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QUÍMICA ANALÍTICA III

Edineldo Lans Ceballos. M.Sc.

Febrero 9 del 2015

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Contenido

1 CROMATOGRAFÍA 1
1.1 Clasificación de métodos cromatográficos . . . . . . . . . 2
1.1.1 Cromatografı́a en columna . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 Cromatografı́a plana . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Clasifición de métodos cromatográficos en columna . . . 2
1.2.1 Cromatografı́a de Gases . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Cromatografı́a lı́quida . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.3 Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos . . . . . . 4
1.3 Algunos términos y ecuaciones utilizados en cromatografı́a 4
1.3.1 Resolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.2 Difusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.4 Velocidades de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5 Relación entre tiempo de retención y el coeficiente de partición 11
1.6 Relación tiempo de retención y constante de distribución 12
1.7 Asimetrı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.8 Tipos de fuerzas que están presentes en un sistema cromatográfico 13
1.8.1 Interacciones iónicas . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.8.2 Fuerzas de enlaces de hidrógeno . . . . . . . . . 13
1.8.3 Fuerzas de repulsión . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls . . . . . . . . . . . . . 14
1.9 Bases fı́sicas de la cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . 15
1.9.1 Eficiencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.9.2 Ecuación de Van Deemter . . . . . . . . . . . . . 16
1.10 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA 21

2.1 Ventajas de la cromatografı́a en capa fina . . . . . . . . 22
2.2 Adsorbentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.1 Proceso de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2
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Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 3

2.2.2 Adsorbentes utilizados . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.3 Preparación de placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.4 Aplicación de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.5 Elección del eluyente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.6 Desarrollo de la cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.7 Evaluación de un cromatograma de capa fina . . . . . . 26
2.7.1 Análisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.7.2 Análisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.8 Localización de sustancias . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.8.1 Métodos quı́micos . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.8.2 Métodos fı́sicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.9 Constante Rf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3 ANALISIS CUANTITATIVO Y CUALITATIVO 28

3.1 Análisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.1.1 Co-Cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2 Análisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2.1 Método de normalización de área . . . . . . . . . 29

4 CROMATOGRAFIA DE GAS 33
4.1 Cromatografı́ gas lı́quido . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.2 Fase móvil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.3 Columnas tubulares abiertas . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.3.1 WCOT :wall coated tubular column . . . . . . . 34
4.3.2 SCOT: support coated open tubular column. . . 34
4.3.3 PLOT: porous layer open tubular column . . . . 34
4.4 Ventajas de las open tubular column . . . . . . . . . . . 35
4.5 Clases de fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.6 Escogencia de la fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . 35
4.7 Columnas empacadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.8 Indice de retención . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.9 Programación de temperatura y presión . . . . . . . . . 36
4.10 Carrier gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.11 Inyección de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.11.1 Inyeción split . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.11.2 Inyección splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.11.3 Inyección on column . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.12.1 Clases de detectores . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.13 Preparación de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
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4 E.Lans

4.13.1 Selección del método en cromatografı́a de gas . . 42

4.14 Escogencia del modo de inyección . . . . . . . . . . . . . 45
4.15 Análisis cuantitativo y cualitativo . . . . . . . . . . . . . 45
4.15.1 Co-cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

5 ESPECTROMETRÍA DE MASAS 47
5.1 Cualidades de la espectrometrı́a de masas . . . . . . . . 47
5.1.1 Cualidades de indentificación . . . . . . . . . . . 47
5.1.2 Cuantifica e identifica . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.1.3 Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.1.4 Universal y especı́fica . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.1.5 Información estructural . . . . . . . . . . . . . . 48
5.1.6 Rapidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.2 Tecnicas de ionización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.3 Ionización por impacto electrónico (EI) . . . . . . . . . 48
5.4 Ionización quı́mica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.5 Ionización Quı́mica negativa . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.6 Ionización por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.7 Fuentes de desorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.8 Desorción por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.9 Bombardeo por Átomos Rápidos (FAB) . . . . . . . . . 51
5.10 Ionización electrospray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.11 Espectrómetro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.11.1 Cámara de ionización . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.11.2 Analizador de masas . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.12.1 Channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.12.2 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.13 MÉTODOS ACOPLADOS A MASAS . . . . . . . . . . 53
5.13.1 Cromatografı́a gas/masas- lı́quida/masas . . . . 53
5.13.2 Espectrometrı́a de masas en tandem MS/MS . . 53
5.13.3 Aplicaciones: Espectrometrı́a de masas en tandem 54
5.13.4 Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.13.5 Desventajas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.13.6 Identificación de compuestos por espectrometrı́a de masas 55
5.13.7 Analizador de trampas de iones . . . . . . . . . . 55
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Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 5

