- 200 años de independencia”

“Año del Bicentenario del Perú:

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÈ FAUSTINO

SÀNCHEZ CARRIÒN
FACULTAD DE BROMATOLOGIA Y NUTRICIÒN

ESCUELA PROFESIONAL DE BROMATOLOGIA Y NUTRICIÒN

TINCION DE ESPORAS

 CURSO : Microbiología General

 DOCENTE : Palacios Rodríguez Betty Martha

 ALUMNOS : Bazan Fonseca, Gabriela Alejandra

Martin Chumpitaz, Jordan Isaías
Norabuena Flores, Edith María

HUACHO - PERÙ
2021
 I. INTRODUCCIÒN

Antecedentes: Las llamadas tinciones especiales son aquellas que se utilizan

para teñir y aislar partes específicas de algunos microorganismos, tales como,
endosporas (esporas) y flagelos. Además, son usadas para detectar la presencia de
cápsulas (Tortora, Funke, & Case, 2007).

Justificación: Algunas estructuras como las esporas, cápsulas bacterianas o

flagelos no se logran teñir con las técnicas habituales de tinción, es por esto que se
hace uso de tinciones especiales.

Algunos microorganismos contienen una cubierta gelatinosa denominada cápsula.

La tinción de esta estructura es más difícil que otros tipos de tinciones ya que los
materiales capsulares son hidrosolubles, es decir, que se puede perder con un
lavado riguroso. Por este motivo se usa una solución con suspensión coloidal fina
de partículas coloreadas (como nigrosina) para otorgar un fondo de contrastes y
luego teñirlas con colorantes simples (como safranina).

Las endosporas (esporas) son estructuras especiales y resistentes que se forman

dentro de una célula, estas no se tiñen con los métodos comunes porque los
colorantes que se usan no pueden atravesar sus paredes. Es por esto que se usa la
tinción Schaeffer Fulton para endosporas (Tortora, Funke, & Case, 2007).

II. OBJETIVO

 Poder observar las esporas y su disposición en las formas vegetativas.

 Comparar las distintas morfologías y disposiciones que adoptan las endosporas en las
especies empleadas.
 III. FUNDAMENTO TEORICO

ESPORAS

Algunas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva de resistencia,
denominada endospora o espora. Se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas (por
eso la denominación de endospora) de los géneros Bacillus y Clostridum entre otros. Estas
estructuras son resistentes a situaciones vitales estresantes como el calor, la desecación, la
radiación ultravioleta, los ácidos y los desinfectantes químicos. Debido a su resistencia y al
hecho de que varias especies de bacterias formadoras de esporas son agentes patógenos
peligrosos, las esporas tienen gran importancia en microbiología alimentaria, industrial y
médica. El conocimiento de estas formas altamente resistentes al calor (pueden sobrevivir a la
cocción durante una o más horas) fue esencial para el desarrollo de métodos adecuados de
esterilización para medicamentos, alimentos, medios de cultivo microbiológicos, etc. En el
ambiente las endosporas permiten la supervivencia de las bacterias cuando la humedad o los
nutrientes son escasos. (Pirez y Mota, 1990, p.40)

Se pueden observar con el microscopio óptico y electrónico. Como las esporas son
impermeables a la mayoría de los colorantes, se observan como áreas incoloras dentro de las
células coloreadas. (Pirez y Mota, 1990, p.40)

Existen además coloraciones especiales para teñir los esporos. La situación de la espora en la
célula madre o esporangio, es característica para una especie bacteriana determinada, siendo
esto importante para la identificación de la bacteria. Las esporas pueden estar.-

En el centro de la bacteria denominándola (C. perfringens),

Próxima a un extremo o subterminal (C. botulinum)
En el extremo, terminales (C. tetani).
A veces la espora es tan grande que deforma el esporangio (C. botulinum).

Las esporas bacterianas son estructuras celulares procariotas de resistencia producidas por las
bacterias para soportar y sobrevivir en condiciones medioambientales desfavorables. Una vez
que las condiciones medioambientales son favorables, estas dan origen a un nuevo individuo.
(Parada, 2020).

CARACTERISTICAS DE LAS ESPORAS BACTERIANAS

Resistencia: Las esporas bacterias son estructuras sumamente resistentes, diseñadas

para soportar distintos tipos de “estrés” medioambiental como las altas temperaturas, la
deshidratación, la radiación solar o la presencia de diferentes compuestos químicos.
(Parada, 2020).

