Enzimología de
Alimentos
Cinética enzimática
Inhibición enzimática
Inmovilización de enzimas
Diana Coello Montoya, MSc. Diciembre, 2017
Cinética enzimática
Una reacción enzimática puede representarse como:
E+S [ES] E+P
Cinética enzimática
Para que una reacción química se lleve a cabo, se necesita cierta
cantidad de energía Energía de activación (Ea)
Ea es la que determina la velocidad con la que se da la reacción.
Enzimas disminuyen la Ea de las
reacciones que catalizan, al
reducir el “camino” de la
reacción.
Este “camino corto” requerirá
menos energía para que las
moléculas de sustrato sean
convertidas en producto.
Cinética enzimática
ü La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas.
ü La velocidad en sentido químico es la variación de concentración
por unidad de tiempo.
ü Se puede medir como:
ü Velocidad de desaparición del reactivo A, es decir, -d[A]/dt,
o
ü Velocidad de aparición del producto B, es decir, d[B]/dt
ü Factores que afectan la velocidad de las reacciones:
temperatura, pH, concentración de enzima, concentración de
sustrato y presencia de inhibidores.
Cinética enzimática
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la [S]
sobre la v de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima
constante.
Cuando [S] es pequeña, v es
directamente proporcional a [S], y
por tanto, la reacción es de
primer orden.
A altas [S], la velocidad ya no
depende de [S]. En este punto, la
reacción es de orden cero y la
velocidad es máxima (Vmax).
Cinética enzimática
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten
propusieron una ecuación de velocidad que
explica el comportamiento cinético de las enzimas.
𝑉$%& 𝑆
𝑣=
𝐾$ + 𝑆 Modelo de equilibrio
Velocidad: número de moles de S convertidos en P por unidad de tiempo.
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Supuestos:
1. [S] >> [E], de tal manera que [ES] en
cualquier momento es muy pequeña.
2. [ES] no cambia con el tiempo, esto quiere
decir que la velocidad de formación de
ES es igual a aquella para su desintegración
(estado estacionario).
3. Se utiliza la velocidad inicial de la
reacción, ya que la velocidad se mide
apenas el S y el E se mezclan y hasta antes
de que se haya consumido el 10 % de la [S]0. Curva de avance de la reacción
La [P] acumulado es muy pequeña y, por o, Curva de reacción
tanto, P à S puede ser ignorada.
Km: medida de la afinidad
del enzima por el sustrato.
Corresponde a la [S] de ½
Vmax
𝑉$%& 𝑆
𝑣=
𝐾$ + 𝑆
[S] << Km
𝑉$%&
𝑣= 𝑆 =𝑘 𝑆
𝐾$
𝑘 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 1º𝑜𝑟𝑑𝑒𝑛
[S] >> Km
𝑣 = 𝑉$%& = 𝑘
𝑘 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 0 𝑜𝑟𝑑𝑒𝑛
Transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
Recíproca doble
𝑉$%& 𝑆
𝑣=
𝐾$ + 𝑆
1 𝐾$ 1 1
= × +
𝑣 𝑉$%& 𝑆 𝑉$%&
Transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten
Eadie-Hofstee
𝑉$%& 𝑆
𝑣=
𝐾$ + 𝑆
𝑣
𝑣 = −𝐾$ + 𝑉$%&
𝑆
Transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten
Hanes-Woolf
𝑉$%& 𝑆
𝑣=
𝐾$ + 𝑆
𝑆 𝐾$ 1
= + 𝑆
𝑣 𝑉$%& 𝑉$%&
CINÉTICA NO MICHAELIANA
Los enzimas alostéricos no siguen una cinética Michaeliana, éstas contienen múltiples
subunidades y centros activos.
Pequeñas variaciones de [S], en una zona crítica (alrededor de KM), pueden
traducirse en grandes variaciones en la velocidad de reacción.
El factor que limita la velocidad de la reacción
es el cambio de conformación a la forma
activa del enzima.
A bajas concentraciones de sustrato, el enzima
está en la forma inactiva.
Después de que el primer sustrato esté unido,
la segunda y siguientes moléculas de sustrato
se unen con mayor afinidad (cooperatividad
positiva).
Cinética enzimática
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (U)
Cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de
sustrato en un minuto (µmol/min).
Katal (kat): 1 katal=60×10; 𝑈, es la unidad del SI para actividad
catalítica. Se utilizan submúltiplos como el µkat (10-6 kat) o Ƞkat (10-
9 kat)
La actividad específica es el número de unidades de enzima por
miligramo de proteína (U/mg proteína) o por mililitro de solución
(U/ml).
Cinética enzimática – Inactivación enzimática
• El enzima activo es convertido en enzima inactivo.
• La pérdida de conformación es irreversible y obedece la cinética de 1º orden.
𝐸 C = 𝐸 > 𝑒 @ABC 𝑉$%&,> ∗ 𝑒 @ABC ∗ 𝑆
𝑣= ec. M-M
𝐾$ + 𝑆
𝑉$%& = 𝑘E 𝐸 > 𝑒 @ABC
𝑣 = 𝑉$%& ∗ 𝑒 @ABC ec. 0º orden
𝑉$%& = 𝑉$%&,> 𝑒 @ABC
𝑘F : 𝑠 @H 𝑉$%&,> ∗ 𝑒 @ABC
𝑣= 𝑆 =𝑘 𝑆 ec. 1º orden
𝐾$
Kd: constante de inactivación enzimática
Cinética enzimática – Efecto del pH
´ El pH del medio es una de las variables de mayor sensibilidad.
´ La mayoría de los enzimas muestra un pH óptimo (región de máxima
actividad).
´ En algunos casos la actividad máxima es en un rango de pH.
´ El efecto puede darse en:
• Ionización del sustrato
• Ionización del centro activo
• Ionización del enzima (sitios
diferentes al centro activo)
Cinética enzimática – Efecto del pH
Inactivación irreversible
Pérdida de la conformación activa
Forma activa Forma inactiva
Activación por protonación
Actividad determinada por el grado de protonación de residuos en el sitio activo
Forma inactiva Activación reversible
Cinética enzimática – Efecto del pH
Condiciones óptimas pH < pK de los carboxilos del sustrato pH > pK de los de los grupos básicos
del enzima
Cinética enzimática – Efecto de la temperatura
T à Ec y movilidad de partículas
Más colisiones y mayor velocidad
de transformación
T à se rompen uniones
intermoleculares (responsables
de la conformación)
Disminuye la actividad
T excesivas à desnaturalización
Cinética enzimática – Efecto de la temperatura
Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción
kd k
E Ei S P
Cinética enzimática – Efecto de la temperatura
Efecto de la temperatura en la constante de velocidad de reacción
Relación de Arrhenius
KL
@MN
𝐸%
k= 𝑘J 𝑒 𝑙𝑛 𝑘 = 𝑙𝑛 𝑘J −
𝑅𝑇
𝑘J : 𝑠 @H
Tiempo de vida media (t0.5)
R
𝐸% : U$ST Tiempo en el que la mitad de la actividad del
enzima se pierde por inactivación.
R: 8.314 RU$ST [
𝑇: 𝐾 ln 0.5 ln 2
𝑡>.\ = = (𝑠)
−𝑘F 𝐾F
K∞: constante de Arrhenius
Cinética enzimática – Efecto de la temperatura
Efecto de la temperatura en la constante de velocidad de reacción
𝐸%
𝑙𝑛 𝑘 = 𝑙𝑛 𝑘J −
𝑅𝑇