6 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) 56

6.1 Proceso cromatográfico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
6.1.1 Efectos del tamaño de las partı́culas en HPLC . 57
6.1.2 Columnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
6.1.3 Columnas analı́ticas . . . . . . . . . . . . . . . . 58
6.1.4 Fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
6.1.5 Proceso de elución . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
6.2 Clasificación de la cromatografı́a lı́quida . . . . . . . . . 59
6.2.1 Cromatografı́a lı́quido - lı́quido o de partición . 59
6.2.2 Cromatografı́a lı́quido-sólido o de adsorción . . . 60
6.3 Cromatografı́a en fase reversa . . . . . . . . . . . . . . . 60
6.4 Cromatografı́a en fase normal . . . . . . . . . . . . . . . 60
6.5 Cromatografı́a de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . 60
6.5.1 Elección del solvente . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.6 Gradiente de dilusión isocrática . . . . . . . . . . . . . . 62
6.7 Selección del modo de separación . . . . . . . . . . . . . 63
6.8 Solventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.9 Criterios para una buena separación . . . . . . . . . . . 64
6.9.1 Atributos de una buena separación . . . . . . . . 65
6.10 Optimización con un solvente . . . . . . . . . . . . . . . 65
6.10.1 Orden de escogencia de un solvente orgánico . . 65
6.11 Optimización con dos o tres solventes orgánicos . . . . . 66
6.12 Temperatura como una variable en separaciones isocrática 66
6.12.1 ¿Como se consigue una buena separación? . . . . 66

7 CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS 68

7.1 Carácterı́sticas de un fluı́do supercrı́tico . . . . . . . . . 70
7.2 Analitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
7.3 Fase Móvil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.4 Cosolventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.4.1 Fluı́dos usados para extracción supercrı́tica . . . 72
7.5 Forma e inyección de la muestra . . . . . . . . . . . . . 72
7.6 Columnas y fases estacionarias . . . . . . . . . . . . . . 72
7.7 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.8 Areas donde se utilizan los fluı́dos supercrı́tico . . . . . 73

8 ELECTROFORÉSIS 74
8.1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
8.2 Electroforésis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
8.2.1 Tipos de electroforésis . . . . . . . . . . . . . . . 75
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6 E.Lans

8.2.2 Electroforésis convencional . . . . . . . . . . . . 75

8.2.3 Electroforésis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . 76
8.2.4 Cambio de sentido del flujo electroosmótico . . . 80
8.3 Instrumentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
8.3.1 Introducción de la muestra . . . . . . . . . . . . 80
8.4 Sistema de detección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
8.4.1 Métodos de absorbancia . . . . . . . . . . . . . . 82
8.5 Modalidades de la electroforésis capilar . . . . . . . . . . 84
8.5.1 Electroforésis capilar por zona (CZE) . . . . . . 84
8.5.2 Electroforésis capilar en gel (CGE) . . . . . . . . 84
8.5.3 Isotacoforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . 84
8.5.4 Cromatografı́a capilar electrocinética miscelar (MECC) 85
8.6 Enfoque isoeléctrico capilar (CIEF ) . . . . . . . . . . . 85
8.7 Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

Bibliografı́a 87
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Lista de figuras

1.1 Cromatografı́a en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Curva Gaussiana ideal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3 Resolución de un cromatograma . . . . . . . . . . . . . . 6
1.4 Ensanchamiento de banda debido a la difusión . . . . . 7
1.5 Asimetrı́a de un pico cromatográfico . . . . . . . . . . . 14
1.6 Ecuación de Van Deemter en Cromatografı́a de gas . . . 18
1.7 Isotermas comunes y formas de las bandas . . . . . . . . 18
1.8 Silanización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1 Placa cromatográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.2 Siembra de la muestra en una placa cromatográfica . . . 25
2.3 Placa cromatográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4.1 Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gas . . . . 34

4.2 Inyección split/splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.3 Detector de ionización por llama . . . . . . . . . . . . . 39

