Cinética enzimática de la fosfatasa ácida de germen de trigo
en la desfosforilación del p-nitrofenilfosfato
Mateo Pescador1 (1537964), Johanna A. Martinez2 (1539975), Lizeth Y. Buitrago3 (1670041),
Deiby Zambrano4 (1523498)
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4. [Link]@[Link]
Departamento de Química, Universidad del Valle, AA. 25360, Cali, Colombia
Fecha de entrega: 08/10/2020
Palabras claves: Michaelis-Menten, cinética enzimática, pH óptimo, temperatura óptima, inhibidores.
RESUMEN: Las fosfatasas ácidas son un grupo de enzimas que se caracterizan por su papel en la mineralización del fósforo orgánico
en sus formas inorgánicas disponibles, por lo que resulta bastante útil su estudio cinético para análisis de suelos y medios acuosos.
Mediante el programa KinetiscopeTM, se simuló la cinética enzimática de la desfosforilación del p-NFP catalizada por la fosfatasa
ácida de germen de trigo. Luego, se realizó el tratamiento de datos acorde al modelo de Michaelis-Menten, analizando el efecto de
diferentes factores. La variación de [S]0, permitió calcular las constantes cinéticas kM=418.11μM, Vmax=37.04μM/min y
kcat=3.09min-1; por su parte, el efecto de [E]0, exhibió un comportamiento lineal frente a la velocidad; luego, del efecto de inhibición
de los efectores se obtuvo kI=1.27x102 μM (competitivo) para fosfatos, 2.74 μM (acompetitivo) para molibdato y 48.0x10-2 μM
(acompetitivo) para vanadato. Finalmente, los valores de temperatura y pH óptimos fueron 50°C y 6.00 respectivamente.
Adicionalmente, se calculó la energía de activación, obteniendo 28.75 kJ/mol. Se observa un comportamiento cinético enzimático
aproximado al modelo Michaelis-Menten. Sin embargo, se obtuvieron porcentajes de error altos en las constantes cinéticas respecto a
valores teóricos y a los grupos 1 y 6 del laboratorio. Se concluye que los errores se deben a las condiciones del sistema real contra las
de la simulación, a las consideraciones estadísticas y la forma en que cada grupo realizó los cálculos.
MATERIALES Y MÉTODOS Donde v max = k cat [E]0 es la velocidad máxima
Mediante el programa KinetiscopeTM Versión 1.1.956.x64 correspondiente al valor asintótico de la curva, y kM es la
copyright © 2015-2020 Columbia Hill Technical Consulting[1], constante de Michaelis, definida como la concentración de
se simuló la cinética enzimática de la desfosforilación del sustrato cuando v0 es igual a la mitad de Vmax.[2] Se realizó el
p-nitrofenilfosfato (p- NFP) catalizada por la fosfatasa ácida de análisis de distintos efectos sobre la cinética enzimática de la
germen de trigo. Se estableció (cuando fue necesario), desfosforilación de la p- NFP.
condiciones de pH y temperaturas óptimas. Por último, para
los efectos de sustrato, molibdato y fosfato, se usó 1. Efecto de [S]0
[E]0=1.2x10-5, y para los efectos de fosfato y molibdato se usó
[efector]=5.0x10-6. Las demás condiciones se ajustaron según Cuando se analiza la concentración de un sustrato respecto a
lo indicado. la velocidad de una reacción catalizada por una enzima, se
cumple el modelo de Michaelis-Menten (Figura 1), donde la
RESULTADOS Y DISCUSIÓN velocidad aumenta con la concentración de sustrato hasta
Las reacciones catalizadas por enzimas se pueden describir, llegar a una velocidad máxima.[3]
como cualquier otra reacción química, mediante ecuaciones de
velocidad. El modelo de Michaelis-Menten describe la
cinética enzimática para la mayoría de estas reacciones, en él
se omite la etapa de disociación del complejo [EP], lo que
facilita la deducción de la ecuación de velocidad. Para el
análisis cinético, se suelen graficar curvas de velocidad inicial
en función de la concentración del sustrato.[2]
E + S ⇄ES → P + E Rxn 1. Etapas de reacción para la
cinética de Michaelis-Menten.
