El microscopio
Es una herramienta que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser observados a simple
vista. El tipo más común y el primero que fue inventado es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento
que contiene dos lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por
refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.
Tipos de microscopio
Microscopios según el sistema de iluminación
A un nivel básico podemos diferenciar los microscopios según el medio utilizado para iluminar la muestra. El
sistema más habitual es iluminar la muestra con luz visible, dando lugar al microscopio óptico. Sin embargo,
existen alternativas.
1) Microscopio óptico
En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz visible. Esto significa que existe un foco de luz
apuntando hacia la muestra. Esa misma luz es conducida a través del objetivo y del ocular hasta llegar a
formar la imagen en el ojo del observador. Este es el tipo de microscopio más habitual pero su resolución está
limitada por la difracción de la luz. El aumento máximo que se puede obtener con este tipo de microscopio
alcanza alrededor de 1500x.
2) Microscopio electrónico
En el microscopio electrónico la muestra no es iluminada con luz sino que se utilizan electrones. Los electrones
impactan contra la muestra dentro de una cámara de vacío. Existen diferentes tipos de microscopio
electrónico pero su principio de funcionamiento se basa siempre en capturar los electrones dispersados u
omitidos por la muestra y así poder reconstruir una imagen.
La ventaja principal de este tipo de microscopio es que puede obtenerse un nivel de aumento muy superior al
del resto de microscopios. Sin embargo, es necesario preparar la muestra y colocarla en una cámara de vacío
de modo que no es posible observar muestras biológicas vivas. Los dos tipos de microscopio electrónicos
principales son el microscopio electrónico de barrido y el microscopio electrónico de transmisión.
3) Microscopio de luz ultravioleta
Los microscopios de luz ultravioleta iluminan la muestra, como el nombre indica, con luz ultravioleta. Este tipo
de luz tiene una longitud de onda más corta que la luz visible utilizada en los microscopios ópticos. La ventaja
principal de utilizar esta técnica es que puede alcanzarse una resolución mejor que con luz visible. Además, el
contraste obtenido en la muestra es distinto que en los microscopios ópticos. De este modo, con el
microscopio de luz ultravioleta pueden observar muestras que aparecen transparentes si son observadas con
luz visible.
4) Microscopio de luz polarizada
También conocido como microscopio petrográfico. Este microscopio es en realidad un tipo de microscopio
óptico al que se la han añadido dos polarizadores. Esto significa que la onda de luz utilizada para observar la
muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar
estructuras cristalinas de rocas y minerales.
5) Microscopio de fluorescencia
Los microscopios de fluorescencia son aquellos que utilizan las propiedades de fluorescencia para generar una
imagen de la muestra. Este microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia cuando son
iluminadas con una longitud de onda determinada. Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una
lámpara xenón o con una lámpara de vapor de mercurio. Estos microscopios incorporan además filtros de luz
para aislar la luz correspondiente a la muestra.
Microscopios según el número de lentes
En el caso concreto del microscopio óptico puede hacerse una distinción según el número de lentes de su
sistema óptico.
1) Microscopio simple
Este tipo de microscopio dispone de una única lente y es más habitualmente conocido como lupa. Aún así, con
un microscopio simple pueden conseguirse grandes aumentos. Hay que destacar que durante el siglo XVII,
Antonie van Leeuwenhoek utilizó este tipo de microscopios para conseguir el mayor aumento alcanzado hasta
el momento. A día de hoy, uno de los conceptos basados en la misma idea es el Foldscope.
2) Microscopio compuesto
Este tipo de microscopio es aquél que dispone de por lo menos dos lentes. Este es el caso más habitual en
todos los microscopios modernos. Normalmente los microscopios disponen de distintas lentes tanto en el
objetivo como en el ocular para corregir las aberraciones ópticas y alcanzar una imagen con buena calidad. La
invención del microscopio está asociada con la invención del microscopio compuesto. Este apareció en los
Países Bajos a finales del siglo XVI.
