ESTANDARIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA

DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS POR MEDIO DE LA TECNICA

FOTOMETRICA (KIT ELISA) A MATERIAS PRIMAS DE AVICULTURA EN
LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS PARA ANIMALES CIPA S.A

CATALINA OSORNO DUQUE

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2015
 ESTANDARIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA
DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS POR MEDIO DE LA TÉCNICA
FOTOMETRICA (KIT ELISA) A MATERIAS PRIMAS DE AVICULTURA EN
LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS PARA ANIMALES CIPA S.A

CATALINA OSORNO DUQUE

Trabajo de grado presentado como requisito para optar el título de

Químico Industrial

Director.
CLARA INES ARANGO SOTELO
Especialista en gestión de calidad y normalización técnica
Adscrita a la Facultad de Ciencias Ambientales de la Universidad
Tecnológica de Pereira

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2015
 ESTANDARIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA
DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS POR MEDIO DE LA TECNICA
FOTOMETRICA (KIT ELISA) A MATERIAS PRIMAS DE AVICULTURA EN
LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS PARA ANIMALES CIPA S.A

CATALINA OSORNO DUQUE

NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO

Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez
revisada la versión escrita y presenciado la sustentación oral,
decidimos otorgar:

La nota de: ____________________________________________

Con la connotación:____________________________________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:

Director:
Clara Inés Arango Sotelo________________________________________

Jurado:
Firma _____________________________________________

Jurado:
Firma _____________________________________________

3
 DEDICATORIA

A mi madre, Luz Elena Duque Jaramillo que siempre

creyó en mí y me brindó todo su amor y acompañamiento.

4
 AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a DIOS primero que todo por permitirme realizar este
proyecto, y por darme la fuerza y el empeño para culminar mi carrera
profesional. A mi familia y amigos por su apoyo incondicional, ánimo y
paciencia, a todas las personas que me acompañaron en este proceso en
especial a mi directora Clara Inés Arango Sotelo, por la orientación, la
motivación y la supervisión de este proyecto, pero sobre todo por su respaldo
y el apoyo recibido durante todo este proceso.
También agradezco a CIPA S.A empresa dedicada a la producción de
alimento para animales por permitirme realizar un aporte a la industria con el
desarrollo de la técnica empleada en esta tesis.

5
 CONTENIDO

PÁG.
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................. 15
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................... 18
3. OBJETIVOS .......................................................................................... 23
3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................... 23
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................... 23
4. MARCO DE ANTECEDENTES ............................................................. 24
4.1. APARICION DE LAS MICOTOXINAS EN EL MUNDO .................... 24
4.2. METODOS INMUNOQUÍMICOS EN LA DETERMINACIÓN DE
MICOTOXINAS ......................................................................................... 26
5. MARCO REFERENCIAL ....................................................................... 27
5.1. PRINCIPALES MICOTOXINAS PRESENTES EN ALIMENTOS .... 28
5.2. DETECCIÓN DE MICOTOXINAS ................................................... 32
5.3. NIVELES DE MICOTOXINAS PERMISIBLES EN ALIMENTOS ..... 34
5.4. PANORAMA EN AMÉRICA LATINA ............................................... 36
6. MARCO TEORICO ................................................................................ 38
6.1. ESTANDARIZACIÓN...................................................................... 38
6.1.1. Rango y Linealidad ..................................................................... 40
6.1.2. Coeficiente de variación (CV) .................................................... 42
6.1.3. Precisión ..................................................................................... 42
[Link]. Repetibilidad ........................................................................ 44
[Link]. Precisión Intermedia ............................................................ 45
[Link]. Reproducibilidad .................................................................. 45
6.1.4. Exactitud ..................................................................................... 45
6.1.5. Límite de Detección (LD) ............................................................ 46
6.1.6. Límite de Cuantificación (LC) ...................................................... 46
[Link]. Método Basado en la Relación Señal/Ruido. ....................... 47
[Link]. Método Basado en la Desviación Estándar de la Respuesta
del Blanco. ......................................................................................... 47
[Link]. Método Basado en la Extrapolación de la Recta de Calibrado
a concentración Cero. ........................................................................ 48
6.1.7. Recuperación .............................................................................. 48
6.1.8. Sensibilidad ................................................................................. 49
6.1.9. Blanco (BK) ................................................................................. 49
6
 6.1.10. Muestra ................................................................................... 50
6.1.11. Muestra Adicionada ................................................................. 50
6.2. LAS MICOTOXINAS ....................................................................... 50
6.2.1. Principales Hongos Productores de Micotoxinas ........................ 51
6.2.2. Contaminación con Micotoxinas.................................................. 53
6.2.3. Micotoxicosis ............................................................................... 54
6.2.4. Clasificación de las Micotoxinas.................................................. 54
6.2.5. Micotoxinas en Animales ............................................................ 56
6.2.6. Control y Prevención ................................................................... 58
6.2.7. Legislación Sobre Micotoxinas .................................................... 60
6.3 KIT ELISA PARA MICOTOXINAS ...................................................... 64
6.4. FOTOMETRIA DE ABSORCION .................................................... 66
6.4.1 Generalidades ............................................................................. 66
6.4.2. Radiación Electromagnética ....................................................... 66
[Link]. Espectro Electromagnético .................................................. 67
[Link]. Absorción de la Radiación ................................................... 68
6.4.3. Mediciones de transmitancia y absorbancia. .............................. 69
[Link]. Transmitancia (T) ................................................................. 69
[Link]. Absorbancia(A) .................................................................... 69
6.4.4. Leyes de Absorción..................................................................... 70
[Link]. Ley de Lambert .................................................................... 70
[Link]. Ley de Beer.......................................................................... 71
6.4.5. Curva de Calibración................................................................... 73
6.5 ANALIZADOR DE ELISA.................................................................... 75
6.5.1. Especificaciones Técnicas del Analizador Elisa: ......................... 76
6.5.2. Propósito del Analizador de ELISA ............................................. 77
6.5.3. Principios de Operación .............................................................. 77
7. SECCIÓN EXPERIMENTAL ................................................................. 79
7.1. MATERIALES Y EQUIPOS............................................................. 80
7.1.1. Estándar...................................................................................... 80
7.1.2. Muestra de análisis ..................................................................... 80
7.1.3. Blanco ......................................................................................... 80
7.1.4. Equipo ......................................................................................... 81
7.2. SECCIÓN EXPERIMENTAL ANTES DE LA ESTANDARIZACIÓN. 81
7.2.1. Límite de detección ..................................................................... 81
7.2.2. Límite de cuantificación ............................................................... 82
7.2.3. Curvas de calibración.................................................................. 82
7.2.4. Sensibilidad ................................................................................. 82
7.2.5. Linealidad.................................................................................... 83
7.2.6. Intervalo de trabajo lineal ............................................................ 83
7.3. PROCEDIMIENTO DE ESTANDARIZACIÓN. ................................ 83
7.3.1. Exactitud ..................................................................................... 83
7.3.2. Precisión. .................................................................................... 84
[Link]. Repetibilidad: ....................................................................... 84
7
 [Link]. Repetibilidad intermedia: ..................................................... 84
[Link]. Reproducibilidad: ................................................................. 84
7.3.3. Recuperación. ............................................................................. 85
7.3.4. Verificación de la estandarización (análisis de la muestra). ........ 85
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................. 86
8.1. ZEARALENONA ............................................................................. 86
8.1.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN .......................... 86
8.1.2. CALIBRACION ........................................................................... 88
8.1.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN .................................. 92
[Link]. Precisión .............................................................................. 93
[Link] Exactitud .............................................................................. 94
8.2. AFLATOXINA ................................................................................. 95
8.2.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN ...................... 95
8.2.2. CALIBRACION ........................................................................... 97
8.2.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN ................................ 101
[Link]. Precisión ............................................................................ 102
[Link] Exactitud ............................................................................ 103
8.3. OCRATOXINA .............................................................................. 104
8.3.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN ........................ 104
8.3.2. CALIBRACION ......................................................................... 107
8.3.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN ................................ 111
[Link]. Precisión ............................................................................ 112
[Link] Exactitud ............................................................................ 113
8.4. FUMONISINA ............................................................................... 114
8.4.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN ........................ 114
8.4.2. CALIBRACION ......................................................................... 117
8.4.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN ................................ 121
[Link]. Precisión ............................................................................ 122
[Link] Exactitud ............................................................................ 123
8.5. DON.............................................................................................. 124
8.5.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN ........................ 124
8.5.2. CALIBRACION ......................................................................... 126
8.5.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN ................................ 130
[Link]. Precisión ............................................................................ 131
[Link] Exactitud ............................................................................ 132
8.6. T-2/HT-2 ....................................................................................... 133
8.6.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN ........................ 133
8.6.2. CALIBRACION ......................................................................... 136
8.6.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN ................................ 140
[Link]. Precisión ............................................................................ 140
[Link] Exactitud ............................................................................ 142
9. EVALUACION DEL COMPORTAMIENTO DE LAS MICOTOXINAS EN
LAS MATERIAS PRIMAS DE AVICULTURA. ........................................... 143

8
 9.1 SOYA ............................................................................................... 144
9.2 HARINA DE ARROZ......................................................................... 145
10. CONCLUSIONES ................................................................................ 157
RECOMENDACIONES ............................................................................... 159
BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 160

9
 INDICE DE TABLAS

PAG

TABLA Nº 1 INCIDENCIA DE 5 MICOTOXINAS EN ENSILAJE DE MAÍZ, GRANO DE MAÍZ Y

EN TODOS LOS ALIMENTOS SOMETIDOS A ANÁLISIS EN LA UNIVERSIDAD DE
CAROLINA DEL NORTE, ESTADOS UNIDOS, PERÍODO 1989-1997. FUENTE
(WHITLOW Y HAGLER, 2002)..................................................................... 29
TABLA Nº 2 INCIDENCIA DE MICOTOXINAS SEGÚN ZONAS GEOGRÁFICAS
(DEVEGOWDA ET AL., 1998, CITADOS POR LAWLOR Y LYNCH, 2001A). ......... 30
TABLA Nº 3 NIVELES DE MICOTOXINAS PERMISIBLES POR LA FDA. ...................... 36
TABLA Nº 4 HONGOS PRODUCTORES DE MICOTOXINAS. ..................................... 53
TABLA Nº 5 CONTAMINACION CON MICOTOXINAS................................................ 54
TABLA Nº 6 CLASIFICACION DE LAS MICOTOXINAS. ............................................. 55
TABLA Nº 7 EFECTO DE LAS MICOTOXINAS EN ANIMALES. ................................... 57
TABLA Nº 8 PROGRAMA DE ANÁLISIS DE PELIGROS Y PUNTOS CRÍTICOS DE
CONTROL PARA COMBATIR LAS MICOTOXINAS EN CEREALES. FUENTE: PARK
ET. AL. (1999) .......................................................................................... 60
TABLA Nº 9 LEGISLACION MUNDIAL PARA MICOTOXINAS EN ALIMENTOS[25]. .......... 63
TABLA Nº 10 DATOS Y PARÁMETROS ESTADÍSTICOS OBTENIDOS PARA LA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN CON EL
SOLVENTE A DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA ZEARALENONA. ............. 86
TABLA Nº 11 COMPARACIÓN ENTRE EL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CON LOS INDICADOS EN EL KIT PARA
ZEARALENONA. ........................................................................................ 88
TABLA Nº 12 DATOS CORRESPONDIENTES A LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA
ZEARALENONA. ........................................................................................ 90
TABLA Nº 13 DATOS ESTADÍSTICOS PARA LA CALIBRACIÓN PARA ZEARALENONA. .. 91
TABLA Nº 14 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN EN TÉRMINOS
DE REPETIBILIDAD, REPETIBILIDAD INTERMEDIA Y REPRODUCIBILIDAD PARA
ZEARALENONA. ........................................................................................ 93
TABLA Nº 15 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD A TRES
NIVELES DE CONCENTRACIÓN PARA ZEARALENONA. .................................... 94
TABLA Nº 16 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO. ................................... 95
TABLA Nº 17 DATOS Y PARÁMETROS ESTADÍSTICOS OBTENIDOS PARA LA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN CON EL
SOLVENTE A DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA AFLATOXINA. ................ 96

10
TABLA Nº 18 COMPARACIÓN ENTRE EL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CON LOS INDICADOS EN EL KIT PARA
AFLATOXINA............................................................................................. 97
TABLA Nº 19 DATOS CORRESPONDIENTES A LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA
AFLATOXINA............................................................................................. 99
TABLA Nº 20 DATOS ESTADÍSTICOS PARA LA CALIBRACIÓN PARA AFLATOXINA..... 100
TABLA Nº 21 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN EN TÉRMINOS
DE REPETIBILIDAD, REPETIBILIDAD INTERMEDIA Y REPRODUCIBILIDAD PARA
AFLATOXINA........................................................................................... 102
TABLA Nº 22 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD A TRES
NIVELES DE CONCENTRACIÓN PARA AFLATOXINA. ...................................... 103
TABLA Nº 23 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO. ................................. 104
TABLA Nº 24 DATOS Y PARÁMETROS ESTADÍSTICOS OBTENIDOS PARA LA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN CON EL
SOLVENTE A DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA OCRATOXINA. ............. 105
TABLA Nº 25 COMPARACIÓN ENTRE EL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CON LOS INDICADOS EN EL KIT PARA
OCRATOXINA. ........................................................................................ 106
TABLA Nº 26 DATOS CORRESPONDIENTES A LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA
OCRATOXINA. ........................................................................................ 109
TABLA Nº 27 DATOS ESTADÍSTICOS PARA LA CALIBRACIÓN PARA OCRATOXINA. .. 110
TABLA Nº 28 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN EN TÉRMINOS
DE REPETIBILIDAD, REPETIBILIDAD INTERMEDIA Y REPRODUCIBILIDAD PARA
OCRATOXINA. ........................................................................................ 112
TABLA Nº 29 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD A TRES
NIVELES DE CONCENTRACIÓN PARA OCRATOXINA. ..................................... 113
TABLA Nº 30 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO. ................................. 114
TABLA Nº 31 DATOS Y PARÁMETROS ESTADÍSTICOS OBTENIDOS PARA LA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN CON EL
SOLVENTE A DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA FUMONISINA. .............. 115
TABLA Nº 32 COMPARACIÓN ENTRE EL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CON LOS INDICADOS EN EL KIT PARA
FUMONISINA. ......................................................................................... 116
TABLA Nº 33 DATOS CORRESPONDIENTES A LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA
FUMONISINA. ......................................................................................... 119
TABLA Nº 34 DATOS ESTADÍSTICOS PARA LA CALIBRACIÓN PARA FUMONISINA. ... 120
TABLA Nº 35 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN EN TÉRMINOS
DE REPETIBILIDAD, REPETIBILIDAD INTERMEDIA Y REPRODUCIBILIDAD PARA
FUMONISINA. ......................................................................................... 122
11
TABLA Nº 36 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD A TRES
NIVELES DE CONCENTRACIÓN PARA FUMONISINA. ...................................... 123
TABLA Nº 37 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO. ................................. 124
TABLA Nº 38 DATOS Y PARÁMETROS ESTADÍSTICOS OBTENIDOS PARA LA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN CON EL
SOLVENTE A DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA DON. ........................ 125
TABLA Nº 39 COMPARACIÓN ENTRE EL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CON LOS INDICADOS EN EL KIT PARA DON.
............................................................................................................. 126
TABLA Nº 40 DATOS CORRESPONDIENTES A LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA DON.
............................................................................................................. 128
TABLA Nº 41 DATOS ESTADÍSTICOS PARA LA CALIBRACIÓN PARA DON. .............. 129
TABLA Nº 42 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN EN TÉRMINOS
DE REPETIBILIDAD, REPETIBILIDAD INTERMEDIA Y REPRODUCIBILIDAD PARA
DON. .................................................................................................... 131
TABLA Nº 43 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD A TRES
NIVELES DE CONCENTRACIÓN PARA DON. ................................................ 132
TABLA Nº 44 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO. ................................. 133
TABLA Nº 45 DATOS Y PARÁMETROS ESTADÍSTICOS OBTENIDOS PARA LA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y DETECCIÓN CON EL
SOLVENTE A DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA T-2/HT-2. .................. 134
TABLA Nº 46 COMPARACIÓN ENTRE EL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CON LOS INDICADOS EN EL KIT PARA T-2/HT-
2. .......................................................................................................... 135
TABLA Nº 47 DATOS CORRESPONDIENTES A LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA T-
2/HT-2. ................................................................................................. 138
TABLA Nº 48 DATOS ESTADÍSTICOS PARA LA CALIBRACIÓN PARA T-2/HT-2. ....... 139
TABLA Nº 49 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN EN TÉRMINOS
DE REPETIBILIDAD, REPETIBILIDAD INTERMEDIA Y REPRODUCIBILIDAD PARA T-
2/HT-2. ................................................................................................. 141
TABLA Nº 50 PARÁMETROS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD A TRES
NIVELES DE CONCENTRACIÓN PARA T-2/HT-2. .......................................... 142
TABLA Nº 51 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS DEL MÉTODO. ................................. 143

12
 INDICE DE FIGURAS

PAG.

FIGURA Nº 1 TEMPERATURAS ÓPTIMAS Y PERMISIBLES PARA EL CRECIMIENTO DE

HONGOS COMÚNMENTE ASOCIADOS A GRANOS. ......................................... 31
FIGURA Nº 2 RELACIÓN ENTRE ACTIVIDAD HÍDRICA Y CRECIMIENTO DE HONGOS EN
ALIMENTOS DE USO ANIMAL ....................................................................... 32
FIGURA Nº 3. PORCENTAJE DE LA POBLACIÓN DE AMÉRICA LATINA CON
REGLAMENTOS PARA LAS MICOTOXINAS. ..................................................... 35
FIGURA Nº 4. ESTUDIOS EN LOS QUE SE DIVIDE LA PRECISIÓN. ........................... 43
FIGURA Nº 5. MICOTOXINAS DE MAYOR IMPORTANCIA MUNDIAL Y LOS
CORRESPONDIENTES HONGOS TOXICOGÉNICOS PRODUCTORES.. ................ 52
FIGURA Nº 6. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ANÁLISIS DE MICOTOXINAS DE ELISA
COMPETITIVO. .......................................................................................... 65
FIGURA Nº 7. FOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN. ....................................................... 66
FIGURA Nº 8. ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO. ................................................. 67
FIGURA Nº 9. RANGOS APROXIMADOS DE LONGITUD DE ONDA DONDE SE UBICAN
LOS COLORES. ......................................................................................... 67
FIGURA Nº 10. LEY DE LAMBERT. ...................................................................... 71
FIGURA Nº 11. LEY DE BEER. ........................................................................... 72
FIGURA Nº 12. CURVA DE CALIBRACIÓN. ........................................................... 73
FIGURA Nº 13. INTERPOLACIÓN GRÁFICA. ......................................................... 75
FIGURA Nº 14. ANALIZADOR ELISA. ................................................................. 76
FIGURA Nº 15. CURVAS REALIZADAS PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
ZEARALENONA. ........................................................................................ 89
FIGURA Nº 16. CURVA ELEGIDA PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
ZEARALENONA. ........................................................................................ 90
FIGURA Nº 17. CURVAS REALIZADAS PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
AFLATOXINA............................................................................................. 98
FIGURA Nº 18. CURVA ELEGIDA PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
AFLATOXINA............................................................................................. 99
FIGURA Nº 19 CURVAS REALIZADAS PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
OCRATOXINA. ........................................................................................ 108
FIGURA Nº 20 CURVA ELEGIDA PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
OCRATOXINA. ........................................................................................ 109
FIGURA Nº 21 CURVAS REALIZADAS PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
FUMONISINA. ......................................................................................... 118

13
FIGURA Nº 22 CURVA ELEGIDA PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
FUMONISINA. ......................................................................................... 119
FIGURA Nº 23 CURVAS REALIZADAS PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA
DON. .................................................................................................... 127
FIGURA Nº 24 CURVA ELEGIDA PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA DON. . 128
FIGURA Nº 25 CURVAS REALIZADAS PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA T-
2/HT-2. ................................................................................................. 137
FIGURA Nº 26 CURVA ELEGIDA PARA LA CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA T-2/HT-2.
............................................................................................................. 138
FIGURA Nº 27 NIVELES DE AFLATOXINA EN SOYA. ............................................ 144
FIGURA Nº 28 NIVELES DE T-2/HT-2 EN SOYA................................................. 144
FIGURA Nº 29 NIVELES DE ZEARALENONA EN HARINA DE ARROZ. ...................... 145
FIGURA Nº 30 NIVELES DE AFLATOXINA EN HARINA DE ARROZ. ......................... 146
FIGURA Nº 31 NIVELES DE OCRATOXINA EN HARINA DE ARROZ. ........................ 146
FIGURA Nº 32 NIVELES DE FUMONISINA EN HARINA DE ARROZ. ......................... 147
FIGURA Nº 33 NIVELES DE DON EN HARINA DE ARROZ. ................................... 147
FIGURA Nº 34 NIVELES DE T-2/HT-2 EN HARINA DE ARROZ. ............................. 148
FIGURA Nº 35 NIVELES DE ZEARALENONA EN SALVADO DE TRIGO. .................... 149
FIGURA Nº 36 NIVELES DE AFLATOXINA EN SALVADO DE TRIGO. ....................... 149
FIGURA Nº 37 NIVELES DE OCRATOXINA EN SALVADO DE TRIGO. ...................... 150
FIGURA Nº 38 NIVELES DE FUMONISINA EN SALVADO DE TRIGO. ....................... 150
FIGURA Nº 39 NIVELES DE DON EN SALVADO DE TRIGO................................... 151
FIGURA Nº 40 NIVELES DE T-2/HT-2 EN SALVADO DE TRIGO. ........................... 151
FIGURA Nº 41 NIVELES DE ZEARALENONA EN MAÍZ. ......................................... 152
FIGURA Nº 42 NIVELES DE AFLATOXINA EN MAÍZ. ............................................. 153
FIGURA Nº 43 NIVELES DE OCRATOXINA EN MAÍZ............................................. 153
FIGURA Nº 44 NIVELES DE FUMONISINA EN MAÍZ. ............................................. 154
FIGURA Nº 45 NIVELES DE DON EN MAÍZ. ....................................................... 155
FIGURA Nº 46 NIVELES DE T-2/HT-2 EN MAÍZ.................................................. 155

14
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La Cámara de la Industria de Alimentos Balanceados de la ANDI define la

cadena de alimentos balanceados como: El eslabón agroindustrial en la

cadena del sector pecuario que se encarga de convertir las materias primas

de origen agrícola como sorgo, maíz amarillo, yuca industrial y soya, así

como subproductos de la industria del azúcar como melazas y de la molinería

como los salvados y mogollas de trigo, maíz y arroz, en alimento para

animales [1]

CIPA S.A es una empresa dedicada a la producción y comercialización de

alimentos balanceados para animales en todas las líneas de explotación

animal, una de estas líneas es la AVICULTURA dirigida exclusivamente a la

nutrición de aves[2]

Pequeños, medianos y grandes productores avícolas cuentan siempre con el

respaldo de CIPA S.A no sólo para el cuidado alimenticio de sus aves, sino

también para la asesoría en los temas relacionados con su crianza,

desarrollo y sanidad, es por esto que ha creado productos nutritivos que

cubren los requerimientos de las aves y permiten mejorar la calidad del

producto que ofrecerán al mercado. La labor parte del cuidado de las

materias primas que son la base de los alimentos especializados que allí se

elaboran [3].

15
Las materias primas usadas en CIPA S.A para la producción consisten

principalmente de productos de origen vegetal y productos de origen animal

a las cuales se le realiza una serie de análisis que evalúan sus cargas

nutricionales y la calidad de las mismas, es decir, todo tipo de análisis

bromatológicos y microbiológicos según el caso. Pero existe otro tipo de

riesgo y son las micotoxinas, que son metabolitos secundarios tóxicos para

los animales y el hombre producidos por ciertas especies de hongos que

afectan la salud humana y animal y algunas ocasionan cáncer.

Las micotoxinas se pueden encontrar en toda clase de cereales incluyendo el

maíz, arroz, trigo, cebada, centeno y sorgo. También en alimentos y bebidas

como nueces, maní, café, leche, jugos de fruta y especias es decir, en la

materia prima empleada por CIPA S.A para su producción.

Las micotoxinas están estrictamente reguladas tanto a nivel nacional como

internacional. El CODEX ALIMENTARIUS bajo el cual se rigen 169 países

del mundo (incluyendo Colombia) establece normas específicas para

micotoxinas tanto para protección del consumidor como para efectos

comerciales.

La comercialización de alimentos con niveles de micotoxinas por encima del

máximo permisible puede acarrear sanciones económicas y legales.