v max [S]
v0 = k m +[S]
Ec. 1. Ecuación de Figura 1. Gráfica de Michaelis-Menten sobre el efecto de la
Michaelis-Menten concentración del sustrato con la velocidad de reacción
enzimática.[4]
Una vez analizados los datos simulados para el efecto de la Figura 3. Linealización Lineweaver-Burk para el efecto del
concentración del sustrato, se observó que la gráfica obtenida sustrato p-NFP.
sigue el comportamiento del modelo de Michaelis-Menten
(Figura 2). De acuerdo a este modelo, en las reacciones Por otro lado, cuando toda la enzima se encuentra saturada,
catalizadas por enzimas, estas se pueden encontrar de manera es decir en forma de complejo ES, se observa la velocidad
libre o formando un complejo con el sustrato; así es como a máxima de la reacción y cualquier aumento adicional de [S]
una baja concentración de p-NFP (sustrato) se tendrá que una no tendrá efecto sobre esta; es decir que la velocidad total de
gran cantidad de fosfatasa ácida se encuentra libre. En este la reacción es Vmax y está determinada por la concentración de
punto, la velocidad es proporcional a la concentración de la enzima. De esta manera se calcula kcat obteniendo un valor
sustrato, pero al aumentar la concentración de sustrato, el de 3.09min-1 que comparado con el valor reportado en la
equilibrio de la reacción se desplaza a la formación del literatura (38.4min-1)[5] se halla un error del 92.0% indicando
complejo ES. [4] que en la simulación, por minuto, pocas cantidades de sustrato
fueron convertidas en producto.[5]
2. Efecto de [E]0
Al linealizar el tratamiento de datos por el método de
Linewaver-Burk, se determinó la concentración de enzima y la
actividad que está presente, logrando evidenciar cómo la
actividad enzimática se ve influenciada al variar la
concentración de enzima con la concentración la
concentración de sustrato constante. (Figura 4).
Figura 2. Comportamiento de Michaelis-Menten para la
concentración de p- NFP en función de la actividad enzimática
de la fosfatasa ácida.
Al realizar la linealización de Lineweaver-Burk (Figura 3)
que toma el recíproco de ambos lados de la ecuación de
Michaelis-Menten, es posible determinar a partir de la
ecuación de la recta los valores de kM y v max , siendo
4.18x102μM y 37.0μM/min respectivamente. En este caso se
eliminó un dato que a partir de la prueba de Grubbs fue
considerado atípico y se realizó la linealización con 7 puntos.
Sin embargo, respecto a los valores reportados en la
literatura,[5] se obtuvo unos porcentajes de error del 115% y
99.6% para kM y v max respectivamente; dichos errores se
pueden atribuir a las condiciones en las que se llevaron a cabo Figura 4. Linealización Lineweaver-Burk para el efecto de la
los experimentos y a las grandes fluctuaciones observadas en concentración de enzima sobre la actividad enzimática.
los gráficos de [S] vs t. Tampoco se tuvo en cuenta la
linealización de Eadie–Hofstee puesto que su R2= 0.7234. En general se observa un incremento en la velocidad de
reacción debido a un aumento de la concentración de enzima
para el germen de trigo, todo esto es debido al tener una
concentración mayor, el número de sitios activos se
intensifican, donde la enzima tiene una alta capacidad de
reaccionar con un número elevado de sustratos. Su linealidad
baja a tiempos más largos, esta caída se debe a la disminución
significativa de la concentración de sustrato, sin embargo
pueden influir otros factores como el aumento de la
concentración de producto, cambios de pH o la inactividad de
la enzima, entre otras.[6]
3. Efecto de la concentración de efectores
Un inhibidor enzimático es una molécula que se une a una
enzima y disminuye su actividad. Existen varios tipos de
inhibidores, entre ellos; Inhibidor competitivo, son aquellos Por último, el molibdato de amonio, en la literatura se
inhibidores que pueden unirse a la enzima y bloquear la unión reporta como un inhibidor de tipo no competitivo, donde no
de sustrato, esto ocurre debido a que el inhibidor tiene afinidad bloquea la unión del sustrato con el sitio activo, sino que se
por el sitio activo de la enzima, mientras que el inhibidor no une a otro sitio activo y evita que la enzima realice su función.
