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ESPECTROFOTOMETRIA
Yeison Sanchez1, Sebastián Vallejo2, Ana María Carabalí Banderas3
1
yeison.sanchez00@[Link]
2
sebastian.vallejo00@[Link]
3
ana.carabali04@[Link]
Grupo 1 – Bloque 3
Laboratorio de Bioquímica

RESUMEN
Durante la práctica se efectuó el espectro de absorción de luz visible de una sustancia
colorida donde se determinó la longitud de onda en su absorbancia máxima;
encontrándose para el azul de bromotimol en medio acido a 430nm; además se aplicó y
se utilizó la ley de Beer-Lambert, encontrando una relación lineal entre la Absorbancia y
concentración por medio de la regresión lineal, con un coeficiente correlación 0,9998. La
concentración hallada para la solución problema fue de 26 mg/L y con un porcentaje de
error del 4,0%.
Palabras claves: Espectrofotómetro, Absorbancia, longitud de onda, UV-visible, ley de
Beer-Lambert, concentración.
concentración.
1. INTRODUCCION
El espectrofotómetro es el instrumento más versátil del laboratorio puede utilizarse para
diferentes determinaciones analíticas. La espectrofotometría UV-visible es una técnica
analítica que se fundamenta en la absorción de estas radiaciones por parte de las
moléculas. Por ello el espectrofotómetro está constituido por un foco de radiación visible o
ultravioleta, que emite una radiación que atraviesa un selector, que permite escoger una
radiación de una longitud de onda (λ) concreta. [1]
Una gran variedad de biomoléculas adsorbe luz a longitudes de onda características, esta
propiedad de las biomoléculas es utilizada para la medición de absorción de la luz
mediante un espectrofotómetro para detectar e identificar moléculas y para medir
concentración en disolución. La fracción de la luz incidente absorbida por una disolución a
una longitud de onda determinada está relacionada con el espesor de la capa absorbente
(paso óptico) y con las concentraciones de la especie absorbente (como lo muestra la
Figura 1). Estas dos relaciones se combinan en la ley de Lambert-Beer. [2]
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Figura 1. Componentes principales de un espectrofotómetro

En donde I0 es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida, la
razón I/I0 (el inverso de la razón utilizada en la formula) es la transmitancia, Ɛ es el
coeficiente de absorción molar (en unidades de litros por mol-centímetro), c es la
concentración de la especie absorbente (en moles por litro) y l es paso óptico de la
muestra que absorbe la luz (en centímetros). [2]
Para el análisis cuantitativo se debe construir una curva de calibración con patrones de
concentración conocida, procurando siempre que la matriz sea igual o muy similar a la de
la muestra. Para la cuantificación la absorbancia de la muestra se debe interpolar en esta
reta de calibración con el fin de obtener la concentración de la muestra. [1]

El objetivo de esta práctica fue principalmente familiarizarse con el equipo y el uso del
espectrofotómetro UV-VIS. Para esto primero se determinó el espectro de máxima
absorción de una solución de azul bromotimol, realizando un barrido espectral desde
400nm a 700nm. Posteriormente se realizó la lectura de una curva de calibración, para
luego leer una muestra problema comprobando la relación entre absorbancia y la
concentración (Ley de Beer-Lambert) y aplicando dicha ley para la determinación de la
concentración de la
sustancia problema.

2. RESULTADOS Y DISCUSION
El espectro electromagnético, representa las regiones visibles y no visibles más
importantes de la distribución energética, al considerar la luz (fotón) de máxima
Absorbancia que las sustancias, donde cada fotón tiene una energía, que está dada por
E=hc/λ, donde “h” corresponde a la constante de Planck y “c” corresponde a la velocidad
de la luz, donde se observa que la energía es inversamente proporcional a la longitud de
onda (λ). [3].
Por lo tanto, en el caso del azul de bromotimol en medio acido, mostró una longitud de
onda muy pequeña 430 nm y una Absorbancia de color Violeta. Tal como lo muestra los
datos de la tabla 1.
Tabla 1. Datos de absorbancia azul bromotimol pH acido

longitud
(nm) 400 430 460 490 520 550 580 610 640 670 700
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Absorbancia
(A) 0,244 0,297 0,253 0,152 0,076 0,040 0,028 0,024 0,023 0,021 0,019

Si la longitud de onda es de 430nm para el azul de bromotimol pH acido quiere decir que
su color de absorción es violeta y el color que emite es el amarillo tal como lo muestra el
espectro electromagnético de la figura 2. [4].

