FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE MEDICINA HUMANA
“EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN,
AMPLIFICACIÓN Y LECTURA DEL
ADN”
Asenjo Acuña, Danna; Bazán Cayetano, Jimmy; Burga Hinostroza,
Gianella; Cajachagua Cueva, Fatima
Docente
Armando Jesus Edilberto Velez Azañero
2019
Introducción
El estudio del ácido desoxirribonucleico (ADN) va a requerir tener conocimiento de la
naturaleza de los compuestos químicos que este presenta; tiene una estructura
químicamente compleja, la cual está conformada por: grupos fosfatos, pentosas y
bases nitrogenadas. Asimismo, está conformada por una doble hélice en forma de
escalera, donde se encuentran pares ordenados de adenina – timina y guanina-
(1)
citosina . De igual manera, está presente en células procariotas y eucariotas; es
importante ya que controla y participa en procesos vitales como: reproducción
(2)
celular, síntesis de proteínas y transmisión de caracteres hereditarios . En cuanto a
investigaciones relacionadas al ADN, con el paso de los años, se han desarrollado
nuevas técnicas tales como: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
(4)
electroforesis para poder identificar genes con mutaciones patológicas .
(5)
El ADN es reconocido como el director de la herencia , esta definición se dio a
partir de investigaciones de los doctores Alfred Hershey y Martha Chase; los cuales
demostraron, mediante un experimento sobre los bacteriófagos, que el ADN es el
agente activo de la duplicación de estos dentro de las bacterias; es decir, que los
genes del bacteriófago contienen ADN: y por lo tanto, el ADN es la verdadera
(2)
materia de la herencia . Es por este motivo, que se utiliza el método de PCR, el
cual se realiza mediante tres etapas, obteniendo un gran número de copias de un
(3)
fragmento del ADN mediante la amplificación ; y la electroforesis, definida como
una técnica que permite identificar un gen de interés a través de la separación de
fragmentos de ADN; todo esto con el fin de poder realizar investigaciones de genes
alterados (7).
El objetivo de la práctica fue realizar un proceso de electroforesis en una muestra de
ADN; por su importancia en los distintos ámbitos de la salud tales como la
determinación de patologías.
Materiales y métodos
Extracción y cuantificación de ADN
Se extrajo 20uL de ADN con la ayuda de una micropipeta, depositándolo en un tubo
eppendorf. Inmediatamente, se agregó 20uL de RNasa y 20uL de proteinasa K. Se
sometió la mezcla en el vórtex por 15 segundos y se incubó a temperatura ambiente
por 2 minutos. Luego, se añado 100uL de Buffer lisis a la mezcla para
posteriormente someterla al vórtex por 15 segundos. A continuación, se incubó la
muestra a 55 °C durante 10 min y se le añadió 100uL de etanol 96-100%. Se
procedió a mezclar en el vórtex por 15 segundos. Después de esto se procedió a
purificar la muestra colocando 260uL de esta en una columna de extracción. Se
introdujo la columna a la microcentrífuga por 1 min a 8500 rpm (Figura 1). Concluido
el tiempo se descartó el filtrado de la columna (Figura 2) y se le agregó a la muestra
200uL de Buffer de lavado para después centrifugarlo a 8500 rpm durante 1 minuto.
Se colocó la columna en un nuevo tubo de lavado y se le añadió 200uL de Buffer de
lavado para centrifugarlo 3 minutos a velocidad máxima. Nuevamente, se colocó la
columna en otro tubo de recolección. Seguidamente, se le agregó 100uL de Buffer
de elución a la columna y se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto.
Luego, se centrifugó a velocidad máxima durante 1 minuto y se almacenó el ADN
purificado a -80 °C. En cuanto a su cuantificación, se extrajo el ADN, se colocó en el
espectrofotómetro de acuerdo a las condiciones dictadas por el profesor y se anotó
los resultados.
Figura 1. Fotografía de la
microcentrifugadora a aproximadamente
8500 rpm.
Figura 2. Fotografía tomada de la
columna de extracción en el proceso de
purificación del ADN.
Amplificación de ADN mediante PCR
Siguiendo con la amplificación, en un tubo de PCR se colocó 25uL de solución de
reacción final (mix de PCR) (Tabla 1). Luego, se centrifugó brevemente y se colocó
el tubo en el termociclador (Figura 3), el cual debe estar programado con las
indicaciones del manual (Figura 4).
Tabla 1. Míx de PCR.
Figura 3. Termociclador donde se
sometió la muestra a temperatura
alta.
Figura 4. Condiciones a las que se sometió
la muestra del ADN.