competitivo; son aquellos que se pueden unir al mismo tiempo Con el fin de analizar la actividad hidrolítica de la fosfatasa
que el sustrato. Sin embargo, esta unión del inhibidor afecta a ácida del germen de trigo, sobre el sustrato p-NFP, se
la unión del sustrato, y por último el inhibidor acompetitivo; establecieron condiciones óptimas de pH para la catálisis. La
es aquel que se une solo al complejo enzima-sustrato, no a la comparación del inhibidor se observa en la Figura 5, esto
enzima libre, este a su vez impide la acción catalítica. comprueba una diferencia según lo reportado en la literatura,
El vanadato de sodio es un inhibidor competitivo reversible obteniendo un inhibidor de forma acompetitiva, posiblemente
que compite con el sustrato p-NFP por el acceso al sitio activo se deba a los datos presentes en el simulador.
de la enzima fosfatasa ácida ya que tienen una estructura
similar. Este inhibidor de tipo reversible se une en forma débil Al realizar la linealización de Lineweaver-Burk como se
con la enzima siendo fácil de reemplazar. Al realizar las observa en la Figura 5, con una concentración de inhibidor
gráficas de [P] vs t para una concentración de sustrato de de 2.5 × 10−6 M , se logró calcular las constantes Vmax, kM y
5 × 10−6 M y 1 × 10−5 M y de inhibidor de 2.5 × 10−6 M se ki , obteniendo valores de 13.04 μM /min , 175.45 μM y 2.74
observó una fluctuación en la gráfica, esto se debe a que el μM , al comparar estos valores con los reportados en la
índice sustrato/inhibidor es muy pequeño y por tanto el efecto literatura se logra obtener un porcentaje de error del 78.84% y
del inhibidor se vuelve muy grande. Conforme se aumentó la 62.85% para Vmax y kM, sin embargo, no se determinó el
concentración de sustrato las gráficas se fueron linealizando porcentaje de error de ki debido a las condiciones de reacción
más; esto es porque el número de colisiones entre la enzima y que debió presentarse en la literatura, deberían ser iguales que
el inhibidor se vuelve pequeño en relación con las colisiones la simulación.
entre la enzima y sustrato y el efecto del inhibidor se vuelve Se utilizó la gráfica de linealización de Lineweaver- Burk y
mínimo.[7] no Eadie–Hofstee para el caso del vanadato, fosfato y el
Utilizando la gráfica de linealización observada en la Figura molibdato ya que la primera tiene un error estadístico
5, se calculó las constantes v max y kM siendo 1.36 μM /min y significativamente menor que la segunda siendo (R²=0.9515),
67.40 μM respectivamente. Al comparar estos valores con los (R2=0.8586), (R²=0.9959) y (R²=0.7675), (R2=0.9939),
obtenidos para el efecto de sustrato se determina que el tipo de (R²=0.7328) respectivamente. Al comparar con el grupo 1 y 6
inhibición es acompetitiva, lo cual es contradictorio con lo se encuentra que los valores de ki, son diferentes, esto se
reportado en la literatura.[8] Se calculó ki considerando al atribuye a los métodos de obtención de la constante y a los
inhibidor como competitivo y acompetitivo, encontrando en el valores empleados de kM para calcularla.[10]
primer caso un valor de -2.98 μM , siendo un valor negativo
que no tiene interpretabilidad. Por otra parte, al considerarlo
acompetitivo, se tiene un ki=0.48 μM . Estas variaciones con
respecto a lo reportado se pueden atribuir en parte a el error
estadístico de la simulación para obtener los datos. Además se
modificaron algunos valores de la absorbancia y el tiempo
para obtener las gráficas [P] vs t lo más lineal posible con el
fin de obtener valores de Vo correctos para cada concentración
de sustrato. Se determinó una kcat de 0.91 min-1 para el
inhibidor de vanadato.
Asimismo, para el fosfato se tiene que es un inhibidor
reversible de tipo competitivo pues gracias a su similitud
estructural con el p- NFP es posible que compita para fijarse en
el sitio activo de la fosfatasa ácida. Este inhibidor se une de
manera fuerte con la enzima e incluso con isoenzimas de la
fosfatasa ácida.[9] También presenta un comportamiento de Figura 5. Linealización Lineweaver- Burk para el efecto de
acuerdo al modelo de Michaelis-Menten en el análisis de Vo los inhibidores. La línea roja representa el comportamiento
vs [S] y en su linealización de acuerdo a Lineweaver-Burk sin efector, la azul el efecto de fosfatos, verde molibdato y la
(Figura 5) se observa que el valor de Vmax (39.1μM/min) es naranja del vanadato.