Los alimentos para animales contaminados con micotoxinas pueden generar

demandas al productor.

16
Es un compromiso ético y social garantizar la inocuidad de los alimentos,

especialmente cuando se trata de sustancias potencialmente carcinogénicas

[4]
.

A pesar de todo esto en CIPA S.A hasta ahora no se había implementado un

protocolo para el estudio e identificación de micotoxinas en sus materias

primas, por lo cual se desarrolló la forma para que el laboratorio de calidad

de CIPA S.A tenga la capacidad de monitorear, identificar y cuantificar las

micotoxinas en sus materias primas y que, además, la experiencia adquirida

permita asesorar en aspectos como información general sobre las

micotoxinas y el impacto que éstas tienen sobre la salud humana y animal.

El objetivo final, de este trabajo, es contribuir al mejoramiento de la calidad

de los alimentos animales, garantizando la inocuidad de los mismos y para

ésto, se realizó la estandarización de un método para la determinación de

micotoxinas por medio de la técnica fotométrica (KIT ELISA) a materias

primas de avicultura en la industria de alimentos para animales CIPA S.A

17
 2. JUSTIFICACIÓN

Las micotoxinas son sustancias tóxicas resultantes del metabolismo

secundario de diferentes cepas de hongos filamentosos. Son compuestos

orgánicos, de bajo peso molecular y no poseen inmunogenicidad. En climas

tropicales y subtropicales, el desarrollo fúngico se ve favorecido por factores

como excelentes condiciones de humedad y temperatura. Los hongos

crecen y proliferan bien en cereales, principalmente en maíz, trigo, cebada,

sorgo y arroz, en los que generalmente encuentran un substrato altamente

nutritivo para su desarrollo. Esto explica el alto predominio de micotoxinas

como contaminantes habituales de los cereales en Colombia y países con un

clima similar.

Cuando se ingieren micotoxinas, los diferentes efectos se deben a las

diferentes estructuras químicas de estas sustancias. También influye que

sean ingeridas por diferentes organismos animales superiores y también por

una diversidad de especies, raza, sexo, edad, factores ambientales, manejo,

condiciones nutricionales y otras sustancias químicas. El cuadro clínico-

patológico producido por la intoxicación con micotoxinas se conoce como

micotoxicosis. La micotoxicosis implica enormes pérdidas de orden

económico, sanitario y comercial, principalmente por sus propiedades

anabolizantes, estrogénicas, carcinogénicas, mutagénicas y teratogénicas.

Sin embargo, el mayor problema de las micotoxicosis se atribuye a los daños

18
relacionados con los diversos órganos y sistemas de los animales,

implicando la reducción del rendimiento productivo de los mismos. Las

manifestaciones agudas ocurren cuando los individuos consumen dosis

moderadas a altas de micotoxinas. Pueden aparecer signos clínicos y un

cuadro patológico especifico, dependiendo de la micotoxina ingerida, de la

susceptibilidad de la especie, de las condiciones individuales del organismo y

de la interacción o no con otros factores. Las lesiones dependerán de cada

micotoxina, siendo las más encontradas, hepatitis, hemorragias, nefritis,

necrosis de las mucosas digestivas y finalmente, muerte. La micotoxicosis

crónica es la más frecuente. En estos casos, los animales presentan un

cuadro que se caracteriza por la reducción de la eficiencia reproductiva, peor

conversión alimenticia, reducción de la tasa de crecimiento y de la ganancia

de peso. Este cuadro sólo se detecta mediante cuidados especiales a través

de un programa de análisis de micotoxinas presentes en la alimentación.

Los signos clínicos aún pueden confundirse con deficiencias de manejo,

otras enfermedades, inclusive las resultantes de esta micotoxicosis o con

deficiencias nutricionales [5].

Actualmente se conocen más de 200 diferentes micotoxinas presentes en

granos como el maíz, trigo, cebada, arroz, semilla de ajonjolí, maní, etc.,

siendo las aflatoxinas, la ocratoxina A, la zearalenona, las fumonisinas y los

tricotecenos las principalmente asociadas a problemas de toxicidad

alimentaría.

19
En avicultura, como en otras cadenas agro alimenticias, se han propuestos

diversas estrategias para lograr contrarrestar los efectos de estos indeseados

metabolitos, entre estas destacan el uso de inhibidores de hongos,

incremento de los niveles de proteínas, vitaminas y energía de las dietas; la

selección genética, los tratamientos físicos, químicos y biológicos de las

materias primas, los cuales en condiciones experimentales han mostrado

resultados prometedores sin embargo su aplicación a nivel de granjas de

explotación comercial todavía necesitan ser validados.

Se debe por otra parte lograr unificar los criterios en materia de

normalización de los procedimientos para el muestreo, los análisis para la

detección y los niveles permisibles tratando de globalizar el problema de las

micotoxinas y las acciones para contrarrestarlo.

No debemos esperar que ocurran hechos lamentables que involucren la vida

ya sea humana como animal para empezar a conocer sobre las

micotoxinas[6].

Se han realizado muchos estudios en diferentes países como los reportados

por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la

Alimentación (FAO), la Organización Panamericana de la Salud (OPS), por

Centros de Investigaciones Internacionales y Nacionales, entre los que

destacan los conducidos por Osuna (1989), Manning (1989), Wyatt (1998),

Demet (1999) y Díaz (2005) y los llevados en nuestro país por Martínez

20
(1993), Carabaño y Silva (1998), Mazzani (1998), Saume et al. (2005) y

Jaramillo (2005).

Sin embargo, el abordaje más eficaz de este problema consistiría en adoptar

medidas de prevención en materias primas de producción nacional y de

control en materias primas importadas y alimentos preparados de

disponibilidad comercial bajo un sistema integral. Igualmente es importante

crear una cultura hacia la micotoxinas tratando de difundir información que

sea comprensible tanto para productores y consumidores, sobre los riegos y

procedimientos para combatir estas sustancias ya que la amplitud de la

difusión de las mismas en un gran número de alimentos hace muy difícil la

tarea que a nivel mundial se coordina para minimizar los graves problemas

de salud que ellas representan y de los cuales estamos obligados a afrontar.

Si a nivel mundial se ha iniciado la búsqueda de micotoxinas en alimentos y

se han iniciado estudios tendientes a mirar cómo incide su presencia en la

salud humana, en Colombia, a pesar de que el ICONTEC, según norma 3581

de 1972 reglamentó la presencia de aflatoxinas en 10 ppb, se ha pasado por

alto este problema de salud pública y sólo en los últimos años se observa

una búsqueda de las micotoxinas en alimentos, especialmente para

animales. Aun así, Colombia carece de un programa serio y continuo de

monitoreo sobre la contaminación por hongos y micotoxinas en materias

primas de los alimentos balanceados. Se hace necesario establecer los

21
niveles reales de incidencia, frecuencia y distribución de dichos metabolitos

mediante una técnica fotométrica como lo es el KIT ELISA.

El método de ELISA para determinar micotoxinas proporciona resultados

exactos y reproducibles y es una técnica basada en la fotometría [7] ya que el

analizador de Elisa es un espectrofotómetro especializado, diseñado para

efectuar la lectura de los resultados de una técnica que se utiliza para

determinar la presencia de anticuerpos o antígenos específicos presentes en

una muestra. La técnica se basa en la detección de un antígeno

inmovilizado sobre una fase sólida, mediante anticuerpos que, directa o

indirectamente, producen una reacción cuyo producto puede ser leído por el

espectrofotómetro[8].

Es necesario entonces, implementar métodos de detección e identificación

de micotoxinas en todas estas materias primas, para así evitar

contaminaciones en los productos obtenidos finalizando los procesos de

producción y garantizar al cliente que el alimento está completamente libre

de cualquier tipo de toxinas, en este caso de micotoxinas.

22
 3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Estandarizar y aplicar un método para la determinación de micotoxinas por

medio de la técnica fotométrica (KIT ELISA) a materias primas de avicultura

en la industria de alimentos para animales CIPA S.A.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Estandarizar el método para la determinación de micotoxinas en

materias primas de avicultura para CIPA S.A.

 Documentar el procedimiento para la realizar el análisis de

micotoxinas de acuerdo al sistema documental de CIPA S.A.

 Determinar los parámetros característicos del método de

micotoxinas en materias primas de avicultura de CIPA S.A como

son: límite de detección, límite de cuantificación, sensibilidad,

exactitud y precisión.

23
 4. MARCO DE ANTECEDENTES
4.1. APARICION DE LAS MICOTOXINAS EN EL MUNDO

El conocimiento de la existencia de las enfermedades en el hombre y en los

animales, asociadas al crecimiento de hongos en los alimentos, data de

siglos atrás. Tal es el caso del ergotismo, enfermedad asociada al consumo

de alimentos contaminados con el cornezuelo del centeno, llamado por los

asirios “pustula nociva en la espiga del centeno” que hacía que la

embarazada abortara y muriera en el lecho del parto.

En la edad media aparecieron por primera vez descripciones del

envenenamiento por el cornezuelo; se registraron epidemias cuyo síntoma

característico era gangrena de pies, piernas, manos y brazos, se decía que

las personas eran consumidos por el fuego sagrado y se ennegrecían como

carbón, por lo que la enfermedad se denominó Fuego Sagrado o Fuego de

San Antonio, en honor al beato en cuyo santuario se buscaba la curación. Es

probable que el alivio encontrado al viajar al santuario fuera real, pues los

peregrinos no consumían centeno contaminado durante el viaje. Solo en

1815 fue posible determinar la naturaleza fúngica del parasito del cornezuelo

del centeno y en 1875 se identificaron los componentes tóxicos del hongo

Claviceps purpurea, como responsables del ergotismo.

En Illinois, Estados Unidos, murieron 5.000 caballos en 1934 al consumir

maíz mohoso. Para 1939 se aislaron dos endotoxinas del Aspergillus

fumigatus. Una hemolítica y otra pirógena, en 1940 el distrito de Oremburg

24
(URSS) se vio afectado por una epidemia de aleukia (leucopenia) toxica

alimentaria (ATA), enfermedad que disminuye los glóbulos blancos y

disminuye la resistencia a enfermedades, debido al consumo de mijo

contaminado con tricotecenos; produjo numerosas muertes, llegando hasta el

10% de la población en algunas comarcas. Se identificó como responsable la

toxina T-2 (tricotecenos) producida por el hongo del genero Fusarium. A

pesar de las publicaciones de los científicos rusos describiendo la

enfermedad y los hongos productores de las micotoxinas, los países

occidentales no prestaron ningún interés.

Fue solo en 1960 cuando una serie de circunstancias hizo cambiar la actitud

adoptada frente a los mohos en los alimentos humanos y animales: la

aparición de una enfermedad en los pavos en Inglaterra, que llevo a la

muerte a 100.000 pavipollos denominada enfermedad X. al poco tiempo

hubo brotes similares que afectaron a otras aves de corral. El origen de la

enfermedad se encontró en tortas de prensado de cacahuetes mezclado en

el alimento, con rapidez sorprendente se detectó el hongo responsable, el

Aspergillus flavus y también fueron aislados metabolitos tóxicos, las

aflatoxinas (acrónimo de Aspergillus flavus toxin). A partir de 1961, con el

aislamiento de las aflatoxinas producidas por el Aspergillus flavus y

Aspergillus parasiticus, se evidencio la importancia de los hongos saprofiticos

en el desarrollo de procesos patológicos en animales y la posible conexión

con la patología humana[9].

25
4.2. METODOS INMUNOQUÍMICOS EN LA DETERMINACIÓN DE
MICOTOXINAS

Desde 1975, Chu y Ueno en applied and Environmental Microbiology (AEM)

o Microbiologia Aplicada y Ambiental (texto que publica artículos que hacen

contribuciones significativas a la Microbiologia aplicada incluida la

biotecnología, la ingeniería de proteínas, la biorremediacion y microbiología

de los alimentos[10], sentaron las bases para la aplicación de los métodos

inmunoquímicos a la determinación de micotoxinas, puesto que aislaron

anticuerpos para el reconocimiento de aflatoxina B1.

26
 5. MARCO REFERENCIAL

Las toxinas producidas por hongos o micotoxinas se pueden encontrar de

modo natural en un gran número de productos agrícolas, utilizados como

materias primas para la preparación de alimentos balanceados para

animales o como contaminantes o residuos tóxicos de los productos de las

explotaciones zootécnicas (leche, huevos carnes).

Son numerosos los factores que pueden influir para la contaminación con

hongos productores de micotoxinas, entre estos están la resistencia genética

del cultivo, las condiciones climatológicas caracterizadas por temperaturas y

humedades relativas altas, condiciones de transporte y almacenamiento

inadecuado y un secado deficiente (Wood, 1992). Por tanto, la contaminación

del producto puede ocurrir en cualquier punto de la cadena alimenticia,

desde la cosecha, pasando por la recolección, almacenaje, transporte,

elaboración y conservación.

La incidencia de micotoxinas en la producción de animales, especialmente

aves y cerdos, representa uno de los mayores problemas que preocupa a

estos importantes sectores agroproductivos. Entre los efectos adversos que

pueden traer consigo el consumo de alimentos contaminados se encuentran

la drástica reducción de la productividad, caracterizada por una disminución

de la velocidad de crecimiento y una baja eficiencia alimentaría (Osuna,

1989). Esta influencia negativa se debe principalmente a interferencias

producida por las micotoxinas sobre diversos sistemas enzimáticos ligados al

27
proceso digestivo y del metabolismo de los nutrientes así como del sistema

inmunosupresor (Reddy, 1982).

Para la salud humana estas también representan una amenaza latente pues

pueden actuar como un "asesino silencioso", ya que su consumo en dosis

muy pequeñas no induce síntomas clínicos evidentes, pero con el tiempo

puede traer graves consecuencias sobre la calidad y durabilidad de la

vida[11].

5.1. PRINCIPALES MICOTOXINAS PRESENTES EN ALIMENTOS

Actualmente se conocen más de 200 diferentes micotoxinas presentes en

granos como el maíz, trigo, cebada, arroz, semilla de ajonjolí, maní, etc.,

siendo las aflatoxinas, la ocratoxina A, la zearalenona, las fumonisinas y los

tricotecenos las principalmente asociadas a problemas de toxicidad

alimentaría (Díaz, 2005).

Es muy común encontrar granos contaminados, por ejemplo CAST (1989)

citado por Whitlow y Hagler (2002) señala que a nivel mundial alrededor del

25% de los alimentos cosechados anualmente son afectados por

micotoxinas. Más recientemente (1998) Yiannikouris y Jouany (2002) indican

que los granos de cereales que anualmente son afectados fluctúan entre 25

a 40%. En la tabla Nº1 se presentan los resultados de los análisis hechos a

alimentos de uso animal por agricultores de Carolina del Norte (USA) en la

Universidad del mismo nombre. Como se observa, la presencia de

28
 micotoxinas es común en todos alimentos de uso animal, obsérvese el alto

porcentaje de muestras positivas a Deoxinivalenol, 58% del total de

alimentos analizados y 70% del maíz.

Fumonisin
Aflatoxina Deoxinivalenol Zearalenona T-2 Toxin
a
>10 ppb >50 ppb >70 ppb >50ppb >1ppm
%
% medi % %
N N media±d.e N % Pos media±de N media±de N Po
Pos a±de Pos Pos
s
Ensilaje de Maíz
28±1
461 8 778 66 1991±2878 487 30 525±799 717 7 569±830 63 37
9
Grano de Maíz
170±
231 9 362 70 1504±2550 219 11 206±175 353 6 569±690 37 60
606
Todos
91±3
1617 7 2472 58 1739±10880 1769 18 445±669 2243 7 482±898 283 28
20

Tabla Nº 1 Incidencia de 5 micotoxinas en ensilaje de maíz, grano de maíz y

en todos los alimentos sometidos a análisis en la Universidad de Carolina del
Norte, Estados Unidos, período 1989-1997. Fuente (Whitlow y Hagler, 2002).
N: Número de muestras; % Pos: porcentaje de muestras positivas por sobre

determinada concentración; de: desviación estándar.

Sin embargo, esta alta incidencia tiene también una distribución estacional y

geográfica. Esta distribución puede variar, por ejemplo, por las condiciones

climáticas entre años en una misma zona (Whitlow et al., 1998) o entre zonas

geográficas diferentes por las condiciones climáticas predominantes que

favorecen a uno u otro microorganismo (Devegowda et al., 1998, citados por

Lawlor y Lynch, 2001a; Tabla Nº2).

29
 LOCALIDAD MICOTOXINAS
Oeste de Europa ocratoxinas, deoxinivalenol, zearalenona
Este de Europa Zearalenona, deoxinivalenol
Norteamérica ocratoxinas, deoxinivalenol, zearalenona, aflatoxinas
aflatoxinas, fumonisinas, ocratoxinas, deoxinivalenol, toxina
Sudamérica
T-2
África aflatoxinas, fumonisinas, zearalenona
Asia Aflatoxinas
Australia aflatoxinas, fumonisinas
Tabla Nº 2 Incidencia de Micotoxinas según zonas Geográficas (Devegowda
et al., 1998, citados por Lawlor y Lynch, 2001a).

Los granos intactos están físicamente protegidos para ser utilizados como

fuente de energía o Nitrógeno por los hongos. Daños mecánicos durante la

cosecha, por insectos durante el almacenaje o por el procesamiento, como

molienda o descascarado, facilitan el desarrollo de hongos al dejar expuestas

las fuentes de energía y nitrógeno (Nelson, 1993). La prevención en este

sentido estaría dada por una mejor condición de cosecha y un buen control

de insectos durante el almacenaje. Además, si es necesario hacer un

procesamiento del grano, es conveniente hacerlo inmediatamente antes de

ser utilizado.

En trabajo realizado por Joffe (1986) citado por Whitlow y Hagler (2002) se

observó un buen desarrollo de Fusarium a temperaturas entre 25 y 30 °C

pero con una baja producción de toxinas. Cuando la temperaturas se bajaron

cerca del punto de congelación, la producción de toxinas fue elevada con un

escaso desarrollo fúngico.

30
La temperatura a la cual se almacenan granos, heno y ensilajes por lo

general favorece el desarrollo fúngico. A pesar de que los hongos crecen en

un amplio rango de temperaturas, un crecimiento significativo tiene rangos

más acotados (Figura Nº1). Mientras Aspergillus y Penicillium requieren

temperaturas elevadas, Fusarium lo hace en ambientes más helados.

Figura Nº 1 Temperaturas Óptimas y Permisibles para el Crecimiento de

Hongos comúnmente Asociados a Granos usados en Alimentación Animal
(Nelson, 1993).

La actividad hídrica (Ah) mide la cantidad de agua disponible para el

desarrollo de los microorganismos, y es igual a la presión de vapor de agua

que rodea al alimento divido por la presión de vapor del agua pura a la

misma temperatura (FAO, 1991). Raciones completas normalmente tienen

una Ah que fluctúa entre 0,5 y 0,94 dependiendo de la cantidad de ensilaje y

de la cantidad de agua del ensilaje usado en la ración. La mayoría de los

hongos requieren una Ah sobre 0,62 aunque es muy variable (Figura Nº2).

De esta forma, una buena deshidratación de alimentos (granos, henos) y

condiciones de almacenaje apropiadas previenen los problemas de

micotoxicosis.

31
En alimentos húmedos, como ensilaje, el crecimiento de hongos depende de

la cantidad de oxígeno disponible y del pH. La gran mayoría de los hongos

son aeróbios obligados y las condiciones de anaerobiosis propias de un silo,

favorecidas por la alta humedad y bajo pH, limitan el desarrollo de hongos.

De ahí la importancia de sellar rápidamente un silo y, una vez abierto, no

prolongar en demasía el tiempo de entrega a los animales (Whitlow y Hagler,

2002; Nelson, 1993)[12].

Figura Nº 2 Relación entre Actividad Hídrica y crecimiento de hongos en

alimentos de uso animal (Nelson, 1993).

5.2. DETECCIÓN DE MICOTOXINAS

Los métodos para el análisis de las micotoxinas han ido evolucionando en

busca de una mayor precisión en la identificación de estas sustancias en

alimentos, tejidos y fluidos orgánicos. En los primeros años que siguieron al

descubrimiento de las aflatoxinas el hombre tuvo interés en los métodos

rápidos que le permitiera inspeccionar en corto tiempo un gran volumen de

32
granos. Fue así como se publicó el uso de la lámpara ultra violeta para

detectar la fluorescencia.

Luego surge la utilización de los anticuerpos monoclonales para la detección

rápida de aflatoxinas, en lotes sospechosos que posteriormente podrán ser

sometidos al análisis cuantitativo. La cromatografía en capa delgada (TLC)

se toma como una herramienta valiosa en el análisis semi-cuantitativo o

cuantitativo, adoptándose como métodos oficial establecido por la

Association of Analytical Chemist hasta llegar hoy en día a métodos más

sofisticados como la Cromatografía de Alta Precisión (HPLC) y la Reacción

en Cadena de Polimerasas (PCR).

También pueden utilizarse métodos basados en ELISA (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay),

La importancia de cada uno de estos métodos depende del medio en que se

va a aplicar y se distinguen por el grado de sensibilidad en la detección de

altas o bajas concentraciones presentes en las muestras problema. Por otra

parte, debe considerarse el programa de muestreo por lo que la FAO invita a

tener en cuenta las siguientes consideraciones: La distribución de la

concentración de las micotoxinas es un factor importante a considerar

cuando se adoptan criterios reglamentarios de muestreo para los productos.

La distribución puede ser muy heterogénea, como para las aflatoxinas del

maní. La cantidad de granos de maní contaminados en un lote es

33
habitualmente muy baja, pero el nivel de contaminación dentro del grano

puede ser muy alto. De no tenerse los debidos cuidados para obtener una

muestra representativa, la concentración de las micotoxinas en los lotes

inspeccionados puede con facilidad estimarse erróneamente. Además, el

consumo de maníes podría llevar a una única dosis accidental alta de

aflatoxinas más que a una ingesta crónica a un nivel relativamente bajo [12].

5.3. NIVELES DE MICOTOXINAS PERMISIBLES EN ALIMENTOS

Es importante señalar que estas reglamentaciones varían según las

normativas que los países o las comunidades de comercialización

internacional a las que pertenecen (Unión Europea, Mercosur, etc.). Sin

embargo, no existe una legislación internacional al respecto y en algunos

países ni siquiera existen normativas vigentes para su control.

Según la FAO, al menos 99 países tenían reglamentos para las micotoxinas

en los alimentos y/o en las raciones en el año 2003. La población total en

estos países representa aproximadamente 87% de los habitantes del globo.

En 1995, el 23% de la población mundial vivía en una región en la que no

estaba vigente ningún reglamento conocido para las micotoxinas. Este

porcentaje había disminuido al 13% en el año 2003, en razón de un ligero

aumento en América Latina y Europa e incrementos más significativos en

África y Asia/Oceanía.

34
La Figura Nº3 muestra los límites reglamentarios respectivos para diversas

micotoxinas en América Latina en los alimentos y en las raciones. Se sabe

que 19 países, que representan el 91% de la población de la región, cuentan

con reglamentaciones específicas sobre micotoxinas.

En Venezuela según la FAO 2004, solamente se encuentran reglamentados

los niveles máximos de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 para el maíz, harina

de maíz, maníes y manteca de maní (20 µg/kg) y de la aflatoxina M1 para la

leche de consumo (0,5 µg/kg) y leche en polvo (5,0 µg/kg)[13].

Figura Nº 3. Porcentaje de la población de América Latina con reglamentos

para las micotoxinas. Fuente: FAO

En la Tabla Nº3 se muestran los niveles de Micotoxinas encontrados en

alimentos y sus niveles permisibles según la División para la Administración

de comidas y drogas (FDA) de los Estados Unidos, uno de los principales

35
países suministradores de materias primas para nuestro país, los cuales

generalmente son tomados como referencia[6].

niveles con
niveles
episodios
MICOTOXINA PRODUCTO comunes niveles permisibles de la FDA
toxicos
(mg/kg)
(mg/kg)
Mani 2-6 30-125
Mantequilla de
10 14-213 20ppb en alimentos, 0,5ppb aflatoxina M1 en
AFLATOXINAS mani
leche.
Mani azucarado 20 30-230
Maiz >10
Productos de 2ppm en germen seco de maiz molido, 3ppm
1-12
maiz en el maiz para las cotufas, 4ppm en entero de
FUMONISINAS >20000
Maiz de varios los productos del maiz, del salvado de maiz y
30-2000
paises de la masa parcialmente desgerminada.
Cebada <3
3800 (cebada en
Trigo 210-2900 la
OCRATOXINA A la Republica Ningun nivel es permisible
harina de pan
Maiz Checa)
(trazas)
Harina de trigo 170-400 38000
Harina de maiz 100-400 1ppm para el deoxinivalenol en productos
TRICOTECENOS 84000 en
Palomitas de terminados de trigo
80 importaciones
maiz, pan

Tabla Nº 3 Niveles de Micotoxinas permisibles por la FDA.