Capas: Típicamente las esporas bacterianas están envueltas por 6 capas diferentes;
aunque estas pueden variar según sea la especie de bacteria. Estas 6 capas son:

 Exosporio (en algunas especies esta capa no se encuentra presente)

 Capa exterior de la espora
 Capa interior de la espora
 Córtex
  Pared celular de la célula germinal
 Membrana plasmática de la célula germinal

Componentes: En el interior de cada espora bacteriana se encuentran todos los

componentes esenciales para formar un individuo similar (si no idéntico) al que le dio
origen. Entre dichos elementos destacan:

 ARN de distintos tipos, esencial para el establecimiento de la nueva célula

bacteriana. Algunos de estos son el ARN ribosomal, los ARN de transferencia, los
ARN mensajeros, entre otros.
 ADN genómico, con la información genética para “determinar” todas las estructuras
y funciones de la célula. Las esporas también pueden tener ADN plasmídico, que es
ADN extracromosómico.
 Moléculas de calcio, manganeso, fósforo y otros iones y cofactores para el correcto
funcionamiento de las enzimas, así como para el mantenimiento de la homeostasis
celular del futuro individuo. (Parada, 2020).

Reproducción asexual: Las esporas son consideradas una forma de reproducción

asexual, ya que muchas veces las condiciones se tornan desfavorables por un
crecimiento excesivo de la población y las bacterias que perciben el estímulo de la
escasez de recursos comienzan la esporulación. Es importante entender que todas las
esporas bacterianas dan origen a individuos genéticamente idénticos a aquel que les dio
origen, por lo que considerarlas una forma de reproducción asexual es perfectamente
válido. (Parada, 2020).

Esporas de Bacillus anthracis, causante de la enfermedad ántrax. (Parada,

2020).

ESTRUCTURA

Protoplasto: En la parte más interna de las esporas bacterianas se encuentra el

protoplasto, también conocido como el “núcleo de la espora” o la “célula germinal”. La
estructura externa de la espora está diseñada con la función primordial de proteger al
protoplasto, en el cual se encuentra el citoplasma, las moléculas de ADN y ARN, las
proteínas, las enzimas, los cofactores, los iones, los azúcares, etc., que son necesarios
para el mantenimiento metabólico de la bacteria. (Parada, 2020).

Membrana celular: La primera capa que rodea al protoplasto es la membrana celular,

compuesta por lípidos y proteínas. Tiene muchas estructuras especializadas en la
interacción con las cubiertas más externas, con el fin de percibir los estímulos del medio
ambiente recibidos por estas. (Parada, 2020).

Pared celular: Tanto la pared celular interna como la externa, que son las capas que
preceden a la membrana celular, tienen la estructura típica de la pared celular de las
bacterias: se componen principalmente del heteropolisacárido llamado peptidoglicano
(N-acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico). (Parada, 2020).

Córtex: Cubriendo las paredes que recién mencionamos se encuentra el córtex, que se
compone de grandes cadenas de peptidoglicano (con una proporción de entre el 45 y 60
% de residuos de ácido murámico). Sobre el córtex están la capa interna y externa de las
esporas bacterianas, compuestas por proteínas con funciones especializadas para
desactivar enzimas y agentes químicos tóxicos que pudiesen dañar a la espora. Dos de
las enzimas más abundantes en esta capa son la superóxido dismutasa y la catalasa.
(Parada, 2020).

Exosporio: El exosporio (que no es producido por todas las especies) está formado por
proteínas y glucoproteínas que bloquean el acceso de grandes proteínas como
anticuerpos, por ejemplo. Se cree que esta capa se encuentra en bacterias que dependen
de un carácter patogénico para sobrevivir. (Parada, 2020).

Esquema representativo de una espora bacteriana. Se muestran las

distintas “capas”: el exosporio, las cubiertas (túnica), el córtex, la pared de
la espora, la membrana, el citosol y el ADN. (Parada, 2020).
TINCIÒN DE ESPORAS

La tinción de esporas es la metodología usada para colorear las estructuras de resistencia que
forman algunos géneros bacterianos cuando se encuentran en condiciones desfavorables; estas
estructuras corresponden a una forma de supervivencia. (Gil, 2019).

Cada bacilo puede dar origen a una espora. Al momento de teñir la preparación, la espora se
puede encontrar dentro del bacilo (endospora) o fuera de este (exospora).