aproximadamente igual al de la enzima sin inhibir
(37.0μM/min), mientras que el KM (4.58x102μM) aumenta 4. Efecto de la temperatura
considerablemente respecto a la enzima sin inhibir
(4.18x102μM), mostrando así que el inhibidor fosfato es En general, las reacciones catalizadas por enzimas se
competitivo y los datos simulados concuerdan con lo aceleran cuando se aumenta la temperatura del sistema. Esto
esperado. También se determinaron los valores de KI= debido a que los sustratos colisionan con los sitios activos con
1.27x102 μM y Kcat = 7.81min-1 para el efecto del inhibidor mayor frecuencia por el aumento en su energía cinética. Sin
fosfato. embargo, este fenómeno se exhibe hasta cierto punto, por
encima de la temperatura óptima la velocidad de reacción
enzimática cae abruptamente. Esto se debe a que la vibración
y movimiento térmico de la enzima rompe los enlaces de
hidrógeno, interacciones iónicas y demás fuerzas débiles que
estabilizan la estructura activa de la molécula, lo que provoca
su desnaturalización y con ello la pérdida de su actividad
catalítica.[11]
La temperatura óptima de los datos simulados se observa en
el pico más alto de la curva de la Figura 6, el cual
corresponde a 50°C. Comparando con el valor teórico
(45°C)[12] se tiene un error del 10%. Esto se debe
principalmente al error estadístico de los datos simulados
(R2=0.9985 para ambos). Además, la diferencia entre la
velocidad a 45°C y a 50°C es de solo 7.8 × 10−3 μM /min , por
lo tanto, se debieron generar más puntos en dicho rango para
observar de manera más detallada el comportamiento de la
curva, ya que en esta zona la velocidad es más o menos
constante. Figura 7. Linealización de la ecuación de Arrhenius para la
cinética enzimática de la desfosforilación de la p- NFP.
5. Efecto del pH
El pH es un factor que influye en la cinética de la enzima;
cada enzima posee un pH y una temperatura óptima en el que
alcanza su mayor actividad catalítica. El pH óptimo de la
fosfatasa ácida varía dependiendo de la fuente de la enzima y
de las estructuras estereoquímicas o estereoisoméricas del
sustrato[5], encontrando en la literatura que el pH óptimo para
la fosfatasa ácida de germen de trigo está en el rango de 4-6.[8]
La dependencia de la velocidad del pH en la reacción
catalizada por la fosfatasa ácida se observa en la Figura 8.
Figura 6. Efecto de la temperatura sobre de cinética
enzimática de la desfosforilación de la p- NFP.
Por otra parte, la energía de activación para una cinética de
tipo Michaelis-Menten, corresponde a la diferencia energética
entre los reactivos y el complejo activado [ES]‡, esta barrera
se correlaciona con la constante de velocidad catalítica (k cat )
mediante la ecuación de Arrhenius, y corresponde a la etapa
de reacción [ES]→P+E.[12] Con los datos de temperatura y Figura 8. Efecto del pH sobre la cinética enzimática de la
velocidad, se calcula la energía de activación (Ea) mediante la desfosforilación de la p-NFP.
linealización de la ecuación de Arrhenius.
En la Figura 7 se observa el gráfico de ln(v 0 ) en función de Como se observa en la gráfica, a un pH alrededor de 6 la
1/T, de esta se extrae que la energía de activación es igual a velocidad de la reacción es mayor y disminuye en pH cercanos
28.75 kJ/mol, la cual, comparada con el valor teórico (36.10 a 8. Esto se debe a que los cambios del pH afectan las
kJ/mol)[5], tiene un error del 20.4%. El error puede atribuirse propiedades iónicas del sustrato, la enzima y la conformación
en parte al error estadístico (R²=0,9837), sin embargo, este no de la enzima.[7] La velocidad máxima a un pH de 6
es lo suficientemente grande como para representar un error corresponde al valor de Vo= 270.15 μM /min . El pH óptimo
tan alto. Cabe la posibilidad que la simulación realizada haya se obtuvo en el mismo valor comparado con el grupo 1, y con
sido para otro tipo de fosfatasa ácida distinta a la del germen el grupo 6 se obtuvo dentro del mismo rango reportado en la
de trigo. literatura.[8]
Finalmente se realizó la estadística de las constantes SUGERENCIAS
calculadas con las de los grupos 1 y 6 del curso de Realizar simulaciones de cinética enzimática de reacciones
Bioquímica. Para la mayoría de casos, la media se calculó con con sustratos múltiples, de este modo se podría analizar el
los datos que tuvieran una diferencia de menos del 100% entre comportamiento bajo distintas variaciones de los sustratos y su
sí. En los casos en que todos los datos difieren en más del cercanía con el modelo de Michaelis-Menten.[13] Sería también
100%, se consideró que tan diferentes eran. Los resultados se interesante realizar simulaciones de cinética de enzimas
muestran en la Tabla 1. alostéricas, la cual sería posible con modelos sencillos como
los expuestos por Néstor Torres y Guido Santos.[14]
Tabla 1. Estadística de las constantes cinéticas. Además se pueden explorar distintos simuladores, como
Constante Nuestro grupo 1 grupo 6 media Labster, que a pesar de ofrecer el software bajo membresía, es
grupo una excelente herramienta, con una interfaz que acerca más al
estudiante a una experiencia en el laboratorio. Dicha
k m [μM] 4.18x102 1.05x102 4.18x102 4.18x102 membresía podría ser adquirida por la universidad, tal como se
ha hecho con otros softwares.[15]
k cat [min-1] 3.09 20.0x10-2 30.9x102 1.65 BIBLIOGRAFÍA
[1] KINETISCOPE, a stochastic kinetics simulator.