5.1 Ionización por impacto electronico . . . . . . . . . . . . 49

5.2 Partes de un espectrómetro de masas . . . . . . . . . . . 51
5.3 Esquema interno de un espectrómetro de masas . . . . . 52
5.4 Detector channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.5 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.1 Cromatografı́a fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad) 61

6.2 Cromatografı́a fase normal.(Fase móvil de polaridad media) 61
6.3 Cromatografı́a en fase normal.(Fase móvil de polaridad media) 61
6.4 Cromatografı́a en fase inversa.(Fase móvil de alta polaridad ) 62

8.1 Flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

8.2 Perfil del flujo electro osmótico . . . . . . . . . . . . . . 79
8.3 Dirección del flujo electroosmótico . . . . . . . . . . . . 81

7
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8 E.Lans

8.4 Componentes básicos de un sistema de electroforésis capilar 81

8.5 Métodos de introducción de muestra . . . . . . . . . . . 83
8.6 Diseños de celda para mejorar la sensibilidad de detección por medida de absorbancia aument
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Lista de tablas

3.1 Normalización de área con factor de respuesta . . . . . . 30

7.1 Temperatura crı́tica, presión crı́tica y punto de ebullición de algunos compuestos comunes 6

9
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10 E.Lans
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Capı́tulo 1

CROMATOGRAFÍA

Ciencia y arte de separar los componentes de una mezcla. Estos compo-

nentes son transportados a través de una fase estacionaria, por el flujo
de una fase móvil, donde la fase móvil puede ser un lı́quido o un gas.
Aunque esta es una definición fácilmente entendible en principio, puede
presentar algunas limitaciones, estas limitaciones se deben básicamente
al desarrollo de la cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos en la década
de los sesenta, donde la fase móvil no es ni un gas ni un lı́quido sino
un fluı́do surpercrı́tico. Por ello es mas conveniente relacionar la cro-
matografı́a como un método separativo y aceptar más bien la definición
dada por Guiddings que la define como un método de migración en
zonas; esto con el fin de aceptar los cambios que se puedan dar con el
avance de las ciencias.
La IUPAC define la cromatografı́a como un método fı́sico de separación
en el cual los componentes a ser separados son distribuı́dos entre dos
especies, una de las cuales es la fase estacionaria, mientras que la otra
se mueve en una dirección definida.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración
entre los distintos componentes de la mezcla. La cromatografı́a, fué
originalmente descrita por Tswett en el 1906. Tswett ideó un método
para separar pigmentos de plantas utilizando un tubo de vidrio lleno con
CaCO3 ,agregó un extracto de planta a la columna no sin antes lavarla
con un solvente orgánico y observó que se separaban diferentes bandas
coloreadas en el interior de la columna.A la separación de bandas colore-
adas le dió el nombre de cromatografı́a, de la palabra griega Chromatos
que significa color.

1
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2 E.Lans

En la figura 2.1 se muestra una solución que contiene una mezcla la cual
se coloca sobre una columna empacada con partı́culas sólidas y llenado
con solvente. Vemos como los solutos que conforman la mezcla fluyen
hacia abajo de la columna a medida que se le agrega solvente fresco.De
los distintos solutos que conforman la mezcla el primero que eluye es el
menos adsorbido por la fase estacionaria y el que eluye de ultimo es el
mas adsorbido por ésta, completándose ası́ la separación.

En general podemos decir que en la cromatografı́a no se incluyen sep-

araciones que emplean campos eléctricos para impulsar las moléculas
con cargas de modo que se separen. Este tipo de métodos se clasifican
como electroseparaciones.

1.1 Clasificación de métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos son de dos tipos

1.1.1 Cromatografı́a en columna

La fase estacionaria está contenida en un tubo estrecho y se fuerza el
paso de la fase móvil a través del tubo ya sea a presión o gravedad

1.1.2 Cromatografı́a plana

La fase estacionaria está sostenida sobre una placa plana, o en los poros
de un papel. Aquı́ la fase móvil se desplaza a través de la fase esta-
cionaria por capilaridad, o por efectos de la gravedad.

1.2 Clasifición de métodos cromatográficos en

columna
Los métodos cromatográficos se clasifican según la fase móvil, si esta
es un gas se denomina cromatografı́a de gas, si es un lı́quido toma el
nombre de cromatografı́a lı́quida y si es un fluı́do supercrı́tico se le da
el nombre de cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos.

