GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA

Código de registro: RE-10-LAB-244 Versión 5.0

UNIVERSIDAD DEL VALLE
LABORATO4RIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL
Práctica No. 1

BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS DE MICROBIOLOGIA

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

Los laboratorios de microbiología constituyen medio ambientes de trabajo

especiales, generalmente únicos, que pueden presentar riesgos de
enfermedades infecciosas identificables para las personas que se encuentren en
o cerca de ellos. Durante todo el transcurso de la historia de la microbiología, las
infecciones se han contraído en el laboratorio. Los informes publicados hacia
fines del siglo pasado describieron casos de fiebre tifoidea, cólera, muermo,
brucelosis y tétano adquiridos en el laboratorio. En 1941, Meyer y Eddie
publicaron un estudio de 74 infecciones de laboratorio con brucelosis que se
habían producido en los Estados Unidos, y concluyeron que la “manipulación de
cultivos o especímenes o la inhalación de polvo con contenido de organismos de
Brucella constituye un peligro inminente para quienes trabajan en los
laboratorios”. Algunos casos se atribuyeron al descuido o a malas técnicas en la
manipulación de materiales infecciosos.
En 1913, Eyre fue el primer autor que publicó un libro de texto en el que incluyó
prácticas de seguridad para el laboratorio de microbiología, como
recomendaciones sobre la necesidad de: 1) usar guantes, 2)lavarse las manos
después de trabajar con materiales infecciosos, 3) desinfectar todos los
instrumentos inmediatamente después de su uso, 4)utilizar agua para humedecer
los rótulos de las muestra, en lugar de saliva, 5)desinfectar todos los residuos
contaminados antes de su descarte y 6) informar a todo el personal afectado
sobre cualquier accidente o exposición a agentes infecciosos.
Estas pautas, que aún se incorporan en los programas de seguridad del
laboratorio del siglo XXI, se expandieron hasta incluir no solo el manejo adecuado
de los peligros biológicos enfrentados al procesar las muestras o manejar
microorganismos infecciosos.
Bioseguridad consiste en las precaucione sobre seguridad, salud y trabajo. Las
medidas preventivas están destinadas a proteger la salud de los recursos
humanos, de los riesgos por agentes biológicos, físicos, químicos y/o factores
humanos. El cumplimiento de estas normas unidas al empleo de técnicas de
laboratorio adecuadas disminuye el riesgo para el personal y para la integridad
de los productos.
Principios de Bioseguridad
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El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar
materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son
manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la
exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio
ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.
La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato
del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante
buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de equipos de seguridad
adecuados. El uso de vacunas puede brindar un mayor nivel de protección del
personal.
La contención secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio
de la exposición a materiales infecciosos, se logra a través de una combinación
del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos
de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad
y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un
agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos.

NORMAS DE SEGURIDAD
Las precauciones estándares y las prácticas seguras del trabajo de laboratorio se
basan en los siguientes fundamentos:
▪ No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos (incluso brillo labial)
▪ Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
▪ Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con
agua y jabón.
▪ El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de
comenzar cada practica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo
con los desinfectantes químicos( Hipoclorito de sodio y alcohol etílico)
▪ No colocarse o quitarse lentes de contacto
▪ No morderse las uñas o masticar lapiceras
▪ No pipetear con la boca
▪ Limitar el acceso al laboratorio solo al personal capacitado
▪ Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por
HIV y otros patógenos transportados por la sangre
▪ Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama
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▪ Usar precauciones de barrera adecuadas para impedir la exposición de la
piel y las membranas mucosas, por ejemplo, siempre lavar guantes y
máscaras, anteojos, batas o guardapolvos si hay riesgo de salpicaduras o
formación de gotitas.
▪ Lavarse adecuadamente las manos y otras superficies de la piel tras
quitarse los guantes e inmediatamente después de cualquier
contaminación
▪ Tener cuidado especial en evitar lesiones con objetos cortantes, como
aguja y escalpelos.
▪ Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la
realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
▪ En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de
microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.
Desechos generales o comunes son aquellos que no presentan un riesgo
adicional para la salud humana y el ambiente y que no requieren de un manejo
especial como papel, cartón, plásticos, restos de alimentos.
Desechos peligrosos o especiales son aquellos que presentan un riesgo para la
salud humana y el ambiente y que requieren de un manejo especial como
sangre y hemoderivados
Desechos cortopunzantes son aquellos representa un peligro para la salud como
hojas de bisturí, agujas, lancetas
Desechos especiales como frascos de antibióticos

2. COMPETENCIAS.-
➢ Define los principios básicos de bioseguridad en laboratorios de
microbiología
➢ Aplica de forma correcta las precauciones estándares en los laboratorios

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

▪ Manual de bioseguridad

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
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Todos los estudiantes antes de entrar a las aulas deben cumplir las
precauciones estándar mientras trabajan dentro del laboratorio las siguientes
pautas:
▪ Usar guantes y guardapolvo de laboratorio
▪ Manipular con cuidado todos los materiales e instrumentos
▪ Descartar el material infeccioso y punzo cortante en los recipientes
identificados respectivamente.

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-

200 Minutos
6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-
No aplica
7. CUESTIONARIO.-

1. Cite las normas de Bioseguridad recomendadas durante el trabajo con

agentes Infecciosos
2. Como eliminaría residuos infecciosos
3. Que cuidados se debe tener durante el transporte hasta el laboratorio de
una muestra (Ej. muestras de sangre).
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Práctica No. 2

MATERIALES E INSTRUMENTOS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

El trabajo en un laboratorio de Microbiología es significativamente diferente al de

otros laboratorios, requiriendo de unos cuidados especiales ya que se debe
trabajar en condiciones que se evite la contaminación del operario, de las
muestras y del ambiente. Por todo ello es necesario reconocer cada uno de los
materiales que son utilizados en laboratorio de Microbiología y reconocer el uso
que se le da en el mismo. Es cierto que muchos materiales se comparten con
otros laboratorios, sin embargo en microbiología se le da un uso especial porque
el objetivo es diferente. Ejemplo: el caso de un mechero, que se utiliza para
esterilizar.
2. COMPETENCIAS.-
➢ Describa el material utilizado en el laboratorio de microbiología, a través de
la resolución de problemas
➢ Indica el empleo del material descrito en trabajos microbiológicos, a través de
la resolución de problemas.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 PORTAOBJETOS 10 PIEZAS
2 CUBREOBJETOS 20 PIEZAS
3 TUBOS DE ENSAYO 10 PIEZAS
4 TUBOS DE HEMÓLISIS 10 PIEZAS
5 CAJAS PETRI 10 PIEZAS
6 ASAS BACTERIOLÓGICAS 10 PIEZAS
MATRACES ERLENMEYER
7 DE 250 mL 5 PIEZAS
8 PIPETAS DE 5 mL 10 PIEZAS
9 GRADILLAS 5 PIEZAS
10 VARILLAS DE TINCIÓN 2 PIEZAS
11 FRASCOS GOTEROS 10 PIEZAS
12 PROBETA DE 100 mL 10 PIEZAS
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13 ESPÁTULA DE DRIGASKI 10 PIEZAS
14 PINZAS DE RASPASO 10 PIEZAS
15 MICROSCOPIOS 5 PIEZAS
16 AUTOCAVE 1 EQUIPO
HORNO DE CALOR SECO
17 (ESTUFA) 1 EQUIPO
18 INCUBADORAS 1 EQUIPO
19 BAÑO MARÍA 1 EQUIPO
CÁMARA DE CÁMAR
20 ANAEROBIOSIS 1 A
21 MECHERO A GAS 5 PIEZAS
22 BALANZA DE 400g 4 PIEZAS