Lectura de ADN mediante electroforesis
En un tubo ependorff se le agregó 1uL de Buffer de carga, 3uL de Bromuro de etidio
y 5uL de la muestra de ADN. Esto se realizó 2 veces y dejando las muestras de lado
se procedió a calentar, en el microondas, un beaker con agarosa obteniendo un
líquido homogéneo. Se echó la agarosa en un soporte de electroforesis y se colocó
el peine (Figura 6). Se dejó secar la agarosa y se retiró el peine. A continuación, se
vertió en la cámara de electroforesis Buffer TAE 1X y se colocó la agarosa con los
hundimientos creados por el peine hacia el lado negativo. Seguidamente, se echó
los 9 uL de cada muestra en esos hundimientos con extremo cuidado. Se dejó
reposar el sistema durante 30 minutos y se procedió con la lectura.
Figura 6. Proceso en el que se vertió la
agarosa en el soporte de electroforesis.
Resultados
Para nuestro experimento se utilizó un kit de extracción de sangre con el objeto de
obtener la muestra deseada. Asimismo, se usó proteinasas K y se obtuvo como
reacción la eliminación de proteínas, como las de la membrana del núcleo. De igual
manera, se utilizó el RNasa para destruir el ARN y buffer de lavado para la
purificación del ADN, el cual limpia y remueve grasas y proteínas de la muestra. En
cuanto al uso del buffer lisis, se obtuvo el resultado esperado que es la disgregación
de los fosfolípidos de las membranas y la disolución de otros componentes
celulares, como azúcares y grasas. Después se someter la muestra a una
temperatura de 55°C en el termociclador, la muestra cambió a un color más oscuro.
Asimismo, se vertió la muestra a una columna de extracción con la finalidad de
obtener una muestra pura, mediante el uso de etanol, que cumplió la función de
deshidratar la muestra, y del buffer de lavado. Este con ayuda de la microcentrifuga
en 8500 rpm descartó el filtrado y se obtuvo una muestra pura. Seguidamente Se
colocó parte de la muestra en el espectrofotómetro para la cuantificación obteniendo
como resultado 40.1 y se refrigero a unos -80ºC.
Seguidamente, se colocó él tuvo eppendorf con la muestra en el PCR para permitir
realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reacción en cadena de la
polimerasa de amplificación de ADN. (Figura 1)
Figura 1. PCR indicando los valores que representan los cambios de
temperatura para poder obtener su amplificación de un parte del ADN
Finalizando, se realizó la lectura del ADN en electroforesis. En la cual se obtuvo
como resultado que las muestras de ADN colocadas en los pocillos se movilizaron
por las condiciones del voltaje desde el lado negativo hacia el lado positivo
obteniendo una medida similar en pares de base. Sin embargo, en la banda 3 se
pudo notar mayor claridad, ya que en esta banda se encontraba una muestra con
mayor presencia de ADN (Figura 2).
Figura 2. Fotografía tomada a la cámara de electroforesis, en los
cuales por acción de un campo eléctrico, se pudo observar el peso
molecular y presencia del ADN.
Discusión
Al comparar nuestra muestra de ADN aislado con los diferentes grupos de
laboratorio, se pudo observar que era de un color más oscuro. Esto debido a que
después de realizar la extracción, purificación del ADN, y de someter la muestra a
centrifugación y un aumento de temperatura; se rompió la Hemoglobina (por acción
de la proteinasa K), la cual contiene iones de hierro y al oxidarse dio como resultado
una coloración más oscura. Asimismo, se observó al momento de cuantificar, que
las cantidades de nuestro grupo eran mayores (40.1 ug/mL) con respecto al grupo
liderado por la Srta. Ximena Barrutia (37.5 ug/mL). Esta variación se puede explicar
debido a que, aunque se extrajo el mismo volumen de sangre; y a pesar que hay un
determinado número de ADN por célula, no se pudo calcular cuántas células
estaban presentes en el volumen extraído, por lo que la cantidad de ADN podría
variar.
Otro punto de discusión en base al experimento realizado por Arnulfo Salas
(8)
Betancourt , es el uso de enzimas. En el proceso que él realizó el producto
filamentoso que obtuvo de la extracción no fue un ADN puro, ya que éste se
encontraba mezclado con fragmentos de ARN, debido a la ausencia de enzimas; a
diferencia de nuestro experimento, en el cual se obtuvo un ADN puro, gracias al uso
de la proteinasa K, RNasa, entre otras enzimas.