Debido a la composición de las esporas, éstas se tiñen con algunos colorantes. Las esporas, ya
sean exosporas o endosporas, son una forma de resistencia de los microorganismos. Los
géneros Clostridium y Bacillus son los más destacados entre las bacterias que producen estas
formas de resistencia. (Rodríguez, 2017). Con las técnicas de coloración convencionales para
bacterias: como la tinción de Gram las esporas quedan incoloras. En la actualidad se cuentan
con varias metodologías de coloración que son capaces de atravesar la gruesa estructura de la
espora para teñirla. Estas metodologías son muy variadas; entre estas se pueden mencionar la
técnica de Dorner, la tinción de Möeller y la metodología de Shaeffer–Fulton, también conocida
como Wirtz-Conklin. (Gil, 2019). La espora es una estructura deshidratada que contiene un 15
% de calcio y ácido dipicolínico. Por ello, la mayoría de las técnicas de coloración de esporas se
basan en la aplicación de calor para que el colorante pueda penetrar la gruesa estructura. (Gil,
2019).

TECNICAS DE COLORACIÒN DE ESPORAS

Para realizar la tinción de esporas se debe tener un cultivo puro de la cepa sospechosa que se
quiere estudiar. El cultivo se somete a temperaturas extremas durante 24 horas para estimular al
microorganismo a esporular. Para ello se puede colocar el cultivo en una estufa a 44 °C o en
nevera (8 °C) durante 24 o 48 horas.

Si se deja demasiado tiempo a las temperaturas mencionadas, solo se observarán exosporas,

pues ya todas las endosporas habrán salido del bacilo. Culminado el tiempo se deben colocar
unas gotas de solución fisiológica estéril sobre un portaobjeto limpio. Luego se toma una
pequeña porción del cultivo y se realiza un extendido fino. Posteriormente se deja secar, se fija
al calor y se tiñe con alguna de las técnicas que se explican a continuación.-

 TÈCNICA WIRTZ – CONKLIN

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio óptico como estructuras refringentes. No son fáciles de teñir debido a sus múltiples
cubiertas impermeables, motivo por el que la coloración se fuerza con calor y poniendo papel de
filtro con colorante. Se utiliza safranina como contraste para poder visualizar mejor el
microorganismo y sus esporas. (Rodríguez, 2017). La envuelta de la endospora es más compleja
e impermeable que la envuelta de las células vegetativas en las que se forma. Solo se puede teñir
el contenido de la espora alterando su envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta
que las endosporas se decoloren una vez teñidas.
La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo
harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

IV. PRODECIMIENTO

 Técnica de Dorner:

1. Preparar en un tubo de ensayo una suspensión concentrada del microorganismo

esporulado en agua destilada y agregar un volumen igual de fucsina fenicada de

Kinyoun filtrada.

2. Colocar el tubo en un baño con agua en ebullición durante entre 5 y 10 minutos.

3. Sobre un portaobjetos limpio mezclar una gota de la suspensión anterior con una gota

de solución acuosa de nigrosina al 10 %, hervida y filtrada.

4. Extender y secar rápidamente con calor suave.

5. Examinar con objetivo de 100X (inmersión).

Las esporas se tiñen de color rojo y las células bacterianas aparecen casi incoloras contra un

fondo gris oscuro.

 Técnica de Dorner modificada

1. Se hace un extendido de una suspensión del microorganismo esporulado en un

portaobjeto y se fija al calor.

2. La muestra se cubre con una tira de papel de filtro a la que se le agrega fucsina

fenicada. El colorante se calienta de 5 a 7 minutos con la llama del mechero de Bunsen

hasta que se genere el desprendimiento de vapores. Luego se retira el papel.

3. Se lava la preparación con agua y luego se seca con papel absorbente.

 4. Se cubre el frotis con una película delgada de nigrosina al 10 %, usando un segundo

portaobjeto para extender la nigrosina o una aguja. La coloración que toman las esporas

y las bacterias es igual a la descrita en la técnica anterior.

 Técnica de Möeller

1. Cubrir el frotis con cloroformo por 2 minutos.

2. Descartar el cloroformo.

3. Cubrir con ácido crómico al 5 % durante 5 minutos.

4. Lavar con agua destilada

5. Se cubre la lámina con carbol fucsina-fenicada y se expone a la llama del mechero de

Bunsen hasta la emisión de vapores; luego se retira de la llama unos instantes. Se repite

la operación hasta cumplir 10 minutos.

6. Lavar con agua.

7. Usar etanol acidificado (alcohol clorhídrico) para decolorar. Se deja durante 20 o 30

segundos.

8. Lavar con agua destilada.

9. Contrateñir cubriendo la lámina con azul de metileno por 5 minutos.

10. Lavar con agua destilada.

11. Se deja secar y se lleva la muestra al microscopio.

Las esporas se ven de color rojo y los bacilos azules. Es importante no aspirar los vapores, pues

son tóxicos y a largo plazo pueden ser cancerígenos.

