República Bolivariana de Venezuela
Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”
Núcleo: Ezequiel Zamora
Áreas Ciencias Del Agro Y Del Mar
Programa: Ciencias Veterinarias
Semestre I
UNIDAD TEMATICA II
HISTOTECNIA
Profesor: MV. Characo Zulma Alumno: Hernández Pinto Danny Tomas
Cedula de identidad: 11.882.888
0426-9437110
17 de Octubre de 2020.
1
INDICE
PORTADA……………………………………………………….1
INDICE…………………………………………………………..2
INTRODUCCION……………………………………………….3
HISTOTECNIA…………………….…………………………...4
TERMINILOGIA BASICA.……………………………………4
COMPARACIÓN DE LOS DIFERENTES MÉTODOS…….5
DESCRIPCIÓN DE LAS ETAPAS……………………………6
DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS DE COLORACIÓN….8
BIBLIOGRAFIA………………………………………………..10
2
INTRODUCCIÓN
El objetivo de este documento es familiarizar al usuario con el mundo de la
HISTOTECNIA, la cual es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la
secuencia de manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los tejidos de
los seres vivos, donde se estudiara la preparación de tejidos para su observación
microscópica, en toda muestra obtenida de un individuo o animal sano con la finalidad
de investigar su estructura para lo cual comenzaremos haciendo un breve recorrido por
la Terminología básica del proceso histoctenico, las comparación de los diferentes
métodos empleados en el proceso histológico de los tejidos de los cuales se
mencionaran los directos e indirectos, se realizara un breve comentario de la
Clasificación de los tipos de inclusión para el estudio histológico en microscopio de luz,
entre otros puntos de interés para el alumno.
3
¿Qué Histotenia?
Es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la secuencia de manipulaciones
necesarias para llevar a cabo el análisis de los tejidos de los seres vivos, la reparación de
tejidos para su observación microscópica, en toda muestra obtenida de un individuo o
animal sano con la finalidad de investigar su estructura.
Terminología básica del proceso histoctenico.
El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. En el
caso de los tejidos vegetales directamente se toman muestras de los distintos órganos que
componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por
dos opciones: coger una porción del tejido u órgano y procesarla o procesar primero el
animal completo y luego extraer la muestra que nos interese. En cualquier caso las muestras
son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas denominadas fijadores, las cuales se
usan para mantener las estructuras celulares y moleculares inalterables durante el
procesamiento posterior y con una organización lo más parecida posible a como se
encontraban en la muestra viva. También podemos fijar las moléculas de los tejidos por
congelación rápida. Fijar un tejido es como hacer una fotografía de dicho tejido, su
estructura se mantendrá hasta su observación. La fijación por congelación se emplea
cuando la fijación química o los procesos histológicos posteriores alteran las características
de la muestra que queremos estudiar, por ejemplo una molécula sensible a dichos
tratamientos.
A) Fijación
En este paso el tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora, generalmente
líquida, para evitar los cambios post-mortem y para lograr conservar la forma
original del tejido. Unos de los fijadores más usado es el formol al 10%
(formaldehído).En el caso de que realicemos estudios mediante el microscopio
electrónico, deberemos usar otros fijadores más específicos como
paraformaldehido, glutaraldehido y tetróxido de osmio.
B) Deshidratación
La deshidratación se realiza empleando diferentes soluciones de alcohol a
concentraciones crecientes hasta llegar a alcohol puro. La técnica de la parafina,
para cortar fácilmente.
C) COLORACIÓN
El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o
tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia
colorante. Se considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al ser
lavada con el líquido que disuelve al colorante, no se decolora.
ACIDOFILIA
4
Propiedad que tienen algunas estructuras celulares y algunos tejidos para unirse
a colorantes de tipo ácido, como la eosina.
D) BASOFILIA
Es la capacidad de tinción de los colorantes básicos. FILIA / AFINIDAD
Mediante la fijación, se modifican las propiedades de las proteínas, debido a la
desnaturalización, y el resultado es un aumento de la afinidad por el colorante.
E) METACROMASIA
Se denomina Metacromasia al cambio que ocurre en el color que exhiben ciertos
colorantes utilizados en tinciones histológicas cuando se unen a determinadas
sustancias presentes en estos tejidos, llamadas cromotropos.
Comparación de los diferentes métodos empleados en el proceso histológico de los
tejidos
Métodos Directos
Estudio donde se emplean procedimientos que no afectan la biología celular, o
permiten observar los cambios que sufre ante determinados procedimientos.
Métodos Indirectos.
Procedimientos que requieren mayor tiempo para poderlos ejecutar, a veces
requieren de una fijación previa. Son procedimientos mediatos o postmorten.
Clasificación de los tipos de inclusión para el estudio histológico en microscopio
de luz
Inclusión en parafina
Para la inclusión de muestras que han de observarse con el microscopio óptico se
utiliza sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusión.
Vamos a describir los pasos para la inclusión en parafina de muestras de tejido previamente
fijadas.
La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de
hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión puede
variar entre 40 ◦C y 70 ◦C según la composición de la mezcla de hidrocarburos. Así,
parafinas más duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras que
las más blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras más
duras. Las parafinas más usadas tienen un punto de fusión en torno a los 60 ◦C.
Podemos también modificar las características de las parafinas añadiendo sustancias
para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etcétera.
5
La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados
principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto
implica que para que la parafina liquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de
sustituirse el agua por un solvente orgánico.