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
Descripción ordenada de cada uno de estos y realizar el correspondiente dibujo.
• Procedimientos de lavado, secado y protección de los mismos.
• Señalar los usos de cada uno de los materiales a utilizar en el laboratorio de
Microbiología.
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-
200 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

No se aplica

7. CUESTIONARIO.-

.- Dibuje y cual su utilizada

MATERIALES USOS DIBUJO

Portaobjetos

Cubreobjetos
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Tubo de ensayo

Tubos de hemolisis

Caja petri

Pipetas graduadas
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Práctica No. 3

TOMA DE MUESTRA PARA UN ANALISIS MICROBIOLOGICO CLINICO

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

El laboratorio de microbiología debe recolectar la muestra para ser sometida a un
aislamiento y cultivo de microorganismos causante de procesos infecciosos,
aplicando la metodología es necesario tener un protocolo que permita la adecuada
manipulación de muestras que serán enviadas al laboratorio y los resultados
obtenidos estarán, estrechamente relacionados con el éxito del informe
Consideraciones importantes para la recolección de muestras son las
siguientes:
• Si el paciente recolectara la muestra las instrucciones deberán ser claras
(Mejor si son por escrito)
• La muestra deberá ser representativa del proceso infeccioso
• La recolección deberá realizarse antes de comenzar la terapia antimicrobiana
o suspender el antibiótico 48-72 horas antes de la toma de muestra
• Cuando se realice cultivo y aislamiento de gérmenes el material deberá
recolectarse en recipientes estériles
• Una vez recolectada la muestra deberá ser llevada al laboratorio lo más rápido
posible
• Etiquetar correctamente las muestras
• Toda muestra deberá como si fuera potencialmente patógena
• Cuando se realiza cultivo de material deberá conocerse el lugar de donde
proviene la muestra: Zonas corporales que normalmente son estériles
(sangre, punción de medula ósea, líquido cefalorraquídeo, liquido sinovial,
liquido pleural, liquido peritoneal, tracto respiratorio inferior, orina recolectada
por punción supra púbica), Zonas corporales que poseen flora normal
comensal (boca, nariz, tracto respiratorio superior, piel, tracto genital, tracto
gastrointestinal, orina recolectada por micción media, sondas o bolsas
recolectoras)

2. COMPETENCIAS.-

➢ Aplica la metodología adecuada para la recolección de muestras

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➢ Aplica los métodos correctos para la conservación de las
muestras.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 BAJALENGUAS 20 PIEZAS
2 HISOPOS ESTÉRILES 20 PIEZAS
3 PORTAOBJETOS 20 PIEZAS
POR MESON
4 MECHEROS BUNSEN 4 PIEZAS SOLAMENTE
5 GUANTES 5 PARES
6 JERINGAS DE 5mL 10 PIEZAS
7 TUBOS DE HEMÓLISIS 40 PIEZAS
8 CENTRIFUGADORA 1 EQUIPO
GRADILLA PARA TUBOS DE
9 HEMÓLISIS 1 PIEZA
10 ALGODÓN 100 gr
11 ALCOHOL MDICINAL 100 mL
12 LIGADURAS 5 PIEZAS
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Instrucciones
Muestra Preparación del paciente
especiales

Orina chorro Mujeres: limpiar la zona con agua y El recipiente donde

medio jabón, luego enjuagar con agua, se recolecta la
colocar tampón vaginal, muestra deberá ser
Manteniendo separados los labios estéril, boca ancha y
mayores y comenzar A evacuar en no tocar la piel del
el inodoro; recoger el chorro medio paciente.
después de eliminar los primeros ml En el caso de niños
de orina. se podrá emplear
Varones: limpiar el glande con agua bolsa recolectora de
y jabón, luego enjuagar con agua; orina.
retraer la piel del glande; recoger el
chorro medio después de eliminar
varios ml.

Sangre venosa Limpiar el sitio de punción venosa Extraer sangre

con alcohol al 70 % o con alcohol durante el episodio
yodado. febril, extraer dos
muestras, de brazo
izquierdo y derecho,
no extraer más de
tres muestras en un
periodo de 24 horas.

Tracto Limpiar la piel antes de Se puede aspirar el

genital la recolección. líquido o se puede
femenino realizar un hisopado,
o recolectar las
secreciones con
ayuda de un hisopo.

Tracto Limpiar el glande con agua y jabón.

Recolectar las
genital
secreciones con
masculino hisopo o en tubo.
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Vías respiratorias Enjuagar con agua antes de la Pasar el hisopo por

superiores recolección de la muestra la faringe posterior y
faringe las amígdalas, con la
ayuda de un baja
lengua, sin tocar
paladar, úvula y
dientes.

La muestra recolectada es Esputo. El paciente debe

Vías respiratorias
Enjuagar o hacer gárgaras con agua obtenerlo por tos
inferiores
antes de la recolección. profunda.

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-

Extracción de una muestra de sangre

Realización de un hisopado faríngeo
Recolección una muestra de orina

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA.-

200 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

No se aplica

7. CUESTIONARIO.-
• Cite otras recomendaciones para la extracción de muestras
• Que otras muestras se toman para un análisis microbiológico en los seres
vivos
• Cite los medios de transporte
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Práctica No. 4

COLORANTES EMPLEADOS EN BACTERIOLOGIA

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.

Los colorantes son sales organicas cuya estructura fundamental es un anillo
bencénico con distintos radicales, los colorantes se clasificn en básicos, acidos
y neutros. En bacteriología las mas empleados son colorantes básicos como
fusina básica, cristal violeta y azul de metileno.
Acido alcohol resistentes
Solución A: fucsina básica 4 g en 20 ml de etanol al 95%
Solución B: fenol (90%) 6.7 ml en 100ml de agua desionizda ( temperar
ligeramente parafacilitar la disolución; no calentar en exceso ya que es inflamable
Mezclar ambas soluciones en un reciiente tapado( mediante agitación constante
durante varias horas). Filtrar con papel de filtro
Alcohol clorhídrico
Alcohol etílico (95%) 970ml
Acido clorhídrico 30 ml
Mezclar en cámara ventilada (extractora)
Azul de metileno
Azul de metileno 3 g
Agua desionizada 1000ml
Disolver completamente 3 g de azul de metileno en 1000 ml de agua desionizada
Dejar reposar durante 24 horas y filtrar con papel de filtro
Crista violeta
Solución A cristal violeta en 200 ml de etanol (95%) (utilizar mortero)
Solución B 8 g de oxalato amónico en 800 ml de agua desionizda (utilizar mortero)
Mezclar ambas soluciones. Filtrar con papel filtro
Lugol
Yodo resublimado 1 g
Yoduro de potasio 20 g
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Triturar y mezclar finamente: 1 g de yodo resublimado con 20 g de yoduro de
potasio. Disolverlo a continuación en 1000ml de agua desionizada. Filtrar con
papel defiltro
Safranina
Safranina 0.25 g
Etanol 10 ml
Disolver 0,25 d de safranina en 10 ml de etanol (95%). (utilizar mortero). Anadir
agua desionizda hasta un volumen total de 100 ml . una vez disuleta tras
agitación, filtrar con papel filtro
2. COMPETENCIAS.-
➢ Preparar una solución de azul de metileno
➢ Aplicando las técnicas y precauciones durante la preparación de un
colorante.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
VASO DE PRECIPITADO
1 DE 250 mL 1 PIEZA
FRASCO DE VIDRIO
2 ÁMBAR DE 100mL 1 PIEZA
3 ESPÁTULAS 2 PIEZAS
4 PISETA DE AGUA 2 PIEZAS
5 PROBETA DE 100 mL 1 PIEZA
6 BALANZA 1 PIEZA
7 EMBUDO 1 PIEZA
8 PAPEL FILTRO 1 PLIEGO
9 AZUL DE METILENO 20 mL