Microscopios según la transmisión de la luz
Existen dos tipos básicos de microscopio óptico según el camino seguido por la luz hasta llegar el objetivo:
microscopios de luz transmitida y los microscopios de luz reflejada.
1) Microscopio de luz transmitida
En este tipo de microscopio la luz atraviesa la muestra. Para esta clase de microscopios es necesario preparar
la muestra cortándola en láminas muy finas. La muestra se ilumina desde debajo la platina. La preparación de
la muestra hace que esta sea semitransparente y parte de la luz pueda atravesarla y llegar al objetivo para ser
observada posteriormente a través del ocular. En general este es el sistema de iluminación más utilizado entre
los microscopios ópticos.
2) Microscopio de luz reflejada
En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y dirigida al objetivo. De este modo es
necesario iluminar la muestra desde la parte superior de la platina. Este tipo de microscopía es utilizada para
examinar materiales opacos como pueden ser estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc. Existen
microscopios ópticos que permiten los dos tipos de iluminación de modo que es posible observar tanto
muestras semitransparentes como opacas. Los microscopios estereoscópicos (permiten observar la muestra
en tres dimensiones) son siempre de luz reflejada.
Microscopios según el número de oculares
Los microscopios también pueden ser clasificados según el número de oculares. En base a este criterio puede
distinguirse entre microscopios monoculares, binoculares o trinoculares.
1) Microscopio monocular
Este tipo de microscopio dispone de un solo ocular a través del cual se puede observar la muestra. Es el tipo
más sencillo y es ideal para aficionados a la microscopía o para alguien que se introduce en este campo. Su
desventaja principal es que puede resultar un poco incómodo si tiene que utilizarse durante largos periodos
de tiempo. Por este motivo los microscopios monoculares no son en general utilizados en ámbitos
profesionales.
2) Microscopio binocular
Los microscopios binoculares disponen, como indica su nombre, de dos oculares. Esto permite observar la
muestra simultáneamente con los dos ojos resultando en una mayor comodidad para el usuario. Este es el tipo
de microscopio más utilizado en los laboratorios de investigación. La distancia entre los dos oculares puede
regularse para adaptarse a las necesidades del usuario. No hay que confundir el microscopio binocular con el
microscopio estereoscópico. El microscopio estereoscópico siempre es binocular. Sin embargo, no todo
microscopio binocular es estereoscópico.
3) Microscopio trinocular
El microscopio trinocular está equipado con dos oculares para observar la muestra además de un tercer ocular
para conectar una cámara. En el caso de conectar una cámara digital esta puede conectarse a un ordenador
para ver la imágenes de la muestra en tiempo real. Con este microscopio es posible observar la muestra y al
mismo tiempo tomar fotografías o videos con la cámara.
Microscopios según la configuración de los elementos
Microscopio invertido
Los microscopios convencionales tienen una configuración vertical. Esto significa que el foco de luz se
encuentra en la parte inferior de la estructura. A continuación hay la platina donde se coloca la muestra y
finalmente el cabezal con los objetivos y el ocular en la parte superior. Esta es la configuración más habitual
pero no la única.
Existen también los microscopios invertidos. Esto microscopios tienen una configuración totalmente opuesta a
la del microscopio vertical. La muestra es iluminada desde la parte superior y los elementos ópticos se
encuentran debajo la platina. Con este tipo de microscopio es posible observar muestras colocadas en el
fondo de un recipiente. Esto es muy útil para mantenerlas hidratadas y poder así observar muestras vivas y
procesos biológicos que duran días.
Microscopio digital
Los microscopios digitales son aquellos que capturan una imagen digital de la muestra. Esto se consigue
conectando una cámara digital en lugar del ocular. Existen microscopios digitales con distintas
configuraciones. Habitualmente deben conectarse al ordenador para poder transmitir las imágenes y a
continuación visualizarlas. También es cierto que existen microscopios digitales con una pantalla incorporada.
