 2.- ningún otro tipo de material detectarse en la
preparación, y 3.- los ensayos con diferentes enzimas mostraron que sólo aquellas capaces de
digerir ADN podían inactivar el principio transformador.
El trabajo publicado en 1944 fue escrito con escrupulosa cautela, sin conclusiones
espectaculares afirmando que los genes estaban constituidos por ADN y no por proteínas.
Algunos biólogos estaban convencidos que las preparaciones de Avery debían estar
contaminadas con cantidades mínimas de proteínas y que ese contaminante, no el ADN, era el
agente transformador activo. Otros se preguntaban si estudios acerca de bacterias publicados
en una revista médica podían tener relevancia alguna en el campo de la genética y
consideraban el fenómeno de la transformación como una peculiaridad de las bacterias.
En los años siguientes a la publicación del trabajo de Avery hubo cambios importantes en la
genética, se reconoció la existencia de cromosomas bacterianos y algunos prominentes
genetistas volvieron su atención a esos procariotes. Estos científicos estaban convencidos de
que el conocimiento logrado por el estudio de organismos celulares muy simples arrojaría luz
sobre los mecanismos que operan en plantas y animales complejos.
EL EXPERIMENTO DE MESELSON Y STHAL
Dos características bien definidas que saltan a la vista de inmediato en el modelo de Watson y
Crack hicieron más evidente el hecho de que el ADN es el material genético. Se sabe que el
ADN puede contener información codificada en su secuencia de bases. El modelo también
sigiere una forma en que esa información puede ser copiada de manera precisa, proceso
conocido como “DUPLICACIÓN” (O REPLICACIÓN) del ADN. La importancia del mecanismo
de duplicación era conocida para Watson y Crack, quienes en un clásico y ahora famoso
ejemplo de exposición escueta al final de su primer artículo, escribieron: “NO HA ESCAPADO A
NUESTRA ATENCIÓN EL HECHO DE QUE EL APAREAMIENTO ESPECÍFICO DE BASES
QUE HEMOS POSTULADO SUGIERE DE INMEDIATO UN POSIBLE MECANISMO DE
COPIADO PARA EL MATERIAL GENÉTICO”.
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Estructura del ADN
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El modelo sugería que, como los nucleótidos se aparean entre sí de manera complementaria,
cada molécula de la cadena del ADN podría servir de plantilla o patrón para la síntesis de la
cadena opuesta. Sólo sería necesario que los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas se
rompieran y que las dos cadenas se separaran. Cada semihélice (cada cadena) podría
entonces aparecer como nucleótidos complementarios para restituir al compañero faltante. El
resultado serían dos dobles hélices de ADN, cada una idéntica a la original y consistente en
una cadena original de la cadena progenitora y una cadena complementaria recién sintetizada.
Este tipo de copiado de información se conoce como mecanismo de “DUPLICACIÓN
SEMICONSERVADORA”.
Si bien el mecanismo de duplicación semiconservadora propuesto por Watson y crack era (y
sigue siendo) un modelo sencillo y atractivo, se requerían pruebas experimentales para
establecer que en efecto el ADN se duplica de esa manera. Primero era necesario descartar
otras posibilidades. Por ejemplo, con un mecanismo de DUPLICACION CONSERVADORA,
ambas cadenas progenitoras (“antiguas”) permanecían juntas, y las cadenas recién
sintetizadas, formarían una segunda doble hélice. En una tercera alternativa, las cadenas
originales y recién sintetizadas podrían mezclarse al azar durante el proceso de duplicación;
esta posibilidad recibió el nombre de DUPLICACIÓN DISPERSA.
Teorías que trataban de explicar la replicación de ADN
Para discriminar entre el mecanismo de duplicación semiconservadora y las otras posibilidades,
era necesario distinguir entre las cadenas originales y las recién sintetizadas del ácido
desoxirribonucleico (ADN).
Un modo de lograr esto es con el empleo de un isótopo pesado del nitrógeno, el nitrógeno 15
con símbolo N15 (el nitrógeno ordinario o liviano es el nitrógeno 14, N14), para marcar cadenas
de ADN haciéndolas más densas. Las moléculas más grandes, como la de ADN, pueden
separarse por diferencias en su densidad mediante una técnica conocida como
“CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD”. Cuando el ADN se mezcla co n la
solución que contiene cloruro de cesio (CsCl) y se centrifuga a alta velocidad, la solución forma
un gradiente de densidad en el tubo de la centrífuga, que va de una región de baja densidad en
la parte superior a una región con la máxima densidad en el fondo. Durante la centrifugación,
las moléculas de ADN emigran a la región del gradiente que tiene valor de densidad idéntico al
suyo.