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
Pesar el colorante
Anadir la cantidad de agua
Dejar reposar
Filtrar la solución
Colocar en el frasco y rotular
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5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-

200 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

No se aplica

7. CUESTIONARIO
Investigue la estructura química de la fucsina básica, cristal violeta, azul de
metileno
Cite las tinciones mas empleadas en microbiologia
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Práctica No. 5

TINCION DE GRAM

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

Con el objeto de incrementar el contraste y facilitar la observación de las muestras

en microscopia de campo claro, se pueden utilizar colorantes. Los colorantes son
compuestos orgánicos y cada tipo de colorante suele tener afinidad por
determinas estructuras celulares. Muchos de los colorantes utilizados con
frecuencia en microbiología están cargados positivamente catiónicos; esto es,
que en un campo eléctrico se desplazan hacia el cátodo (-) y se combinan
fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los
ácidos nucleicos y los polisacáridos. Entre los colorantes catiónicos se pueden
citar el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Dado que las envolturas
externas de los microorganismos están por lo general cargadas negativamente,
estos colorantes se combinan con estructuras de la superficie celular, y son por
lo tanto excelentes colorantes de aplicación general.
Las tinciones más simples se realizan sobre preparaciones presecados. Sobre un
portaobjetos con una suspensión seca de microorganismos se derrama una
pequeña cantidad de una solución diluida del colorante y se mantiene el contacto
durante uno o dos minutos; se lava varias veces con agua y se seca. Este tipo de
preparación suele observarse con un objetivo de inmersión.
Se denominan tinciones diferenciales aquellas que no tiñen de manera
homogénea a todos los tipos de células, Las más importante tinción diferencial
utilizada en microbiología se denomina tinción de Gram, en honor al microbiólogo
que la describió. Dependiendo del resultado de esta tinción, las bacterias pueden
dividirse en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Una vez
determinada la tinción de Gram, las bacterias Gram positivas aparecen de color
violeta o púrpura, mientras que las Gram negativas presentan color rosa.
La distinta tinción de estos dos grupos de bacterias se basa en las profundas
diferencias que presentan sus paredes celulares. En bacterias Gram positivas el
peptidoglicano representa hasta el 90 % de la pared, aunque pequeñas
cantidades de ácidos teicoicos suelen también formar parte de la misma. Si bien
se cree que algunas Bacterias poseen una sola capa de peptidoglicano, muchas
Bacterias, especialmente las Gram positivas, tienen varias capas de
peptidoglicano. En Bacterias Gram negativas el peptidoglicano constituye solo
alrededor del 10 % de la pared.
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Fundamento de la Gram: Este método divide las bacterias en dos grupos: Gram
positivos y Gram negativas. Al colocar los agentes como cristal violeta o violeta
de genciana y añadirles una solución débil de yodo (lugol), se combinan con
algunos componentes de la célula bacteriana que son retenidos por la membrana
citoplasmática cuando se tratan con alcohol acetona; otros, en cambio liberan
rápidamente el colorante, por lo que no aparecerán a la visión microsocopica.a
no ser quese contratiñeran con algún otro tinte biológico como safranina o
fucsina. Por lo tanto los microorganismos que conservan el cristal violeta o violeta
de genciana se observa de violeta Gram positivo y los que no lo hacen Gram
negativos muestran un color que corresponde al colorante de contraste de color
rosado.
La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:

1. Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las células

cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más
utilizado es el cristal violeta o violeta de genciana.

2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el

colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales
metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de yodo
o Yodo de Gram.

3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, alcohol-

acetona (1:1).

4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el

primer colorante, como, por ejemplo, la safranina o fucsina básica. Los dos
grupos bacterianos a los que anteriormente nos referíamos difieren en el
color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se
teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante
los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración
inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido
a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su
envoltura celular.
Una de las precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en
fase exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. Por
ejemplo, las bacterias Gram positivas en fase estacionaria pueden aparecer
como Gran negativas.
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2. COMPETENCIAS.-

➢ Diferencia bacterias Gram positivas y Gram negativas, a través de la

resolución de problemas
➢ Realiza el manejo con desenvoltura de los microscopios ópticos, a
través de la resolución de problemas.

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
PORTAOBJETOS 20 PIEZAS
ASAS BACTERIOLÓGICAS 5 PIEZAS
MECHERO BUNSEN POR
MESÓN 4 PIEZAS
COLORANTES DE GRAM 1 KIT
VARILLAS DE TINCIÓN 2 PIEZAS
HISOPOS ESTÉRILES 15 PIEZAS
BAJALENGUAS 10 PIEZAS
MICROSCOPIOS 10 PIEZAS
ACEITE DE INMERSIÓN 5 mL

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-

Preparación de un frotis bacteriano

1. Colocar una pequeña gota de agua en un portaobjetos limpio.

2. Con el asa de siembra previamente flameada transferir una pequeña cantidad

del cultivo bacteriano en medio sólido a la gota. Remover la mezcla hasta
formar una suspensión homogénea y extenderla para facilitar su secado.
Nota: si el material de partida es un cultivo en medio líquido, no es necesario
realizar estos dos primeros pasos. Basta con colocar y extender una muestra
de la suspensión bacteriana directamente sobre el portaobjetos.

3. Esperar hasta que la fina película de líquido se evapore o bien acelerar este
proceso con un ventilador o un secador. No eliminar el líquido calentando el
portaobjetos a la llama pues las células pueden deformarse o romperse.
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4. Fijación de las bacterias al vidrio portaobjetos por calor. Pasar tres veces el
portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos
entre los pases.
Pasos de la Tinción Gram
1. Teñir con cristal violeta (1 minuto)
2. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
3. Cubrir con Lugol o solución de yodo (1 minuto)
4. Lavar con agua el exceso de Lugol.
5. Decolorar con alcohol-acetona hasta que la preparación deje de perder color
(unos 30 segundos).
6. Lavar con abundante agua para eliminar el resto del disolvente.
7. Teñir con safranina (1 minuto)
8. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
9. Secar la preparación.
10. Examinar al microscopio. Dibujar la morfología y el color que toman los
distintos tipos bacterianos en estudio.
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-

200 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

Cálculos de preparación de colorantes

7. CUESTIONARIO.-

1. Cual la utilidad de la tinción de GRAM para el diagnóstico microbiológico

2. ¿Cree Ud., que existen bacterias que no pertenecen a ninguno de los grupos
(Gram positivas o Gram negativas)?.Justifique su respuesta.

3. Que cuidados se debe tomar en cuenta al momento de elegir el cultivo

bacteriano.