 Técnica de Wirtz – Conklin o Shaeffer - fulton

Material
 Cubeta.
 Trípode.
 Barras de tinción.
 Mechero Bunssen.
 Pinzas metálicas.
 Pinzas de madera.
 Portaobjetos.
 Papel de filtro.
 Asa de siembra.
 Microscopio óptico.
  Placa de petri sembrada con microorganismo en agar sangre.
 Matraz aforado de 100 ml.
Reactivos
 Agua destilada.
 Safranina.
 Verde malaquita al 0.25% en solución hidroalcohólica. Es decir, 0.25 gramos de
malaquita disueltos en 10 ml de etanol de 96º, y enrasado hasta 100 ml en un matra con
agua destilada.
Técnica
1. Preparar el frotis bacteriano que se va a teñir.
2. Colocar un trozo de papel de filtro, del tamaño de la extensión, encima de ella.
3. Añadir el colorante verde malaquita para que cubra bien la extensión.
4. Pasar la preparación por encima de la llama del mechero bunssen para fijar el colorante,
durante cinco minutos.
5. Retirar el papel de filtro y lavar con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
6. Teñir la preparación con safranina, para el contraste, durante un minuto.
7. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
8. Secar la preparación al aire, o entre dos papeles de filtro, teniendo especial cuidado en
el segundo caso para no arrastrar la extensión.
9. Observar al microscopio óptico y anotar los resultados.

Resultados
Utilizamos un microorganismo adecuado para esta práctica, un bacilo del género Bacillus que
nos permitiese ver esporas.

Al microscopio pudimos observar tanto endosporas como exosporas. También pudimos apreciar
bien los microorganismos gracias al colorante de contraste. El dibujo es una representación
gráfica de un campo cualquiera del microscopio, donde se aprecian los bacilos, teñidos de color
rosado debido a la safranina, y sus esporas, teñidas de color azul oscuro o verde azulado debido
al verde malaquita.
Observaciones
 Un minuto de safranina resultó insuficiente y no se producía el contraste buscado.
Aumentamos el tiempo de tinción a tres minutos con mejores resultados.

 Por necesidad utilizamos agua desionizada en lugar de agua destilada.

Técnica por video:

Algunas bacterias realizan la esporulación como mecanismo de supervivencia, ya ue no son

fáciles de teñir, se exponen al calor de la tinción.

Materiales

o Verde de malaquita
o Safranina
o Agua destilada
o Portaobjetos
o Vaso de precipitado 500 ml
o Mechero Fisher
o Trípode
o Malla de asbesto
o Recipiente de residuos
o Cepa bacillus subtilis

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 1 gota de verde de malaquita.

2. Espera 3 minutos cuidando que no se seque el colorante, si sucede eso , solo se le
agrega más.

3. Se lava el exceso del colorante con agua destilada.

4. Luego cubrimos con una gota de safranina por 1 minuto

5. Retirar la safranina con agua destilada.

6. Lo dejamos secar.

7. Y por último lo llevamos a observar a inmersión al microscopio, y en la imagen se ve

que los bacillus subtilis son rojos y las esporas color verde.
 V. CONCLUSIONES

Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una estructura muy
pequeña, por medio de la tinción con verde de malaquita, el cual requirió
del calor para la penetración; se pudo observar la estructura interna de la célula
bacteriana, particularmente las endosporas. En este experimento se utilizó una
tinción simple debido a que la misma permite que se coloree toda la célula
excepto la espora que se observa de un tamaño bien aceptable

VI. BIBLIOGRAFIAS

- Francisco Rodríguez. (2017). Tinción de esporas mediante técnica de Wirtz.

https://www.franrzmn.com/tincion-de-esporas-mediante-tecnica-de-
wirtz/#:~:text=Preparar%20el%20frotis%20bacteriano%20que,que%20cubra%20bien%
20la%20extensi%C3%B3n.&text=Te%C3%B1ir%20la%20preparaci%C3%B3n%20co
n%20safranina,el%20contraste%2C%20durante%20un%20minuto
- M. Pirez, M.Mota. (1990). Morfologia y estructura bacteriana.
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- Parada Puig, Raquel (2020). Esporas bacterianas: características, estructura, formación.
https://www.lifeder.com/esporas-bacterianas/#
- Gil, Marielsa. (2019). Tincion de esporas: fundamento, técnicas y usos.
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- Yohn Jairo Guevara Bohórquez , Monografias.com. (2008, 17 abril). Tinción de
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bacteriana
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