Estos permiten ver la muestra en la pantalla y almacenar imágenes que pueden transmitirse a continuación a
un ordenador mediante conexión USB o tarjeta SD.
Un tipo especial de microscopios digitales son los microscopios USB. Estos microscopios consisten únicamente
en una lente de gran aumento y una cámara digital. El aumento que se alcanza es limitado en comparación
con un microscopio óptico convencional. Aún así son instrumentos muy versátiles y útiles para observar
objetos cotidianos. Los microscopios USB se conectan al ordenador mediante conexión USB y permiten
guardar imágenes de la muestra.
Microscopio estereoscópico
El microscopio estereoscópico es un tipo de microscopio que permite observar la muestra de forma
tridimensional. Estos microscopios están equipados siempre con dos oculares. La imagen de la muestra que
llega a cada ocular es ligeramente distinta de modo que cuando se combinan se consigue el efecto 3D. Este
efecto no podría conseguirse si la muestra se observara con un solo ocular.
El aumento que se consigue con el microscopio estereoscópico es inferior al que se consigue con un
microscopio óptico convencional. Sin embargo, los microscopios convencionales solo permiten una
observación bidimensional de la muestra. Los microscopios estereoscópicos son muy utilizados en aplicaciones
donde debe manipularse la muestra mientras se observa. Por ejemplo para el montaje de circuitos o relojes.
Otros tipos de microscopios
Además de los microscopios anteriormente presentados existen multitud de técnicas de microscopía
adicionales optimizadas para tipos de muestra específicas. Algunos de los que vale la pena mencionar son:
1) Microscopio confocal
Este es un tipo de microscopio de fluorescencia. En lugar de iluminar la muestra de forma global se ilumina
punto a punto de forma sucesiva y se reconstruye la imagen al final del proceso. Este proceso de escaneado
de la muestra es similar al que se produce en los microscopios electrónicos de barrido. Este tipo de
microscopio fue inventado por Marvin Minsky en 1957.
2) Microscopio de campo oscuro
Esta técnica de microscopía consiste en iluminar la muestra oblicuamente. De este modo los rayos de luz que
llegan al objetivo no provienen directamente del foco de luz sino que han sido dispersados primero por la
muestra. Esta técnica permite ver muestras que de otro modo no serían visibles debido a su transparencia.
También tiene la ventaja que no requiere teñir la muestra para aumentar su contraste y poder observarla.
3) Microscopio de contraste de fases
La luz viaja a distintas velocidades dependiendo del medio de propagación. Esta propiedad es utilizada en el
microscopio de contraste de fases ya que la luz atraviesa la muestra con distintas velocidades en distintas
secciones. Este efecto es amplificado para generar la imagen de la muestra. Mediante esta técnica no hace
falta utilizar tintes y, por lo tanto, pueden observarse células vivas. El microscopio de contraste de fases fue
inventado por Frits Zernike en 1932 y recibió por ello el premio Nobel de física en 1953.
Partes del microscopio
Estas son las partes que conforman el microscopio, las cuales se pueden dividir en dos sistemas: el mecánico y
el óptico.
SISTEMA MECÁNICO
El sistema mecánico del microscopio comprende todas aquellas partes que forman parte de la estructura del
propio aparato.
Estas partes le otorgan equilibrio, unen las partes que constituyen el sistema óptico del microscopio y regulan
tanto la nitidez como el aumento de la imagen de la muestra.
1. Base o pie
El pie constituye la base del microscopio, encontrándose en la parte más inferior del aparato y le da apoyo.
Acostumbra a ser la parte más pesada de todo el microscopio, y es gracias a ello que el aparato consigue el
suficiente equilibrio para evitar tumbarse.
Esta estructura puede tener varias formas, pero la más común es en forma de Y o de rectángulo. Suele incluir
algún tope de goma para evitar que, mientras se usa, se deslice por la superficie.