1.2.1 Cromatografı́a de Gases

Gas-Lı́quido:La fase estacionaria es un lı́quido y la fase móvil un gas.
Gas-Sólido: Donde la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil es
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Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 3

Figura 1.1: Cromatografı́a en columna

un gas.

1.2.2 Cromatografı́a lı́quida

Lı́quido-Lı́quido o de reparto:La fase estacionaria es un lı́quido.
Lı́quido - Sólido:La fase estacionaria es un sólido.
Intercambio iónico:La fase estacionaria es una resina de intercambio
iónico.
Exclusión por tamaño:La fase estacionaria es un lı́quido en los inter-
sticios de un sólido polimérico. También es llamada permeación por gel.
La cromatografı́a de permeación por gel es llamado también filtración
por gel, se utilizan materiales con un control del tamaño de los poros
de la fase estacionaria. Esta cromatografı́a se usa para separaciones
preparativas de polı́meros sintéticos de alto peso molecular.
Afinidad: La fase estacionaria es un lı́quido con grupos especı́ficos
unidos a una superficie sólida. Es especialmente utilizada para el análisis
de muestras biológicas.
En cromatografı́a por afinidad la fase estacionaria es un péptido o
proteı́na las cuales tienen una afinidad especı́fica por un analito en par-
ticular, se enlaza covalentemente a un ligando como un ácido nucléico a
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4 E.Lans

una enzima. Sólo los analitos con una afinidad especı́fica por el ligando
serán retenidos y separados. La cromatografı́a por afinidad tiene gran
aplicación en bioquı́mica, ya que puede separar proteı́nas.

1.2.3 Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos

Fase móvil es un fluı́do supercrı́tico.
Como se puede notar las diferentes clases de cromatografı́a se clasifican
de acuerdo a la fase móvil, como se dijo anteriormente.

1.3 Algunos términos y ecuaciones utilizados

en cromatografı́a
Para tener un entendimiento mas preciso, sobre los procesos cromato-
gráficos, se hace necesario que el lector tenga claro algunos conceptos
utilizados en cromatografı́a.

1.3.1 Resolución
El movimiento del soluto a través de la columna cromatográfica, se
propaga en forma gausiana con una desviación estándar de σ. La res-
olución de una columna es la medida cuantitativa de su capacidad para
separar los analitos presentes en una mezcla Figura 1.3
. Entre mas tiempo gasta un soluto pasando a través de la columna, mas
ancha es la banda. Medidas comunes al ensanchamiento de la banda
son la anchura media del pico W1/2 , medida a la mitad de la altura del
pico y la anchura de la lı́nea base W. Figura 1.7

La resolución está dada por las siguientes ecuaciones:

∆tr ∆Vr
Rs = =
Wav Wav
∆tr y ∆Vr son las diferencias de tiempo de retención y volumen respec-
tivamente entre picos y Wav es el promedio de la anchura base de ambos
picos en sus unidades correspondientes.

(tr )B − (tr )A
Rs = 2
WA + WB
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Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 5

Figura 1.2: Curva gausiana ideal muestra como w y w1/2 son medidos. El
valor de w es obtenido extrapolando las tangentes en el punto de inflección de
la linea base

Para análisis cuantitativo una resolución >de 1.5 es altamente deseada.

Factores que afectan la resolución

La resolución de una columna se ve afectada por el número de plato

′
teórico N, la retención relativa σ y el factor de capacidad K como se
observa en la siguiente ecuación:
√ ′
N α−1 K2
Rs = ( )( ′ )
4 α 1 + Kav

Donde N es el número de platos teóricos en la columna, α es la re-

′
tención relativa de los dos picos (1.3.2), K2 es el factor de capacidad
′
para el componente más retenido y Kav es el promedio de los factores
de capacidad para ambos picos. √ De la ecuación anterior se deduce que
la resolución es proporcional a N , de tal modo que√si doblamos la
longitud de la columna, se incrementa la resolución en 2. Igualmente
podemos decir que la resolución se incrementa cuando aumenta α y el
′
factor de capacidad K2 .
La manera de cambiar la retención relativa es cambiando en cromatogra-
fı́a de gas la fase estacionaria y en HPLC cambiando la fase estacionaria
o fase móvil.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 6 — #16

6 E.Lans

Figura 1.3: Resolución de un cromatograma

1.3.2 Difusión
Una causa del ensanchamiento de una banda es la difusión. Una banda
del soluto se ensancha a medida que se va moviendo a través de la
columna.Figura1.4
El coeficiente de difusión mide la velocidad a la cual una substancia se
mueve aleatoriamente de una región de alta concentración a otra región
de baja concentración.
El número de moles que cruzan en un metro cuadrado por segundo, se
llama flujo y es proporcional al gradiente de concentración.

mol
F = ≡J
m2 S

dc
J = −D
dx
La constante de proporcionalidad D es el coeficiente de difusión, y el
signo negativo se debe a que el flujo neto va de una región de alta con-
centración a otra de baja concentración.