5.4. PANORAMA EN AMÉRICA LATINA

Se han reportado contaminaciones con tricotecenos, especialmente DON, en

varios países Latinoamericanos (Argentina, Brasil, Uruguay) y, luego de un

importante reporte de contaminación en harinas de trigo del Uruguay con

DON (2001-2002), es que se estableció una regulación que contempla un

límite máximo de esta toxina en trigo, siendo el primer antecedente en un

país del MERCOSUR para tricotecenos.

Teniendo en cuenta que Argentina y Brasil, entre otros, son grandes

exportadores de cereales y que Europa es un mercado importante y a la vez

riguroso en sus controles, es que se deben tomar decisiones para el

36
monitoreo adecuado, fundamentalmente por el impacto en la salud de la

población por el consumo de micotoxinas y por el otro, por las exigencias de

los países importadores de estos cereales. Esto hace que, por un lado, se

trabaje fundamentalmente desde la prevención, especialmente a nivel de los

cultivos y obteniendo metodologías confiables y rápidas que permitan

detectar el cereal contaminado antes de ingresar a la cadena productiva. Por

ejemplo, con la disponibilidad de secuencias de ADN en bancos de datos de

libre acceso, es posible contar con información de gran utilidad para diseñar

estrategias que permitan, mediante la aplicación de técnicas moleculares,

identificar regiones codificantes asociadas a la síntesis de distintas toxinas y

así tener un panorama claro del potencial tóxico de una muestra de granos

destinada al consumo humano y animal[14].

37
 6. MARCO TEORICO

6.1. ESTANDARIZACIÓN

Se conoce como estandarización al proceso mediante el cual se realiza una

actividad de manera standard o previamente establecida. El término

estandarización proviene del término standard, aquel que refiere a un modo o

método establecido, aceptado y normalmente seguido para realizar

determinado tipo de actividades o funciones. Un estándar es un parámetro

más o menos esperable para ciertas circunstancias o espacios y es aquello

que debe ser seguido en caso de recurrir a algunos tipos de acción.

El término de estandarización tiene como connotación principal la idea de

seguir el proceso standard a través del cual se tiene que actuar o proceder.

Al mismo tiempo, esta idea supone la de cumplir con reglas que, si bien en

ciertos casos pueden estar implícitas, en la mayoría de las oportunidades

son reglas explícitas y de importante cumplimiento a fin de que se obtengan

los resultados esperados y aprobados para la actividad en cuestión. Esto es

especialmente así en el caso de procedimientos de estandarización que se

utilizan para corroborar el apropiado funcionamiento de maquinarias, equipos

o empresas de acuerdo a los parámetros y estándares establecidos[15].

38
La estandarización de un método analítico es un proceso riguroso que

dependiendo de la técnica analítica a la que pertenezca el método, la matriz,

el analito, la cantidad de parámetros de estandarización, y de la logística

empleada para su desarrollo, puede requerir un tiempo más o menos

considerable (en algunos casos puede superar los seis meses).

El proceso de estandarización incluye los parámetros fundamentales para

que un método analítico una vez montado pueda empezar a reportar datos

con adecuado y comprobable grado de confianza.

Estandarizar un método de análisis consiste en verificar y documentar, que

éste conduzca con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados

precisos y exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad

previamente establecidos[16]. La estandarización de las metodologías

analíticas, junto con otras actividades englobadas en la gran área del

aseguramiento de la calidad permite conseguir calidad, otorgando la

confianza necesaria a la vez que confieren un grado elevado de

comparabilidad entre los resultados de los análisis químicos.

El análisis se considera hoy en día un proceso mediante el cual se obtiene

información. Se realizan millones de análisis cada día en el mundo en los

ámbitos más variados: análisis de productos manufacturados, naturales,

análisis medioambientales, clínicos, forenses, químicos y físicos. En todos

ellos se requiere una confianza en los resultados obtenidos.

39
La estandarización del método debe detectar la presencia de error en los

resultados emitidos. Los requisitos analíticos para un uso determinado

establecen los parámetros o criterios de calidad del método a utilizar para

resolver el problema. Estos criterios de calidad, llamados “performance

characteristics” o “figures of merit”, pueden ser de tipo estadístico. En estos

figuran los parámetros fundamentales de exactitud (relacionados con la

trazabilidad) y precisión (relacionados con la incertidumbre) y los secundarios

de selectividad, sensibilidad, límites de detección y cuantificación [17].

6.1.1. Rango y Linealidad

La linealidad es la capacidad del método de proporcionar resultados que son

directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales

a la concentración del analito en la muestra dentro del rango establecido.

Siempre que sea posible se buscará respuesta del tipo lineal que facilitará su

trazado, interpolación e interpretación.

El rango es el intervalo entre la concentración superior e inferior de analito

para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del

método descrito. Aunque el proceso lógico consistiría en evaluar cuáles son

los límites de concentración en los que el método analítico pierde su

linealidad, normalmente se toma como punto de partida un intervalo de

concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el

conocimiento analítico de la técnica empleada y principalmente en función de

las especificaciones[16.18].

40
Con los resultados del estudio de la linealidad se prepara una tabla

relacionando las concentraciones x y la respuesta y. La relación entre ambas

variables se expresa matemáticamente como una recta de regresión del tipo

y = bx + a, obtenida por un método de ajuste. Si la recta no pasa cerca del

origen de coordenadas significa que el método a evaluar está afectado por

un error sistemático por defecto o por exceso en el intervalo estudiado. Si

existen diferencias apreciables entre los valores experimentales y los puntos

de la recta significa que la linealidad no es buena.

En la recta de regresión y = bx + a, x es la concentración, y la respuesta, b el

valor de la pendiente y, al término independiente. La pendiente b se

encuentra relacionada con la sensibilidad del método de forma que a mayor

pendiente mayor sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de

la concentración del analito). El término independiente a, u ordenada en el

origen, es la intersección de la recta con el eje de las ordenadas y es

indicativo del error sistemático, no difiriendo estadísticamente de cero en

caso de no existir sesgo. El coeficiente de correlación (r) indica el grado de

relación entre la variable x (concentración), y la variable y (respuesta). Su

valor máximo es 1, si r es cercano a la unidad significa que existe correlación

con una probabilidad elevada. Un valor nulo indica ausencia de relación

lineal entre variables. El valor recomendable para el coeficiente de

correlación es ≥ 0,999, aunque en el caso de impurezas se admite ≥ 0,990[16]

41
6.1.2. Coeficiente de variación (CV)

Es una medida de la dispersión relativa de un conjunto de datos, que se

obtiene dividiendo la desviación estándar del conjunto entre su media

aritmética y se expresa generalmente en términos porcentuales[19].

El coeficiente de variación es una calificación que permite a los usuarios

evaluar la calidad estadística de las estimaciones. Se considera que una

estimación con un coeficiente de variación:

• Hasta del 7%, es precisa;

• Entre el 8 y el 14% significa que existe una precisión aceptable;

• Entre el 15% y 20% precisión regular y por lo tanto se debe utilizar con

precaución

• Mayor del 20% indica que la estimación es poco precisa y por lo tanto se

recomienda utilizarla sólo con fines descriptivos (tendencias no niveles)[20].

6.1.3. Precisión

Indica el grado de concordancia entre los resultados obtenidos para réplicas

de una misma muestra, aplicando el mismo procedimiento experimental bajo

condiciones prefijadas. Usualmente se expresa en términos de la

DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s). Otra forma de expresar la precisión es la

Desviación estándar Relativa o COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV)[18]

42
La procedencia de las muestras destinadas al estudio de la precisión puede

ser de muestras reales o preparadas en el laboratorio. La importancia de

evaluar este parámetro es la de conocer la variabilidad o la incertidumbre del

método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios

inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de

estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las

mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos.

Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no

pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos,

tiempo, etc.)[16,21],

En la figura Nº4 se muestra los diferentes tipos de resultados que engloba la

precisión.

Figura Nº 4. Estudios en los que se Divide la Precisión.

43
[Link]. Repetibilidad

Es una medida de la precisión de datos obtenidos por un solo operador

trabajando siempre en las mismas condiciones (equipos, materiales y

reactivos).

La repetibilidad se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación

(desviación estándar relativa) de una serie de medidas. Uno de los factores

que más influye en la repetibilidad del método de análisis es la concentración

del analito, ya que la desviación estándar de las respuestas obtenidas

aumenta al disminuir la concentración del analito. La repetibilidad

instrumental estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento y se

determina analizando repetidamente una misma muestra de forma

consecutiva de 6 a 10 veces. El ensayo de la repetibilidad del método se

efectúa sobre una serie de alícuotas de una muestra homogénea que se

analiza independientemente desde el principio (preparación de muestra)

hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo

analista, los resultados de la repetibilidad instrumental dependen del

instrumento, por ejemplo no se puede obtener el mismo coeficiente de

variación con un fotómetro de doble haz que con uno de haz sencillo. Cuanto

mayor sea la manipulación de la muestra más probable es que la variabilidad

del método aumente.

44
[Link]. Precisión Intermedia

Con ella se determina la variabilidad del método efectuando una serie de

análisis sobre la misma muestra, en un mismo laboratorio pero en

condiciones operativas diferentes.

[Link]. Reproducibilidad

La reproducibilidad es una medida de la precisión de los datos obtenidos

entre dos o más analistas y/o laboratorios que utilizan el mismo método y

similares condiciones.

Permite verificar que el método de análisis proporciona los mismos

resultados en diferentes laboratorios[16].

6.1.4. Exactitud

La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el

valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor

de referencia y el valor experimental encontrado. Se expresara como

porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de

analito añadida sobre la muestra o como la diferencia entre la media

obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de

confianza[16].

45
6.1.5. Límite de Detección (LD)

El límite de detección se define como la mínima cantidad de analito en la

muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo

las condiciones experimentales establecidas[16].

El límite de detección es un término solo cualitativo. No debe confundirse

este término con otro al que normalmente se asocia, la sensibilidad, ya que

esta es la capacidad de un método de análisis para discriminar pequeñas

diferencias en concentración o masa del analito. Una alta sensibilidad del

método analítico no siempre permite suponer inferiores límites de detección,

ya que lo que definiría este límite es la relación entre el ruido y la señal

debida al analito[16].

6.1.6. Límite de Cuantificación (LC)

El límite de cuantificación de un método, corresponde a la mínima cantidad

de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las

condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisión y

exactitud.

El límite de cuantificación es un término cuantitativo, encontrándose entre

este y el límite de detección un rango de concentraciones en el que si bien

no puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable certeza, si puede

detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos[16].

46
Existen diversos métodos de análisis y equipos instrumentales, dependiendo

de cada uno se elige el método para hallar tanto el límite de detección como

el de cuantificación, en los siguientes párrafos se mencionaran algunos

métodos para hallarlos.

[Link]. Método Basado en la Relación Señal/Ruido.

Uno de los empleados, requiere que el procedimiento de análisis sea

instrumental y que proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una

línea de base, es decir una señal residual a concentración de cero analito

(espectrofotometría UV-visible). Este procedimiento presenta la desventaja

que en numerosas ocasiones al llevar a cabo la comprobación experimental

del LC calculado, se observa que es posible obtener resultados igualmente

precisos y exactos aun cuando se desciende más en la concentración

limite[16].

[Link]. Método Basado en la Desviación Estándar de la Respuesta

del Blanco.

De acuerdo con la IUPAC, puede calcularse el LD y LC de un método

analítico a partir del conocimiento de la desviación estándar atribuible a la

respuesta de una muestra y la pendiente de la recta de calibrado del analito.

La expresión a aplicar para este cálculo varía en función de si el método

instrumental empleado corrige la señal frente a un blanco o no. (ver numeral

6.1.9.) (métodos espectrofotométricos) (métodos cromatográficos)[16].

47
[Link]. Método Basado en la Extrapolación de la Recta de

Calibrado a concentración Cero.

Se trata de un procedimiento aplicable también a métodos analíticos

instrumentales que proporcionan resultados numéricos y dirigido a evitar el

cálculo, en ocasiones costoso en tiempo, de la señal media del blanco y su

desviación estándar. Utilizando como en el anterior la pendiente de la recta

de calibrado, pero en este caso sustituye el valor real de un blanco, por la

extrapolación de dicha recta[16].

6.1.7. Recuperación

Es la capacidad que tiene un procedimiento analítico para determinar

cuantitativamente una especie química que ha sido adicionada a una

muestra. Se expresa como porcentaje de recuperación (%R)[18].

La recuperación esperada depende de la matriz de la muestra, del

procedimiento de preparación de la muestra y de la concentración del analito

en la misma. Aunque es deseable alcanzar valores de recuperación cercanos

al 100%, en algunas muestras de matrices complejas sólo se obtienen

valores del 50, 80 o 90%. En estos casos es importante que aunque la

recuperación sea baja, la precisión del método sea alta ya que entonces

puede intentar aplicarse un factor de corrección. La desviación de la

exactitud por exceso se produce cuando existen interferencias y la

selectividad del método no es la adecuada, entonces se obtienen resultados

superiores al valor verdadero. En este caso, si es posible, se debería

48
modificar las condiciones del método para optimizar la selectividad o bien

cambiar a otro alternativo que sea selectivo. La desviación de la exactitud por

defecto suele producirse cuando la matriz de la muestra es compleja y la

extracción del analito requiere varios pasos obteniéndose recuperaciones

más bajas. Cuando esto ocurre sería conveniente intentar optimizar la

preparación de la muestra para mejorar el factor de recuperación[16].

6.1.8. Sensibilidad

Es una medida del factor de respuesta del instrumento como una función de

la concentración[18]. En contraste con el límite de detección, la sensibilidad de

un método está definida como la habilidad para distinguir entre diferentes

concentraciones. Para métodos donde la respuesta con respecto a la

concentración es una función lineal, la sensibilidad es constante con respecto

a la concentración y es igual a la pendiente de la curva de calibración.

Contrariamente a las funciones lineales, la sensibilidad de métodos cuando

su respuesta es no-lineal cambia con la concentración del analito[21,22].

Normalmente la sensibilidad se mide como la pendiente de la curva de

calibración[18].

Para métodos espectrofotométricos: S=(∆A/∆C).

6.1.9. Blanco (BK)

Es un sistema físico que no contiene muestra real y por consiguiente no

debería contener el analito de interés, pero que debe contener todos los

49
reactivos que se utilizan en el método de análisis, y ser sometido a las

mismas condiciones y al mismo procedimiento que las muestras reales y los

estándares. En lugar de muestra el volumen faltante se completara con agua

grado reactivo[23].

6.1.10. Muestra

Para este propósito, el termino se refiere a cada sistema físico que sea

sometido al procedimiento de análisis siguiendo el método que se está

estandarizando, ya sea un blanco, un estándar, una muestra adicionada, o

una muestra real propiamente dicha[23].

6.1.11. Muestra Adicionada

Es una muestra natural o real a la cual se le ha adicionado una cantidad

conocida del analito que se estudia. Esta adición debe hacerse en la forma

prevista en el diseño de las condiciones de estandarización para que sea

reproducible[23].

6.2. LAS MICOTOXINAS

Son metabolitos secundarios tóxicos, de composición variada, producidos y

secretados por organismos del reino fungi, que incluye setas, mohos y

levaduras, durante el proceso de degradación de la materia orgánica, como

mecanismo de defensa frente a otros microorganismos.

50
El término suele referirse principalmente a las sustancias tóxicas producidas

por hongos que afectan a animales vertebrados en bajas concentraciones,

sin incluir a las que afectan exclusivamente a las bacterias (por ejemplo, la

penicilina) o a las plantas. También se excluyen, de manera un tanto

arbitraria, las toxinas presentes en las setas venenosas.

Se considera que alrededor del 25% de las cosechas anuales están

contaminadas con algún tipo de micotoxinas y que esos valores pueden ser

aún mayores, del orden del 80% e incluso del 100%, y corresponden a

aquellas regiones cuyos cultivos estuvieron sometidos a condiciones de

estrés hídrico, ataque de insectos o fueron cosechados y/o almacenados en

condiciones inapropiadas.

6.2.1. Principales Hongos Productores de Micotoxinas

Los principales hongos productores de micotoxinas, conocidos como

micotoxicogénicos, corresponden a los géneros Aspergillus, Penicillium y

Fusarium.

Cada uno de estos géneros puede generar diferentes tipos de micotoxinas,

de la misma forma que un determinado tipo de micotoxina puede ser

producida por diferentes especies de hongos (Figura Nº5).

51
 Figura Nº 5. Micotoxinas de Mayor Importancia Mundial y los
Correspondientes Hongos Toxicogénicos productores. Adaptado de Miller
(1994).

Dada la compleja ecología de la proliferación de los mohos y la producción

de micotoxinas, pueden producirse mezclas de micotoxinas en alimentos y

piensos, especialmente en cereales. La presencia simultánea de diversas

micotoxinas puede influir (Miller, 1991) tanto en el nivel de producción de

micotoxinas como en la toxicidad del material contaminado[13].

52
 HONGOS PRODUCTORES DE MICOTOXINAS
GENERO ESPECIES MEDIO EN EL QUE CRECE TEMPERATURA TOLERABLE TRANSMISION
ASPERGILLUS · A. niger, · Por medio de las esporas o
· A. flavus, conidios que penetran en el
· A. ochraceus, Suelos y materiales en organismo vía respiratoria.
descomposicion. Es Es termotolerable, puede
· A. terreus, · También es posible por
comun encontrarlos en vivir entre los 12-57ᴼC. Las
· A. parasiticus, contaminación de heridas o
conductos de esporas pueden sobrevivir
· A. versicolor, ventilacion y a 70ᴼC. mucosas
· A. oryzae, climatizacion.
· Por ingestión de alimentos
· A. nidulans,
contaminados.
· A. niveus.
PENICILLUM
se adquiere por inhalación y
· P. chrysogenum, Estan ampliamente
termodimórfico, produce produce una infección pulmonar
· P. citrinum, distribuidas en la
colonias filamentosas, seguida de fungemia y
· P. janthinellum, naturaleza y es comun
lisas, con surcos radiales a diseminación. En la piel del
· P. marneffei y encontrarlos en el
25°C. A 37°C, colonias con tronco, cara y extremidades se
· P. purpurogenum. Suelo, la vegetacion
textura glabra y plegada. observan lesiones moluscoides o
Etc caida y el aire.
acneiformes.

FUSARIUM · F. aquaeductuum Especies frutales, tales

· F. chlamydosporum como cacao, aguacate,
· F. coeruleum mango y guaraná La puerta de entrada de las
aire y suelo calido, asi
· F. dimerum infecciones localizadas son las
plantas de importancia como temperaturas que
· F. incarnatum pequeñas lesiones producidas
económica tales como ocsilen alrededor de 28ᴼC.
· F. napiforme por traumatismos.
cítricos, soja, maní,
· F. oxysporum
pimienta, papa, calabaza
Etc

Tabla Nº 4 Hongos Productores de Micotoxinas.

6.2.2. Contaminación con Micotoxinas

CONTAMINACION CON MICOTOXINAS

CONDICIONES PARA EL
SUSTRATOS FORMA DE CONTAMINACION
CRECIMIENTO
· granos de cereales y cualquier momento
· Estrés térmico o hídrico
oleaginosas dentro de la cadena de
producción, transporte y
DIRECTA
· Forraje verde o manejo de los alimentos · Daños físicos producidos
ensilado o forrajes en el cultivo por factores bióticos
(previo a la cosecha)

cuando el hongo · Prácticas de manejo

toxicogénico que inapropiadas
· Alimentos en
INDIRECTA contaminó el sustrato ha
general. · Presentar características
desaparecido pero su
genéticas
micotoxina aún persiste

53
 Tabla Nº 5 Contaminacion con Micotoxinas.
6.2.3. Micotoxicosis

Bajo determinadas circunstancias las micotoxinas pueden causar en el

hombre o en los animales las llamadas micotoxicosis, es decir, intoxicaciones

agudas a corto plazo o crónicas, con efectos teratogénicos, carcinogénicos y

mutagénicos, consideradas enfermedades no transmisibles y caracterizadas

por presentar efectos análogos a los causados por la exposición a pesticidas

o residuos de metales pesados. Esta problemática puede tener su origen en

el consumo directo de alimentos contaminados con micotoxinas

(micotoxicosis primaria) o bien corresponder a la ingesta de leche, carne u

otros productos, derivados de animales que consumieron alimentos

contaminados (micotoxicosis secundarias).

Actualmente está muy extendida la opinión de que el efecto más importante

de las micotoxinas, particularmente en los países en desarrollo, es la

capacidad de algunas micotoxinas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y,

por consiguiente, de reducir la resistencia a enfermedades infecciosas[13].

6.2.4. Clasificación de las Micotoxinas

54
 CLASIFICACION DE LAS MICOTOXINAS

GENERO Y ESPECIE DISTRIBUCION

MICOTOXINA ESTRUCTURA PRODUCTO EFECTOS OTROS
PRODUCTORA (REGION)

Principalmente en En bajas Infertilidad, edema La ZEA, a pesar de ser muy

maíz, aunque concentraciones, en vulvar,e hipertrofia diferente
Fusarium
también es posible Norteamérica, Japón mamaria en hembras y en estructuralmente al
ZEARALENONA graminearum y
encontrarla en trigo, y Europa. En altas machos atrofia testicular y estrógeno, posee una
otras especies
cebada, arroz y concentraciones en agrandamiento de la fuerte actividad
sorgo. países en desarrollo glándula mamaria. estratogénica.

Es un carcinogénico Han sido las micotoxinas

Cacahuete, girasol,
potente y se lo asocia en más estudiadas hasta el
Aspergillus flavus coco, maíz, sorgo, Areas tropicales y
AFLATOXINA particular con el cáncer de presente; La aflatoxina B1
y parasiticus arroz, trigo, cebada, subtropicales.
hígado en varias especies es el grupo con mayor
etc.
de vertebrados. toxicidad.

Aspergillus Agente cancerígeno y se

ochraceus, A. Cevada, Trigo, maíz, Principalmente en asocia a tumores del tracto
Sulfureus, A. arroz, guisantes, zonas templadas del urinario. Produce La más conocida es
OCRATOXINA melleus, frijoles, café, hemisferio norte, nefrotoxicidad, ocratoxina A, siendo a su
Penicillium especias, nueces e Canada y Reino hepatotoxicidad, vez la más tóxica.
viridicatum, P. higos. Unido. inmunosupresión, cáncer y
commune. teratogénesis.

Estados Unidos, La producción de toxinas

Efectos tóxicos en el
Canadá, Uruguay, es particularmente
sistema nervioso central,
FUMONISINA F. moniliforme Maíz y sus productos. Brasil, Sudáfrica, frecuente cuando el maíz
hígado, páncreas, riñones y
Austria, Italia y se cultiva en condiciones
pulmones.
Francia. calurosas y secas.

No es carcinogénica,
T Se encuentra tanto Es probablemente la
Fusarium pero es tóxica para el
R Diversos cereales, en países micotoxina de Fusarium
DEOXINIVALENO culmorum, sistema
I especialmente el desarrollados como más corriente. Se conoce
L (DON) Fusarium inmunológico
C maíz y el trigo. en paises en vías de vulgarmente como
graminearum. disminuyendo las defensas
O desarrollo. vomitoxina.
del organismo.
T
E El efecto más importante Se han estudiado
C Avena, trigo, maíz, es su actividad ampliamente en
E cebada, arroz y Regiones templadas inmunodepresora; es un animales, pero, a pesar de
N Fusarium
T-2/HT-2 habas. de América, Europa y potente sus
O sporotrichioides
así como en sus Asia. inhibidor de la síntesis de efectos, no se ha
S productos derivados. proteínas y de la función estudiado nunca la
mitocondria. toxicología en humanos.

Tabla Nº 6 Clasificacion de las Micotoxinas.

55
6.2.5. Micotoxinas en Animales

La sensibilidad a las distintas micotoxinas difiere entre las especies animales

y también depende de otros factores, como los que están relacionados con la

toxina (tipo de micotoxina consumida, el nivel y la duración de la ingesta),

con los animales (sexo, edad, raza, salud general, estado inmunológico,

estado nutricional) y el medio ambiente (gestión de las explotaciones, la

higiene, temperatura). Por lo tanto es muy difícil de detectar y diagnosticar

los problemas con las micotoxinas en los animales.