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El experimento de MatthewW Meselson y Franklin Stahl
En 1957, Matthew Meselson y Franklin Stahl cultivaron células de la bacteria Escherichia coli
en un medio que contenía N15 en la forma de cloruro de amonio (NH 4Cl). Las células utilizaban
el N15 para sintetizar bases, que a su vez eran incorporadas en EL ADN. Las moléculas de
ADN resultantes, que contenían nitrógeno pesado, se extrajeron de algunas células; cuando se
sometieron a centrifugación en gradiente de densidad se acumularon en la región de alta
densidad del gradiente. El resto de las bacterias (que también contenían ADN marcado con
N15) se transfirieron a un medio de cultivo y más ligero; ahí se le permitió experimentar varias
divisiones celulares más.
Se esperaba que las cadenas de ADN recién sintetizadas fueron menos densas, por haber
incorporado bases que contenían el isótopo ligero, N14. En efecto, las moléculas de ADN de
células aisladas después de una generación tenían densidad intermedia, lo cual indicaba que
contenían la mitad de átomos de N15 que el ADN “progenitor”. Este hecho apoyaba el modelo
semiconservador, el cual decía que cada doble hélice debe contener una cadena previamente
sintetizada (pesada en este caso) y una recién sintetizada (ligera en este caso). Refutaba el
modelo conservador, que sugería que habrían dos clases de moléculas de doble cadena (una
con dos cadenas pesadas y otra con dos cadenas ligeras).
Después de otro ciclo de división celular en el medio con el isótopo ligero (N14), aparecieron
dos tipos de ADN en el gradiente de densidad. Uno consistía en hélices “HÍOBRIDAS” de ADN
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(con N15 en una cadena y N14 en la otra), en tanto que la otra contenía sólo ADN con el isótopo
ligero natural. Esta observación refutaba el modelo disperso, el cual sugería que todas las
cadenas debían tener densidad intermedia. En cambio, cada cadena de la doble hélice original
se conservaba, pero en una molécula hija “diferente”, tal como lo sugería el modelo de
duplicación semiconservadora.
REPLICACION SEMICONSERVADORA
REPLICACION CONSERVADORA
REPLICACION DISPERSA
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LA REPLICACION DEL ADN
CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO REPLICATIVO
Existen cierto número de características para el proceso de replicación del ADN que son
comunes a todos los organismos, virus, bacterias y células eucariotas. Es sin embargo
importante destacar que la mayor parte del conocimiento que se tiene sobre ellas proviene de
estudios realizados en bacterias y bacteriófagos. En lo que sigue se describirán algunas de
estas características:
1. ESQUEMA SEMICONSERVADOR DE LA REPLICACIÓN: la replicación de una
molécula de ADN de doble cadena es un proceso semiconservador. Esto significa que
cada cadena cuando se copia queda apareada a la cadena hija. Ello implica que
durante el proceso de copia cada cadena debe separarse de su homóloga y que luego
no vuelve a aparearse a ésta, sino que, como ya se dijo, queda ligada a la cadena hija.
2. ORIGEN Y SENTIDO DE LA REPLICACIÓN: por lo menos en virus y bacterias la
replicación del ADN siempre comienza en un punto fijo del cromosoma y de ese punto
puede extenderse unidireccionalmente o bidireccionalmente.
3. ETAPAS DE LA REPLICACIÓN: como todo proceso de polimerización, la síntesis de
ADN tiene tres etapas: la INICIACIÓN, la ELONGACIÓN y la TERMINACIÓN. La
velocidad de síntesis de la molécula se considera que depende eminentemente de la
etapa de iniciación. Sobre esta etapa actúan la mayor parte de factores de regulación.
Se considera que una vez iniciada la síntesis actúan la mayor parte de factores de
regulación. Se considera que una vez iniciada la síntesis, la elongación se hace a
velociada constante.
4. DIRECCIÓN DE LA REPLICACIÓN: el proceso de polimerización consiste en la adición
de nucleótidos en el sentido 5’ 3’. Ello significa que, siendo las cadenas del
ADN antiparalelas, o sea, que presentan la disposición.
p 5’ 3’ OH Dirección de la síntesis
Dirección de la síntesis OH 3’ 5’ p
La dirección de la síntesis de las cadenas es especialmente opuesta.
