“AÑO 

DE LA UNIVERSALIZACIÓN DE LA SALUD”

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SÁNCHEZ CARRION

FACULTAD DE BROMATOLOGÍA Y NUTRICIÓN

CURSO:
BIOQUÍMICA GENERAL
DOCENTE:
HONORIO DURAND, ZOILA F.
TEMA:
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL
CICLO:
III
ALUMNOS:
CHECA INTI, DIEGO
CHUMBES LUNA, ROGER JOSUE
DÍAZ GARCÍA, MIRIAM
FIGUEROA DÍAZ, CAROL
 I. INTRODUCCIÓN
La cromatografía se engloba dentro de las llamadas técnicas de separación y permite
el análisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente relacionados
químicamente. Son varias las modalidades usadas y se clasifican según la fase móvil
(de gases, líquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados. La
separación se lleva a cabo según la distinta interacción que presenta cada uno de los
componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra móvil que
fluye sobre ella. Esta interacción puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a
distintas subclases de cromatografía: de absorción, de reparto, de cambio iónico, de
afinidad, etc. En esta práctica, vamos a usar la más simple de ellas, la cromatografía
ascendente sobre papel. La fase estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una
mezcla de disolventes orgánicos y agua. La celulosa retiene una cierta cantidad de
agua entrelazada entre sus fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto de los
componentes de una muestra aplicados sobre ella cuando se hace fluir un disolvente
de polaridad distinta de la del agua. Según la solubilidad que tengan los
componentes de la muestra respecto de las dos fases así será su movilidad.
II. MARCO TEÓRICO
La separación de compuestos (de una muestra problema) por cromatografía es una
de las técnicas más recomendadas en los trabajos de bioquímica, la ventaja es que
los compuestos no sufren cambios en su estructura. Para obtener los resultados
deseados se recomienda la atención y cuidado cuando se preparan los materiales,
reactivos y la muestra. El fundamento de la técnica cromatografía se basa en la
separación de los compuestos (solutos) por la distribución física de ellos entre dos
sustancias conocidas como fases: estacionaria y móvil o dinámica. La fase
estacionaria puede ser un sólido o un líquido (o sorbente). El sorbenté tiene como
soporte a un sólido denominado matriz. Por otro lado, la fase móvil o estacionaria
puede ser líquida o gaseosa, esta fase es conocida como solvente o eluyente. Los
compuestos o solutos de una muestra problema que se encuentran disueltas en la
fase móvil van a separarse dependiendo de la naturaleza química, peso molecular,
polaridad que les da la fuerza de atracción de éstos por la fase estacionaria. Los
componentes fuertemente atraídos se mueven más lentamente, desplazándose los
demás compuestos de la muestra a medida que el disolvente se desplace por la fase
estacionaria. (Zoila, Honorio, 2021)
La cromatografía puede ser de las siguientes clases: Cromatografía de Adsorción,
Cromatografía de Intercambio Iónico, Cromatografía de Partición, Cromatografía en
Capa Fina y Cromatografía en Columna, Cromatografía de Alta Resolución,
Cromatografía de Gases, Cromatografía de Plasma. (Zoila, Honorio, 2021)
Como un resumen de las características de algunas clases de cromatografía
comentaremos que:
En la C. de Adsorción los compuestos son adsorbidos en la fase estacionaria
creándose un equilibrio entre los compuestos (que deseamos separar) unidos al
soporte y los otros que están libres en la solución. La unión va a depender de las
cargas, fuerza de Van der Waals, interacciones bipolares, enlaces de hidrógeno entre
los solutos y el soporte y por la estructura de los solutos. Esta clase de cromatografía
se recomienda para las sustancias que son muy solubles en solventes orgánicas y
poco solubles en agua. (Zoila, Honorio, 2021)
En la C. de Intercambio Iónico, las separaciones de los compuestos se hacen sobre
un soporte o matriz insoluble que contiene iones intercambiables con los iones del
medio que le rodea. Las sustancias que se desean separar deben de poseer cargas
iónicas opuestas a la del soporte para que se pueda adsorber por enlace
electrostático. (Zoila, Honorio, 2021)
El soporte o matriz son resinas especiales para el tipo de solutos que se quieren
separar (catiónicos o aniónicos), por ejemplo, las resinas de intercambio iónico son
ideales para separar a los aminoácidos los que son fácilmente ionizables por los
grupos químicos que poseen (-COOH, -OH, -NH2). (Zoila, Honorio, 2021)
La C. de I.I. se recomienda para las sustancias que son ionizables e hidrosolubles.
La C. de partición es útil para los compuestos que son muy solubles en solventes
orgánicos y poco solubles en agua. Por ello, el compuesto al distribuirse en los dos
solventes (agua y solvente orgánico) se van a encontrar equitativamente en ellos. La
razón de la concentración del compuesto en los dos solventes es constante y se
conoce como coeficiente de partición (alfa).
 = Concentración de X en Solvente 1
Concentración de X en Solvente 2
En la C.P, generalmente el solvente agua permanece en la fase estacionaria (puede
ser una columna o una película de material inerte). El solvente orgánico es la fase
móvil que va a estar saturado con agua. La sustancia o los solutos se van a
separar si el coeficiente de partición es diferente a 1. A esta clase de cromatografía
pertenece la Cromatografía en papel, la que será empleada en la presente práctica.
La Cromatografía en capa fina es muy semejante a la del papel, usa como soporte
sustancias como gel, sílica gel. Tiene ventajas sobre la C. de papel, una de ellas es
de que puede separar sustancias que se encuentren en bajas concentraciones, el
método es más rápido, se pueden usar materiales corrosivos, altas temperaturas, etc.
(Zoila, Honorio, 2021)
Reacciones coloreadas de aminoácidos Los métodos colorimétricos de
determinación de aminoácidos se basan en la reacción específica de éstos con
determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formación de color se
toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de
color es indicativo de que no está presente. Para cada prueba se utilizará un control
negativo, también denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá
a agua destilada (o solvente adecuado).
De todos los métodos el más general y utilizado es el de la reacción con la
ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos
que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y
anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina (Figura
1). La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de
ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración
azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta
(recordar que en la prolina el grupo amino está sustituido). El derivado coloreado
presenta máximo de absorción en torno a 570 nm. La reacción se lleva a cabo en
caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R-CH2-
NH2) dan también positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se
libera CO2. La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar
 concentraciones bajas de aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en
cromatogramas y fracciones procedentes de otras técnicas de separación.
Figura 1. Reacción de aminoácidos con la ninhidrina.