2. Brazo o columna
El brazo, también llamado columna o asa, es el esqueleto del microscopio. Es una pieza que se encuentra en la
parte intermedia del aparato, conectando todas sus partes. De esta manera, conecta la superficie donde se
colocará la muestra a observar y el ocular, parte por la que se observará.
Tanto las lentes que conforman el ocular como las que se encuentran en los objetivos están en el brazo del
microscopio.
3. Platina
La platina es la parte en la que se coloca la muestra que se quiere observar. Se trata de una superficie plana en
la que se coloca la tira de cristal en la que se encuentra el objeto minúsculo que se desea observar. Para
sujetar esta tira de cristal, la platina posee dos pinzas de metal.
La posición vertical de la platina con respecto a las lentes del objetivo es regulable mediante dos tornillos,
permitiendo también modular el grado de enfoque de la imagen de la muestra. En el centro de la platina se
encuentra un orificio a través del cual pasa el haz de luz proveniente de la fuente de iluminación, ubicada en la
base del microscopio.
4. Tornillo macrométrico
El tornillo macrométrico permite ajustar la posición vertical de la muestra con respecto al objetivo. Este
tornillo, cuando es girado, hace que el tubo del microscopio se deslice verticalmente gracias a un sistema
similar al de una cremallera.
Mediante este movimiento, es posible enfocar rápidamente la preparación que se encuentra en la platina.
5. Tornillo micrométrico
El tornillo micrométrico es un mecanismo que se utiliza para conseguir un enfoque más preciso de la muestra
a observar. Si bien el enfoque con este tornillo se hace de forma más lenta, es más preciso que con el tornillo
macrométrico.
Así pues, mediante esta parte del microscopio, es posible obtener un enfoque nítido moviendo verticalmente
y de forma casi imperceptible la platina. Estos movimientos son del orden de 0,001 milímetros.
6. Revólver
El revólver es una pieza giratoria en la que se montan los objetivos. Su nombre se debe a que, cuando se usa,
se mueve y suena como el revólver de una pistola.
Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan de forma que permitan ver lo que se
encuentra en la platina. Cada uno de los objetivos que están enroscados en esta pieza tienen un aumento
diferente y, girando el revólver, es posible escoger el objetivo más adecuado para la muestra a observar.
7. Tubo
El tubo es una pieza estructural, la cual va unida al brazo del microscopio, conectando el ocular con los
objetivos. Esta parte es la que mantiene la correcta alineación entre las lentes que conforman la primera y
segunda fase de aumento de la imagen de la muestra.
SISTEMA ÓPTICO
El sistema óptico del telescopio incluye todos los elementos necesarios para poder aumentar la imagen de lo
que se posee en la platina y corregir su iluminación. Todas las partes del sistema óptico están diseñadas de tal
forma que sea posible corregir las irregularidades cromáticas, como por ejemplo que la luz se divida en
diferentes colores.
1. Foco o fuente de luz
El foco, que ofrece iluminación a la placa, suele estar conformado por una lámpara halógena que se encuentra
en la base del microscopio. La luz sale de la bombilla y pasa a un reflector, enviando los rayos de luz a la
platina.
En función del tamaño del microscopio esta fuente de luz tendrá un mayor o menor voltaje. En los
microscopios más utilizados en laboratorios el voltaje suele ser de 12 voltios.
2. Condensador
El condensador consiste en un sistema de lentes convergentes que captan el haz de luz y concentra sus rayos
de forma que se ofrezca un mayor o menor contraste.
Normalmente, los rayos que emite el foco de luz son divergentes. Mediante el condensador, es posible hacer
que estos rayos sean paralelos o, incluso, convergentes.
En el microscopio existe un tornillo que sirve para regular la condensación lumínica. Este tornillo puede
encontrarse en diferente lugar en función del modelo del aparato.
3. Diafragma o iris
El diafragma se encuentra sobre el reflector de la luz y debajo de la platina.