4. Que cuidados se debe tomar en cuenta al realizar una tinción de GRAM

5. Cite 3 medios de transporte y cual su utilidad

6. Cite cuales son los componentes de los reactivos y las soluciones y como se
prepara.
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Práctica No. 6
TINCION ACIDO ALCOHOL RESISTENTE

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

La mayoría de las eubactacterias se encuentran englobadas en dos grandes

grupos según la tinción de Gram; sin embargo, algunas bacterias de los grupos
Micobacteria y Actinomicetos no puede ser clasificado por aquella tinción. Para
poder observar y diferenciar con detalle estos grupos bacterianos. Robert Koch
ideó una tinción que fue denominada como tinción para bacilos alcohol acido
resistente. En la actualizad la técnica más utilizada es una modificación de la
original, que recibió el nombre de tinción de Ziehl Neelsen
Fundamento
Los bacilos alcohol acido resistentes son teñidos fucsina fenicada, retienen el
colorante y no se decoloran por acción de los ácidos, se tiñen de color rosado,
los no ácidoresistentes se tiñen con el colorante de contraste de color azul.
2. COMPETENCIAS.-
➢ Estudia la morfología y la capacidad tintorial de las bacterias ácido
alcohol resistente.
➢ Comprueba la capacidad de discriminar esta bacteria en una muestra
contaminada.

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 PORTAOBJETOS 20 PIEZAS
COLORANTES DE ZIEHL
2 NELSSEN 1 KIT
3 PINZAS ANATÓMICAS 5 PIEZAS
MECHERO BUNSEN POR
4 MESÓN 4 PIEZAS
5 MICROSCOPIOS 10 PIEZAS
6 ACEITE DE INMERSIÓN 5 mL
TAMAÑO
7 PAPEL FILTRO 1 HOJA OFICIO
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8 MECHERO DE ALCOHOL 2 PIEZAS

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-

1. Preparar un frotis de los microorganismos a observar

2. Cubrir completamente con fucsina fenicada

3. Calentar la preparación cuidadosamente en un mechero Bunsen, sin que

hierva la muestra, durante 5 minutos
Nota: añadir más fucsina fenicada ésta se evapora; la preparación no
debe quedar seca en ningún momento.

4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

5. Decolorar con la solución ácido-alcohol hasta que la muestra adopte un

color rosa claro (unos 30 segundos).

6. Lavar con agua para detener la decoloración.

7. Teñir con azul de metileno (1 minuto)

8. Lavar con agua el exceso de colorante.

9. Secar la preparación
10. Examinar al microscopio. Anotar las diferencias existentes entre los dos
grupos bacterianos.
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5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-

200 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

Cálculos de dilución de porcentaje

7. CUESTIONARIO.-

1. ¿Por qué es necesario que la muestra no hierva durante la tinción fucsina

y como actúa la carbofucsina?

2. Cite las muestras empleadas para realizar una tinción de Zielh

3. Cuál es el colorante de contraste

4. Las bacterias acido alcohol resistentes de qué color se teñirán?

5. Cite como se prepara los reactivos.

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Práctica No. 7
ESTERILIZACION Y DESINFECCIÓN
1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

La esterilización puede definirse como la destrucción y eliminación de todos los

microorganismos incluyendo las esporas generalmente por métodos físicos.
Dicho de otro modo: Carente de vida y una técnica estéril significa, el uso o
transferencia de materiales sin introducir ningún organismo extraño. Tome en
cuenta además que en el laboratorio de Microbiología, el uso de términos como
técnica aséptica condiciones asépticas se usa como sinónimos de estéril.
La desinfección destruye solo formas vegetativas y no esporas, generalmente por
substancias químicas.
2. COMPETENCIAS.-
➢ Conoce los diferentes tipos de esterilización.
➢ Esteriliza diversos materiales de uso corriente en el laboratorio.
Aplica los diferentes agentes químicos en un proceso de desinfección

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 AUTOCLAVE 1 EQUIPO
MECHEROS BUNSEN EN CADA
2 MESON 4 PIEZAS
3 ESTUFA DE ESTERILZACIÓN 1 EQUIPO
4 ASAS BACTERIOLÓGICAS 5 PIEZAS
5 SOLUCIÓN DE LUGOL 10 mL
SOLUCIÓN DE LAVANDINA AL CANTIDAD
6 1% NECESARIA
7 ALCOHOL EN GEL 50 mL
8 CAJAS PETRI 20 CAJAS
9 PAPEL ALUMINIO 1 ROLLO

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-

METODOS DE ESTERILIZACIÓN
Esterilización por calor seco:
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- Por simple flameado; para esterilizar agujas, espátulas bocas de tubos de
ensayo, matraces, etc. En el caso de un asa de inoculación, colocar este en
el centro de la llama azul del mechero, con un ángulo de 90 ºC
aproximadamente, dejar que el asa llegue al rojo vivo y luego dejar enfriar
dentro del área de esterilización.

- Por medio de aire caliente; En este caso se hace uso de los hornos
bacteriológicos, donde se esteriliza vidriería en general. Los cuales se colocan
en cilindros ó cajas metálicas que se colocan en el horno por espacio de dos
a tres horas de 170 a 180ºC, después de transcurrido ese tiempo apagar el
aparato y sacar el material cuando la temperatura interior esté a 40ºC ó
menos. Tampoco abrir la puerta mientras el horno esté a altas temperaturas,
porque al contacto con el aire frío, los materiales de vidrio pueden romperse.
Esterilización por calor húmedo:

- Por ebullición con agua; Este método tiene el inconveniente de que a 1

atmósfera de presión el agua hierve a 100ºC y aún más, pero en nuestro
medio el agua hierve a 92ºC; este factor hace que no nos asegure una perfecta
esterilización. Sin embargo por un tiempo mayor a 15 minutos pueden
esterilizarse jeringas, pinzas, etc.

- Por el vapor de agua a presión; Se utiliza las llamadas autoclaves, donde se

esterilizan los medios de cultivo, y aquellos materiales que no toleran el calor
seco como delantales, guantes de goma, etc., Para ello tomar en cuenta lo
siguiente:
o Que los materiales estén convenientemente preparados, en lo posible
use papel kraft para evitar el humedecimiento del material.
o Que haya suficiente espacio entre los materiales para asegurar una libre
circulación de aire.
o Los recipientes con contenido no deben exceder de las 2/3 partes del
volumen del frasco, para evitar rebalses del contenido por una ebullición
violenta.
o La esterilización de los materiales limpios y sucios deben efectuarse por
separado, nunca juntos.
o Antes de colocar en funcionamiento el aparato, verificar que el nivel del
agua
esté aproximadamente en el nivel medio.
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o Cerrar herméticamente el aparato o Que la temperatura llegue a 121ºC
y una atmósfera de presión y sólo a partir de este momento controlar 15
minutos.
o Al cabo de ese tiempo apagar el aparato y dejar que la presión llegue a
cero, (puede descompresiones manualmente, pero teniendo el cuidado
de no hacerlo violentamente, sino los frascos con contenido pueden
llegar a ebullición y rebalsar), para extraer el material esterilizado.
o Por el vapor de agua sin presión (vapor fluente; en este caso se puede
utilizar el autoclave, manteniendo la espita (tapa) abierta.
o Se esterilizan por este método aquellas sustancias que se destruyen a
elevadas temperaturas, como por ejemplo medios de cultivo
azucarados y productos poco contaminados.
Filtración:
o Este método se basa en el paso de líquidos a través de sustancias
porosas ó membranas de celulosa, que retienen a los microorganismos.
o Se emplean principalmente para eliminación de bacterias de los sueros
líquidos asépticos, extractos de tejidos y soluciones de hidratos de
carbono.
o No se aconseja esterilizar líquidos turbios ó viscosos.
o Para la presente práctica el alumno usará una membrana de celulosa
de 0,22 micrones de porosidad.
Radiaciones ultravioleta:
o Estas ejercen efectos letales y mutagénicos en las bacterias,
presentando su mayor efectividad como agente bactericida alrededor
de 2600 Armstrong de longitud de onda de la región espectral. o Se
puede esterilizar cajas petri no autoclavables por espacio de 15 minutos.
o Cabe aclarar que este método presenta dificultades técnicas.
o Evite que el operador ó alumno se exponga a la radiación.