MICOTOXINA/ Mascotas (Gatos

Humanos Porcinos (cerdos) Peces Rumiantes (Ganado) Equinos (caballos) Aves
EFECTOS y Perros)

Z Infertil i da d,
E Aumento de tama ño Ca ra cteri s tica s
Pubertad precoz Hi peres trogeni s mo
A de l a gl á ndul a s exua l es
R Rreducci ón en l a ma ma ri a , Probl ema s en el s ecunda ri a s
N Tra ns tornos de a umentada s
A ca l i da d y numero Reducci ón de l a s i s tema de
A l a reproducci on
L Aumento del Efectos en l a de es permi os producci ón l á ctea , reproducci on
E tama ño de l os ges taci on, l a ctanci a y Aumento del
N Va gi ni tis y s ecreci ón
orga nos pes o del feto tama ño de l a
O va gi na l .
cl oa ca
Vomi tos Inmunos upres i on Sa ngra do na s a l Ca ncer
Tumores en Depres i ón Pérdi da de
Dol or a bdomi na l Tembl ores Ba ja res i s tenci a a
hi ga do s evera a petito
Reducen el a gentes
Pérdi da de
Edema pul mona r Fi ebre creci mi ento del es tres a ntes
coordi na ci ón
Necros i s del ga na do Tendenci a a Al tera ci ones
Ina petenci a Hi ga do gra s o
hi ga do recos tars e hepá tica s
A Icteri ci a
No ha y ga na nci a de Icteri ci a (Pi el
F Ca ncer Perdi da de pes o Convul s i ones
pes o a ma ri l l a )
L Inmunos upres i o Ca nceri geno, Es pa s mos Ba jo cons umo de
A Da ño en ri ñon Fa l ta de energía
n tera togeni co, mus cul a res a l i mento
T Degenera ci on mutageni co, Da ño en el Poca ga na nci a de
O Pérdi da de pes o
hepa to cel ul a r hepa totoxi co i ntes tino pes o
X Negros i s y Vómi tos
I Ba ja producci ón de
fi bros i s del Anemi a
N Aga l a ctia en cerda s y Da ño en el huevos
hi ga do Afectan l a ca l i da d de
A a bortos es toma go
Encefa l opa tia en l a l eche Icteri ci a Di s mi nuci on de l a
ni ños
Pa ra pes i a i ncl us o l a i ncuba bi l i da d de
Sa ngre en s u
es pa s tica Anemi a muerte dentro l os huevos
es tiércol
tropi ca l Res i duo en bi l i s de l os 3 día s de
Infa rto cerebra l Interi ci a y en hi ga do Di a rrea expos i ci ón. Hemorra gi a s
Hema toma s
Muerte Muerte deba jo de l a Anemi a
pi el .

56
 Necros i s de l a s
cél ul a s del ri ñon Inhi bi ci on del
Di s mi nuci ón del Reducci ón del
y del tegi do Anorexi a cons umo de
creci mi ento feta l cons umo
Di fi cul ta d hepa to- a l i mento
res pi ra tori a pa ncrea ti co.
En cerdos jóvenes Pres enci a de Reducci ón de l a
Inhi bi ci on de
oca ci ona edema con tumores en ri ñon ta s a de Pérdi da de pes o
creci mi ento
ri gi dez genera l i za da e híga do creci mi ento
En verra cos
O di s mi nuye l a
Reducci ón de l a Inhi bi ci on de
C ferti l i da d, Des empeño
Fa l l o rena l ga na nci a de Vómi tos producci ón de
R di s mi nuci ón de pobre
pes o huevos
A ca l i da d y producci ón
T s emi na l
O Efi ci enci a de
Menor ca l i da d de
X convers i ón del
Ul cera s gá s tri ca s l a ca s ca ra del
I a l i mento
Tempera tura huevo
N reduci da
corpora l muy
A Aumento de l a Ma yor
Nefropa ti a el eva da Ta s a de
convers i ón s us cepti bi l i da d
i nters ri ci a l Pa l i di ps i a morta l i da d ma s
a l i menti ci a . a i nfecci ones
a l ta
vi ra l es
Di s mi nuci ón del
Recha zo del
índi ce de convers i ón Des hi dra ta ci ón
Muerte por a l i mento
en l echones
i ns ufi ci enci a
Inmunos upres i ón Acumul a ci on en Da ño del híga do
rena l a guda .
Ca ncer Nefrotoxi ci da d y el híga do y en l a Pos tra ci ón.
Di s funci on rena l
hepa totoxi ci da d mus cul a tura
Cól i co
Curs a n con Di s mi nuci on de
Edema pul mona r Inhi ben l a
i nfos ura pes o corpora l
F s íntes i s de
produci da por l a
es fi ngol ípi dos y
U Afecta l a toxi na Incremento del
M el meta bol i s mo
ga na nci a de pes o de l a
O Probl ema s hepá ti cos Cua dros
pes o y mol l eja , ri ñones e
N a cumul a ci ón de res pi ra tori os hi ga do
Ca ncer es ofa gi co
I es fi nga ni na en
S Probl ema s va ri os teji dos ,
I ca rdi ova s cul a res : i ncl uyendo el Da ños a Aumento de l a
N fa l l o del l a do híga do. Ata xi a di vers os morta l i da d
A i zqui erdo del cora zón (i ncoordi na ci ón órga nos
a l ca mi na r)
Ci a nos i s
Di a rrea
Icteri ci a
Vomi to
Les i ones ora l es
Dol or a bdomi na l Dol or a bdomi na l Efectos
Engros a mi ento del nega ti vos s obre
es ófa go Ni vel es a l tos
Reducci ón del el s i s tema
Infl a ma ci ón producen recha zo Di s mi nuci on de
D cons umo i nmune
i ntes ti na l ; di a rrea del a l i mento con pes o corpora l
T O
a guda di s mi nuci ón de
R N Dol or de ca beza
Reducci ón de l a l a ga na nci a de
I pes o.
C producci ón de Pérdi da de pes o
O eri tri ci tos
Al ta morta l i da d en Conducen a
T
E l echones tra s tornos Incremento del
C di ges ti vos pes o de l a
Afecta ga na nci a Ga s troenteri ti s ,
E Inmunos upres i ó (vómi tos , mol l eja , ri ñones e
Vomi tos Vomi tos de pes o y hemorra gi a s
N n di a rrea o hi ga do
convers i ón i ntes ti na l es y muerte.
O recha zo del
a l i menti ci a con a l i mento)
S T
Ina petenci a pres enci a de Recha zo del a l i mento
- Aumento de l a
ga s tri ti s , morta l i da d
2
Di fi cul ta d pa ra crecer hemorra gi a Ma l des empeño
i ntes ti na l y
Di a rrea s Inferti l i da d Inmunos upres i ón
a umento de l a
Les i ones a ni vel de Cól i co Hemorra gi a s Di a rrea
morta l i da d
utero y ova ri o

Tabla Nº 7 Efecto de las Micotoxinas en Animales.

57
6.2.6. Control y Prevención

Una vez que el problema está instalado es muy difícil corregirlo e impacta

negativamente en la rentabilidad del sistema, al reducir la productividad y

aumentar los costos de producción ya que, a los ya existentes, se suman los

recursos económicos y técnicos orientados a subsanar sus efectos.

Normalmente las medidas se toman después de que los animales

manifiestan síntomas de intoxicación por el consumo de alimento

contaminado cuando gran parte de daño ya se produjo. Es por ello que es

necesario actuar en forma preventiva, aplicando programas de control

estrictos y respetando las normas de seguridad a lo largo de toda la cadena

de producción, transporte, almacenamiento, procesado e incorporar un

adecuado manejo de los sustratos y raciones en el criadero, para poder

evitar o reducir con ello la aparición de los hongos[24].

El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA)

quienes han evaluado las micotoxinas por diversos años considera que la

presencia de mohos y micotoxinas puede reducirse mediante la aplicación de

diversas medidas preventivas, tanto antes como después de la cosecha,

como por ejemplo, medidas adecuadas de lucha contra plagas y

enfermedades y buenas prácticas de cosecha, secado y almacenamiento.

El sistema de APPCC identifica, evalúa y controla los peligros importantes

para la inocuidad de los alimentos. Se trata de un enfoque estructurado y

sistemático para controlar la inocuidad de los alimentos en la totalidad del

58
sistema del producto, desde el campo hasta la mesa. Requiere un buen

conocimiento de la relación entre causa y efecto, con objeto de actuar de

forma más dinámica, y es un elemento clave de la Gestión de la Calidad

Total (GCT). El sistema de APPCC se basa en la existencia de sistemas de

gestión de la calidad sólidamente implantados, como las buenas prácticas de

fabricación (BPF), las buenas prácticas de higiene (BPH), las buenas

prácticas agrícolas (BPA) y las buenas prácticas de almacenamiento (BPAL)

(FAO, 2003)[6].

En la Tabla Nº 8. Se puede observar los posibles pasos para la adopción de

programa APPCC para combatir las micotoxinas.

Pasos Alimentos Riesgo Acción correctiva

Utilizar variedades
resistentes para el cultivo.
Reforzar los programas
Granos de efectivos contra el control
Infección con mohos con
cereales, de plagas.
Precosecha subsiguiente formación
oleaginosas, Mantener adecuados
de micotoxinas
nueces, frutas horarios de riego.
Buenas prácticas de
labranza, rotación de
cultivos, etc.
Tiempos apropiados de
cosecha.
Mantener bajas
Granos de temperaturas si es
cereales, Incremento de la posible.
Cosecha
oleaginosas, formación de micotoxinas Remover materiales
nueces, frutas extraños.
Secar rápidamente por
debajo de 10% de
humedad
Granos de Proteger los productos
cereales, Incremento y/ o almacenados de
Poscosecha
oleaginosas, presencia de micotoxinas humedad, insectos,
nueces, frutas factores ambientales, etc.

59
 Almacenar los productos
sobre superficies limpias y
secas.
Evaluar todos los
ingredientes añadidos.
Monitorear las
Granos de operaciones de
Poscosecha, Contaminación
cereales, procesamiento y
procesamiento y conducida por
oleaginosas, manufacturación para
manufacturación micotoxinas
nueces, frutas mantener la alta calidad
de los productos.
Seguir buenas prácticas
de manufacturación
Monitorear los niveles de
Transferencias de micotoxinas en los
Leche, carne y
Alimentos para micotoxinas a productos ingredientes del alimento.
productos
animals lácteos, carnes o Evaluar residuos de
avícolas
productos avícolas micotoxinas en los
productos

Tabla Nº 8 Programa de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control

para Combatir las Micotoxinas en Cereales. Fuente: Park et. al. (1999)
6.2.7. Legislación Sobre Micotoxinas

La legislación de contaminantes de alimentos existe en algunos países

desde comienzos del siglo XX. En la actualidad existen leyes de alimentos

que prohíben o limitan la presencia de ciertas sustancias contaminantes

naturales o artificiales, y dentro de los contaminantes naturales se

contemplan las micotoxinas. Luego del descubrimiento de las aflatoxinas

hacia comienzos de la década de los 60, muchos países desarrollaron una

legislación específica para estas micotoxinas. Más adelante fueron incluidas

regulaciones para otras micotoxinas tales como ocratoxina A, deoxinivalenol,

patulina, T-2 toxina, zearalenona, etc.

60
Las concentraciones o niveles máximos permisibles de micotoxinas en

materias primas y alimentos terminados varían de una micotoxina a otra y de

un país a otro.

La regulación de los niveles de micotoxinas en alimentos y materias primas

siempre se ha basado en decisiones tomadas por autoridades específicas

luego de considerar varios factores como:

1. Disponibilidad de información toxicológica: Si no existe esta

información es imposible evaluar el potencial peligro toxicológico de una

sustancia química.

2. Disponibilidad de datos de monitoreo: Permite establecer cuales

sustratos deben ser considerados para la acción reguladora y sirve para

evaluar el potencial peligro de exposición a las micotoxinas en la

población humana y animal.

3. Disponibilidad de métodos de análisis: La obligatoriedad de las

regulaciones para micotoxinas se basa en la capacidad que tengan los

laboratorios disponibles en cada país de identificar y cuantificar las

micotoxinas de una manera precisa.

4. Legislación en países con los cuales se tienen relaciones

comerciales: Acciones regulativas innecesariamente estrictas crean

dificultades de adquirir materias primas a países importadores y dificultan

la venta a los países exportadores.

61
5. Adecuado suministro de alimentos: El espíritu de las reglamentaciones

no debe poner en peligro la disponibilidad de materias primas a precios

razonables. Este factor es en especial importante en países

subdesarrollados.

Es necesario sopesar cada uno de los anteriores factores antes de legislar

con relación a las micotoxinas y debe prevalecer el sentido común al tomar

estas decisiones. Las aflatoxinas por razones de salud pública, deben

mantenerse excluidas de los alimentos de consumo humano en la medida de

las posibilidades, sin embargo, debido a que las micotoxinas son

contaminantes naturales, debe tolerarse presencia de ciertos niveles

mínimos en alimentos y materias primas.

62
 LEGISLACION MUNDIAL DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS
MICOTOXINA PAIS PRODUCTO NIVEL PERMITIDO ENCARGADO
Programa Nacional de
Brasil MAIZ 200ppb Monitoreo y control de
Micotoxinas de Brasil
Todos los
ZEARALENONA Rumania 20ppb
alimentos
Granos,
Antigua Union
Grasas y 1000ppb (1ppm)
Sovietica
Aceites
20ppb alimento destinado
a consumo Humanos,
animales jovenes y vacas
Administración de
lecheras; 100ppb para
alimentos y drogas
Estados Unidos Maiz Aves, cria de bovinos y
(Food and Drug
AFLATOXINA porcinos; 200ppb para
Administration, FDA)
Cerdos de engorde y
200ppb bovinos de
engorde.
Todos los
Mayoria de Pises 10-20ppb
alimentos
Granos y
Cereales Programa Nacional de
Brasil (Arroz, Frijol, 50ppb Monitoreo y control de
Maiz y Micotoxinas de Brasil
OCRATOXINA Cevada)
20ppb alimento destinado
Todos los a consumo de humanos
Checoslovaquia
alimentos adultos; <5ppb a niños y
<1ppb a bebes.
Harina,
Germen de 1ppm para consumo
Trigo y humano
salvado Administración de
10ppm para consumo de alimentos y drogas
Estados Unidos Granos y
bovinos y pollos que no (Food and Drug
subproductos
exceda el 50% de la dieta Administration, FDA)
DON
Granos y 5ppm para consumo de
subproductos cerdos y demas animales.
Todos los 5ppm para consumo de
Rumania
alimentos cerdos y demas animales.
Antigua Union
Trigo 500ppb
Sovietica

Tabla Nº 9 Legislacion Mundial para Micotoxinas en Alimentos[25].

63
6.3 KIT ELISA PARA MICOTOXINAS

Veratox para micotoxinas es un enzimoinmunoanalisis de adsorción directo

competitivo (CD ELISA, por sus siglas en ingles) en un formato de pocillos

que permiten al usuario obtener concentraciones exactas expresadas en

partes por mil millones (ppmm) y partes por millón, según la micotoxina

analizada. Se permite que la micotoxina libre de las muestras y controles

compitan con la micotoxina enzimomarcada (conjugado) por los sitios de

adsorción de los anticuerpos. Tras un lavado, se agrega un sustrato que

reacciona con el conjugado adsorbido para producir el color azul. Más color

azul significa menos micotoxina. El análisis se lee en un lector de pocillos

para obtener densidades ópticas. Con las densidades ópticas de los

controles se traza la curva típica, luego las densidades ópticas de la muestra

se grafican contra esa curva calculando así la concentración exacta de

micotoxina.

El método de ELISA para determinar micotoxinas ha estado disponible por

más de quince años. La tecnología se basa en la capacidad de un anticuerpo

específico para distinguir la estructura tridimensional de una micotoxina

determinada. El ELISA directo competitivo se utiliza comúnmente en el

análisis de micotoxinas. Una placa de ELISA convencional de micro-

valoración consiste en la reacción en equilibrio del complejo antígeno-

anticuerpo.

64
Actualmente, la mayoría de los kits de prueba disponibles comercialmente de

ELISA para las micotoxinas están trabajando en la fase de la cinética de la

unión antígeno-anticuerpo, lo que reduce el tiempo de incubación a minutos.

Aunque la reducción en el tiempo de incubación puede conllevar a una cierta

pérdida de la sensibilidad del ensayo, la técnica puede proporcionar

resultados exactos y reproducibles. Una descripción general del principio del

ELISA directo competitivo se muestra en la Figura Nº6.

Figura Nº 6. Descripción General del Análisis de Micotoxinas de ELISA

Competitivo.
Los resultados de los Kits de ensayo de ELISA se ven favorecidos como

ensayos de alto rendimiento con bajos requisitos de volumen de la muestra

y, a menudo sin realizar prepurificaciones, en comparación con métodos

convencionales tales como CCD y HPLC (Zengh et al.,2006). En la

actualidad existen Kit para diferentes micotoxinas por ejemplo, NEOGEN

para cereales y alimentos balanceados (AFLA, FUM, T2 , OCA, DON y

ZEA)[26].

65
6.4. FOTOMETRIA DE ABSORCION

6.4.1 Generalidades

La fotometría de absorción se refiere al estudio de la absorción de

radiaciones electromagnéticas por las sustancias. El fenómeno en sí, el

comportamiento de las radiaciones como corpúsculos o partículas, el equipo

utilizado, las relaciones, ley o ecuaciones que se han establecido, las

aplicaciones analíticas y limitaciones[27].

Figura Nº 7. Fotometría de Absorción.

6.4.2. Radiación Electromagnética

La radiación electromagnética tiene propiedades ondulatorias y

corpusculares. Los fenómenos de refracción, reflexión, dispersión, etc. son

explicables considerando la radiación electromagnética como ondas. El

efecto fotoeléctrico sugiere que la radiación electromagnética también tiene

comportamiento corpuscular y que ésta radiación consiste de partículas

discretas llamadas fotones, los cuales tienen energías definidas y se

desplazan a la velocidad de la luz[28].

66
[Link]. Espectro Electromagnético

El espectro electromagnético está compuesto por radiación de diferentes

longitudes de onda mientras menor sea la longitud de onda de la radiación,

mayor será la energía del fotón, de acuerdo a la relación de Planck. El

espectro electromagnético se divide en bandas para su clasificación. Cada

una de éstas bandas tiene aplicaciones en espectroscopia y así tenemos la

espectroscopia de: Microondas, de Rayos X, Infrarrojo, Visible, Ultravioleta,

etc.

Figura Nº 8. Espectro Electromagnético.

Figura Nº 9. Rangos Aproximados de Longitud de Onda donde se Ubican los

Colores.

67
[Link]. Absorción de la Radiación

Cuando la radiación pasa a través de una capa transparente de un sólido,

líquido o gas, ciertas frecuencias pueden ser selectivamente removidas a

través de un proceso de absorción. Durante dicho proceso la radiación

electromagnética es transferida al átomo o moléculas que se encuentran en

la muestra; el resultado es que estas partículas son promovidas desde el

estado basal hasta estados de mayor energía o estados excitados. Los

átomos, iones o moléculas disponen de un número limitado de niveles

energéticos, los cuales están cuantizados. Para que ocurra la absorción de

un cierto tipo de radiación, cada fotón incidente deberá ser de una energía

exactamente igual a la diferencia energética entre el estado basal y alguno

de los estados excitados de la especie absorbente. Dado que esas

diferencias en energía son únicas para cada especie, un estudio de las

frecuencias de radiación que son absorbidas por un átomo, ion o molécula,

proporcionará las características específicas de la entidad química en

estudio. Para esto lo que generalmente se hace es graficar Absorbancia

contra longitud de onda. Al gráfico obtenido de esta manera se le llama

ESPECTRO DE ABSORCIÓN. Este espectro es único para cada elemento o

entidad química y podemos decir que dicha gráfica es la huella dactilar de la

especie considerada. La apariencia de un espectro depende de la

complejidad, estado físico y entorno de la especie absorbente[28].

68
6.4.3. Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación

entre la muestra problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la

referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es

llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

[Link]. Transmitancia (T)

Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una muestra y la

energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente

como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida

por la muestra y la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar

puede ser el líquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco

analítico (solución que contiene todos los componentes de la solución

problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida

arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estándar no es

necesariamente 100%, es necesario especificar el estándar con el cual la

muestra es comparada[29,30].

[Link]. Absorbancia(A)

Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia

pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de

69
la transmitancia.T, transmitancia expresada como fracción decimal %T,

transmitancia expresada como porcentaje.

A = - log T = 2 – log %T

Pero. T = P / P0 = 10-abc

Luego A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc

A=abc

Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la

concentración, donde a es una constante de proporcionalidad llamada

absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la

concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b

en centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ξ ) .

Luego

A=ξbc

6.4.4. Leyes de Absorción

[Link]. Ley de Lambert

Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio

homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es

proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad

de la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar

aritméticamente el espesor del medio absorbente (Figura Nº23).

70
 Figura Nº 10. Ley de Lambert.

La siguiente relación matemática da cuenta de esta ley:

P / P0 = e –kb

P0: Intensidad de la luz incidente

P: Intensidad de la luz transmitida

b: Espesor del medio absorbente

k: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud

de onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la

naturaleza del medio.

[Link]. Ley de Beer.

La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente

al aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente,

cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo (Figura Nº24).

71
 Figura Nº 11. Ley de Beer.

La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación:

P / P0 = e -k’c

dónde: Po: Intensidad de la luz incidente

P: Intensidad de la luz transmitida

c: Concentración de la solución

k: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud

de onda de la luz incidente, de la concentración de la solución, y

frecuentemente, de la naturaleza del medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

log P0 / P = a b c ó A=abc

A = log P0 / P = - log T

dónde: a: Absortividad

b: Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)

72
c: Concentración de la solución

P/Po= T

T: Transmitancia

Los términos absorbancia y transmitancia son definidos a continuación

6.4.5. Curva de Calibración.

Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una

muestra problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de

calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco

soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de

cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max) (Figura Nº 26.).

Figura Nº 12. Curva de Calibración.

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta

dicha recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos

73
cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito.

La siguiente ecuación matemática corresponde a dicha función:

A=mc+n

A: Absorbancia.

n: Intercepto de la recta

m: Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a

de la muestra y el espesor b de la cubeta.

Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor

en la gráfica o se reemplaza en la ecuación, para obtener el valor de

concentración del analito. La concentración de la solución problema debe

estar comprendida en el rango de concentración que comprende la curva de

calibración. Si la concentración de la solución problema es menor que la

concentración del estándar más diluido, debe usarse el método de adición

estándar, que consiste en adicionar un volumen determinado de un estándar

concentrado a la solución problema, antes de realizar la lectura y que permite

que esta lectura este dentro de las obtenidas para la curva de calibración. En

el caso contrario, si la concentración del analito es mayor que la

concentración del estándar más concentrado la solución problema deberá

ser diluida.

74
 Figura Nº 13. Interpolación Gráfica.

Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de

máxima absorbancia (λmax.), para obtener una recta con la máxima

pendiente y así tener mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones.

La medición de la absorbancia de la solución problema debe hacerse a la

misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibración.

6.5 ANALIZADOR DE ELISA

El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado, diseñado

para efectuar la lectura de los resultados de una técnica que se utiliza para

determinar la presencia de anticuerpos o antígenos específicos presentes en

una muestra. La técnica se basa en la detección de un antígeno inmovilizado

sobre una fase sólida, mediante anticuerpos que, directa o indirectamente,

producen una reacción cuyo producto puede ser leído por el

espectrofotómetro. Se le conoce también con el nombre de Lector de

ELISA. La palabra ELISA inglesa Assay es el acrónimo de las palabras en

lengua Enzyme-Linked Immunosorbent[8].

75
 Stat Fax 4700

Analizador de Elisa

es un sistema abierto semiautomatizado para

ensayos de Elisa. Es compacto, confiable y

económico. Diseñado específicamente para

ofrecer acceso de pruebas con esta

metodología a cualquier laboratorio

Figura Nº 14. Analizador ELISA.

6.5.1. Especificaciones Técnicas del Analizador Elisa:

• Capacidad de alimentar hasta 3 tiras con las pruebas deseadas

• Pantalla táctil interactiva LCD con la opción de uso con ratón de USB

• Los porta-tiras vienen en dos estilos, 3x12 ó 3x8

• Capacidad de lectura de Bicromática

• El modelo estándar incluye cuatro filtros: 405, 450, 492 y 630 y tiene

capacidad de hasta seis filtros a su elección.

• Filtros disponibles desde 340nm hasta 700 nm.

• Lleva a cabo cálculos de curvas solicitadas por el usuario

• Impresora incluida con capacidad de impresión de gráficos

• La memoria permanente almacena hasta 120 resultados

• Cuenta con 50 canales para almacenaje de pruebas

• Los lectores del Stat Fax® utilizan los filtros del IAD

• Certificaciones: CE NRTL

76
• Dimensiones: 24 x 34 x 13 cms. Peso: 4.5 kgs.