Mediante esta parte es posible regular la intensidad de la luz, abriendo o cerrando el diafragma, al igual que el
iris humano lo hace ante la luz proveniente del exterior. El punto óptimo del diafragma variará en función de
la muestra que se tenga en la platina y el grado de iluminación del lugar en el que se encuentre el microscopio.
4. Objetivos
Los objetivos son las lentes convergentes que son reguladas mediante el revólver. Estas lentes son las que
ofrecen la primera etapa de aumento.
Girando el revólver en el sentido de las agujas del reloj, los objetivos van acoplándose los unos con los otros,
permitiendo aumentar la imagen de lo que se está observando.
5. Oculares
Los oculares son los sistemas de lentes más cercanos al ojo del observador. Se trata de cilindros huecos que se
encuentran en la parte superior del microscopio y tienen lentes convergentes.
Estos elementos ópticos son los que proporcionan la segunda etapa de ampliación de la imagen. Es decir,
primero la imagen es aumentada por los objetivos y, luego, otra vez aumentada por los oculares.
La combinación entre el objetivo usado y los oculares es lo que determina el aumento total de lo observado en
la platina. En función de si el microscopio posee un solo ocular o dos, hablamos de microscopios monoculares
o microscopios binoculares. También existen microscopios trinoculares.
6. Prisma óptico
Algunos microscopios incluyen prismas ópticos, los cuales se encuentran en el interior del aparato y sirven
para corregir la dirección de la luz.
La existencia de esta parte es muy necesaria en los microscopios binoculares, dado que mediante el prisma es
posible dividir el haz de luz en dos para que vaya a parar a ambos oculares y se tenga una imagen
bidimensional apropiada.
7. Transformador
El transformador es necesario para poder enchufar el microscopio a la corriente, dado que, normalmente, la
potencia de la bombilla de los microscopios suele estar por debajo de la potencia de la corriente eléctrica
común.
Algunos transformadores tienen un potenciómetro el cual sirve para regular la intensidad de la luz.
Creadores de los microscopios
1590: Zacharias Janssen construye un microscopio con dos lentes convergentes.
1611: Johannes Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto.
1665: Robert Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los
pequeños poros en forma de celdas a los que él llamó "células". Publica su libro Micrographia.
1674: Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Nueve años después será el primero
en observar las bacterias.
1828: W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada.
1838: Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y declaran que la célula nucleada es la
unidad estructural y funcional en plantas y animales.
1849: J. Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio.
1876: Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y
muestra cómo perfeccionar el diseño del microscopio.
1881: Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por
ningún otro microscopista de luz. En las siguientes dos décadas él, Cajal y otros histólogos desarrollan
nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la anatomía microscópica.
1886: Carl Zeiss fabrica una serie de lentes, diseño de Abbé que permiten al microscopista resolver
estructuras en los límites teóricos de la luz visible.
1908: Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
1930: Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia.
1932: Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
1952: Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para
el microscopio de luz.
.4.1.-Los objetivos
Representan el componente óptico más importante del microscopio. Su principal función
consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen nítida, real,
invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar
centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje
óptico del sistema. Sus lentes están hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre
otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de
aumento, resolución y de la corrección de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran
objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas
comerciales.
Clasificación:
Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones hay dos categorías de
objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En
cada categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de
inmersión (64, 65, 66):
• Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja.
Corrección de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color
verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo es
acromático cuando no posee ninguna denominación.
• Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para
el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para dos
colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor diseñados
para la microfotografía en colores.
• Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por
ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro,
azul, rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores
objetivos para microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos
objetivos poseen mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto
puede ser un inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un poco
curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta
como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos,
plan-fluoritas o plan-apocromáticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersión:
Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-
objeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el
medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice
del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de
inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido
cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua
destilada (n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción
(n=1,515) casi idéntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la
refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la
luminosidad de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está
disminuida. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y
permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos
refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.
Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y
dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y
(c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente
esférica frontal.