METODOS QUIMICOS
Para la esterilización de un ambiente cerrado use formol con una exposición de
un día (Hágalo en ausencia del personal).
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El formol también puede ser usado para esterilizar material contaminado,
contenidos en recipientes no autoclavables.
Las soluciones en base a cloro también pueden ser usados con el mismo
propósito que el anterior caso.
También la solución de fenol al 5 % puede ser usado como agente bactericida
para limpiar superficies como mesones de trabajo.
Llenar en el siguiente cuadro lo que se efectuó en la práctica.

MÉTODO DE TIEMPO Y/O TIPO DE EFECTO SOBRE LOS

ESTERILIZACIÓN TEMPERATURA MATERIAL MICROORGANISMOS
DE
EXPOSICIÓN

Autoclave
Aire caliente
Flama directa
Ebullición
Pasteurización

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-

200 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

No se aplica

7. CUESTIONARIO.-

1. Indique como se puede verificar si el material de trabajo, como también los

medios de cultivo están realmente estériles.

2. Investigue en que consiste la tindalización.

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3. El metanol también es un químico que se usa para la esterilización
especialmente de material de acero inoxidable para uso de campo.
Averigüé el proceso y las condiciones de esterilización.

4. Que diferencias existen entre los términos bactericida, y bacteriostático.

Que diferencias existen entre: estéril, desinfectado y aséptico
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Práctica No. 8
MEDIOS DE CULTIVO Y ALMACENAJE

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

Los métodos de laboratorio directos, como la microscopia, proporcionan

información preliminar acerca de las bacterias involucradas en una infección, si
bien por lo común se requiere crecimiento bacteriano para la identificación y
caracterización definitivas.
En el laboratorio los nutrientes e incorporan dentro de los medios de cultivo en el
que desarrollan las bacterias. Si un medio de cultivo cubre los requerimientos de
una célula bacteriana, ésta se multiplicará en cantidades suficientes para permitir
la visualización a simple vista. De hecho, el desarrollo bacteriano después de la
siembra también requiere que los medios sean dispuestos en condiciones
ambientales óptimas.
Ya que algunas bacterias patógenas tienen necesidades nutricionales diferentes,
se desarrollaron diversos tipos de medios de cultivo para su uso en el diagnostico
microbiológico. En el caso de ciertas bacterias las necesidades son relativamente
complejas y para su desarrollo deben utilizarse componentes excepcionales en
los medios. Las bacterias con este tipo de requerimientos se denominan bacterias
exigentes (con requerimientos especiales de cultivo fastidios). A su vez, las
necesidades nutricionales de la mayoría de las bacterias importantes en clínica
son relativamente básicas y sencillas. Estas bacterias son consideradas no
exigentes
FASES DE LOS MEDIOS DE CRECIMIENTO
Los medios de crecimiento son utilizados en dos fases: liquida (caldo) o sólida
(agar). En algunos casos se utiliza un medio bifásico que contiene una fase
líquida y otra sólida.
En los medios líquidos los nutrientes se disuelven en agua y el crecimiento
bacteriano se manifiesta con un cambio en el aspecto del caldo, de límpido a
turbio. La turbidez del caldo se debe a la deflexión de la luz por las bacterias
presentes en los cultivos. Cuanto mayor es el crecimiento bacteriano, mayor es
la turbidez.
Los medios sólidos se elaboran agregando un agente solidificante a los nutrientes
y al agua. La azarosa, el agente solidificante más común, tiene la propiedad
singular de fundirse a temperaturas elevadas (mayores a 95ºC) pero sólo se
vuelve a solidificar después que su temperatura disminuye por debajo de 50ºC.
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Los medios se clasifican de acuerdo con su función y uso. En el diagnostico
bacteriológico hay cuatro categorías generales de medios: enriquecimiento,
apoyo, selectivo y diferencial.
Clasificación de los Medios de Cultivo
a. Medios Enriquecidos: Favorece el crecimiento de un determinado tipo
de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del
resto
Agar Sangre (AS): Permite el crecimiento de Gram (+) y (-) y permite
observar el tipo de hemólisis. Sirve para: Estreptococos, Estafilococos,
Haemophillus influenzae, Gardnerellavaginalis.
Agar Chocolate (AC): Este medio es más rico en nutrientes que el
anterior y resulta adecuado para el cultivo de organismos delicados,
por ejemplo Estreptococos.
Müller Hinton (MH): Es utilizado para antibiogramas porque desarrollan
tanto Gram (+) como (-).
b. Medios Selectivos: Permiten el crecimiento de un determinado tipo de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás
MacConkey (Mac): Útil para Enterobacterias
Medio de Cisteína y Lactosa deficiente en electrolitos (CLDE):
Azul de Metileno (AME): Los tres son selectivos para
Enterobacterias, contienen lactosa y un indicador, por lo tanto
permiten la diferenciación entre gérmenes que fermentan y que no
fermentan la lactosa, una reacción importante para la identificación de
las Enterobacterias.
Salmonella- Shigella (S-S): Para desarrollo de Salmonella o Shigella.
Thayer Martin (TM): Para desarrollo de Neisseria gonorrhoeae y
Neisseria meningitidis.
Agar sangre con Violeta Cristal: Sirve para la diferenciación de
Estreptococos cuando en la muestra pueden existir otros gérmenes.
c. Medios Para Microorganismos Anaerobios:
Caldo de Tioglicolato:
Caldo para Anaerobios delicados (CAD): Ambos medios contienen
agentes reductores que ayudan a mantener el estado anaerobio sirve
para Clostridium.
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d. Medios Especiales: Son aquellos en los que se ponen de relieve
propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee.
Sabouraud (Sap): Este medio tiene pH bajo que facilita el desarrollo de
hongos e inhibe el desarrollo de la mayoría de las bacterias.
Lowenstein Jensen y Middlebrook: Ambos medios contienen
glicerol y verde malaquita constituyentes que favorecen el crecimiento
de la Micobacterias como el Mycobacterium tuberculosis.
Agar con Tiosulfito, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS):
Para desarrollo de Vibrio cholerae.
e. Medios de Identificación y/o Pruebas Bioquímicas:
Kligler o TSI (agar triple, azúcar, hierro): Sirve para observar la
fermentación de azúcares y producción de ácido sulfhídrico.
Urea: Para observar la utilización de urea.
Citrato: Para ver la utilización de citrato.
Indol: Para observar el uso de triptófano.
Fenilalanina: Para ver la utilización de fenilalanina.
f. Medios de Transporte:
Stuart: Para transportar las muestras hasta el laboratorio.