Inclusión en Celoidina.
Insustituible para incluir ciertos materiales como ojos, vasos, embriones, etc. Se
trata de dinitrito de celulosa o colodión y se obtiene por acción del ácido nítrico diluido
sobre la celulosa. Es ideal también para cortar grandes piezas.
Cortes por Congelación
La congelación de los tejidos es una manera rápida de endurecerlos sin necesidad de
inclusión. Esto tiene una serie de ventajas. a) La preservación molecular es máxima, lo cual
es muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. b)
Las muestras congeladas pueden cortarse en secciones finas, del orden de 5-15 µm, y más
gruesas del orden de cientos de µm. El vibratomo permite también cortes sin incluir pero no
se pueden conseguir secciones finas. c) La obtención de buenas secciones no depende del
tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente
cornificados). d) Por último, es posiblemente la manera más rápida de obtener secciones
puesto que es posible congelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarla de inmediato,
como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una
congelación muy rápida, normalmente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, lo que
evita la formación de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.
Descripción de las etapas del proceso de inclusión en parafina
Obtención de muestras
Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes, normalmente
etanol, de gradación creciente hasta alcohol de 100°. La deshidratación debe ser completa
porque de no ser así afectará a la infiltración posterior de la parafina. Posteriormente se
transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el alcohol de 100° como con la
parafina, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el
óxido de propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que
comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración de la
sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo de incubación de la pieza en algunos de estos
líquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas
sustancias endurecen la pieza y crean problemas al hacer las secciones.
6
Fijación
Se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufa regulada a la
temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina líquida
para favorecer una completa sustitución del líquido intermediario por la parafina. El tiempo
que dura dichos pasos depende de lo volátil que sea el líquido intermediario y lo grande que
sea nuestra pieza. Será mayor cuanto menos volátil es el líquido intermediario o mayor sea
la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parafina puede
endurecer el tejido. Sin embargo, los efectos de una pobre infiltración pueden ser más
perjudiciales que mantener mucho tiempo las muestras en parafina líquida. Tras el
embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en un molde, se introduce
la muestra y se coloca según la orientación deseada de corte y se deja solidificar a
temperatura ambiente.
La fijación se hace por el método de tejido fijado con formol al 4%, o bien de la
sección congelada. La función de este procedimiento es mantener la muestra evitando que
se produzca la autolisis. El tiempo de fijación es de 1mm de tejido por hora. El tejido se
extrae posteriormente de la solución fijadora, se deshidrata con varios baños en alcoholes
de concentración ascendente, y se orienta en parafina líquida caliente (56º). El bloque de
parafina endurecido con el tejido fijado será cortado con el micrótomo. Con el método de
corte de tejido congelado, el tejido se congela inmediatamente antes de su procesamiento
(sección congelada) y será cortado con un criostato.
7
Corte del bloque de parafinal
Las rebanadas delgadas de tejido congelado se montan en un portaobjetos a
temperatura ambiente, o las diapositivas incluidas en parafina se montan sobre el cristal
calentado.2 Esto permite dejarlos preparados para la tinción. Las finas láminas del tejido se
montan en seco al aire libre o en un horno de secado.
Coloración y montaje.
Varios baños de tinte son usados para que el tejido sea visible al microscopio. El
método de tinción de rutina es el denominado como Hematoxilina - [Link] hematoxilina
es un colorante nuclear, y la Eosina, citoplasmático. También existen las denominadas
técnicas especiales, tal como: Gomori (para fibras de reticulina), Ziehl neelsen (para bacilos
ácido-alcohol resistentes), Grocott (para hongos), Orceína (para fibras elásticas), etc. Por lo
general, los cortes se cubren con una delgada pieza de vidrio llamada cubreobjetos. Los
cubreobjetos se pegan sobre la sección de tejido con un pegamento transparente especial de
grado óptico, como bálsamo del Canadá, DPX u otro medio de montaje
Descripción de los métodos de coloración
Hematoxilina
La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se extrae
de la corteza del árbol Hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el
comercio se encuentra en forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en
alcohol. Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es
un colorante, para ser empleada como tal, ha de ser oxidada previamente a hemateína. Tras
el proceso de oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial
agregándole determinados grupos auxocromos que, además, le confieren un carácter
fuertemente básico y son los responsables de su especificidad por los núcleos celulares.
Como auxocromos se emplean sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en
forma de alumbres de tal forma que se forman diversas lacas de hematoxilina de carácter
catiónico y tonalidad azulada o negruzca, dependiendo de la sal metálica utilizada. La laca
de hematoxilina más utilizada es la producida a partir del alumbre alumínico-potásico,
conocida también en forma genérica como hemalumbre.
Eosina
La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un
derivado hidroxianténico halogenado con tres grupos arilo. Las diferencias de coloración
que existen entre ellos están motivadas por el tipo y número de átomos de halógeno que
contienen (eosina Y: cuatro átomos de bromo y la eosina B: dos átomos de bromo). En
8
general, los colorantes xanténicos tienen autofluorescencia espontánea y colorean los
tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosado. Por lo común, se difunden fácilmente en
las estructuras hísticas, sobre todo en las más compactas, a las cuales tiñen debido a que,
por su carácter ácido, son atraídos fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina,
lisina y arginina presentes en las proteínas citoplasmáticas y tisulares.
9
Bibliografía.
Atlas de histología vegetal y animal Paginas Wed
[Link]
[Link]
10