• Velocidad: 3 segundos por lectura

6.5.2. Propósito del Analizador de ELISA

El analizador de ELISA se utiliza para leer el resultado de las pruebas

efectuadas, utilizando la técnica de ELISA.

6.5.3. Principios de Operación

El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado. A diferencia

de los espectrofotómetros convencionales que permiten efectuar lecturas en

un rango amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas de

difracción que limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se

utilizan en la técnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes

de onda comprendidas entre los 400 y los 750 nm (nanómetros), En este

caso, es decir, para la lectura de micotoxinas es de 650nm. Algunos

analizadores operan en el rango ultravioleta y pueden efectuar análisis entre

los 340 y los 700 nm. El sistema óptico utilizado por muchos fabricantes

utiliza la fibra óptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se

encuentra la muestra bajo análisis. La luz que atraviesa la muestra tiene un

diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Un sistema de detección recibe la

energía lumínica, proveniente de la muestra, la amplifica, determina la

absorbancia y, a través de un sistema de lectura, la convierte en datos que

permiten interpretar el resultado de la prueba. También hay analizadores de

ELISA que emplean sistemas lumínicos de doble haz. Las muestras del

77
ensayo de ELISA se colocan en placas de diseño especial, las cuales

disponen de un número definido de pozos o vasos, en los cuales se lleva a

cabo el procedimiento o ensayo.

Son comunes las placas de 8 columnas por 12 filas, con un total de 96

pozos. También existen placas con un mayor número de pozos. Las hay de

384 pozos y la tendencia actual busca aumentar el número de pozos, y

reducir la cantidad de reactivos y el volumen de las muestras requeridas. La

ubicación de los sensores ópticos en el analizador de ELISA varía

dependiendo de los fabricantes. Algunos los colocan sobre la placa

portamuestras, mientras que otros los ponen directamente bajo los pozos de

la placa.

En la actualidad, los analizadores de ELISA disponen de controles regulados

por microprocesadores, interfases de conexión a sistemas de información,

programas de control de procesos y control de calidad que, a través del

computador, permiten la automatización completa de los ensayos

requeridos[31].

78
 7. SECCIÓN EXPERIMENTAL

Las micotoxinas que se evaluaran en este trabajo son las siguientes:

 ZEARALENONA

La zearalenona se produce principalmente por el hongo Fusarium

graminearum. se clasifica como una micotoxina estrogénica, ya que con

frecuencia provoca respuestas estrogénicas en los animales.

 AFLATOXINA

La aflatoxina es una sustancia tóxica y cancerígena producida por ciertas

cepas del moho Aspergillus flavus y A. parasiticus. Los productos más

afectados por las aflatoxinas son el maíz, maní, algodón, sorgo, y la mayoría

de los frutos secos.

 OCRATOXINA

La ocratoxina es comúnmente producida por Aspergillus ochraceus y

Penicillium viridicatum, se puede encontrar en el maíz, la cebada, el café

verde y diversos frutos secos. Es un posible carcinógeno.

 FUMONISINA

Las fumonisinas son producidas por el Fusarium moniliforme y F.

proliferatum. Estos hongos comúnmente infectan el maíz y el arroz, por lo

tanto, es común encontrar fumonisinas en productos alimenticios.

 DEOXINIVALENOL (DON)

79
Comúnmente producido por el Fusarium graminearum. Es un miembro de la

familia de los tricotecenos, es producida por hongos que viven en cereales

como el trigo, maíz, cebada y ensilados.

 T-2 / HT-2

T-2 / HT-2 son toxinas de la familia de los tricotecenos, producidas por varias

especies de hongos del género Fusarium. estas dos micotoxinas son

evaluados con frecuencia juntas.

7.1. MATERIALES Y EQUIPOS

7.1.1. Estándar

Tanto para la evaluación como para la estandarización, se utilizará como

patrón los controles indicados y contenidos en el kit ELISA para el análisis de

micotoxinas.

7.1.2. Muestra de análisis

Como muestra real se utilizarán muestras con concentración conocida

preparadas a partir del estándar de mayor concentración contenido en el kit

ELISA.

7.1.3. Blanco

Como blanco se utilizará:

Solución de metanol 70% para Aflatoxina, Fumonisina, T-2/HT-2 y

Zearalenona; solución de metanol 50% para Ocratoxina y agua destilada

para DON.

80
7.1.4. Equipo

Lector ELISA

El análisis se realizará en un espectrofotómetro UV/VIS modelo Stat Fax

4700 con Portatiras de 3x12 y Certificaciones: CE NRTL, el cual hace parte

del conjunto de equipos para análisis del laboratorio de control de calidad de

CIPA S.A.

Los análisis se realizarán a una longitud de onda de 650nm la cual está

establecida en las especificaciones del kit ELISA.

7.2. SECCIÓN EXPERIMENTAL ANTES DE LA ESTANDARIZACIÓN

Antes del proceso de estandarización serán establecidos por mediciones

programadas los siguientes parámetros.

7.2.1. Límite de detección

Se analizarán 10 blancos, utilizando los blancos descritos en el numeral 7.1.3

[32]
.

Con el lote de datos se calculará el promedio aritmético (Xm), la desviación

estándar (s), el coeficiente de variación (% CV).

El límite de detección del método se calculará como 3 veces la medida de la

desviación estándar LD = 3s

Los criterios de aceptación que tendremos como base serán: coeficiente de

varianza %CV y %Error menores a 10%.

En caso de no cumplir con dichos criterios se realizarán nuevos análisis con

materiales de referencia de concentraciones más elevadas.

81
7.2.2. Límite de cuantificación

Se analizarán 10 blancos, utilizando el blanco descrito en el numeral 7.1.3[32].

El límite de cuantificación se calculará como 10 veces la medida de la

desviación estándar LC = 10s.

7.2.3. Curvas de calibración

La curva de calibración se realizarán con patrones de concentraciones

conocidas de las diferentes micotoxinas así:

 Para Fumonisina de1-6ppm

 Para Aflatoxina de 5-50ppb

 Para Ocratoxina de 2-25ppb

 Para T-2/HT-2 de 25-250ppb

 Para Zearalenona de 25-500ppb

 0,5-6ppm de DON.

Se analizarán tres curvas para cada micotoxina de las cuales se elegirá la

que presente mejor coeficiente de correlación.

7.2.4. Sensibilidad

De la ecuación obtenida de la curva de calibración que se elegirá en el

numeral 7.2.3. el valor de la pendiente corresponderá a la sensibilidad [32].

82
7.2.5. Linealidad

Se analizarán patrones a diferentes concentraciones con el fin de examinar

la correlación entre ellos (coeficiente de correlación) y observar la linealidad

que presenten.

Dichos patrones se prepararán a partir del valor máximo de concentración de

cada micotoxina presentes en el kit ELISA.

7.2.6. Intervalo de trabajo lineal

El rango de trabajo se definirá con base en las concentraciones de los

patrones que presenten mejor linealidad en la curva de calibración [32].

7.3. PROCEDIMIENTO DE ESTANDARIZACIÓN.

El proceso de estandarización consistirá en la corrida de las muestras y el

registro de los resultados necesarios para la determinación de los parámetros

de estandarización. Los ensayos pueden ser continuos o alternos, con una

diferencia máxima de 3 días entre un ensayo y otro (viernes-lunes), [32].

7.3.1. Exactitud

Se analizarán 2 réplicas de cada estándar, a tres concentraciones teóricas

diferentes, durante 5 días[32].

Eb: Estándar bajo, cercano al LC.

Em: Estándar medio, cerca del 50 % del rango de trabajo.

Ea: Estándar alto, cerca del 80 % del rango de trabajo.

83
Con lo cual se calculará: promedio Xm, desviación estándar s, coeficiente de

variación % CV y porcentaje de error % E.

La exactitud será dada por el valor más alto de porcentaje de error %E

arrojado en el análisis, sin importar el estándar en el que se encuentre.

7.3.2. Precisión.

La determinación de la precisión se realizará en función de:

[Link]. Repetibilidad:

Consistirá en medir 2 réplicas de cada estándar (estándar bajo Eb, estándar

medio Em y estándar alto Ea) y de cada muestra, durante 7 días, con los

cuales se calculará: promedio Xm, desviación estándar s, coeficiente de

variación % CV y porcentaje de error %E [32].

[Link]. Repetibilidad intermedia:

Se analizará el grupo de patrones o muestras dos veces el mismo día (en la

mañana y en la tarde)[32].

Para cada grupo de datos se calculará: Xm, s, % CV y % E.

[Link]. Reproducibilidad:

Un analista sustituto analizará, por duplicado, el grupo de estándares y

muestras durante dos días en la estandarización [32].

Para cada grupo de datos se calculará: Xm, s, % CV y % E.

La precisión será dada por el valor mas alto de coeficiente de varianza %CV

arrojado en el analisis, sin importar el estándar en el que se encuentre.

84
7.3.3. Recuperación.

Para esta estandarización no se hallará porcentaje de recuperación (%R)

debido a que no se realizará extracción del analito, ya que el kit contiene los

patrones con las muestras ya extraídas con concentraciones conocidas.

7.3.4. Verificación de la estandarización (análisis de la muestra).

Después que la técnica sea estandarizada, y la muestra real sea extraída de

la muestra de materia prima seleccionada (maíz, salvado de trigo, harina de

arroz, soya), se hará un análisis espectrofotométrico a las mismas

condiciones a las que se analizarán los patrones.

85
 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1. ZEARALENONA

8.1.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En un análisis preliminar para determinar el límite de cuantificación se realizó

una serie de pruebas que constaron en el análisis de muestras reales a

diferentes concentraciones (numerales 7.2.1 y 7.2.2) de las cuales, para

fines prácticos, sólo se muestran los resultados más significativos (pruebas 1,

2 y 3) ver tabla Nº 10.

PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3

CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION
ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA
(ppm) (ppm) (ppm)
2,071 0,03 2,035 11,9 1,999 24,0
2,071 0,05 2,033 12,5 1,998 24,4
2,071 0,03 2,047 8,0 1,984 29,0
2,071 0,05 2,036 11,9 1,985 28,7
2,071 0,05 2,047 7,9 1,995 25,4
2,071 0,05 2,036 11,7 1,984 29,0
2,071 0,03 2,046 8,5 1,999 24,0
2,071 0,03 2,034 12,5 1,984 29,0
2,071 0,06 2,035 12,0 1,999 24,0
2,071 0,03 2,035 12,1 1,985 28,7
PROMEDIO 0,041 PROMEDIO 10,9 PROMEDIO 26,6
DESVIACION 0,012 DESVIACION 1,9 DESVIACION 2,4
CV 29,2 CV 17,7 CV 9,1
LD 0,04 LD 5,8 LD 7,3
LC 0,12 LC 19,3 LC 24,2
%E No aplica %E 12,8 %E 6,5
Tabla Nº 10 Datos y parámetros estadísticos obtenidos para la
determinación del límite de cuantificación y detección con el solvente a
diferentes concentraciones para Zearalenona.

86
Como se muestra en la tabla Nº 10 En la prueba 1, se analizó una muestra

de metanol al 70% como blanco (numeral 7.1.3), pero esta prueba no arrojó

resultados aceptables ya que el coeficiente de varianza %CV es 29,2%, es

decir, mayor al 10% como se estableció anteriormente (numeral 7.2.1).

Se realizó un nuevo ensayo (prueba 2), con una muestra real de

concentración superior estimativa de 12,5ppb encontrándose que el

coeficiente de varianza %CV es mayor al 10%, lo cual no satisface lo

establecido como resultado aceptable (numeral 7.2.1), para ello fue

necesario realizar otro ensayo con una muestra de concentración superior a

ésta (prueba 3), se eligió una concentración de 25 ppb. Teniendo en cuenta

que en la prueba 3 el coeficiente de varianza %CV y el porcentaje de error

%E son menores a 10%, se deduce que a partir de este valor de

concentración la cuantificación del analito es posible.

Las muestras con concentraciones de 12,5ppb y de 25ppb se prepararon por

dilución a partir de un patrón de mayor concentración contenido en el kit

ELISA

Considerando los datos obtenidos en la Tabla N° 10, se dedujo que el Límite

de detección es LD= 7,3ppb y el de cuantificación es LC= 24,2ppb

En la Tabla Nº11. se comparan los datos obtenidos en la estandarización (X

Experimental) con los indicados en el Kit (X Teórico).

87
 X Experimental X Teórico %Error
LD 7,3 10 27,3
LC 24,2 25 3,1
Tabla Nº 11 Comparación entre el límite de detección y cuantificación
obtenidos experimentalmente con los indicados en el kit para Zearalenona.

Con los datos arrojados en la tabla Nº11. Podemos deducir que se

encuentran algunas diferencias ya que el límite de detección reportado por el

kit es un poco mayor al hallado experimentalmente, esto se puede atribuir a

que algunas empresas fabricantes exceden el valor del límite de

cuantificación del producto, en este caso el kit, para no generar errores en

las mediciones con valores cercanos al límite real para disminuir el riesgo de

cometer falsos positivos o falsos negativos. Sin embargo, el límite de

cuantificación presenta un bajo % de error entre el indicado por el kit, como

el hallado experimentalmente.

8.1.2. CALIBRACION

Después de realizar tres curvas de calibración y observar la de mejor

comportamiento se eligió la que arrojó el coeficiente de correlación (R 2) más

cercano a 1. A continuación en la figura N°15 se muestran las tres curvas

analizadas.

88
Figura Nº 15. Curvas Realizadas para la Calibración del Método para
Zearalenona.
89
Para la calibración a través del método espectrométrico se analizaron

patrones con concentraciones que van desde el blanco 0ppb hasta llegar a

500ppb que es la máxima concentración de los patrones incluidos en el kit

ELISA.

Después se realizó la curva de calibración y se eligió la que presenta el

coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. En la Figura Nº16 se

consolidan los resultados de esta curva.

y = -0,003x + 2,0711
ZEARALENONA R² = 0,9993
2,500

2,000
ABSORBANCIA

1,500

1,000

0,500

0,000
0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0 600,0
CONCENTRACION (ppb)

Figura Nº 16. Curva elegida para la calibración del método para

Zearalenona.

CONCENTRACION
ABSORBANCIA
(ppb)
2,088 0,0
1,997 25,0
1,815 75,0
1,623 150,0
0,554 500,0
Tabla Nº 12 Datos correspondientes a la curva de calibración para
Zearalenona.

90
La ecuación de regresión lineal calculada de acuerdo a los datos obtenidos

en la Tabla N°12. fue la siguiente:

Y=-0,003x+2,0711

Los resultados del análisis estadístico realizado a la técnica espectrométrica

para la cuantificación de Zearalenona fueron:

PARAMETRO VALOR
R² 0,9993
SD(ppb) 2,42
RSD(%) 9,10
LD(ppb) 7,3
LC(ppb) 24,2
Sensibilidad
0,003
(Absorbancia/ppb)
Tabla Nº 13 Datos estadísticos para la calibración para Zearalenona.
De acuerdo con los datos obtenidos:

El valor de R² se acercó mucho al valor ideal el cual es 1, esto indica que la

curva de calibración se aproxima a una línea recta, indicando alta correlación

entre las variables.

Según la desviación estándar (SD) y de la desviación estándar relativa

(RSD), el método es repetible y reproducible. Puesto que el valor de RSD no

sobrepasa el 10 %.

El LD reportado es aceptable ya que este es el mínimo cambio reportado por

el equipo espectrofotométrico lo que permite tener un rango de probabilidad

de error muy pequeño. Además este parámetro es un dato cualitativo

permitiendo identificar si el analito de interés se encuentra presente o no, así

91
sea a bajas concentraciones en la muestra a analizar minimizando el riesgo

de cometer falsos positivos y falsos negativos.

El LC reportado es aceptable, debido a que este es el límite inferior para las

medidas cuantitativas precisas, que para efectos de la técnica permite tener

lecturas de bajas concentraciones por debajo del valor máximo permitido.

La sensibilidad del método se tomó como la pendiente de la curva de

calibración (0,003). Se presume que la curva tiene una baja sensibilidad

debido a la utilización de colorantes, que son sensibles al tiempo. También

se observa que la pendiente es negativa, esto se debe a que la relación entre

la concentración de Zearalenona en la muestra y la absorbancia leída por el

equipo es inversamente proporcional, es decir, a mayor intensidad de color,

menor es la concentración de Zearalenona, este comportamiento es debido a

que este es un enzimoinmunoanalizis de adsorción directo competitivo,

donde se permite que la zearalenona libre de las muestras y controles

compita con la zearalenona enzimomarcada (el conjugado) por los sitios de

adsorción de los anticuerpos.

8.1.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN

Para evaluar la precisión y la exactitud se analizaron patrones que

corresponden a: Eb=25ppb, Em=250ppb y Ea=500ppb. Contenidos en el kit

ELISA.

92
[Link]. Precisión

Los datos para evaluar la precisión fueron obtenidos de la siguiente manera:

Para evaluar la repetibilidad se realizaron análisis a 7 muestras de cada

estándar. El análisis se realizó por duplicado, obteniendo así un total de 14

datos para cada estándar. Para repetibilidad intermedia, el análisis se realizó

a 7 muestras de cada estándar en la mañana y 7 en la tarde, todo esto por

duplicado, obteniendo un total de 28 datos de cada estándar. Posteriormente

para evaluar la reproducibilidad se analizaron 7 muestras de cada estándar

por un analista y 7 muestras de cada estándar por un analista sustituto, todo

esto por duplicado, obteniendo así 28 datos de cada estándar. (ver numeral

7.3.2)

Finalmente para hallar los parámetros se realizó tratamiento estadístico a

todos estos datos tal como se presenta en la tabla 14.

PRECISION ZEARALENONA
PARAMETROS REPETIBILIDAD REPETIBILIDAD INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD
ESTADISTICOS Eb Em Ea Eb Em Ea Eb Em Ea
PROMEDIO 24,4 249,7 505,3 24,3 249,6 505,4 24,2 249,8 505,5
DESVIACION 0,4 0,3 0,3 0,6 0,4 0,3 0,6 0,4 0,4
%CV 1,8 0,1 0,1 2,4 0,1 0,1 2,3 0,2 0,1
LD 1,3 1,0 0,9 1,7 1,1 0,9 1,7 1,3 1,2
LC 4,3 3,5 3,1 5,8 3,6 3,0 5,5 4,3 3,9
%ERROR 2,3 0,1 1,1 2,8 0,1 1,1 3,1 0,1 1,1
Tabla Nº 14 Parámetros para la determinación de la precisión en términos de
repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad para Zearalenona.

Según los datos obtenidos para los estándares bajo (25ppb), medio (250ppb)

y alto (500ppb), se puede concluir que el método para la cuantificación de

93
zearalenona es preciso, ya que él %CV o coeficiente de varianza obtenido

bajo condiciones de repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad

es menor a 10%.

[Link] Exactitud

Para la exactitud se analizaron dos muestras de cada estándar diarios

durante 5 días (ver numeral 7.3.1) obteniendo un total de 10 datos para cada

estándar, En la tabla Nº15 Se presentan los datos obtenidos para la

determinación y los resultados de la exactitud.

EXACTITUD ZEARALENONA
PARAMETROS
Eb Em Ea
ESTADISTICOS
A [] A [] A []
1,998 24,4 1,322 249,7 0,556 505,0
DIA 1 2,000 23,7 1,321 250,0 0,556 505,0
1,998 24,4 1,322 249,7 0,554 505,7
DIA 2 2,002 23,0 1,324 249,0 0,555 505,4
1,996 25,0 1,320 250,4 0,554 505,7
DIA 3 1,999 24,0 1,321 250,0 0,556 505,0
2,002 23,0 1,322 249,7 0,554 505,7
DIA 4 1,997 24,7 1,320 250,4 0,556 505,0
1,998 24,4 1,323 249,4 0,556 505,0
DIA 5 1,999 24,0 1,324 249,0 0,555 505,4
PROMEDIO 24,1 249,7 505,3
DESVIACION 0,7 0,5 0,3
CV 2,7 0,2 0,1
LD 2,0 1,4 0,9
LC 6,6 4,8 3,1
%ERROR 3,7 0,1 1,1
Tabla Nº 15 Parámetros para la determinación de la exactitud a tres niveles
de concentración para Zearalenona.

94
Para hallar el valor de la exactitud, fue necesario utilizar el promedio de las

medidas obtenidas en los análisis de los tres estándares, para hallar la

concentración experimental y posteriormente determinar el % de error.

Para el estándar bajo de 25ppb el %E fue de 3,7%, para el estándar medio

de 250ppb fue de 0,1%E y para el estándar alto de 500ppb fue de 1,1%E.

Como se puede observar el porcentaje de error fue menor al 10% en todos

los casos, estos datos reflejan que el método es exacto.

PARAMETRO EXPRESADO EN RESULTADO OBTENIDO

LIMITE DE DETECCION ppb 7,3
LIMITE DE CUANTIFICACION ppb 24,2
SENSIBILIDAD Absorbancia/ppb 0,003
PRECISIÒN %CV 2,4
EXACTITUD %E 3,7
2
R 0,9993
Tabla Nº 16 Parámetros Estadísticos del Método.

8.2. AFLATOXINA

8.2.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En un análisis preliminar para determinar el límite de cuantificación se realizó

una serie de pruebas que constaron en el análisis de muestras reales a

diferentes concentraciones (numerales 7.2.1 y 7.2.2) de las cuales, para fines

prácticos sólo se muestran los resultados más significativos (pruebas 1, 2 y

3) ver tabla Nº 17.

95
 PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3
CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION
ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA
(ppm) (ppm) (ppm)
2,303 0,003 2,206 2,9 2,142 4,7
2,303 0,004 2,210 2,7 2,162 4,2
2,303 0,007 2,231 2,1 2,134 5,0
2,303 0,001 2,210 2,7 2,160 4,2
2,303 0,005 2,228 2,2 2,142 4,7
2,303 0,003 2,232 2,1 2,132 5,0
2,303 0,003 2,229 2,2 2,167 4,0
2,303 0,001 2,230 2,1 2,130 5,1
2,302 0,009 2,210 2,7 2,166 4,1
2,303 0,001 2,230 2,1 2,165 4,1
PROMEDIO 0,004 PROMEDIO 2,4 PROMEDIO 4,5
DESVIACION 0,003 DESVIACION 0,3 DESVIACION 0,5
CV 72,1 CV 13,6 CV 10,0
LD 0,008 LD 1,0 LD 1,4
LC 0,027 LC 3,2 LC 4,5
%E No aplica %E 4,2 %E 9,8
Tabla Nº 17 Datos y parámetros estadísticos obtenidos para la
determinación del límite de cuantificación y detección con el solvente a
diferentes concentraciones para Aflatoxina.
Como se muestra en la tabla Nº 17 En la prueba 1, se analizó una muestra

de metanol al 70% como blanco (numeral 7.1.3), pero esta prueba no arrojó

resultados aceptables ya que el coeficiente de varianza %CV es 72,1%, es

decir, mayor al 10% como se estableció anteriormente (numeral 7.2.1).

Se realizó un nuevo ensayo (prueba 2), con una muestra real de

concentración superior estimativa de 2,5ppb encontrándose que el

coeficiente de varianza %CV es mayor al 10%, lo cual no satisface lo

establecido como resultado aceptable (numeral 7.2.1), para ello fue

necesario realizar otro ensayo con una muestra de concentración superior a

ésta (prueba 3), se eligió una concentración de 5 ppb.

96
Teniendo en cuenta que en la prueba 3 el coeficiente de varianza %CV y el

porcentaje de error %E son menores a 10%, se deduce que a partir de este

valor de concentración la cuantificación del analito es posible.

Las muestras con concentraciones de 2,5ppb y la de 5ppb se prepararon por

dilución a partir de un patrón de mayor concentración contenido en el kit

ELISA

Considerando los datos obtenidos en la Tabla N° 17, se dedujo que el Límite

de detección es LD= 1,4ppb y el de cuantificación es LC= 4,5ppb.

En la Tabla Nº18. se compara los datos obtenidos en la estandarización (X

Experimental) con los indicados en el Kit (X Teórico).

X Experimental X Teórico %Error

LD 1,4 1,4 3,4
LC 4,5 5,0 9,8
Tabla Nº 18 Comparación entre el límite de detección y cuantificación
obtenidos experimentalmente con los indicados en el kit para Aflatoxina.
Con los datos arrojados en la tabla Nº18. Podemos deducir que tanto el límite

de detección como el límite de cuantificación indicado por el kit, como los

hallados experimentalmente presentan porcentajes de error %E menores al

10%, lo que indica que son confiables.

8.2.2. CALIBRACION

Después de realizar tres curvas de calibración y observar la de mejor

comportamiento se eligió la que arrojó el coeficiente de correlación (R2) más

cercano a 1. A continuación en la figura N°17 se muestran las tres curvas

analizadas.