Figura 2. Espectro electromagnético

Cuando una molécula absorbe ciertas longitudes de onda de luz visible y transmite o
refleja otras, la molécula tiene un color. Un cromóforo es una región molecular donde la
diferencia de energía entre dos orbitales atómicos cae dentro del rango del espectro
visible. El azul de bromotimol presenta una escala de indicación activa comprendida entre
un pH 6.0 y de 7.6. A un pH del medio menor a 6.5 manifiesta una coloración amarilla.
Cuando el pH del medio varía entre 6.5 y 7.6, adquiere una coloración verde. A pH
mayores a 7.6 su color es azul.
Esta característica le confiere gran utilidad a este indicador, ya que puede utilizarse en
una escala de pH cercano a la neutralidad; precisamente donde ocurren los procesos
fisiológicos. La ionización del azul de bromotimol en solución acuosa se representa en la
ecuación 1. [5].
HIn¿¿ (Ec. 1)

Cuando el indicador se encuentra protonado (HIn) adquiere una coloración amarilla;

mientras que el indicador desprotonado (In-) se torna de una coloración azul. Como
podemos observar en la ecuación 1, la estructura molecular si bien no cambia
radicalmente con pH ácido o básico, se altera su estado electrónico, reflejándose
mediante cambios de color de las soluciones. Esta propiedad que presenta el azul de
bromotimol hace que tenga aplicaciones no solo como un indicador adecuado para
determinaciones de ácidos y bases débiles, sino también en otros campos tales como:  la
fabricación de tintes y en estudios metabólicos. En la figura 3 se puede observar la
estructura del azul bromotimol a pH ácido y básico.
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Figura 3. Estructura del azul bromotimol a pH ácidos y básicos [6].

Como hemos mencionado, los átomos y las moléculas pueden absorber fotones, y por
consiguiente sus energías. Dependiendo de la energía del fotón absorbido o emitido,
diferentes fenómenos pueden ocurrir. Cuando un átomo absorbe un fotón UV o un fotón
de luz visible, la energía de ese fotón puede excitar uno de los electrones del átomo de tal
forma que alcance un nivel de energía mayor. Este movimiento del electrón, de un menor
nivel de energía a uno mayor, o de regreso de un nivel mayor de energía a uno menor, se
conoce como transición. Para que ocurra una transición, la energía del fotón absorbido
debe ser mayor o igual que la diferencia de energía entre los 2 niveles. Sin embargo, una
vez que el electrón es excitado y alcanza un mayor nivel de energía, está en una posición
más inestable que en la que estaba cuando se hallaba relajado en su estado base. Así, el
electrón rápidamente caerá al estado de menor energía y, al hacerlo, emitirá un fotón con
la misma energía que la diferencia entre los niveles energéticos. Tal como lo muestra la
figura 4. [7].

Figura 4. Energía entre los niveles energéticos

Con los datos de la tabla 1 es posible graficarlos, con el fin de observar cual fue la
longitud de onda de máxima absorbancia. Que para este caso la solución acuosa de azul
bromotimol a pH acido fue a 430nm. Tal como lo muestra la figura 5.
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0.350
0.297
0.300

0.250

Absorbancia (A) 0.200

0.150

0.100

0.050

0.000
400 450 500 550 600 650 700
longitud de Onda (nm)

Figura 5. Espectro absorción azul bromotimol a pH acido

La absorbancia (A) de una solución es directamente proporcional a su concentración (c), a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la
distancia que recorre la luz por la solución (l), a igual concentración, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción,
que es específica de cada cromóforo. Es entonces donde nace la ley de Beer-Lambert,
que como nos muestra la ecuación 2 relaciona cada uno de los términos anteriormente
mencionados. [8].

A=ε c l (Ec. 2)

La ley de Lambert-Beer permite la determinación de concentraciones de disoluciones

problema, a partir de una recta de calibrado obtenida midiendo las absorbancias de
disoluciones patrón de concentraciones conocidas. Para hacer las determinaciones
cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda correspondiente a un máximo, pues
el error de medición es mínimo y la sensibilidad máxima. [9].
Para esto en el laboratorio, a partir de una solución patrón de 100mg/L se tomaron
diferentes alícuotas para llegar a concentraciones conocidas, pero mas diluidas. En la
tabla 2 enseña la concentración de cada punto de la curva con respecto a la respuesta del
equipo de UV-Vis (absorbancia)
Tabla 2. Datos experimentales de la curva de calibración

Tubo numero 1 2 3 4 5 6 7 8
Solución de la
sustancia (mL) 0,3 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 0,0
Agua Destilada (mL) 9,8 9,5 9,0 8,5 8,0 7,0 6,0 10,0
0,45 0,58 0,86 1,14 -
Absorbancia (A) 0,118 0,173 0,311 1 7 7 6 0,002
Concentración 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 30,0 40,0 0,0
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(mg/L)