Por otra parte, coincidimos con el experimento realizado por Laura Espinoza Asuar
(4)
, en el cual las temperaturas y ciclos fueron similares, con una desnaturalización
inicial al 95°C, un alineamiento a 50°C y una extensión dada a 72°C. Esto debido a
que se necesitan temperaturas estándares para obtener un resultado óptimo, ya que
si la temperatura es muy baja se obtendría un PCR menos específico y, en el caso
de que sea muy alta, no se amplificaría correctamente. Igualmente, concordamos en
que el principal problema del PCR suele darse por la contaminación del ADN
mediante proteínas o alguna sustancia que inhibe la reacción, también está
involucrado en la discusión el uso de un kit comercial que esté diseñado
específicamente para el tipo de organismo con el cual se va a trabajar.
Sin embargo, la mayor diferencia encontrada fue el gel utilizado en la electroforesis,
(4)
ya que la Srta. Espinoza utilizó gel de poliacrilamida para calcular el peso
molecular de su respectiva muestra; a diferencia de nuestro experimento en el cual
utilizamos el gel de agarosa. Aunque ambos geles tengan el mismo objetivo, su uso
será determinado por el tamaño de los fragmentos que se manejen, ya que las
moléculas de acrilamida forman redes de poros más uniformes y pequeños; por lo
tanto, serán óptimos para lecturas donde se necesite alto poder de resolución.
Teniendo en cuenta que la producción de gel de acrilamida es laboriosa y compleja,
la mayoría de laboratoristas prefieren el uso del gel de agarosa.
Además, para una buena lectura del ADN, es necesario el correcto uso de la
micropipeta en la mezcla del buffer de carga, bromuro de etidio y ADN con el objeto
de lograr una mezcla homogénea. Igualmente, se requiere la micropipeta en el
proceso en el cual se vierte la mezcla en los pocillos del gel de agarosa. Ya que, en
este proceso, el docente encargado cometió el error de introducir la punta de la
micropipeta muy bruscamente en el gel de agarosa.
Finalmente, en nuestro experimento se requirió colocar el gel de agarosa con los
pocillos hacia el lado negativo del soporte de electroforesis, ya que el ADN posee
una carga negativa debido al grupo fosfato y debía colocarse de este modo con la
(3)
finalidad de lograr una migración hacia el lado positivo .
Conclusión
Se colige que el uso de enzimas influye directamente en todo el proceso realizado,
ya que sin éstas no se podría tener una adecuada lectura debido a la impureza de la
muestra principal.
Asimismo, gracias al PCR se logró entender los procesos de replicación del ADN,
los cuales se dividen en etapas: desnaturalización, alineación y extensión.
De igual manera, se demostró su utilidad para comparar patrones de bandas de
diferentes muestras biológicas las cuales se usan para la identificación de ácidos
nucleicos de agentes infecciosos involucrados en genes de interés; demostrando así
que estos estudios podrían influenciar a futuro las distintas terapias genéticas y
creación de fármacos aplicables en ámbitos de la medicina.
Sin embargo, existen muchas variables, las cuales no permiten un correcto resultado
de la lectura del ADN, provocado por distintos factores a lo largo de la realización del
experimento, por eso es importante tener un manejo adecuado de los implementos
del laboratorio y una correcta cuantificación y aplicación de las sustancias
involucradas en la práctica.
Bibliografía
1. Salas Betancourt C. Importancia y uso actual de las técnicas moleculares. s.f.
p.1.
2. De la Torre y Callejas, Salvador Luis. Manual básico de microtecnia
biológica. Edición Revolucionaria. Instituto Cubano del Libro. La Habana,
1975. pp. 140-143.
3. Héctor L.E. García Febus. Metabolismo celular. [internet]. Cuzco; BS BIOL
[citado el 22 de diciembre del 2016]. disponible en: [Link] ›
HectorLEOlivenciaBS › metabolismo-celular-703.
4. Robertis Eduardo, biología celular y molecular.3ra ed. Buenos Aires B.S.; el
alcineci -2004.
5. Antonio Leeuwenhoek. Biología Celular. [internet]. México. biblioteca de
investigaciones, [citado el 1 de diciembre del 2014]; disponible en:
[Link] › la-biologia-celular.
6. Harper H., Rodwell V. y Mayes P. Química Fisiológica. Decimoséptima
edición. México: El manual moderno; 1980.
7. Pfeiffer J. La célula. Sexta edición. México: Offset Multicolor; 1964.
8. Chavéz T. Biología. Octava edición. Perú: Cobra; 2001.
9. Espinoza Asuar L. Ecología Molecular. Primera edición. México:
Publicaciones IEPSA; 2007.
10. Berry A. y Dewey J. ADN: El secreto de la vida. Cuarta edición. Londres:
Taurus; 2003.
11. Dewey J. La doble hélice. Séptima edición. Londres: Simon & Schuster,
Weidenfeld & Nicolson; 1968
12. Fierro F. Electroforesis del ADN. México: Departamento de Biotecnología,
División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma
Metropolitana.