97
Figura Nº 17. Curvas Realizadas para la Calibración del Método para
Aflatoxina.

98
Para la calibración a través del método espectrométrico se analizaron

patrones con concentraciones que van desde el blanco 0ppb hasta llegar a

50ppb que es la máxima concentración de los patrones incluidos en el kit

ELISA.

Después se realizó la curva de calibración y se eligió la que presenta el

coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. En la Figura Nº18 se

consolidan los resultados de esta curva.

AFLATOXINA y = -0,0339x + 2,3028

R² = 0,9993
2,500

2,000
ABSORBANCIA

1,500

1,000

0,500

0,000
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
CONCENTRACION (ppb)

Figura Nº 18. Curva elegida para la calibración del método para Aflatoxina.

CONCENTRACION
ABSORBANCIA
(ppm)

2,320 0,0
2,137 5,0
1,765 15,0
0,616 50,0
Tabla Nº 19 Datos correspondientes a la curva de calibración para
Aflatoxina.

99
La ecuación de regresión lineal calculada de acuerdo a los datos obtenidos

en la Tabla N°19. fue la siguiente:

Y=-0,0339x+2,3028

Los resultados del análisis estadístico realizado a la técnica espectrométrica

para la cuantificación de Aflatoxina fueron:

PARAMETRO VALOR
R² 0,9993
SD(ppb) 0,45
RSD(%) 9,99
LD(ppb) 1,4
LC(ppb) 4,5
Sensibilidad
0,0339
(Absorbancia/ppb)
Tabla Nº 20 Datos estadísticos para la calibración para Aflatoxina.
De acuerdo con los datos obtenidos:

El valor de R² se acercó mucho al valor ideal el cual es 1, esto indica que la

curva de calibración se aproxima a una línea recta, indicando alta correlación

entre las variables.

Según la desviación estándar (SD) y de la desviación estándar relativa

(RSD), el método es repetible y reproducible. Puesto que el valor de RSD no

sobrepasa el 10 %.

El LD reportado es aceptable ya que este es el mínimo cambio reportado por

el equipo espectrofotométrico lo que permite tener un rango de probabilidad

de error muy pequeño. Además este parámetro es un dato cualitativo

permitiendo identificar si el analito de interés se encuentra presente o no, así

100
sea a bajas concentraciones en la muestra a analizar minimizando el riesgo

de cometer falsos positivos y falsos negativos.

El LC reportado es aceptable, debido a que este es el límite inferior para las

medidas cuantitativas precisas, que para efectos de la técnica permite tener

lecturas de bajas concentraciones por debajo del valor máximo permitido.

La sensibilidad del método se tomó como la pendiente de la curva de

calibración (0,0339). Se presume que la curva tiene una baja sensibilidad

debido a la utilización de colorantes, que son sensibles al tiempo. También

se observa que la pendiente es negativa, esto se debe a que la relación entre

la concentración de Aflatoxina en la muestra y la absorbancia leída por el

equipo es inversamente proporcional, es decir, a mayor intensidad de color,

menor es la concentración de Aflatoxina, este comportamiento es debido a

que este es un enzimoinmunoanalizis de adsorción directo competitivo,

donde se permite que la Aflatoxina libre de las muestras y controles compita

con la Aflatoxina enzimomarcada (el conjugado) por los sitios de adsorción

de los anticuerpos.

8.2.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN

Para evaluar la precisión y la exactitud se analizaron patrones que

corresponden a: Eb=5ppb, Em=25ppb y Ea=50ppb. Contenidos en el kit

ELISA.

101
[Link]. Precisión

Los datos para evaluar la precisión fueron obtenidos de la siguiente manera:

Para evaluar la repetibilidad se realizaron análisis a 7 muestras de cada

estándar, el análisis se realizó por duplicado, obteniendo así un total de 14

datos para cada estándar; para repetibilidad intermedia, el análisis se realizó

a 7 muestras de cada estándar en la mañana y 7 en la tarde, todo esto por

duplicado, obteniendo un total de 28 datos de cada estándar. Posteriormente

para evaluar la reproducibilidad se analizaron 7 muestras de cada estándar

por un analista y 7 muestras de cada estándar por un analista sustituto, todo

esto por duplicado, obteniendo así 28 datos de cada estándar. (Ver numeral

7.3.2)

Finalmente para hallar los parámetros se realizó tratamiento estadístico a

todos estos datos tal como se presenta en la tabla Nº21.

PRECISION AFLATOXINA
PARAMETROS REPETIBILIDAD REPETIBILIDAD INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD
ESTADISTICOS Eb Em Ea Eb Em Ea Eb Em Ea
PROMEDIO 4,9 25,0 49,8 4,9 25,0 49,8 4,9 25,0 49,8
DESVIACION 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
CV 0,4 0,1 0,1 0,4 0,1 0,0 0,6 0,1 0,0
LD 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
LC 0,2 0,3 0,3 0,2 0,3 0,2 0,3 0,3 0,2
%ERROR 2,3 0,1 0,5 2,1 0,0 0,5 1,9 0,0 0,5
Tabla Nº 21 Parámetros para la determinación de la precisión en términos de
repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad para Aflatoxina.

Según los datos obtenidos para los estándares bajo (5ppb), medio (25ppb) y

alto (50ppb), se puede concluir que el método para la cuantificación de

102
Aflatoxina es preciso, ya que el %CV o coeficiente de varianza obtenido bajo

condiciones de repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad es

menor a 10%.

[Link] Exactitud

Para la exactitud se analizaron dos muestras de cada estándar diarios

durante 5 dias (ver numeral 7.3.1) obteniendo un total de 10 datos para cada

estándar, En la tabla Nº22 Se presenta los datos obtenidos para la

determinación y los resultados de la exactitud.

EXACTITUD AFLATOXINA
PARAMETROS
Eb Em Ea
ESTADISTICOS
A [] A [] A []
2,136 4,9 1,455 25,0 0,615 49,8
DIA 1 2,137 4,9 1,456 25,0 0,616 49,8
2,137 4,9 1,457 24,9 0,617 49,7
DIA 2 2,136 4,9 1,455 25,0 0,614 49,8
2,137 4,9 1,458 24,9 0,615 49,8
DIA 3 2,136 4,9 1,455 25,0 0,615 49,8
2,137 4,9 1,456 25,0 0,615 49,8
DIA 4 2,137 4,9 1,455 25,0 0,616 49,8
2,137 4,9 1,457 24,9 0,616 49,8
DIA 5 2,136 4,9 1,457 24,9 0,616 49,8
PROMEDIO 4,9 25,0 49,8
DESVIACION 0,0 0,0 0,0
CV 0,3 0,1 0,1
LD 0,0 0,1 0,1
LC 0,2 0,3 0,3
%ERROR 1,9 0,1 0,5
Tabla Nº 22 Parámetros para la determinación de la exactitud a tres niveles
de concentración para Aflatoxina.

103
Para hallar el valor de la exactitud, fue necesario utilizar el promedio de las

medidas obtenidas en los análisis de los tres estándares, para hallar la

concentración experimental y posteriormente determinar el % de error.

Para el estándar bajo de 5ppb el % error fue de 1,9%, para el estándar medio

de 25ppb fue de 0,1%E y para el estándar alto de 50ppb fue de 0,5%E. como

se puede observar el porcentaje de error fue menor al 10% en todos los

casos, estos datos reflejan que el método es exacto.

PARAMETRO EXPRESADO EN RESULTADO OBTENIDO

LIMITE DE DETECCION ppb 1,4
LIMITE DE CUANTIFICACION ppb 4,5
SENSIBILIDAD Absorbancia/ppb 0,0339
PRECISIÒN %CV 0,6
EXACTITUD %E 1,9
2
R 0,9993
Tabla Nº 23 Parámetros Estadísticos del Método.

8.3. OCRATOXINA

8.3.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En un análisis preliminar para determinar el límite de cuantificación se realizó

una serie de pruebas que constaron en el análisis de muestras reales a

diferentes concentraciones (numerales 7.2.1 y 7.2.2) de las cuales, para fines

prácticos, sólo se muestran los resultados más significativos (pruebas 1, 2 y

3). Ver tabla Nº 24.

104
 PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3

CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION

ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA
(ppm) (ppm) (ppm)

2,720 0,002 2,648 1,0 2,574 2,1

2,720 0,003 2,644 1,1 2,557 2,3
2,720 0,001 2,650 1,0 2,556 2,3
2,720 0,006 2,669 0,7 2,579 2,0
2,720 0,003 2,647 1,0 2,580 2,0
2,720 0,007 2,632 1,3 2,556 2,3
2,720 0,008 2,632 1,3 2,591 1,8
2,720 0,002 2,651 1,0 2,579 2,0
2,720 0,001 2,666 0,8 2,553 2,4
2,720 0,005 2,654 0,9 2,578 2,0
PROMEDIO 0,004 PROMEDIO 1,0 PROMEDIO 2,1
DESVIACION 0,003 DESVIACION 0,2 DESVIACION 0,2
CV 66,6 CV 17,2 CV 9,0
LD 0,008 LD 0,5 LD 0,6
LC 0,025 LC 1,7 LC 1,9
%E No aplica %E 0,4 %E 6,1
Tabla Nº 24 Datos y parámetros estadísticos obtenidos para la
determinación del límite de cuantificación y detección con el solvente a
diferentes concentraciones para Ocratoxina.
Como se muestra en la tabla Nº 24 En la prueba 1, se analizó una muestra

de metanol al 50% como blanco (numeral 7.1.3), pero esta prueba no arrojó

resultados aceptables ya que el coeficiente de varianza %CV es 66,6%, es

decir, mayor al 10% como se estableció anteriormente (numeral 7.2.1).

Se realizó un nuevo ensayo (prueba 2), con una muestra real de

concentración superior estimativa de 1ppb encontrándose que el coeficiente

de varianza %CV es mayor al 10%, lo cual no satisface lo establecido como

resultado aceptable (numeral 7.2.1), para ello fue necesario realizar otro

ensayo con una muestra de concentración superior a ésta (prueba 3), se

105
eligió una concentración de 2ppb. Teniendo en cuenta que en la prueba 3 el

coeficiente de varianza %CV y el porcentaje de error %E son menores a

10%, se deduce que a partir de este valor de concentración la cuantificación

del analito es posible.

Las muestras con concentraciones de 1ppb y la de 2ppb se prepararon por

dilución a partir de un patrón de mayor concentración contenido en el kit

ELISA

Considerando los datos obtenidos en la Tabla Nº 24, se dedujo que el Límite

de detección es LD= 0,6ppb y el de cuantificación es LC= 1,9ppb.

En la Tabla Nº25. Se compara los datos obtenidos en la estandarización (X

Experimental) con los indicados en el Kit (X Teórico).

X Experimental X Teórico %Error

LD 0,6 1,0 43,0
LC 1,9 2,0 5,0
Tabla Nº 25 Comparación entre el límite de detección y cuantificación
obtenidos experimentalmente con los indicados en el kit para Ocratoxina.
Con los datos arrojados en la tabla Nº25. Podemos deducir que se

encuentran algunas diferencias ya que el límite de detección reportado por el

kit es un poco mayor al hallado experimentalmente, esto se puede atribuir a

que algunas empresas fabricantes exceden el valor del límite de

cuantificación del producto, en este caso el kit, para no generar errores en

las mediciones con valores cercanos al límite real para disminuir el riesgo de

cometer falsos positivos o falsos negativos. Sin embargo, el límite de

106
cuantificación presenta un bajo % de error entre el indicado por el kit, como

el hallado experimentalmente.

8.3.2. CALIBRACION

Después de realizar tres curvas de calibración y observar la de mejor

comportamiento se eligió la que arrojó el coeficiente de correlación (R2) más

cercano a 1. A continuación en la figura N°19 se muestran las tres curvas

analizadas.

107
 Figura Nº 19 Curvas Realizadas para la Calibración del Método para
Ocratoxina.

Para la calibración a través del método espectrométrico se analizaron

patrones con concentraciones que van desde el blanco 0ppb hasta llegar a

25ppb que es la máxima concentración de los patrones incluidos en el kit

ELISA.

Después se realizó la curva de calibración y se eligió la que presenta el

coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. En la Figura Nº20 se

consolidan los resultados de esta curva.

108
 OCRATOXINA y = -0,0708x + 2,7204
R² = 0,9997
3,000

2,500

ABSORBANCIA 2,000

1,500

1,000

0,500

0,000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0
CONCENTRACION (ppb)

Figura Nº 20 Curva elegida para la calibración del método para Ocratoxina.

CONCENTRACION
ABSORBANCIA
(ppm)

2,725 0,0
2,584 2,0
2,372 5,0
1,991 10,0
0,958 25,0
Tabla Nº 26 Datos correspondientes a la curva de calibración para
Ocratoxina.

La ecuación de regresión lineal calculada de acuerdo a los datos obtenidos

en la Tabla N°26. fue la siguiente:

Y=-0,0708x+2,7204

Los resultados del análisis estadístico realizado a la técnica espectrométrica

para la cuantificación de Ocratoxina fueron:

109
 PARAMETRO VALOR
R² 0,9997
SD(ppb) 0,19
RSD(%) 8,96
LD(ppb) 0,6
LC(ppb) 1,9
Sensibilidad
0,0708
(Absorbancia/ppb)
Tabla Nº 27 Datos estadísticos para la calibración para Ocratoxina.

De acuerdo con los datos obtenidos:

El valor de R² se acercó mucho al valor ideal el cual es 1, esto indica que la

curva de calibración se aproxima a una línea recta, indicando alta correlación

entre las variables.

Según la desviación estándar (SD) y de la desviación estándar relativa

(RSD), el método es repetible y reproducible. Puesto que el valor de RSD no

sobrepasa el 10 %.

El LD reportado es aceptable ya que este es el mínimo cambio reportado por

el equipo espectrofotométrico lo que permite tener un rango de probabilidad

de error muy pequeño. Además este parámetro es un dato cualitativo

permitiendo identificar si el analito de interés se encuentra presente o no, así

sea a bajas concentraciones en la muestra a analizar minimizando el riesgo

de cometer falsos positivos y falsos negativos.

110
El LC reportado es aceptable, debido a que este es el límite inferior para las

medidas cuantitativas precisas, que para efectos de la técnica permite tener

lecturas de bajas concentraciones por debajo del valor máximo permitido.

La sensibilidad del método se tomó como la pendiente de la curva de

calibración (0,0708). Se presume que la curva tiene una baja sensibilidad

debido a la utilización de colorantes, que son sensibles al tiempo. También

se observa que la pendiente es negativa, esto se debe a que la relación entre

la concentración de Ocratoxina en la muestra y la absorbancia leída por el

equipo es inversamente proporcional, es decir, a mayor intensidad de color,

menor es la concentración de Ocratoxina, este comportamiento es debido a

que este es un enzimoinmunoanalizis de adsorción directo competitivo,

donde se permite que la Ocratoxina libre de las muestras y controles compita

con la Ocratoxina enzimomarcada (el conjugado) por los sitios de adsorción

de los anticuerpos.

8.3.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN

Para evaluar la precisión y la exactitud se analizaron patrones que

corresponden a: Eb=2ppb, Em=15ppb y Ea=25ppb. Contenidos en el kit

ELISA.

111
[Link]. Precisión

Los datos para evaluar la precisión fueron obtenidos de la siguiente manera:

Para evaluar la repetibilidad se realizaron análisis a 7 muestras de cada

estándar, el análisis se realizó por duplicado, obteniendo así un total de 14

datos para cada estándar; para repetibilidad intermedia, el análisis se realizó

a 7 muestras de cada estándar en la mañana y 7 en la tarde, todo esto por

duplicado, obteniendo un total de 28 datos de cada estándar. Posteriormente

para evaluar la reproducibilidad se analizaron 7 muestras de cada estándar

por un analista y 7 muestras de cada estándar por un analista sustituto, todo

esto por duplicado, obteniendo así 28 datos de cada estándar. (ver numeral

7.3.2)

Finalmente para hallar los parámetros se realizó tratamiento estadístico a

todos estos datos tal como se presenta en la tabla Nº28.

PRECISION OCRATOXINA
PARAMETROS REPETIBILIDAD REPETIBILIDAD INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD
ESTADISTICOS Eb Em Ea Eb Em Ea Eb Em Ea
PROMEDIO 1,9 15,0 24,9 1,9 15,0 24,9 1,9 15,0 24,9
DESVIACION 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
CV 0,5 0,1 0,0 0,6 0,1 0,0 0,6 0,1 0,0
LD 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
LC 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
%ERROR 3,8 0,1 0,4 4,1 0,1 0,4 4,1 0,1 0,4
Tabla Nº 28 Parámetros para la determinación de la precisión en términos de
repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad para Ocratoxina.

Según los datos obtenidos para los estándares bajo (2ppb), medio (15ppb) y

alto (25ppb), se puede concluir que el método para la cuantificación de

112
Ocratoxina es preciso, ya que el %CV o coeficiente de varianza obtenido

bajo condiciones de repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad

es menor a 10%.

[Link] Exactitud

Para la exactitud se analizaron dos muestras de cada estándar diarios

durante 5 dias (ver numeral 7.3.1) obteniendo un total de 10 datos para cada

estándar, En la tabla Nº29 Se presenta los datos obtenidos para la

determinación y los resultados de la exactitud.

EXACTITUD OCRATOXINA
PARAMETROS
Eb Em Ea
ESTADISTICOS
A [] A [] A []
2,584 1,9 1,658 15,0 0,957 24,9
DIA 1 2,584 1,9 1,658 15,0 0,957 24,9
2,584 1,9 1,657 15,0 0,956 24,9
DIA 2 2,584 1,9 1,657 15,0 0,957 24,9
2,585 1,9 1,657 15,0 0,957 24,9
DIA 3 2,584 1,9 1,658 15,0 0,958 24,9
2,586 1,9 1,657 15,0 0,957 24,9
DIA 4 2,586 1,9 1,657 15,0 0,956 24,9
2,584 1,9 1,657 15,0 0,957 24,9
DIA 5 2,586 1,9 1,658 15,0 0,957 24,9
PROMEDIO 1,9 15,0 24,9
DESVIACION 0,0 0,0 0,0
CV 0,7 0,0 0,0
LD 0,0 0,0 0,0
LC 0,1 0,1 0,1
%ERROR 4,2 0,1 0,4
Tabla Nº 29 Parámetros para la determinación de la exactitud a tres niveles
de concentración para Ocratoxina.

113
Para hallar el valor de la exactitud, fue necesario utilizar el promedio de las

medidas obtenidas en los análisis de los tres estándares, para hallar la

concentración experimental y posteriormente determinar el % de error.

Para el estándar bajo de 2ppb el % error fue de 4,2%, para el estándar medio

de 15ppb fue de 0,1%E y para el estándar alto de 25ppb fue de 0,4%E. como

se puede observar el porcentaje de error fue menor al 10% en todos los

casos, estos datos reflejan que el método es exacto.

PARAMETRO EXPRESADO EN RESULTADO OBTENIDO

LIMITE DE DETECCION ppb 0,6
LIMITE DE CUANTIFICACION ppb 1,9
SENSIBILIDAD Absorbancia/ppb 0,0708
PRECISIÒN %CV 0,6
EXACTITUD %E 4,2
2
R 0,9997
Tabla Nº 30 Parámetros Estadísticos del Método.

8.4. FUMONISINA

8.4.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En un análisis preliminar para determinar el límite de cuantificación se realizó

una serie de pruebas que constaron en el análisis de muestras reales a

diferentes concentraciones (numerales 7.2.1 y 7.2.2) de las cuales, para fines

prácticos, sólo se muestran los resultados más significativos (pruebas 1, 2 y

3). Ver tabla Nº 31.

114
 PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3
CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION
ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA
(ppm) (ppm) (ppm)
2,550 0,02 2,379 0,5 2,297 0,8
2,550 0,02 2,376 0,5 2,299 0,8
2,552 0,01 2,392 0,5 2,238 1,0
2,550 0,02 2,379 0,5 2,240 1,0
2,550 0,02 2,413 0,4 2,241 1,0
2,552 0,01 2,415 0,4 2,297 0,8
2,553 0,01 2,411 0,4 2,247 1,0
2,551 0,02 2,412 0,4 2,240 1,0
2,552 0,01 2,375 0,5 2,299 0,9
2,548 0,03 2,411 0,4 2,238 1,0
PROMEDIO 0,02 PROMEDIO 0,5 PROMEDIO 0,9
DESVIACION 0,00 DESVIACION 0,1 DESVIACION 0,1
CV 28,7 CV 11,2 CV 9,9
LD 0,01 LD 0,2 LD 0,3
LC 0,04 LC 0,5 LC 0,9
%E No aplica %E 3,2 %E 9,4
Tabla Nº 31 Datos y parámetros estadísticos obtenidos para la
determinación del límite de cuantificación y detección con el solvente a
diferentes concentraciones para Fumonisina.

Como se muestra en la tabla Nº 31 En la prueba 1, se analizó una muestra

de metanol al 70% como blanco (numeral 7.1.3), pero esta prueba no arrojó

resultados aceptables ya que el coeficiente de varianza %CV es 28,7%, es

decir, mayor al 10% como se estableció anteriormente (numeral 7.2.1).

Se realizó un nuevo ensayo (prueba 2), con una muestra real de

concentración superior estimativa de 0,5ppm encontrándose que el

coeficiente de varianza %CV es mayor al 10%, lo cual no satisface lo

establecido como resultado aceptable (numeral 7.2.1), para ello fue

necesario realizar otro ensayo con una muestra de concentración superior a

ésta (prueba 3), se eligió una concentración de 1ppm. Teniendo en cuenta

115
que en la prueba 3 el coeficiente de varianza %CV y el porcentaje de error

%E son menores a 10%, se deduce que a partir de este valor de

concentración la cuantificación del analito es posible.

Las muestras con concentraciones de 0,5ppm y la de 1ppm se prepararon

por dilución a partir de un patrón de mayor concentración contenido en el kit

ELISA

Considerando los datos obtenidos en la Tabla N° 31, se dedujo que el Límite

de detección es LD= 0,3ppm y el de cuantificación es LC= 0,9ppm.

En la Tabla Nº32. se compara los datos obtenidos en la estandarización (X

Experimental) con los indicados en el Kit (X Teórico).

X Experimental X Teórico %Error

LD 0,3 0,2 35,1
LC 0,9 1,0 9,9
Tabla Nº 32 Comparación entre el límite de detección y cuantificación
obtenidos experimentalmente con los indicados en el kit para Fumonisina.

Con los datos arrojados en la tabla Nº32. Podemos deducir que se

encuentran algunas diferencias ya que el límite de detección reportado por el

kit es un poco mayor al hallado experimentalmente, esto se puede atribuir a

que algunas empresas fabricantes exceden el valor del límite de

cuantificación del producto, en este caso el kit, para no generar errores en

las mediciones con valores cercanos al límite real para disminuir el riesgo de

cometer falsos positivos o falsos negativos. Sin embargo, el límite de

116
cuantificación presenta un bajo % de error entre el indicado por el kit, como

el hallado experimentalmente.

8.4.2. CALIBRACION

Después de realizar tres curvas de calibración y observar la de mejor

comportamiento se eligió la que arrojó el coeficiente de correlación (R2) más

cercano a 1. A continuación en la figura N°21 se muestran las tres curvas

analizadas.

117
 Figura Nº 21 Curvas Realizadas para la Calibración del Método para
Fumonisina.

Para la calibración a través del método espectrométrico se analizaron

patrones con concentraciones que van desde el blanco 0ppm hasta llegar a

6ppm que es la máxima concentración de los patrones incluidos en el kit

ELISA.

Después se realizó la curva de calibración y se eligió la que presenta el

coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. En la Figura Nº22 se

consolidan los resultados de esta curva.

118
 FUMONISINA
y = -0,3295x + 2,5558
R² = 0,9992
3,000

2,500
ABSORBANCIA
2,000

1,500

1,000

0,500

0,000
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0
CONCENTRACION (ppm)

Figura Nº 22 Curva elegida para la calibración del método para Fumonisina.

CONCENTRACION
ABSORBANCIA
(ppm)

2,558 0,0
2,232 1,0
1,905 2,0
1,200 4,0
0,600 6,0
Tabla Nº 33 Datos correspondientes a la curva de calibración para
Fumonisina.

La ecuación de regresión lineal calculada de acuerdo a los datos obtenidos

en la Tabla N°33. fue la siguiente:

Y=-0,3295x+2,5558

Los resultados del análisis estadístico realizado a la técnica espectrométrica

para la cuantificación de Fumonisina fueron:

119
 PARAMETRO VALOR
R² 0,9992
SD(ppm) 0,09
RSD(%) 9,95
LD(ppm) 0,3
LC(ppm) 0,9
Sensibilidad
0,3295
(Absorbancia/ppm)
Tabla Nº 34 Datos estadísticos para la calibración para Fumonisina.