Con los datos experimentales de concentración y absorbancia es posible trazar la recta de

calibración que nos permitirá cuantificar. Tal como muestra la figura 6, podemos observar
que el coeficiente correlación está muy cercano a 1. Un R 2 igual o muy cercano a 1
significa un ajuste lineal perfecto. Este R 2 es el porcentaje de la variación en la variable de
respuesta que es explicado por un modelo lineal. Es decir: R 2 = Variación explicada /
variación total.
El R2 siempre está entre 0 y 100%: 0% indica que el modelo no explica ninguna porción
de la variabilidad de los datos de respuesta en torno a su media. Por otro lado, 100%
indica que el modelo explica toda la variabilidad de los datos de respuesta en torno a su
media. Para nuestro caso, el coeficiente de correlación cuadrado nos dio del 99.98%, un
valor muy cercano al 100%, indicándonos que los datos presentan una alta correlación
entre ellos.

1.2
f(x) = 0.03 x + 0.04
1 R² = 1

0.8
Absorbancia (A)

0.6

0.4

0.2

0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0
Concentracion (mg/L)

Figura 6. Curva de calibración de azul bromotimol a pH acido

Con la ecuación de la recta podemos despejar la x que en este caso es la concentración,
la ecuación se muestra en la ecuación 3.
y −0,039
x mg = (Ec. 3)
(
L
) 0,0276

El valor de y, sería la absorbancia determinada por el equipo de UV-vis para la muestra

problema. En este caso, la absorbancia de la muestra problema fue 0,756. Utilizando la
ecuación 3, se determina la concentración de la muestra problema.
0,756−0,039
x mg = =25,978 ≈ 26.0 mg/ L
(
L
) 0,0276
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De acuerdo a las indicaciones de la preparación de la muestra problema, está contenía 25

mg/L del azul bromotimol a pH acido. Con el valor teorico se puede determinar el
porcentaje de error mediante la siguiente ecuación:

|Valor Experimental−Valor Teorico|

%Error= ×100 (Ecu. 4)
Valor Teorico
Se obtiene entonces así un porcentaje de error de 4,0%. La principal fuente de error es el
tipo de material utilizado para la preparación de la muestra y curva de calibración. Se
debe manejar material volumétrico en pipetas, y la utilización de balones volumétricos
donde se puedan aforar el volumen final. Otra posible fuente de error, sería la calificación
del equipo. Todo equipo requiere una calificación operacional con la que se evalúa si el
equipo se encuentra apto para realizar una determinación correctamente.
Por ultimo hablaremos del equipo espectrofotómetro UV-Vis, este equipo se componen de
cinco elementos principales:

 Una fuente de radiación que suele ser una lámpara de filamento de wolframio
 Un monocromador que permite seleccionar una longitud de onda determinada
originando un haz monocromático.
 Un recipiente para contener la muestra denominado cubeta fabricado con un material
que permite el paso de la radiación en la región del espectro de interés. Suelen ser de
vidrio, plástico o cuarzo. El espesor de la cubeta más habitual es 1 cm.
 Un detector que convierte la energía radiante en una señal eléctrica.
 Por último, Una pantalla de visualización.
Este equipo es muy sencillo en su funcionamiento, el equipo es muy compacto y no ocupa
mucho espacio. Tal como lo muestra figura 7. [10].

Figura 7. Componentes del equipo espectrofotómetro UV-Vis.

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3. MATERIALES Y METODOS
Esta práctica se realizó basándose en la guía del laboratorio de Bioquímica General:
Espectrofotometría. [11]
Para la primera parte, se realizó la determinación de espectros de absorción para el azul
bromotimol a pH acido. Para esto se preparó un blanco y una solución acuosa de azul
bromotimol. El blanco consta de 10mL agua destilada en un tubo de ensayo con una gota
de ácido acético al 5%. Para la preparación de la muestra se toman 1mL de azul
bromotimol con 9mL agua destilada y 1 gota de ácido acético al 5%.
Para el acondicionamiento del equipo se realizó la lectura de un blanco al 100%
transmitancia. Posteriormente se realizó la lectura de la solución acuosa de bromotimol en
el rango visible (400nm a 700nm) con intervalos de 30nm y realizando el blanco antes de
cada lectura.
Para la segunda parte, se realizó la comprobación de la ley de Beer-Lamber. Para esto se
preparó una serie de estándares a concentraciones de 2.5, 5.0, 15.0, 20.0, 30.0 y 40.0
mg/L de azul bromotimol a pH acido. Utilizando la longitud de onda de máxima absorción
determinado en la primera parte (430nm) se procede a realizar lectura de cada uno de los
estándares para tomar el dato de la absorbancia. Por último, se realiza la lectura de una
muestra problema.
Para esta práctica se hizo uso de los siguientes materiales:

 Equipo UV-Vis
 Celda de 1cm
 Campana de extracción
 11 Tubos de ensayo con capacidad para 10mL
 Gradilla para tubos de ensayo
 Pipetas graduadas de 10mL y 2mL
 Auxiliar pipeteado
 Pipeta Pasteur o gotero
 Frasco Lavador

4. CONCLUSIONES
Un espectro de absorción es la luz absorbida en función de la longitud de onda, constituye
una verdadera señal de identidad de cada sustancia o molécula. Para el azul de
bromotimol a pH acido pudimos observar que la longitud de onda donde absorbía mayor
luz es a 430nm.
El quipo espectrofotómetro UV-Vis, es un equipo muy práctico y fácil de operar, su
funcionamiento se basa principalmente en la selección de una longitud de onda; en este
punto la luz monocromática emite luz y el monocromador selecciona esta longitud. Esta
luz pasa atreves de la celda que contienen la muestra; en este punto la muestra absorbe y
ocurren las transiciones de los electrones. Esta respuesta llega al detector y la transforma
una señal.
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El cromóforo (azul bromotimol) permite cambios de color en el rango visible, ideal como
indicador de soluciones acuosas entre otros usos. A pH ácido este permite percibir un
color amarillo, que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite; pero no el
que absorbe, el color que absorbe es el complementario del que transmite, que para este
caso es el color violeta.
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc).
Con experimento en el laboratorio donde se muestro cómo utilizar un espectrofotómetro
para llevar a cabo la determinación cuantitativa de un compuesto se adquirieron los
conocimientos básicos sobre espectrofotometría de absorción visible, incluyendo la Ley
de Lambert-Beer y sus aplicaciones en Química.
Con esta práctica aprendimos que el estudio a nivel bioquímico requiere también la
utilización de técnicas analíticas que permitan la determinación cualitativa y cuantitativa.
Uno de los métodos más sencillos y accesibles es la espectroscopia ultravioleta-visible.
Con esta técnica analítica se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y
en muestras biológicas, con el empleo de cambios en el pH o reactivos específicos que
reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite
detectarlo en muestras complejas.

REFERENCIAS
[1]. Nelson D, Lehninger A, Cox M. Lehninger principios de bioquímica. 5th ed. Barcelona:
Omega; 2009.
[2]. Castellanos I, Velandia J, Gonzales M, Varela D, Ramírez E. Aplicaciónes y
generalidades de un espectrofotómetro UV-VIS UV-1800 de Shimadzu. 5th ed. Colombia:
Ediciones EAN; 2018
[3]. Rami A. Rami Arieli: "The Laser Adventure" [Internet]. [Link]. 2020 [cited 13 March
2021]. Available from: [Link]
%20h%20*%20c%2Fl,a%20su%20longitud%20de%20onda%20.
[4]. Para ver la luz: Un repaso de la espectroscopia visible y ultravioleta visible de
Masterflex [Internet]. [Link]. 2019 [cited 16 March 2021]. Available from:
[Link]
[5]. Azul de bromotimol - EcuRed [Internet]. [Link]. 2021 [cited 17 March 2021].
Available from: [Link]
%20bromotimol%20en,pH%206.0%20y%20de%207.6.
[6]. López Pérez J. Microbiología de la producción de hidrógeno. un estudio sencillo en el
laboratorio de Educación Secundaria. Revista Eureka sobre enseñanza y divulgación de
las ciencias. 2011;8(2):201-204.
[7]. Espectroscopía: la interacción de la luz y la materia [Internet]. [Link]. 2021
[cited 19 March 2021]. Available from: [Link]
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chemistry/electronic-structure-of-atoms-ap/bohr-model-hydrogen-ap/a/spectroscopy-
interaction-of-light-and-matter
[8]. Fuentes i Arderiu X, Castiñeiras Lacambra M, Queraltó Compañó J. Bioquímica clínica
y patología molecular. 2nd ed. Barcelona: Reverté; 1998.
[9]. Qué es una curva de calibración. [Internet]. curiosoando. 2021 [cited 21 March 2021].
Available from: [Link]
%20curva%20de%20calibraci%C3%B3n%20es,determinada%20se%C3%B1al%20anal
%C3%ADtica%20(propiedad).
[10]. Harris, D. C. Análisis Químico Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed. Reverté, 2007.
[11]. Martinez C, Lizcano Y, Vera O. GUÍA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Cali; 2020.