2. COMPETENCIAS.-

➢ Aplica la metodología para el crecimiento y aislamiento de todas las

bacterias presentes en una muestra
➢ Prepara adecuadamente medios de cultivo artificiales, a través de la
resolución de problemas

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 AGAR NUTRIENTE 15 gr
2 AGAR EMB 15 gr
3 AGAR MAC CONKEY 15 gr
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4 AGAR TSI 5 gr
AGAR CITRATO DE
5 SIMMONS 5 gr
6 MEDIO SIM 5 gr
TUBOS CON TAPA ROSCA
7 DE 15mL 20 PIEZAS
8 PIPETAS DE 10mL 5 PIEZAS
9 GRADILLA 3 PIEZAS
10 CAJAS PETRI DE VIDRIO 20 PIEZAS
FRASCOS SCOTT DE 250
11 mL 5 PIEZAS
12 PROBETAS DE 100mL 5 PIEZAS
13 BALANZA 1 PIEZA
14 ESPÁTULAS GRANDES 5 PIEZAS
15 HORNILLA 1 PIEZA
16 AUTOCLAVE 1 EQUIPO

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-

Casi todos los medios están disponibles en el comercio, listos para usar
en placas de agar o en tubos con caldo. Si no se adquieren en el comercio, el
personal de laboratorio puede preparar los medios sólidos y líquidos
utilizando polvos deshidratados que se reconstituyen con agua
(destilada o desionizada) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

1. Para preparar medios de cultivo sólidos utilizar Erlenmeyer

en los cuales solamente se ocupe hasta 2/3 del volumen del envase.

2. Disolver una cantidad especificada del medio en polvo, que

habitualmente contiene todos los componentes necesarios, en agua
destilada, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

3. Llevar a ebullición para disolver el polvo, pero deben

seguirse exactamente las instrucciones específicas del
fabricante impresas en los prospectos de los envases.

4. Enfriar el medio de cultivo hasta por lo menos 45ºC y medir el pH del medio
de cultivo.
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5. La mayoría de los medios requiere esterilización. El tiempo de
esterilización en la autoclave debe comenzar cuando la temperatura
alcanza los 121ºC y por lo común requiere un mínimo de 15 minutos.

6. Una vez completado el ciclo de esterilización, el agar fundido se deja

enfriar a cerca de 50ºC antes de distribuirse en las placas Petri individuales
(por lo común 25 mL de agar fundido por placa)
7. Si se intenta agregar otros ingredientes (p. ej., suplementos como sangre
de carnero o vitaminas específicas, nutrientes o antibióticos) deben
incorporase cuando el agar fundido se enfrió, justo antes de distribuirlo en
placas.

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA.-

400 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

Registro de la composición de los medios de cultivo empleados en la

práctica.

7. CUESTIONARIO.-
1. ¿Cuáles son las características de los medios de cultivo diferenciales?

2. ¿Cuáles son las características nutricionales que todo medio de cultivo

debe tener?

3. Por qué se coloca solamente hasta 2/3 partes de los envases en los
cuales se esterilizara los medios de cultivo?

4. ¿Cómo verificamos que hemos realizado una adecuada esterilización del

medio de cultivo?
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Práctica No. 9
TIPOS DE SIEMBRA

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

El proceso de cultivos bacterianos implica el uso de medios artificiales y

condiciones de incubación óptimas, para aislar e identificar las etiologías
bacterianas de una infección con tanta rapidez y precisión como fuere posible.
Se entiende por siembra, la operación que consiste en “colocar” a los
microorganismos en un medio adecuado, el cual permite que se desarrollen y
reproduzcan. Esta operación se realiza teniendo en cuenta el tipo de medio y tipo
de siembra que se debe efectuar.
PRECAUCIONES PARA REALIZAR SIEMBRAS BACTERIANAS

1. Efectuar la siembra en ambientes cerrados, evitar corrientes de aire.

2. Trabajar cerca de la llama del mechero.

3. Evitar hablar.

4. Esterilizar a la llama el asa antes y después de realizada la siembra; el

flameado debe hacerse también en la parte del mango cerca al hilo.

5. Flamear la boca de los tubos antes y después de realizada la siembra.

6. Marcar convenientemente los tubos y placas a sembrar.
Existen diferentes tipos de siembras, entre los que se tienen:

- Siembra en profundidad.
- Siembra en superficie.
- Siembra en picada.
- Siembra por emulsión.
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Agar inclinado Pruebas

En tubo
Pico de flauta bioquímicas

En superficie
Barrido con hisopo Antibiograma
Agotamiento por Recuento de
En placa
estrías colonias
Siembra con pipeta Aislamiento

Puncion o Pruebas
En tubo
Picadura bioquímicas
En
profundidad
Recuento de
En placa Siembra con pipeta
colonias

2. COMPETENCIAS.-

✓ Realiza diferentes siembras, según el caso requerido a través de la

resolución de problemas que se presentan en el campo de trabajo del
profesional
✓ Evalúa las siembras realizadas

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 ASAS DE PLATINO 5 PIEZAS
2 MECHERO BUNSEN 4 PIEZAS
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PREPARADAS
EN LA
PRÁCTICA
3 PLACAS DE AGAR NUTRITIVO 10 PLACAS ANTERIOR
PREPARADAS
EN AL
PRÁCTICA
4 PLACAS DE AGAR MACCONKEY 10 PLACAS ANETRIOR
PREPARADAS
EN AL
PRÁCTICA
5 PLACAS DE EMB 10 PLACAS ANETRIOR

3. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
Siembra en profundidad
- Pipetear la muestra (diferentes diluciones), en una caja petri.
- Echar el agar de 10-15 ml, el cual debe estar a una temperatura
entre 40 a 45ºC.

- Mezclar en la forma de un número ocho y circunferencialmente por

lo menos 20 veces.

- Dejar solidificar e incubar. Siembra en superficie

- Con la ayuda del asa de platino, previamente esterilizada, transferir

un poco de la muestra al agar sólido (lugar de descarga).

- Realizar los diferentes tipos de estriaciones, ya sea para un

reaislamiento o para un recuento, de acuerdo a las instrucciones
del profesor.

- Llevar a incubar.
En caso de que la muestra sea liquida:
- Colocar 0,1 ml de la muestra sobre el agar o de las diferentes
diluciones.
- Extender la muestra, con la ayuda de una espátula Drigalski
previamente esterilizada en los sentidos de los radios de una
bicicleta.

- Dejar un momento la placa en reposo y luego llevarlos a incubar.

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Siembra en picada

- Esterilizar la aguja de bacteriológica.

- Tomar los tubos, tanto el de la muestra como aquel en el que se
realizará la siembra.

- Destapar y flamear las bocas.

- Recoger la muestra con la aguja y pasarla al medio estéril en línea
recta hasta el fondo, sin tocar las paredes del tubo.

- Desde el fondo trazar una línea continua hasta que se termine el

medio de cultivo.

- Flamear las bocas nuevamente, cerrar e incubar.

Siembra por emulsión

- Con el asa de platino estéril, tomar la muestra de una colonia

aislada.
- Transferirla al tubo con medio líquido en línea recta sin tocar las
paredes.
- Depositar la descarga en la pared del tubo.
- Emulsionar la muestra, rimero con una pequeña gota del medio,
luego con más cantidad hasta que ya no queden vestigios de la
muestra.

- Homogenizar e incubar.

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA.-

400 minutos

6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

No se aplica
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7. CUESTIONARIO.-

1. Indique tres razones principales por las cuáles se deben tomar

precauciones en la siembra de microorganismos.