FUENTE. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR,

CAMPUS UNIVERSITARIO DE RABANALES, EDIFICIO SEVERO OCHOA,
14071-CÓRDOBA
III. OBJETIVOS
Identificar los aminoácidos presentes en alimentos
IV. MATERIALES Y REACTIVOS
 Cámara cromatográfica
 Estufa
 Pipetas Pasteur y/o capilares
 Papel filtro
 Pinzas
 Tijeras
 Regla y lápiz
Mezcla de aminoácidos Patrón
 Solvente:
 Butanol: Ácido acético: agua (4: 1:5)
 Revelador: Sol. de Ninhidrina 10% (pesar 0,3 g de ninhidrina y disolver en
95 ml de butanol y 5ml de ác. acético)
V. PROCEDIMIENTO:
  Cortar el papel Watman (usar la pinza para coger el papel) en forma de tiras.
 A una distancia de 1-2 cm del extremo inferior de la tira trazar una línea con el
lápiz.
 Sobre la línea (en el extremo izquierdo) sembrar con cuidado la mezcla de
aminoácidos usando para ello la pipeta Pasteur y/o el capilar, siguiendo las
instrucciones del Profesor.
 En el extremo derecho sobre la línea sembrar el patrón de aminoácidos.
 En el extremo izquierdo sembrar con cuidado la muestra problema
 Esperar que sequen. Colocar con mucho cuidado la tira de papel en la cámara de
vidrio que contiene los solventes (los cuales habrán sido colocados con
anticipación en la cámara, la que permanecerá cerrada a fin de que se sature).
 Dejar que los solventes asciendan hasta el extremo superior del papel.
 Sacar con cuidado el papel de la cámara y trazar una línea con lápiz que indique
el desplazamiento final del solvente (debe ser hasta unos 2 cm antes del extremo
final)
 Rociar el papel con el revelador (tener cuidado de no inhalar los vapores).
 Llevar a la estufa caliente para acelerar la reacción entre el revelador y los
aminoácidos.
 Las manchas y distancias iguales entre el patrón y lo que se revele en el
sembrado del lado izquierdo nos indicará los aminoácidos presentes en la
muestra.
VI. RESULTADOS E INTERPRETACION
La identificación del aminoácido se hace a través del valor del valor del Factor de
Retención (Rf) con lo reportado en la literatura con el sistema de disolventes y
soporte igual al que utilizamos.
 El valor Rf se calcula con la siguiente fórmula:
𝑹𝒇 = 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 muestra (sustancia)
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 solvente

Nota: Los dibujos fueron tomados del Manual de Prácticas del Laboratorio de
Bioquímica. Carrera de Médico Cirujano. Universidad Autónoma de México, 2013.
España
METODO RECOPILADO DE ARTICULO ANÁLISIS PROXIMAL, PERFIL
DE ÁCIDOS GRASOS, AMINOÁCIDOS ESENCIALES Y CONTENIDO DE
MINERALES EN DOCE ESPECIES DE PESCADO DE IMPORTANCIA
COMERCIAL EN VENEZUELA

Determinación del perfil de ácidos grasos

Un volumen de 1,5 ml del extracto lipídico evaporado al cual se le adicionó 0,5 ml de

hexano, fue derivatizado con 100 m l de hidróxido m-trifluoruro metil fenil trimetil
amonio (Meth Prep II Altechâ ), para la transmetilación de los ácidos grasos presentes
(22).