Retención relativa o factor de selectividad: Es la retención de un

compuesto con respecto a otro, también la podemos denominar como
velocidad de migración diferencial.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 7 — #17

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 7

Figura 1.4: Ensanchamiento de banda debido a la difusión

t,r2
α=
t,r1
Entre mas grande el tiempo de retención relativa, mas grande es la
separación entre componentes. La retención relativa es independiente
de la velocidad de flujo por lo que puede ser usado para identificar picos
cuando la velocidad de flujo cambia.

KB
α=
KA
La especie B es mas fuertemente retenida que la especie A, por tanto,
α siempre va a ser mayor que la unidad.

(tr )B − tm
α=
(tr )A − tm
′
KB KB
α= ′ =
KA KA
Altura de plato H : Es una medida de la eficiencia de una columna
y viene dado por la ecuación :

L
H=
N
Fase estacionaria:Material sólido en cuya superficie se enlazan las
moléculas.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 8 — #18

8 E.Lans

Eluyente:Disolvente que se usa para transportar los componentes de

una mezcla a través de una fase estacionaria.
Eluato:Fase móvil que sale de la columna.
Cromatograma:Es una gráfica de alguna señal de la concentración de
un soluto en función del tiempo de elución o el volumen de elución.
′
Factor de capacidad(K ): Es un parámetro importante que con fre-
cuencia se utiliza para describir las velocidades de migración de los
analitos en las columnas.Para una especie A:

′ KA VS
K =
VM
KA = constante de distribución de la especie A
VS = volumen de la fase estacionaria(analito)
VM = volumen del analito en la fase móvil
′
De un cromatograma se puede calcular K de la siguiente ecuación, te-
niendo en cuenta las ecuaciónes 1.3.2 a 1.4 ası́:

L L 1
= × ′
tr tm 1 + KA
Reordenando tenemos:

′ tr − tm
KA =
tm
′
Con esta ecuación se puede calcular KA para un compuesto A desde un
cromatograma.
′
Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la
unidad, es porque la elusion es tan rápida que es difı́cil determinar con
′
exactitud los tiempos de retención. Cuando K es del orden de 20 a
30 o mayores, es porque los tiempos de retención son demasiado largos.
Idealmente las separaciones se realizan en unas condiciones en las que
los factores de capacidad oscilan entre 1-5
Tiempo de retención:Tiempo que transcurre después de la inyección
de la muestra para que el pico del analito alcance el detector, el tiempo
de retención para una especie B viene dada por la siguiente ecuación:
!2 ′
16Rs2 H α (1 + KB )3
(tr )B = ′
µ α−1 (KB )2
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 9 — #19

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 9

Tiempo muerto: Tiempo para que la especie no retenida alcance al

detector; es decir la velocidad de migración de la especie no retenida
coincide con la velocidad promedio del movimiento de las moléculas de
la fase móvil.
′
Tiempo de retención ajustado (tr ): Es la diferencia entre el tiempo
de retención del analito y el tiempo muerto.
′
tr = tr − tm

′ (tr )B − tm
tr =
(tr )A − tm
Número de Plato ( N):
Lo podemos definir como la medida cuantitativa de la eficiencia de una
columna.
El número de plato teórico de una columna con longitud L es:
L L LX LX L2 16L2
N= = 2 = 2 , si hacemos x = L ⇒ 2 = =
H σ σ σ W2 W2
x 16
W 16L2
ya que σ = ⇒N=
4 W2
Si expresamos L y W en unidades de tiempo, en vez de longitud N serı́a
adimensional; ası́ obtenemos la expresión mas útil para N

tr 2
N = 16( )
W
Si usamos la achura de la altura media en vez de la base (figura 1.3),
entonces
tr 2
N = 5, 545( )
W1/2
W1/2 = Anchura de la altura media del pico.