2. Diferenciar :
-siembra de aislamiento, siembra de re-aislamiento, y siembra de recuento
total de microorganismos.

3. Qué características deben tomarse en cuenta para determinar si sus

aislamientos han sido efectivos?.

4. En el caldo lactosado y caldo verde bilis brillante, como se evidencia el

crecimiento bacteriano.
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Práctica No. 10
RECUENTO DE MICROORGANISMOS
DILUCIONES SERIADAS

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.-

Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy
elevado de microorganismos, por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos.
Para ello se realizan diluciones seriadas, que posteriormente se siembran en
placas con medio de cultivo.
Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos
viables en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para
multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. Debemos tener en cuenta
que las condiciones concretas del ensayo pueden limitar la capacidad de
reproducción de algunas de la células viables de la muestra inicial. Es
fundamental procurar que la viabilidad inicial no se vea afectada por el
procedimiento experimental, intentando mantener los microorganismos en las
mismas condiciones ambientales a las que están adaptados. Por tanto, si
trabajamos con una muestra clínica, las diluciones debemos realizarlas en
solución salina, pero, si el recuento lo realizamos a partir de una muestra de agua
corriente, sería más apropiado diluir los microorganismos en agua con un pH
neutro o solución fosfato salina . También es muy importante no aumentar la
carga microbiana inicial, por lo que todas las manipulaciones se realizarán en
condiciones de esterilidad. Aun así, es fundamental recordar que solo vamos a
cuantificar los microorganismos que se multipliquen en las condiciones concretas
del experimento (Temperatura, solvente de las diluciones, medio de cultivo,
atmosfera, etc.).
A diferencia de la técnica de turbidimetría que nos informa sobre todos los
microorganismos presente en la muestra, esta técnica determina sólo
microorganismos viables, aunque proporciona más información ([Link]., el aspecto
de las colonias) y la posibilidad de ampliar el estudio de las colonias hasta su
completa identificación.
La siembra en placa puede ser de dos tipos. Las primera, para aerobios, consiste
en extender por la superficie de la placa previamente solidificada un volumen
conocido procedente de una dilución. La otra técnica consiste en mezclar una
cantidad conocida de una dilución con el medio de cultivo fundido y atemperado,
y posteriormente verterlo en una placa de Petri y dejarlo enfriar. El método de la
extensión en superficie tiene la ventaja adicional de permitir tomar las colonias
para su resiembra en otro medio o para su identificación posterior.
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2. COMPETENCIAS.-
➢ Aplica los métodos de siembra, en placa puede ser de dos tipos a
través de la resolución de problemas
➢ Realiza las diluciones más apropiadas de la muestra dependiendo del
tipo de muestra problema.
➢ Calcula el número de UFC/ ml de muestra problema a partir del
recuento de colonias de las placas

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 TUBOS CON TAPA ROSCA 20 PIEZAS
2 PIPETAS GRADUADAS DE 1 mL 10 PIEZAS
3 ALCOHOL AL 96% 100 mL
4 CAJAS PETRI 20 CAJAS
5 PAPEL ALUMINIO 1 ROLLO
6 FRASCO SCOTT DE 250 mL 3 PIEZAS
7 PEPTONA 5 gr
8 BALANZA DE 400 gr 2 PIEZAS
9 PROBETA DE 100mL 2 PIEZAS
10 FRASCO DE VIDRIO DE 500mL 2 PIEZAS
11 AUTOCLAVE 1 EQUIPO
AGAR PARA REUENTO EN
12 PLACA 10 gr
13 ESTUFA DE CULTIVO 1 EQUIPO
MICROPIPETA AUTOMÁTICA DE
14 100 A 1000 µL 2 PIEZAS

4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
1. Tomar 1 ml de la muestra de agua problema con una pipeta estéril y
añadirlo a uno de los tubos con 9 mL de solución salina estéril. Es muy
importante que los volúmenes sean lo más exactos posible.

2. Agitar el tubo para homogenizar totalmente la suspensión. De esta forma,

hemos conseguido diluir la muestra inicial 10 veces (dilución 10 -1).

3. Repetir la misma operación a partir de esta primera dilución para conseguir

la dilución 10-2, y así sucesivamente. Según la carga microbiana que
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sospechamos que exista en la muestra problema debemos hacer distinto
número de diluciones.

4. Sembrar al menos dos placas de AN con 0,1 ml de cada una de las tres
últimas diluciones realizadas. Este inóculo debe extenderse de forma
homogénea por toda la superficie de la placa para lo cual utilizaremos el
asa de drigalski impregnándola en alcohol y pasándola por la llama del
mechero.

5. Incubar las placas a 37 ª durante 24 horas.

6. Contar las colonias de las placas que presentan un número entre 30 y 300
colonias. Un número menor de 30 colonias por placa puede suponer la
presencia de errores debido a fluctuaciones estadísticas. Por otro lado, un
número mayor de 300 puede ser excesivo para poder contarlas
exactamente.

7. Calcular con estos datos el número de UFC iniciales. Por ejemplo, si en

la placa correspondiente a la dilución 10-3 hemos contado 200 colonias y
23, colonias en la dilución 10-6 UFC/ mL

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-

400 minutos
6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

Registro de datos de la practica en una hoja de resultados

7. CUESTIONARIO.-
1. Se obtendría el mismo resultado si cuantificáramos las bacterias de
una muestra por turbidimetria o por diluciones seriadas?

2. Aplicando la técnica que se ha descrito en esta práctica, se

sembraron 2 placas de medio de cultivo a partir de las diluciones 10 -4
y 10-5. Tras incubación de las placas a 37 ºC durante 24 horas, no
aparición ninguna colonia ¿Cómo se puede explicar este resultado?.
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LABORATO4RIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL
PRACTICA Nº 11
METODO DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO
1. CONOCIMIENTO TEÓRICO REQUERIDO.-

El diagnostico bacteriológico es muy importante dentro de la práctica de la materia de

microbiología general, es importante encontrar el agente etiológico de ciertas
patologías, desde hace mucho tiempo atrás los investigadores empezaron a
encontrar a contribuir con sus conocimientos empleando cada uno de ellos un método
para llegar al diagnóstico bacteriológico.
El hallazgo microbiológico de un agente etiológico se basa en los siguientes pasos
Características morfológicas de los microorganismos
Características del crecimiento y desarrollo del germen
Características fisiologicas del microorganismo
2. COMPETENCIA(S)
➢ Aplica las técnicas adecuadas para la recolección de una muestra de orina.
➢ Realiza el cultivo de la muestra de orina aplicando las técnicas adecuadas
➢ Identifica las características de crecimiento de microorganismos aislado
➢ Aplica las pruebas de identificación de la bacteria aislada
➢ Interpretados resultados de las pruebas bioquímicas de identificación de la bacteria
aislada
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 AGAR EMB 10 gr
2 AGAR DE CLED 10 gr
3 AGAR KLIGER 10 gr
4 AGAR DE CTRATO DE SIMMONS 10 gr
5 AGAR TSI 10 gr
6 MEDIO SIM 5 gr
7 MEDIO MR-VR 5 gr
8 PORTAOBEJTOS 10 PIEZAS
9 CAJAS PETRI 20 PIEZAS
10 ASAS BACTERIOLÓGICAS 3 PIEZAS
11 MICROSCOPIO 6 PIEZAS
12 COLORANTES DE GRAM 1 KIT
13 FRASCOS SCOTT DE 250 mL 6 PIEZAS
14 AUTOCLAVE 1 EQUIPO
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LABORATO4RIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL
15 ESPÁTULA 2 PIEZAS
16 BALANZA 1 PIEZA
17 PROBETA DE 100mL 2 PIEZAS
18 HORNILLA 1 PIEZA
19 PICETA DE AGUA 2 PIEZAS
20 PAPEL ALUMNIO 1 ROLLO
21 TUBOS DE TAPA ROSCA 30 PIEZAS
22 AGUJA BACTERIOLÓGICA 5 PIEZAS