Los ácidos grasos fueron determinados en un Cromatógrafo de Gases Shimadzuâ GC-

14B, equipado con un inyector split/splitless, con una columna capilar de sílica fundida
Omegawax Supelcoâ 320 (30 m/0.25 mm id/0.25 m m) y un detecto de ionización a la
llama. El volumen de inyección fue de 1 m l, por duplicado. Las condiciones
cromatográficas fueron: temperatura del puesto de inyección 260ºC, temperatura del
detector 250ºC, temperatura inicial del horno 200ºC durante 4 minutos, aumentados
progresivamente hasta 240ºC (10ºC/min). Se utilizó el nitrógeno como gas transportador
a un flujo lineal de aproximadamente 25 cm/seg. Los tiempos de retención y áreas de
los picos se procesaron utilizando el software Shimadzuâ SMI Pack Class – VP. Para la
identificación de los ácidos grasos se compararon los tiempos de retención y áreas de las
muestras con la mezcla de estándares de referencia PUFA-1, Marine Source
Supelcoâ Cat. No. 4-7033, diluida en hexano, de concentración 50 mg/ml. Los ácidos
grasos se cuantificaron a través de una relación porcentual de las áreas de los picos con
el área total. Todos los reactivos utilizados en las extracciones fueron grado reactivo y
en la separación cromatográfica, grado HPLC. (Izquierdo Córser, Pedro, Torres Ferrari,
Gabriel, Barboza de Martínez, Yasmina, Márquez Salas, Enrique, & Allara Cagnasso,
María. 2000. Análisis proximal, perfil de ácidos grasos, aminoácidos esenciales y
contenido de minerales en doce especies de pescado de importancia comercial en
Venezuela.)

Determinación del perfil de aminoácidos

Las muestras fueron hidrolizadas a 110ºC durante 22 horas en ácido clorhídrico (HC1)
6N, neutralizadas y su pH ajustado a 2,2 con buffer citrato 0,02 N. Luego se aforó el
volumen a 100 ml con el mismo buffer; una alícuota de 10 ml fue filtrada a través de un
filtro Milliporeâ de 0,45 m m de poro. Los hidrolizados fueron derivatizados usando
ortoftalaldehido. Para el análisis de los aminoácidos se utilizó un Cromatógrafo Líquido
marca Shimadzuâ , integrado por dos bombas LC-6A, una columna Alltex Ultrasphere
 ODS de 12,5 cm y partículas de silica de 5 m m de diámetro, y un detector de
fluoriscencia FLC-6A. El flujo fue constante a 1 ml/min. Para la preparación de los
solventes, así como el gradiente se utilizó el método propuesto por Umagat y Kucera,
1982 (23) modificado por Torres y col, 1994 (24). La identificación y cuantificación de
los aminoácidos se realizó por comparación con los tiempos de retención del estándar
AA 18 Sigmaâ . (Izquierdo Córser, Pedro, Torres Ferrari, Gabriel, Barboza de Martínez,
Yasmina, Márquez Salas, Enrique, & Allara Cagnasso, María. 2000. Análisis proximal,
perfil de ácidos grasos, aminoácidos esenciales y contenido de minerales en doce
especies de pescado de importancia comercial en Venezuela.)

CONCLUSIONES

La cromatografía es uno principales métodos que nos ayudan para poder determinar la
composición del alimento, así como la determinación de aminoácidos y ácidos grasos, y
poder ver la importancia nutricional del alimento para ser administrado a personas con
deficiencia o alteraciones por aminoácidos. Es por ello que la cromatografía comprende
métodos los cuales nos ayudaran a la determinación compuestos. Siempre debemos de
tener una buena técnica y aplicación de la practica ya que este método cromatografía es
muy importante siempre teniendo las precauciones y higiene en nuestra área de análisis
para así evitar errores en nuestros resultados o accidentes en el laboratorio.

VII. BIBLIOGRAFIA:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/10%20CROMATOGRAFIA
%20PAPEL%20AAs.pdf
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA
%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
Izquierdo Córser, Pedro, Torres Ferrari, Gabriel, Barboza de Martínez, Yasmina, Márquez Salas,
Enrique, & Allara Cagnasso, María. (2000). Análisis proximal, perfil de ácidos grasos, aminoácidos
esenciales y contenido de minerales en doce especies de pescado de importancia comercial en
Venezuela. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 50(2), 187-194. Recuperado en 25 de enero de
2021, de http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-
06222000000200013&lng=es&tlng=pt.