La tinción de Gram
Se utiliza en microbiología desde finales del siglo XIX. Es una técnica muy sencilla que
se basa en el uso de un colorante (tinción) y que tiene una gran utilidad en medicina.
Principio o fundamentación química
La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las bacterias para
observarlas mejor bajo el microscopio. Según la distribución del peptidoglicano de la
pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto gram
positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto
formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para
solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que
en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no
se decoloran, mientras que los gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Resultado:
Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
bacterias grampositivas a las que se visualizan de color morado, tienen una pared celular
mucho más gruesa, formada por un gran número de capas de peptidoglicanos entre las
que se inserta la tinción Gram; y bacterias gramnegativas a las que se visualizan de color
rosado y rojo que están formadas por una pared más fina formada por menos capas de
peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al
microscopio aparecen incoloras.
La gran aportación práctica de la tinción de Gram es que permite determinar el tipo
de antibiótico así como su eficacia. El antibiótico de elección ha de ser capaz de atravesar
la pared bacteriana, en función de si la bacteriana es gram positiva o negativa se
seleccionará el antibiótico más eficaz.
Procedimiento
1. Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.
2. Hacer el extendido con un palillo de madera.
3. Dejar secar a temperatura ambiente y fijarlas utilizando un mechero.
4. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces
aproximadamente).
5. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
6. Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
7. Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
8. Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración
del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram +
no)
9. Enjuagar con agua.
10. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto.
Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
11. Lavar levemente con agua.
Ilustración
Una tinción de Gram en la que se observa un mezclado de Staphylococcus aureus (coco
gram positivo) y Escherichia coli (bacilo gramnegativo).