De acuerdo con los datos obtenidos:

El valor de R² se acercó mucho al valor ideal el cual es 1, esto indica que la

curva de calibración se aproxima a una línea recta, indicando alta correlación

entre las variables.

Según la desviación estándar (SD) y de la desviación estándar relativa

(RSD), el método es repetible y reproducible. Puesto que el valor de RSD no

sobrepasa el 10 %.

El LD reportado es aceptable ya que este es el mínimo cambio reportado por

el equipo espectrofotométrico lo que permite tener un rango de probabilidad

de error muy pequeño. Además este parámetro es un dato cualitativo

permitiendo identificar si el analito de interés se encuentra presente o no, así

sea a bajas concentraciones en la muestra a analizar minimizando el riesgo

de cometer falsos positivos y falsos negativos.

120
El LC reportado es aceptable, debido a que este es el límite inferior para las

medidas cuantitativas precisas, que para efectos de la técnica permite tener

lecturas de bajas concentraciones por debajo del valor máximo permitido.

La sensibilidad del método se tomó como la pendiente de la curva de

calibración (0,3295).Se presume que la curva tiene una baja sensibilidad

debido a la utilización de colorantes, que son sensibles al tiempo. También

se observa que la pendiente es negativa, esto se debe a que la relación entre

la concentración de Fumonisina en la muestra y la absorbancia leída por el

equipo es inversamente proporcional, es decir, a mayor intensidad de color,

menor es la concentración de Fumonisina, este comportamiento es debido a

que este es un enzimoinmunoanalizis de adsorción directo competitivo,

donde se permite que la Fumonisina libre de las muestras y controles

compita con la Fumonisina enzimomarcada (el conjugado) por los sitios de

adsorción de los anticuerpos.

8.4.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN

Para evaluar la precisión y la exactitud se analizaron patrones que

corresponden a: Eb=1ppm, Em=3ppm y Ea=6ppm. Contenidos en el kit

ELISA.

121
[Link]. Precisión

Los datos para evaluar la precisión fueron obtenidos de la siguiente manera:

Para evaluar la repetibilidad se realizaron análisis a 7 muestras de cada

estándar, el análisis se realizó por duplicado, obteniendo así un total de 14

datos para cada estándar; para repetibilidad intermedia, el análisis se realizó

a 7 muestras de cada estándar en la mañana y 7 en la tarde, todo esto por

duplicado, obteniendo un total de 28 datos de cada estándar y por ultimo

para reproducibilidad se analizaron 7 muestras de cada estándar por un

analista y 7 muestras de cada estándar por un analista sustituto, todo esto

por duplicado, obteniendo así 28 datos de cada estándar. (ver numeral 7.3.2)

Finalmente para hallar los parámetros se realizo tratamiento estadístico a

todos estos datos tal como se presenta en la tabla Nº35.

PRECISION FUMONISINA
PARAMETROS REPETIBILIDAD REPETIBILIDAD INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD
ESTADISTICOS Eb Em Ea Eb Em Ea Eb Em Ea
PROMEDIO 1,0 3,0 5,9 1,0 3,0 5,9 1,0 3,0 5,9
DESVIACION 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
CV 0,3 0,1 0,0 0,2 0,1 0,0 0,3 0,1 0,1
LD 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
LC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
%ERROR 1,8 0,0 1,1 1,5 0,0 1,1 1,4 0,1 1,1
Tabla Nº 35 Parámetros para la determinación de la precisión en términos de
repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad para Fumonisina.

Según los datos obtenidos para los estándares bajo (1ppm), medio (3ppm) y

alto (6ppm), se puede concluir que el método para la cuantificación de

122
Fumonisina es preciso, ya que el %CV o coeficiente de varianza obtenido

bajo condiciones de repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad

es menor a 10%.

[Link] Exactitud

Para la exactitud se analizaron dos muestras de cada estándar diarios

durante 5 dias (ver numeral 7.3.1) obteniendo un total de 10 datos para cada

estándar, En la tabla Nº36 Se presenta los datos obtenidos para la

determinación y los resultados de la exactitud.

EXACTITUD FUMONISINA
PARAMETROS
Eb Em Ea
ESTADISTICOS
A [] A [] A []
2,231 1,0 1,567 3,0 0,600 5,9
DIA 1 2,232 1,0 1,565 3,0 0,601 5,9
2,231 1,0 1,566 3,0 0,601 5,9
DIA 2 2,232 1,0 1,567 3,0 0,600 5,9
2,232 1,0 1,566 3,0 0,600 5,9
DIA 3 2,231 1,0 1,566 3,0 0,600 5,9
2,230 1,0 1,564 3,0 0,602 5,9
DIA 4 2,232 1,0 1,568 3,0 0,600 5,9
2,231 1,0 1,567 3,0 0,601 5,9
DIA 5 2,233 1,0 1,565 3,0 0,599 5,9
PROMEDIO 1,0 3,0 5,9
DESVIACION 0,0 0,0 0,0
CV 0,3 0,1 0,0
LD 0,0 0,0 0,0
LC 0,0 0,0 0,0
%ERROR 1,6 0,1 1,1
Tabla Nº 36 Parámetros para la determinación de la exactitud a tres niveles
de concentración para Fumonisina.

123
Para hallar el valor de la exactitud, fue necesario utilizar el promedio de las

medidas obtenidas en los análisis de los tres estándares, para hallar la

concentración experimental y posteriormente determinar el % de error.

Para el estándar bajo de 1ppm el % error fue de 1,6%, para el estándar

medio de 3ppm fue de 0,1%E y para el estándar alto de 6ppm fue de 1,1%E.

como se puede observar el porcentaje de error fue menor al 10% en todos

los casos, estos datos reflejan que el método es exacto.

PARAMETRO EXPRESADO EN RESULTADO OBTENIDO

LIMITE DE DETECCION ppm 0,3
LIMITE DE CUANTIFICACION ppm 0,9
SENSIBILIDAD Absorbancia/ppm 0,3295
PRECISIÒN %CV 0,3
EXACTITUD %E 1,6
2
R 0,9992
Tabla Nº 37 Parámetros Estadísticos del Método.

8.5. DON

8.5.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En un análisis preliminar para determinar el límite de cuantificación se realizó

una serie de pruebas que constaron en el análisis de muestras reales a

diferentes concentraciones (numerales 7.2.1 y 7.2.2) de las cuales, para fines

prácticos, sólo se muestran los resultados más significativos (pruebas 1, 2 y

3). Ver tabla Nº38.

124
 PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3
CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION
ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA
(ppm) (ppm) (ppm)
2,890 0,002 2,795 0,3 2,667 0,6
2,890 0,001 2,788 0,3 2,702 0,5
2,890 0,002 2,829 0,2 2,679 0,6
2,890 0,001 2,815 0,2 2,668 0,6
2,888 0,005 2,814 0,2 2,699 0,5
2,888 0,007 2,813 0,2 2,701 0,5
2,890 0,001 2,811 0,2 2,702 0,5
2,888 0,006 2,820 0,2 2,710 0,5
2,890 0,002 2,816 0,2 2,710 0,5
2,889 0,003 2,815 0,2 2,711 0,5
PROMEDIO 0,003 PROMEDIO 0,2 PROMEDIO 0,5
DESVIACION 0,002 DESVIACION 0,0 DESVIACION 0,05
CV 73,7 CV 15,3 CV 8,8
LD 0,007 LD 0,1 LD 0,14
LC 0,022 LC 0,3 LC 0,45
%E No aplica %E 16,4 %E 3,8
Tabla Nº 38 Datos y parámetros estadísticos obtenidos para la
determinación del límite de cuantificación y detección con el solvente a
diferentes concentraciones para DON.
Como se muestra en la tabla Nº 38 En la prueba 1, se analizó una muestra

de Agua destilada como blanco (numeral 7.1.3), pero esta prueba no arrojó

resultados aceptables ya que el coeficiente de varianza %CV es 73,7%, es

decir, mayor al 10% como se estableció anteriormente (numeral 7.2.1).

Se realizó un nuevo ensayo (prueba 2), con una muestra real de

concentración superior estimativa de 0,2ppm encontrándose que el

coeficiente de varianza %CV es mayor al 10%, lo cual no satisface lo

establecido como resultado aceptable (numeral 7.2.1), para ello fue

necesario realizar otro ensayo con una muestra de concentración superior a

ésta (prueba 3), se eligió una concentración de 0,5ppm. Teniendo en cuenta

que en la prueba 3 el coeficiente de varianza %CV y el porcentaje de error

125
%E son menores a 10%, se deduce que a partir de este valor de

concentración la cuantificación del analito es posible.

Las muestras con concentraciones de 0,2ppm y de 0,5ppm se prepararon

por dilución a partir de un patrón de mayor concentración contenido en el kit

ELISA

Considerando los datos obtenidos en la Tabla N° 38, se dedujo que el Límite

de detección es LD= 0,14ppm y el de cuantificación es LC= 0,45ppm.

En la Tabla Nº39. se compara los datos obtenidos en la estandarización (X

Experimental) con los indicados en el Kit (X Teórico).

X Experimental X Teórico %Error

LD 0,14 0,1 36,28
LC 0,45 0,5 9,14
Tabla Nº 39 Comparación entre el límite de detección y cuantificación
obtenidos experimentalmente con los indicados en el kit para DON.

Con los datos arrojados en la tabla Nº39. Podemos deducir que ni el límite

de detección ni el límite de cuantificación presentan porcentaje de error, es

decir, ambos parámetros dieron un valor exacto al indicado por el kit,.

8.5.2. CALIBRACION

Después de realizar tres curvas de calibración y observar la de mejor

comportamiento se eligió la que arrojó el coeficiente de correlación (R2) más

cercano a 1. A continuación en la figura N°23 se muestran las tres curvas

analizadas.

126
Figura Nº 23 Curvas Realizadas para la Calibración del Método para DON.

127
Para la calibración a traves del método espectrométrico se analizaron

patrones con concentraciones que van desde el blanco 0ppm hasta llegar a

6ppm que es la máxima concentración de los patrones incluidos en el kit

ELISA.

Después se realizó la curva de calibración y se eligió la que presenta el

coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. En la Figura Nº24 se

consolidan los resultados de esta curva.

y = -0,3765x + 2,8903
DON R² = 0,9995
3,500
3,000
2,500
ABSORBANCIA

2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
CONCENTRACION (ppm)

Figura Nº 24 Curva elegida para la calibración del método para DON.

CONCENTRACION
ABSORBANCIA
(ppm)
2,903 0,0
2,714 0,5
2,478 1,0
2,146 2,0
0,633 6,0
Tabla Nº 40 Datos correspondientes a la curva de calibración para DON.

128
La ecuación de regresión lineal calculada de acuerdo a los datos obtenidos

en la Tabla N°40. fue la siguiente:

Y=-0,3765x+2,8903

Los resultados del análisis estadístico realizado a la técnica espectrométrica

para la cuantificación de DON fueron:

PARAMETRO VALOR
R² 0,9995
SD(ppb) 0,05
RSD(%) 8,76
LD(ppb) 0,1
LC(ppb) 0,5
Sensibilidad
0,3765
(Absorbancia/ppb)
Tabla Nº 41 Datos estadísticos para la calibración para DON.
De acuerdo con los datos obtenidos:

El valor de R² se acercó mucho al valor ideal el cual es 1, esto indica que la

curva de calibración se aproxima a una línea recta, indicando alta correlación

entre las variables.

Según la desviación estándar (SD) y de la desviación estándar relativa

(RSD), el método es repetible y reproducible. Puesto que el valor de RSD no

sobrepasa el 10 %.

El LD reportado es aceptable ya que este es el mínimo cambio reportado por

el equipo espectrofotométrico lo que permite tener un rango de probabilidad

de error muy pequeño. Además este parámetro es un dato cualitativo

permitiendo identificar si el analito de interés se encuentra presente o no, así

129
sea a bajas concentraciones en la muestra a analizar minimizando el riesgo

de cometer falsos positivos y falsos negativos.

El LC reportado es aceptable, debido a que este es el límite inferior para las

medidas cuantitativas precisas, que para efectos de la técnica permite tener

lecturas de bajas concentraciones por debajo del valor máximo permitido.

La sensibilidad del método se tomó como la pendiente de la curva de

calibración (0,3765). Se presume que la curva tiene una baja sensibilidad

debido a la utilización de colorantes, que son sensibles al tiempo. También

se observa que la pendiente es negativa, esto se debe a que la relación entre

la concentración de DON en la muestra y la absorbancia leída por el equipo

es inversamente proporcional, es decir, a mayor intensidad de color, menor

es la concentración de DON, este comportamiento es debido a que este es

un enzimoinmunoanalizis de adsorción directo competitivo, donde se permite

que la DON libre de las muestras y controles compita con la DON

enzimomarcada (el conjugado) por los sitios de adsorción de los anticuerpos.

8.5.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN

Para evaluar la precisión y la exactitud se analizaron patrones que

corresponden a: Eb=0,5ppm, Em=3ppm y Ea=6ppm. Contenidos en el kit

ELISA.

130
[Link]. Precisión

Los datos para evaluar la precisión fueron obtenidos de la siguiente manera:

Para evaluar la repetibilidad se realizaron análisis a 7 muestras de cada

estándar, el análisis se realizó por duplicado, obteniendo así un total de 14

datos para cada estándar; para repetibilidad intermedia, el análisis se realizó

a 7 muestras de cada estándar en la mañana y 7 en la tarde, todo esto por

duplicado, obteniendo un total de 28 datos de cada estándar. Posteriormente

para evaluar la reproducibilidad se analizaron 7 muestras de cada estándar

por un analista y 7 muestras de cada estándar por un analista sustituto, todo

esto por duplicado, obteniendo así 28 datos de cada estándar. (Ver numeral

7.3.2)

Finalmente para hallar los parámetros se realizó tratamiento estadístico a

todos estos datos tal como se presenta en la tabla Nº42.

PRECISION DON
PARAMETROS REPETIBILIDAD REPETIBILIDAD INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD
ESTADISTICOS Eb Em Ea Eb Em Ea Eb Em Ea
PROMEDIO 0,5 3,0 6,0 0,5 3,0 6,0 0,5 3,0 6,0
DESVIACION 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
CV 0,5 0,1 0,0 0,6 0,1 0,0 0,6 0,1 0,0
LD 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
LC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
%ERROR 6,7 0,0 0,1 6,5 0,0 0,1 6,6 0,1 0,1
Tabla Nº 42 Parámetros para la determinación de la precisión en términos de
repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad para DON.

Según los datos obtenidos para los estándares bajo (0,5ppm), medio (3ppm)

y alto (6ppm), se puede concluir que el método para la cuantificación de

131
Fumonisina es preciso, ya que el %CV o coeficiente de varianza obtenido

bajo condiciones de repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad

es menor a 10%.

[Link] Exactitud

Para la exactitud se analizaron dos muestras de cada estándar diarios

durante 5 dias (ver numeral 7.3.1) obteniendo un total de 10 datos para cada

estándar, En la tabla Nº43 Se presenta los datos obtenidos para la

determinación y los resultados de la exactitud.

EXACTITUD DON
PARAMETROS
Eb Em Ea
ESTADISTICOS
A [] A [] A []
2,714 0,5 1,762 3,0 0,633 6,0
DIA 1 2,715 0,5 1,760 3,0 0,634 6,0
2,713 0,5 1,761 3,0 0,632 6,0
DIA 2 2,716 0,5 1,760 3,0 0,634 6,0
2,714 0,5 1,759 3,0 0,631 6,0
DIA 3 2,715 0,5 1,760 3,0 0,633 6,0
2,714 0,5 1,760 3,0 0,633 6,0
DIA 4 2,715 0,5 1,761 3,0 0,633 6,0
2,714 0,5 1,760 3,0 0,632 6,0
DIA 5 2,713 0,5 1,761 3,0 0,632 6,0
PROMEDIO 0,5 3,0 6,0
DESVIACION 0,0 0,0 0,0
CV 0,5 0,1 0,0
LD 0,0 0,0 0,0
LC 0,0 0,0 0,0
%ERROR 6,5 0,0 0,1
Tabla Nº 43 Parámetros para la determinación de la exactitud a tres niveles
de concentración para DON.

132
Para hallar el valor de la exactitud, fue necesario utilizar el promedio de las

medidas obtenidas en los análisis de los tres estándares, para hallar la

concentración experimental y posteriormente determinar el % de error.

Para el estándar bajo de 0,5ppm el % error fue de 6,5%, para el estándar

medio de 3ppm fue de 0,0%E y para el estándar alto de 6ppm fue de 0,1%E.

como se puede observar el porcentaje de error fue menor al 10% en todos

los casos, estos datos reflejan que el método es exacto.

PARAMETRO EXPRESADO EN RESULTADO OBTENIDO

LIMITE DE DETECCION ppm 0,1
LIMITE DE CUANTIFICACION ppm 0,5
SENSIBILIDAD Absorbancia/ppm 0,3765
PRECISIÒN %CV 0,6
EXACTITUD %E 6,5
2
R 0,9995
Tabla Nº 44 Parámetros Estadísticos del Método.

8.6. T-2/HT-2

8.6.1. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

En un análisis preliminar para determinar el límite de cuantificación se realizó

una serie de pruebas que constaron en el análisis de muestras reales a

diferentes concentraciones (numerales 7.2.1 y 7.2.2) de las cuales, para fines

prácticos sólo se muestran los resultados más significativos (pruebas 1, 2 y

3). Ver tabla Nº 45.

133
 PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3
CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION
ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA
(ppm) (ppm) (ppm)
2,892 0,002 2,780 14,7 2,702 25,0
2,892 0,004 2,772 15,7 2,674 28,6
2,892 0,005 2,779 14,8 2,704 24,7
2,892 0,001 2,780 14,7 2,668 29,4
2,892 0,003 2,797 12,5 2,707 24,4
2,892 0,003 2,778 15,0 2,664 30,0
2,892 0,005 2,809 10,8 2,712 23,6
2,892 0,009 2,809 10,8 2,704 24,7
2,892 0,001 2,786 13,9 2,708 24,2
2,892 0,007 2,779 14,8 2,710 23,9
PROMEDIO 0,004 PROMEDIO 13,8 PROMEDIO 25,8
DESVIACION 0,003 DESVIACION 1,8 DESVIACION 2,5
CV 64,5 CV 12,9 CV 9,5
LD 0,008 LD 5,3 LD 7,4
LC 0,026 LC 17,7 LC 24,6
%E No aplica %E 10,3 %E 3,3
Tabla Nº 45 Datos y parámetros estadísticos obtenidos para la
determinación del límite de cuantificación y detección con el solvente a
diferentes concentraciones para T-2/HT-2.
Como se muestra en la tabla Nº 45 En la prueba 1, se analizó una muestra

de metanol al 70% como blanco (numeral 7.1.3), pero esta prueba no arrojó

resultados aceptables ya que el coeficiente de varianza %CV es 64,5%, es

decir, mayor al 10% como se estableció anteriormente (numeral 7.2.1).

Se realizó un nuevo ensayo (prueba 2), con una muestra real de

concentración superior estimativa de 12,5ppb encontrándose que el

coeficiente de varianza %CV es mayor al 10%, lo cual no satisface lo

establecido como resultado aceptable (numeral 7.2.1), para ello fue

necesario realizar otro ensayo con una muestra de concentración superior a

ésta (prueba 3), se eligió una concentración de 25ppb. Teniendo en cuenta

que en la prueba 3 el coeficiente de varianza %CV y el porcentaje de error

134
%E son menores a 10%, se deduce que a partir de este valor de

concentración la cuantificación del analito es posible.

Las muestras con concentraciones de 12,5ppb y la de 25ppb se prepararon

por dilución a partir de un patrón de mayor concentración contenido en el kit

ELISA

Considerando los datos obtenidos en la Tabla N° 45, se dedujo que el Límite

de detección es LD= 7,4ppb y el de cuantificación es LC= 24,6ppb.

En la Tabla Nº46. se compara los datos obtenidos en la estandarización (X

Experimental) con los indicados en el Kit (X Teórico).

X Experimental X Teórico %Error

LD 7,4 10,0 26,2
LC 24,6 25,0 1,6
Tabla Nº 46 Comparación entre el límite de detección y cuantificación
obtenidos experimentalmente con los indicados en el kit para T-2/HT-2.

Con los datos arrojados en la tabla Nº46. Podemos deducir que se

encuentran algunas diferencias ya que el límite de detección reportado por el

kit es un poco mayor al hallado experimentalmente, esto se puede atribuir a

que algunas empresas fabricantes exceden el valor del límite de

cuantificación del producto, en este caso el kit, para no generar errores en

las mediciones con valores cercanos al límite real para disminuir el riesgo de

cometer falsos positivos o falsos negativos. Sin embargo, el límite de

135
cuantificación presenta un bajo % de error entre el indicado por el kit, como

el hallado experimentalmente.

8.6.2. CALIBRACION

Después de realizar tres curvas de calibración y observar la de mejor

comportamiento se eligió la que arrojó el coeficiente de correlación (R2) más

cercano a 1. A continuación en la figura N°25 se muestran las tres curvas

analizadas.

136
Figura Nº 25 Curvas Realizadas para la Calibración del Método para T-2/HT-
2.

Para la calibración a través del método espectrométrico se analizaron

patrones con concentraciones que van desde el blanco 0ppb hasta llegar a

250ppb que es la máxima concentración de los patrones incluidos en el kit

ELISA.

Después se realizó la curva de calibración y se eligió la que presenta el

coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. En la Figura Nº26 se

consolidan los resultados de esta curva.

137
 y = -0,0076x + 2,8917
T-2/HT-2 R² = 0,9998
3,500
3,000
2,500

ABSORBANCIA 2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
CONCENTRACION (ppb)

Figura Nº 26 Curva elegida para la calibración del método para T-2/HT-2.

CONCENTRACION
ABSORBANCIA
(ppb)

2,905 0,0
2,702 25,0
2,498 50,0
2,130 100,0
0,999 250,0
Tabla Nº 47 Datos correspondientes a la curva de calibración para T-2/HT-2.

La ecuación de regresión lineal calculada de acuerdo a los datos obtenidos

en la Tabla N°47. fue la siguiente:

Y=-0,0076x+2,8917

Los resultados del análisis estadístico realizado a la técnica espectrométrica

para la cuantificación de T-2/HT-2 fueron:

138
 PARAMETRO VALOR
R² 0,9998
SD(ppb) 2,46
RSD(%) 9,52
LD(ppb) 7,4
LC(ppb) 24,6
Sensibilidad
0,0076
(Absorbancia/ppb)
Tabla Nº 48 Datos estadísticos para la calibración para T-2/HT-2.

De acuerdo con los datos obtenidos:

El valor de R² se acercó mucho al valor ideal el cual es 1, esto indica que la

curva de calibración se aproxima a una línea recta, indicando alta correlación

entre las variables.

Según la desviación estándar (SD) y de la desviación estándar relativa

(RSD), el método es repetible y reproducible. Puesto que el valor de RSD no

sobrepasa el 10 %.

El LD reportado es aceptable ya que este es el mínimo cambio reportado por

el equipo espectrofotométrico lo que permite tener un rango de probabilidad

de error muy pequeño. Además este parámetro es un dato cualitativo

permitiendo identificar si el analito de interés se encuentra presente o no, así

sea a bajas concentraciones en la muestra a analizar minimizando el riesgo

de cometer falsos positivos y falsos negativos.

139
El LC reportado es aceptable, debido a que este es el límite inferior para las

medidas cuantitativas precisas, que para efectos de la técnica permite tener

lecturas de bajas concentraciones por debajo del valor máximo permitido.

La sensibilidad del método se tomó como la pendiente de la curva de

calibración (0,0076). Se presume que la curva tiene una baja sensibilidad

debido a la utilización de colorantes, que son sensibles al tiempo. También

se observa que la pendiente es negativa, esto se debe a que la relación entre

la concentración de T-2/HT-2 en la muestra y la absorbancia leída por el

equipo es inversamente proporcional, es decir, a mayor intensidad de color,

menor es la concentración de T-2/HT-2, este comportamiento es debido a

que este es un enzimoinmunoanalizis de adsorción directo competitivo,

donde se permite que la T-2/HT-2 libre de las muestras y controles compita

con la T-2/HT-2 enzimomarcada (el conjugado) por los sitios de adsorción de

los anticuerpos.

8.6.3. PARÁMETROS DE ESTANDARIZACIÓN

Para evaluar la precisión y la exactitud se analizaron patrones que

corresponden a: Eb=25ppb, Em=150ppb y Ea=250ppb. Contenidos en el kit

ELISA.