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Recolección de una muestra de orina

• Siembra de la muestra de orina en un medio de cultivo
• Identificación de microorganismo
• Realización de la serie bioquímica para la identificación de la bacteria aislada
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA
400 minutos
6. MEDICION; CALCULOS Y GRAFICOS
El estudiante realizara la lectura de la serie bioquímica
7. CUESTIONARIO.-
Que significa bacteriuria significativa
Porque que se utiliza un asa calibrada para realizar un urocultivo
Porque que son importantes las medidas de asepsia en la recogida de la muestra.
Por que debe procesarse lo antes posible
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PRÁCTICA Nº 12
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
(Antibiograma)
1. CONOCIMIENTO TEÓRICO REQUERIDO.-

Una vez aisladas las bacterias en cultivo puro es posible determinar su sensibilidad o
resistencia a los antibióticos en el laboratorio.
El antibiograma es el conjunto de procedimientos que nos permite determinar la
sensibilidad o la resistencia bacteriana in vitro ante determinados quimioterapicos y/o
antibióticos.
Eso se suele hacer exponiendo una cepa de los organismos sometidos a prueba,
sembrados en una placa de agar, a los antibióticos contenidos en discos de papel de
filtro. Durante la incubación por 18 a 24 horas, los organismos crecen y se multiplican,
y los antibióticos difunden desde los discos e inhiben el crecimiento alrededor del
disco
Esta prueba está basada en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en la
superficie de un medio de cultivo inoculado alrededor de un disco de papel de filtro
impregnado con un agente antimicrobiano. El germen aislado se siembra en un medio
de cultivo cuya composición asegura el desarrollo óptimo del microorganismo y no
interfiere con la acción del antibiótico, se pone en contacto con discos de papel de
filtro impregnados con agentes antimicrobianos en concentraciones ya establecidas
y se miden los diámetros de las zonas de inhibición del desarrollo del microorganismo.
Los tamaños de las zonas se comparan con las tablas de referencia llamadas CLSI
(clinical and laboratory standards institute actualizado), y los resultados se registran
como: S (susceptible o sensible), I (intermedio) o R (resistente).
2. COMPETENCIA (S)
✓ Interpreta y analiza la repuesta de los microorganismos a los antimicrobianos a través
de la resolución de problemas en relación con su contexto.
✓ Determina la importancia del antibiograma en el análisis microbiológico y su aplicación
en el tratamiento.
✓ Selecciona en antibiótico más adecuado de acuerdo con los resultados de un
antibiograma, a través de la resolución de problemas en relación con su contexto.
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LABORATO4RIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
1 PLACAS PETRI 10 CAJAS
2 FRASCOS SCOTT DE 250mL 2 PIEZAS
3 ESPÁTULA 2 PIEZAS
4 HORNILLA 1 PIEZA
5 BALANZA 2 PIEZAS
6 AUTOCLAVE 1 EQUIPO
7 PROBETA DE 100mL 1 PIEZA
8 AGAR MULLER HINGTON 15 gr
DISCOS PARA
ANTIBIOGRAMA DE
9 GENTAMICINA 10 DISCOS
10 CIPROFLOCXINA 10 DISCOS
SULFAMETOXAZOL
11 TRIMETOPRIMA 1’ DISCOS
12 NITRIFURANTOÍNA 10 DISCOS
131 TETRACICLINA 10 DISCOS
4 ÁCIDO NALIDÍXICO 10 DISCOS
15 ERITROMICINA 10 DISCOS
16 CEFALEXIMA 10 DISCOS
17 VANCOMICINA 5 DISCOS
18 CLORANFENICOL 5 DISCOS
19 CEFRIAXONA 5 DISCOS
AMOXICILINA/AC.
20 NALIDÍXICO 5 DISCOS
21 CEFOXITINA 5 DISCOS
22 ESTUFA DE CULTVO 1 EQUIPO
MICROPIPETA DE 100 A
23 1000µL 2 PIEZAS
SOLUCIÓN FISIOLÓGICA
24 ESTÉRIL 100 mL
TUBO D ETAPA ROSCA DE 10
25 mL 8 PIEZAS
26 ASA BACTERIOLÓGICAS 3 PIEZAS
PINZA ANATÓMICA DIENTE
27 DE RATÓN 3 PIEZAS
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28 HISOPOS ESTÉRILES 10 PIEZAS
4. TECNICA O PROCEDIMIENTO
Preparación del inóculo:
La cepa se obtiene de la placa original donde se sembró el material problema.
La colonia aislada se suspende en solución fisiológica de manera de obtener
una turbiedad final equivalente al 0,5 de la escala de Mac Farland, es decir, 150
millones de gérmenes por ml
Preparación de la placa:
Antes de la siembra la placa deberá estar a temperatura ambiente.
Siembra en placa:
Por escobilladura: Se distribuye el material uniformemente en tres direcciones,
con hisopo de algodón previamente mojado en el inóculo y eliminado el exceso
de caldo por presión contra las paredes del tubo.
Aplicación de los Discos:
Se los coloca sobre la superficie, oprimiéndolos suavemente contra ella. La
distancia que separe los discos debe ser suficiente para impedir una
superposición de los halos de inhibición, y nunca será inferior a 1,5 cm del borde
de la placa.
Incubación:
Debe ser de 18 a 24 horas a 37 C, colocada la cápsula en posición invertida.
Dependiendo del tipo de bacteria identificada.
Lectura e Interpretación de los Resultados:
Con una regla se miden los halos de inhibición al milímetro más cercano,
recurriéndose luego a la tabla correspondiente para determinar si el germen es
sensible, resistente o intermedio para cada antibiótico. Así cepa sensible es
aquella que, después de ser tratada en el curso de una infección general a las
dosis habituales del antibiótico, responde favorablemente al tratamiento, cepa
intermedia es la que en las mismas condiciones necesita dosis superiores a las
habituales para obtener una respuesta terapéutica adecuada y cepa resistente
es la que en las condiciones antedichas no se obtiene ninguna respuesta
terapéutica.

5. . TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA

200 minutos
6. MEDICION, CALCULOS Y GRAFICOS
Medición de los halos de inhibición y comparación con tablas de referencia
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7. CUESTIONARIO.-
Interprete los resultados de los siguientes antibiogramas comparándolos con la tabla
que aparece al final e indique el tratamiento antimicrobiano adecuado:
1. Paciente femenino de 24 años, se solicita urocultivo el cual reporta crecimiento de
Escherichia coli, el antibiograma:
• Trimetoprim y Sulfametoxazol: Resistente
• Ceftriaxona: Sensible
• Ampicilina: Resistente
• Gentamicina: Sensible
• Acido Nalidixico: Sensible
• Amikacina: Sensible
• Nitrofurantoína: Sensible
¿Que antibiótico elige? Debe justificar su elección ( vía de administración, costo,
toxicidad, etc)