v max 37.0 13.8 37.1 37.1 ©Columbia Hill Technical Consulting (2020) - Todos los
[μM/min] derechos reservados.
[Link]
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pH óptimo 6.00 6.00 5.00 5.67 [5] Tazisong, Irenus A., Zachary N. Senwo, and Zhongqi He.
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Ea 28.8 25.9 29.1 27.9 [7] Karp G. Biología celular y molecular. Conceptos y
[kJ/mol] experimentos. 4 Ed. McGraw-Hill. 2006. pp 111.[11]
Campbell, Neil A., and Jane B. Reece. Biología. Ed. Médica
En particular, se observaron grandes diferencias (más del Panamericana, 2007. pp 154.
100%) en las constantes de inhibición del molibdato y del [8] VanEtten, R. L.; Waymack, P. P.; Rehkop, D. M.
vanadato. Probablemente debido a las consideraciones Transition Metal Ion Inhibition of Enzyme-Catalyzed
estadísticas y la forma en que cada grupo realizó el cálculo. Phosphate Ester Displacement Reactions. J. Am. Chem. Soc.
1974, 96 (21), 6782–6785.
CONCLUSIONES [Link]
El programa KinetiscopeTM, permitió simular la cinética [9] Verjee, Z. H. M. Isolation of Three Acid Phosphatases
enzimática de fosfatasa ácida de germen de trigo en la from Wheat Germ. Eur. J. Biochem. 1969, 9 (3), 439–444.
desfosforilación del p-NFP. En la variación en sustrato se [10] Joshua, W., Michael P., Wheat Germ Acid Phosphatase
visualizó la curva de Michaelis-Menten, resaltando la región Catalyzed Hydrolysis of Para-Nitrophenyl Phosphate: Enzyme
asintótica (Vmax) y la concentración a la velocidad media Kinetics and Inhibition by Ammonium Molybdate.,
(Km), con valores de 37.0μM/min 4.18x102μM Departament of Chemistry, Bloomsburg University,
respectivamente. También se determinó el tipo de inhibición Bloomsburg.
para cada efector, siendo el vanadato y molibdato inhibidores [11] Verjee, Z. H. M. "Isolation of three acid phosphatases
acompetitivos, y el fosfato un inhibidor de tipo competitivo. from wheat germ." European J Biochem (1969).
Adicional, para la simulación se logró calcular la energía de [12] HORTON, H. Robert; GONZÁLEZ Y POZO, Virgilio.
activación (28.8kJ/mol) y la temperatura (50.0°C) y pH (6.00) OP CIT. pp 150.
óptimos para la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de [13] Torres, Néstor, and Guido Santos. "A simple simulator
trigo, siendo estos datos coincidentes con lo reportado en la to teach enzyme kinetics dynamics. Application in a
literatura y por los grupos 1 y 6. problem-solving exercise." Higher Education Pedagogies 2.1
(2017): 14-27.
[14] © 2020 Labster: Science Online (SO): Inspired.
[Link]
[15] Melo, Virginia, and Oscar Cuamatzi. Bioquímica de los
procesos metabólicos. Reverte, 2020. pp 110-112.