[Link]. Precisión

Los datos para evaluar la precisión fueron obtenidos de la siguiente manera:

140
Para evaluar la repetibilidad se realizaron análisis a 7 muestras de cada

estándar, el análisis se realizó por duplicado, obteniendo así un total de 14

datos para cada estándar; para repetibilidad intermedia, el análisis se realizó

a 7 muestras de cada estándar en la mañana y 7 en la tarde, todo esto por

duplicado, obteniendo un total de 28 datos de cada estándar. Posteriormente

para evaluar la reproducibilidad se analizaron 7 muestras de cada estándar

por un analista y 7 muestras de cada estándar por un analista sustituto, todo

esto por duplicado, obteniendo así 28 datos de cada estándar. (Ver numeral

7.3.2)

Finalmente para hallar los parámetros se realizó tratamiento estadístico a

todos estos datos tal como se presenta en la tabla Nº49.

PRECISION T-2/HT-2
PARAMETROS REPETIBILIDAD REPETIBILIDAD INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD
ESTADISTICOS Eb Em Ea Eb Em Ea Eb Em Ea
PROMEDIO 24,9 150,0 249,0 24,9 150,0 249,0 25,0 150,0 249,0
DESVIACION 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
CV 0,4 0,1 0,0 0,5 0,1 0,1 0,4 0,1 0,0
LD 0,3 0,4 0,3 0,4 0,4 0,4 0,3 0,4 0,3
LC 0,9 1,4 1,1 1,2 1,4 1,3 1,0 1,2 1,1
%ERROR 0,3 0,0 0,4 0,3 0,0 0,4 0,1 0,0 0,4
Tabla Nº 49 Parámetros para la determinación de la precisión en términos de
repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad para T-2/HT-2.

Según los datos obtenidos para los estándares bajo (25ppb), medio (150ppb)

y alto (250ppb), se puede concluir que el método para la cuantificación de T-

2/HT-2 es preciso, ya que el %CV o coeficiente de varianza obtenido bajo

141
condiciones de repetibilidad, repetibilidad intermedia y reproducibilidad es

menor a 10%.

[Link] Exactitud

Para la exactitud se analizaron dos muestras de cada estándar diarios

durante 5 dias (ver numeral 7.3.1) obteniendo un total de 10 datos para cada

estándar, En la tabla Nº50 Se presenta los datos obtenidos para la

determinación y los resultados de la exactitud.

EXACTITUD T-2-7HT-2
PARAMETROS
Eb Em Ea
ESTADISTICOS
A [] A [] A []
2,702 25,0 1,751 150,1 0,999 249,0
DIA 1 2,701 25,1 1,751 150,1 0,999 249,0
2,702 25,0 1,752 150,0 1,001 248,8
DIA 2 2,701 25,1 1,754 149,7 0,998 249,2
2,700 25,2 1,749 150,4 0,999 249,0
DIA 3 2,702 25,0 1,752 150,0 0,999 249,0
2,702 25,0 1,751 150,1 1,000 248,9
DIA 4 2,703 24,8 1,752 150,0 0,999 249,0
2,702 25,0 1,751 150,1 0,998 249,2
DIA 5 2,704 24,7 1,752 150,0 1,000 248,9
PROMEDIO 25,0 150,0 249,0
DESVIACION 0,1 0,2 0,1
CV 0,6 0,1 0,0
LD 0,4 0,5 0,4
LC 1,4 1,7 1,2
%ERROR 0,1 0,0 0,4
Tabla Nº 50 Parámetros para la determinación de la exactitud a tres niveles

de concentración para T-2/HT-2.

142
Para hallar el valor de la exactitud, fue necesario utilizar el promedio de las

medidas obtenidas en los análisis de los tres estándares, para hallar la

concentración experimental y posteriormente determinar el % de error.

Para el estándar bajo de 25ppb el % error fue de 0,1%, para el estándar

medio de 150ppb fue de 0,0%E y para el estándar alto de 250ppb fue de

0,4%E. como se puede observar el porcentaje de error fue menor al 10% en

todos los casos, estos datos reflejan que el método es exacto.

PARAMETRO EXPRESADO EN RESULTADO OBTENIDO

LIMITE DE DETECCION Ppb 7,4
LIMITE DE CUANTIFICACION Ppb 24,6
SENSIBILIDAD Absorbancia/ppb 0,0076
PRECISIÒN %CV 0,5
EXACTITUD %E 0,4
2
R 0,9998
Tabla Nº 51 Parámetros Estadísticos del Método.

9. EVALUACION DEL COMPORTAMIENTO DE LAS

MICOTOXINAS EN LAS MATERIAS PRIMAS DE AVICULTURA.

En esta sección se evaluó el comportamiento de las siguientes micotoxinas:

Aflatoxina, Zearalenona, Ocratoxina, Fumonisina, T-“/HT-2 y Deoxinivalenol

en las materias primas de Avicultura (soya, maíz, trigo y harina de arroz ) en

Cipa S.A.

143
9.1 SOYA

Se evalúa el comportamiento de Aflatoxina y T-2/HT-2 para torta de soya,

frijol soya cocido y frijol soya extruido y los resultados obtenidos fueron:

AFLATOXINA EN SOYA
5,0-50,0(ppb)
8,0
AFLATOXINA (ppb)
6,0

4,0

2,0

0,0

Figura Nº 27 Niveles de Aflatoxina en Soya.

En la Figura Nº27 podemos observar que los niveles normales de Aflatoxina

en soya van desde 0ppb hasta 8,0ppb, lo cual es muy bueno ya que los

niveles permitidos van hasta 50ppb, es decir, mucho más altos.

T-2/HT-2 EN SOYA
25,0-250,0(ppb)
100,0
80,0
T-2/HT-2(ppb)

60,0
40,0
20,0
0,0

Figura Nº 28 Niveles de T-2/HT-2 en Soya.

144
En la Figura Nº28 podemos observar que los niveles normales de T-2/HT-2

en soya van desde 0ppb hasta 90ppb, lo cual es muy bueno ya que los

niveles permitidos van hasta 250ppb, es decir, mucho más altos.

9.2 HARINA DE ARROZ

Para Harina de Arroz, se realiza análisis de todas las micotoxinas, es decir,

Zearalenona, Aflatoxina, Ocratoxina, Fumonisina, DON y T-2/HT-2,

obteniendo los siguientes resultados:

ZEARALENONA EN HARINA DE
ARROZ 25,0-500,0(ppb)
800,0
700,0
ZEARALENONA (ppb)

600,0
500,0
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0

Figura Nº 29 Niveles de Zearalenona en Harina de Arroz.

En la Figura Nº29 podemos observar que los niveles de Zearalenona para

Harina de Arroz generalmente varían entre 0ppb y 500ppb como es

permitido, sin embargo, en algunas ocasiones sobrepasa este nivel,

mostrando concentraciones altas de Zearalenona, lo que sugiere peligro de

contaminación del producto terminado.

145
 AFLATOXINA EN HARINA DE
ARROZ
5,0-50,0 (ppb)
15,0

AFLATOXINA (ppb)
10,0

5,0

0,0

Figura Nº 30 Niveles de Aflatoxina en Harina de Arroz.

En la Figura Nº30 podemos observar que los niveles normales de Aflatoxina

en Harina de Arroz van desde 0ppb hasta 15ppb, lo cual es muy bueno ya

que los niveles permitidos van hasta 50ppb, es decir, mucho más altos.

OCRATOXINA EN HARINA DE
ARROZ
2,0-25,0(ppb)
12,0
OCRATOXINA (ppb)

10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0

Figura Nº 31 Niveles de Ocratoxina en Harina de Arroz.

En la Figura Nº31 podemos observar que los niveles normales de Aflatoxina

en Harina de Arroz van desde 0ppb hasta 10ppb, lo cual es muy bueno ya

que los niveles permitidos van hasta 25ppb, es decir, mucho más altos.
146
 FUMONISINA EN HARINA DE
ARROZ
1,0-6,0(ppm)
3,5
3,0

FUMONISINA (ppm)
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0

Figura Nº 32 Niveles de Fumonisina en Harina de Arroz.

En la Figura Nº32 podemos observar que los niveles normales de

Fumonisina en Harina de Arroz van desde 0ppm hasta 3,5ppm, lo cual es

muy bueno ya que los niveles permitidos van hasta 6ppm, es decir, mucho

más altos.

DON EN HARINA DE ARROZ

0,5-5,0(ppm)
0,4
0,3
0,3
DON (ppm)

0,2
0,2
0,1
0,1
0,0

Figura Nº 33 Niveles de DON en Harina de Arroz.

147
En la Figura Nº33 podemos observar que los niveles normales de DON en

Harina de Arroz van desde 0ppm hasta 0,3ppm, lo cual es muy bueno ya que

los niveles permitidos van hasta 0,5ppm, es decir, más altos.

T-2/HT-2 EN HARINA DE ARROZ

25,0-250,0(ppb)
50,0

40,0
T-2/HT-2 (ppb)

30,0

20,0

10,0

0,0

Figura Nº 34 Niveles de T-2/HT-2 en Harina de Arroz.

En la Figura Nº34 podemos observar que los niveles normales de T-2/HT-2

en Harina de Arroz van desde 0ppb hasta 50ppb, lo cual es muy bueno ya

que los niveles permitidos van hasta 250ppb, es decir, mucho más altos.

9.3 SALVADO DE TRIGO

Para el Salvado de trigo, se realiza análisis de todas las micotoxinas, es

decir, Zearalenona, Aflatoxina, Ocratoxina, Fumonisina, DON y T-2/HT-2,

obteniendo los siguientes resultados:

148
 ZEARALENONA EN S. TRIGO
25,0-500,0(ppb)
700,0
600,0

ZEARALENONA (ppb)
500,0
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0

Figura Nº 35 Niveles de Zearalenona en Salvado de Trigo.

En la Figura Nº35 podemos observar que los niveles normales de

Zearalenona en Salvado de Trigo van hasta el límite superior, es decir hasta

500ppb sin sobrepasarlo, a excepción de un par de veces en los que

notamos que suben hasta 600ppb.

AFLATOXINAS EN S. TRIGO
5,0-50,0(ppb)
7,0
6,0
AFLATOXINAS (ppb)

5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0

Figura Nº 36 Niveles de Aflatoxina en Salvado de Trigo.

149
En la Figura Nº36 podemos observar que los niveles normales de Aflatoxina

en Salvado de Trigo van desde 0ppb hasta 6ppb, lo cual es muy bueno ya

que los niveles permitidos van hasta 50ppb, es decir, mucho más altos.

OCRATOXINAS EN S. TRIGO
2,0-25,0(ppb)
OCRRATOXINAS (ppb) 10,0

8,0

6,0

4,0

2,0

0,0

Figura Nº 37 Niveles de Ocratoxina en Salvado de Trigo.

En la Figura Nº37 podemos observar que los niveles normales de Ocratoxina

en Salvado de Trigo van desde 0ppb hasta 9ppb, lo cual es muy bueno ya

que los niveles permitidos van hasta 25ppb, es decir, mucho más altos.

FUMONISINA EN S. TRIGO
1,0-6,0(ppm)
2,0
FUMONISINA (ppm)

1,5

1,0

0,5

0,0

Figura Nº 38 Niveles de Fumonisina en Salvado de Trigo.

150
En la Figura Nº38 podemos observar que los niveles normales de

Fumonisina en Salvado de Trigo van desde 0ppm hasta 2ppm, lo cual es

muy bueno ya que los niveles permitidos van hasta 6ppm, es decir, mucho

más altos.

DON EN S. TRIGO
0,5-6,0(ppm)
5,0

4,0
DON (ppm)

3,0

2,0

1,0

0,0

Figura Nº 39 Niveles de DON en Salvado de Trigo.

En la Figura Nº39 podemos observar que los niveles normales de DON en

Salvado de Trigo van desde 0ppm hasta 4ppm, lo cual es muy bueno ya que

los niveles permitidos van hasta 6ppm, es decir, mucho más altos.

T-2/HT-2 EN S. TRIGO
25,0-250,0(ppb)
250,0

200,0
T-2/HT-2 (ppb)

150,0

100,0

50,0

0,0

Figura Nº 40 Niveles de T-2/HT-2 en Salvado de Trigo.

151
En la Figura Nº40 podemos observar que los niveles normales de T-2/HT-2

en Salvado de Trigo van desde 0ppb hasta 200ppb, lo cual es muy bueno ya

que los niveles permitidos van hasta 250ppb, es decir, mucho más altos.

9.4 MAIZ

Para el Maíz, se realiza análisis de todas las micotoxinas, es decir,

Zearalenona, Aflatoxina, Ocratoxina, Fumonisina, DON y T-2/HT-2 a tres

tipos diferentes de Maíz, es decir, analizamos el maíz como llega a la

empresa, Maíz después de un proceso de limpieza y el residuo que se quita

en la limpieza, obteniendo los siguientes resultados:

ZEARALENONA EN MAIZ
25,0-500,0(ppb)
800,0
700,0
ZEARALENONA (ppb)

600,0
500,0 IMPURO
400,0 LIMPIO
300,0 RESIDUO
200,0
100,0
0,0

Figura Nº 41 Niveles de Zearalenona en Maíz.

En la Figura Nº41. Podemos observar que los niveles de maíz limpio, alcanza

valores hasta 200ppb de Zearalenona, el Maíz impuro (sin tratamiento) hasta

400ppb y el Residuo hasta casi 800ppb, esto indica problemas en el residuo

de maíz, ya que el nivel máximo permitido de Zearalenona en maíz es

152
500ppb. Sin embargo el maíz impuro y el maíz limpio no tienen problema

alguno, puesto que presentan niveles menores al permitido.

AFLATOXINA EN MAIZ
5,0-50,0(ppb)
14,0
12,0
AFLATOXINA (ppb)

10,0
IMPURO
8,0
LIMPIO
6,0
RESIDUO
4,0
2,0
0,0

Figura Nº 42 Niveles de Aflatoxina en Maíz.

En la Figura Nº42. Podemos observar que los niveles de maíz limpio, alcanza

valores hasta 2ppb de Aflatoxina, el Maíz impuro (sin tratamiento) hasta 6ppb

y el Residuo hasta casi 12ppb, a pesar de la diferencia entre ellos, no hay

problemas ya que el nivel máximo permitido de Aflatoxina en maíz es 50ppb.

OCRATOXINA EN MAIZ
2,0-25,0(ppb)
3,5
3,0
OCRATOXINA (ppb)

2,5
IMPURO
2,0
LIMPIO
1,5
RESIDUO
1,0
0,5
0,0

Figura Nº 43 Niveles de Ocratoxina en Maíz.

153
En la Figura Nº43. Podemos observar que los niveles de maíz limpio, alcanza

valores hasta 0,5ppb de Ocratoxina, el Maíz impuro (sin tratamiento) hasta

1ppb y el Residuo hasta 3ppb, a pesar de la diferencia entre ellos, no hay

problemas ya que el nivel máximo permitido de Ocratoxina en maíz es 25ppb

FUMONISINA EN MAIZ
1,0-6,0(ppm)
35,0
30,0
FUMONISINA (ppm)

25,0
IMPURO
20,0
LIMPIO
15,0
RESIDUO
10,0
5,0
0,0

Figura Nº 44 Niveles de Fumonisina en Maíz.

En la Figura Nº44. Podemos observar que los niveles de maíz limpio, alcanza

valores hasta 7ppm de Fumonisina, el Maíz impuro (sin tratamiento) hasta

15ppm y el Residuo hasta 35ppm, como el nivel máximo de fumonisina

permitido para maíz es de 6ppm lo que indica es que los tres tipos de maíz

analizados sobrepasan dicho nivel pero en el maíz limpio el problema es

ocasional.

154
 DON EN MAIZ
0,5-5,0(ppm)
3,0

2,5

DON 5/5 (ppm)

2,0
IMPURO
1,5 LIMPIO
RESIDUO
1,0

0,5

0,0

Figura Nº 45 Niveles de DON en Maíz.

En la Figura Nº45. Podemos observar que los niveles de maíz limpio, alcanza

niveles hasta 0,5ppm de DON, el Maíz impuro (sin tratamiento) hasta 1,5ppm

y el Residuo hasta 3ppm, a pesar de la diferencia entre ellos, no hay

problemas ya que el nivel máximo permitido de DON en maíz es 5ppm

T-2/HT-2 EN MAIZ
25,0-250,0(ppb)
400,0
350,0
300,0
T-2/HT-2 (ppb)

250,0 IMPURO
200,0 LIMPIO
150,0 RESIDUO
100,0
50,0
0,0

Figura Nº 46 Niveles de T-2/HT-2 en Maíz.

155
En la Figura Nº46. Podemos observar que los niveles de maíz limpio, alcanza

niveles hasta 120ppm de T-2/HT-2, el Maíz impuro (sin tratamiento) hasta

100ppm y el Residuo hasta 370ppm, a pesar de la diferencia entre ellos, no

hay problemas a excepción del residuo que sobrepasa el nivel permitido de

T-2/HT-2 que es de 250ppm.

La elección de las micotoxinas que se analizan a cada materia prima son

elegidas según el tipo de hongo producido en cada una de ellas, su especie y

el medio en el que crecen, por esta razón a la soya solo se le hace prueba

para identificar Aflatoxina y T-2/HT.2.

La frecuencia con la que se analizan estas materias primas también depende

de la empresa de la siguiente manera:

 Soya: una vez por semana, a cada motonave.

 Harina de Arroz: una vez por semana, cada lote.

 Salvado de trigo: una vez por semana, cada lote.

 Maíz impuro y limpio: una vez por semana, cada motonave.

 Residuo de maíz: una vez al mes.

156
 10. CONCLUSIONES

 Se realizó la estandarización y evaluación de un método para la

determinación de micotoxinas por medio de la técnica fotométrica (kit

Elisa) a materias primas de avicultura en la industria de alimento para

animales Cipa S.A

 Se encontraron los criterios de calidad analíticos: Límite de cuantificación

(LC), Límite de detección (LD), Coeficiente de Varianza (CV),

Sensibilidad, Exactitud, y Precisión en la determinación de micotoxinas

mediante la técnica fotométrica (kit Elisa).

Para las condiciones de trabajo establecidas en el proceso de

estandarización para la determinación de micotoxinas en materias primas de

avicultura por el método fotométrico (kit Elisa) en Cipa S.A se establecieron

las siguientes conclusiones:

MICOTOXINA ZEARALENONA AFLATOXINA OCRATOXINA T-2/HT-2 FUMONISINA DON

UNIDADES ppb ppm
RANGO DE TRABAJO 25-500 5-50 2-25 25-250 1-6 0,5-5
LIMITE DE DETECCION 7,3 1,4 0,6 7,4 0,3 0,1
LIMITE DE CUANTIFICACION 24,2 4,5 1,9 24,6 0,9 0,5
SENSIBILIDAD 0,003 0,0339 0,0708 0,0076 0,3295 0,3765
PRECISION (%CV) 0,1 0,6 0,6 0,5 0,3 0,6
EXACTITUD (%E) 1,1 0,5 4,2 0,4 1,6 0,5
2
R 0,9993 0,9993 0,9997 0,9998 0,9992 0,9995

157
  Se compararon LD y LC hallados experimentalmente con los

indicados por el kit.

%Error LIMITE DE %Error LIMITE DE

MICOTOXINA DETECCION CUANTIFICACION
ZEARALENONA 27 3
AFLATOXINA 3 9,8
OCRATOXINA 43 5
FUMONISINA 35 9,9
T-2/HT-2 26 1,6
DEOXINIVALENOL 36 9

 Se documentó el procedimiento para la realización del análisis de cada

una de las micotoxinas indicadas en este trabajo, de acuerdo al sistema

documental de CIPA S.A. (ver Anexo 1).

158
 RECOMENDACIONES

Para el análisis de micotoxinas en Cipa S.A se recomienda utilizar el kit Elisa

ya que las ventajas que ofrece esta metodología son las siguientes:

 Alta especificidad y sensibilidad

 Bajo costo por análisis

 Tiempo reducido de operación

 Es útil tanto para efectuar cuantificaciones y pruebas rápidas en

centros de acopio de granos y otros alimentos.

Para garantizar resultados más confiables, se aconseja analizar muestras

con concentraciones mayores o iguales a los límites de cuantificación de

cada micotoxina.

En el caso de usar maíz como materia prima, es necesario hacer un proceso

de limpieza previo para retirar todas las impurezas y los residuos, puesto que

estos tienen la mayor concentración de micotoxinas.

Para otras materias primas que exceden los límites permitidos de

micotoxinas, es necesario usar otro lote que presente niveles más bajos para

no comprometer la calidad del producto terminado.

159
 BIBLIOGRAFIA

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ALIMENTOS DE USO PECUARIO; Septiembre de 2012 [Articulo de

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[33] ROCHA Castro E.; PRINCIPIOS BÁSICOS DE ESP’ECTROSCOPÍA;

Editorial UACh, México (2000), pág. 34.

166
 ANEXO 1. MODO DE USO DE EL KIT ELISA

PREPARACION Y EXTRACCION DE LA MUESTRA

1. Prepare una solución de metanol al 70% mezclando 7 partes de metanol

grado ACS (reactivo analítico) con 3 partes de agua destilada o

desionizada para cada muestra que será analizada.

2. Obtenga una muestra representativa. Triture toda la muestra de modo

que al menos el 75% del material pase a través de un tamiz de malla 20.

Debe asemejarse al tamaño de partícula del café instantáneo fino.

3. Agregue 5 gramos de la muestra molida a 25ml de metanol al 70% y agite

vigorosamente durante 3 minutos.

4. Filtre el extracto vertiendo por lo menos 5ml a través del filtro Whatman

nº1 y recolectando el filtrado como muestra.

PROCEDIMIENTO DE PRUEBA

1. Utilice un pocillo de mezclado con la marca roja para cada muestra que

desee examinar y otros 5 pocillos con la marca roja para los controles.

Ubíquelos en el soporte de pocillos.

2. Utilice igual número de pocillos recubiertos con anticuerpos. Coloque

nuevamente el paquete para proteger los anticuerpos. Marque un

extremo de la placa con un “1” y colóquela en el soporte de pocillos con el

167
 extremo marcado a la izquierda. No haga las marcas en el interior ni en la

base de los pocillos.

3. Mezcle cada reactivo agitando suavemente en forma circular el frasco del

reactivo antes de utilizarlo.

4. Coloque 100µl de conjugado del frasco con la

etiqueta azul en cada pocillo de mezclado

marcado con rojo.

5. Mediante el uso de una punta de pipeta nueva

para cada uno, transfiera 100 µl de los controles y

muestras a los pocillos de mezclado marcados

con rojo, tal como se muestra a continuación.

0 1 2 4 6 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7

Tira 1

S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19

Tira 2

168
6. Mediante el uso de una pipeta de 12 canales, mezcle el líquido en los

pocillos succionándolo y liberando 3 veces. Transfiera 100 µl a los

pocillos recubiertos con anticuerpos. Mezcle deslizando el soporte de

pocillos hacia adelante y hacia atrás sobre una superficie plana de 10 a

20 segundos, sin salpicar los reactivos de los pocillos. Incúbelos por 10

minutos a temperatura ambiente 30ºC. descarte los pocillos de mezclado

marcados con rojo.

7. La reacción inicial ya se encuentra completa.

Extraiga el contenido de los pocillos de anticuerpos

sacudiéndolos. Llene los pocillos con agua

destilada o desionizada y luego vacíelos. Repita

este paso 5 veces, luego, coloque los pocillos

invertidos con la boca hacia abajo y golpéelos

suavemente sobre una toalla absorbente hasta

retirar el líquido remanente.

8. Vierta el volumen necesario de sustrato del frasco con etiqueta verde

dentro de la capsula de reactivo con etiqueta del mismo color.

9. Mediante puntas nuevas prepare y vierta 100 µl de

sustrato en los pocillos, mezcle deslizando el

soporte de micropocillos hacia adelante y hacia

169
 atrás sobre una superficie plana de 10 a 20 segundos.

10. Incúbelo por 10 minutos. Deseche el sustrato restante y enjuague con

agua la capsula del reactivo.

11. Vierta la solución Red Stop del frasco con etiqueta roja dentro de la

capsula de reactivo marcada con el mismo color.

12. Vierta 100 µl de Red Stop en cada pocillo. Mezcle

deslizando para adelante y para atrás sobre una

superficie plana. Deseche las puntas.

13. Limpie la base de los micropocillos con una toalla

o paño seco y lea en un lector de micropocillos

con un filtro de 650nm. Las burbujas de aire deben

eliminarse, ya que pueden afectar los resultados

del análisis. Los resultados deben leerse antes de

que transcurran 20 minutos desde la adición del

Red Stop.

170