5. DISCONTINUIDAD DE LA REPLICACIÓN: teniendo la replicación un sentido
determinado y siendo la dirección de la síntesis de ambas cadenas opuestas en el
espacio, el sistema está obligado a operar en forma discontinua. Esto significa que el
proceso de replicación da origen temporalmente a la formación de pequeños
segmentos de por lo menos una de las cadenas, que luego son ligados entre sí.
El proceso de REPLICACIÓN se puede dividir en tres etapas: INICIACIÓN, ELONGACIÓN y
TERMINACIÓN:
1. INICIACIÓN.- Las dos cadenas de la doble hélice de ADN se separan y sirven como
moldes para la síntesis de nuevas cadenas complementarias. Las HELICASAS,
enzimas que operan en las horquillas de replicación, separan las dos cadenas de la
doble hélice original. Las TOPOISOMERASAS, evitan el superenrrollamiento,
catalizando la formación y resellado de cortes en una o ambas cadenas delante de las
horquillas de replicación. Las proteínas de unión a cadena simple estabilizan las
cadenas abiertas.
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Como las cadenas no apareadas de un ADN son muy sensibles al ataque por
nucleasas, al producirse la separación, cada cadena es inmediatamente cubierta por
proteínas específicas que la protegen y que se denominan 2PROTEÍNAS DE UNIÓN A
CADENAS SIMPLES”.
La iniciación real de la síntesis de ADN comienza con la formación de una CADENA
INICIADORA o PRIMER (cebador). Curiosamente, esta cadena iniciadora no es de
ADN sino de ARN. La síntesis de la molécula iniciadora es llevada a cabo por una ARN
– polimerasa especial que se denomina INICIASA o PRIMER. La iniciasa, a partir de los
ribonucleótidos trifosfatados, sintetiza una cadena de ARN que ha de ofrecer en su
extremo 3’ el hidroxilo requerido para iniciar la síntesis de la cadena de ADN en la
siguiente etapa.
El proceso de replicación del ADN
El proceso de replicación del ADN
2. ELONGACIÓN.- La ADN polimerasa III cataliza la adición de nucleótidos a ambas
cadenas operando sólo en dirección 5’ a 3’. Para comenzar a añadir nucleótidos, esta
enzima requiere la presencia de un cebador de ARN, unido por puentes de hidrógeno a
la cadena molde que es luego reemplazado por nucleótidos de ADN.
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La cadena adelantada se sintetiza en la dirección 5’ a 3’ en forma continua. En este
caso, el único cebador de ARN está situado en el origen de la replicación. La cadena
rezagada también se sintetiza en la dirección 5’ a 3’, a pesar de que esta dirección es
opuesta a la del movimiento de la horquilla de replicación. El problema se resuelve
mediante la síntesis discontinua de una serie de fragmentos, los FRAGMENTOS DE
OKAZAKI. Cuando un fragmento de Okazaki ha crecido lo suficiente como para
encontrar a un cebador de ARN por delante de él, otra ADN polimerasa (ADN
POLIMERASA I) reemplaza a los nucleótidos de ARN del cebador con nucleótidos de
ADN. Luego, la ADN LIGASA conecta cada fragmento con el fragmento contiguo recién
sintetizado en la cadena.
El proceso de replicación del ADN
3. TERMINACIÓN.- es el menos conocido, y en cromosomas circulares está asociado al
proceso de separación de los dos cromosomas hijos del origen de la replicación así
como también a la generación de superhélices. En estos fenómenos interviene una
familia de enzimas denominadas TOPOISOMERASAS, en particular la ADN - GIRASA.
El ADN de una sola célula humana que, si se extendiera en una hebra única mediría casi 2
metros de largo, puede contener una información equivalente a unas 600,00 páginas impresas
de 500 palabras cada una, o a una biblioteca de aproximadamente 1,000 libros.
Sin duda, la estructura del ADN puede dar cuenta de la enorme diversidad de los seres vivos.
La información se encuentra en la secuencia de bases nitrogenadas y cualquier secuencia de
bases es posible. Dado que el número de pares de bases es de aproximadamente 5,000 en el
virus más simple conocido, hasta una estimación de 5,000 millones en los 46 cromosomas
humanos, el número de variaciones posibles es astronómico. La replicación de los cromosomas
eucarióticos se inicia en orígenes múltiples. Cada burbuja de replicación individual se extiende
hasta que finalmente se encuentra con otra y ambas se unen.
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Esquema de cómo se produce el enrollamiento del ADN para formar los cromosomas
ULADECH : ENERO 2008 : VERSIÓN 01.
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