1.4 Velocidades de separación

La efectividad de una columna cromatográfica para separar dos analitos
depende en parte de las velocidades relativas con la que eluyen las dos
especies. Estas velocidades están determinadas por la magnitud de las
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 10 — #20

10 E.Lans

constantes de los equilibrios de distribución de las especies entre las

fases estacionaria y móvil.

Cs
K=
Cm
K = Constante, razón, o coeficiente de distribución.
Cs = Concentración molar del analito en la fase estacionaria.
Cm = Concentración molar del analito en la fase móvil.
Idealmente K debe ser constante en un amplio intervalo de concentra-
ciones,o sea que Cs ≅ Cm

L
V̄ =
tr
donde V̄ = velocidad lineal media de migración del analito
L = Longitud de la columna

L
µ=
tm
µ = velocidad lineal media de las moléculas de la fase móvil

Entre más rápido es la velocidad lineal media de migración del anal-

ito ( flujo lineal), menos tiempo gasta en la columna y menos ensan-
chamiento de banda ocurre debido a lo difusión longitudinal. Las ve-
locidades lineales de flujo en cromatografı́a de lı́quidos son significati-
vamente menores que las que se utilizan en cromatografı́a de gas.
′
Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la
unidad, es por que la elución es tan rápida que es difı́cil determinar con
′
exactitud los tiempos de retención. Cuando el K es del orden de 20 a
30 o mayores,es porque los tiempos de retención son demasiado largos;
idealmente las separaciones se realizan en unas condiciones en las que
los factores de capacidad oscilan entre 1-5. El factor de capacidad K ,
para cada uno de los picos en un cromatograma está definido como:

′ tr − tm
K =
tm
Para verificar la eficiencia de una columna es bueno monitorizar perı́-
odicamente midiendo el factor de capacidad de un estándar, el número
de platos y la asimetrı́a de los picos. Cambios de estos factores reflejan
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 11 — #21

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 11

degradación de la columna.

moles de analito en la fase móvil

V̄ = µ ×
moles totales de analito

1
V̄ = µ ×
VS
1 + KA
VM

1.5 Relación entre tiempo de retención y el co-

eficiente de partición
La definición del factor de capacidad es equivalente a decir:

′ tsgf e
K =
tsgf m
Donde tsgfe, tsgfm = tiempo del soluto gastado en la fase estacionaria
y tiempo soluto gastado en fase móvil respectivamente.
Si tenemos en cuenta la ecuación(1.4), podemos afirmar que:
Si el soluto gasta todo el tiempo en la fase móvil, entonces el factor de
′
capacidad K = 0 por que el tiempo de retención serı́a igual a tm .
Si el soluto gasta igual tiempo en la fase móvil y la fase estacionaria,
′
entonces el tr = 2tm , por lo que K = 1
Si el soluto gasta tres veces igual tres veces más tiempo en la fase esta-
′
cionaria que en la fase móvil, entonces el tr = 4tm , ası́, K = 3
De lo anterior podemos deducir que habrá tres veces más moles de so-
luto en la fase estacionaria.

′ C s Vs
K =
C m Vm
Donde Cs es la concentración de soluto en la fase estacionaria, Vs vol-
umen de la fase estacionaria, Cm , concentración de soluto en la fase
móvil y Vm volumen en la fase móvil.

′ C s Vs Cs
como K = yK= entonces,
C m Vm Cm
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 12 — #22

12 E.Lans

′ Vs
K =K
Vm
′
′tr − tm tr
como K = =
tm tm
′
′ Vs tr
K =K =
V m tm
′
tr
′
K =
tm

1.6 Relación entre el tiempo de retención y la

constantes de distribución
V̄ = µ × fracción de tiempo que el analito reside en la fase móvil

C m Vm 1
V̄ = µ × =µ×
Cm Vm + Cs Vs C s Vs
1+
C m Vm
1
V̄ = µ ×
KVs
1+
Vm
′ KA Vs
Como KA = entonces:
Vm
1
V̄ = µ × ′
1 + KA

1.7 Asimetrı́a
La asimetrı́a de un pico puede tener distintas causas: Aplicación de un
exceso de analito, error en la técnica de inyección o columna degradada.
Picos no simétricos generalmente indican que interacciones no deseadas
han ocurrido durante el proceso cromatográfico.
Picos anchos son comunes en columnas empacadas,indicando que la
cinética de la transferencia de masas es demasiado lenta.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 13 — #23

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 13

En algunas aplicaciones con columnas empacadas poco se puede hacer

al respecto, sin embargo, el objetivo del cromatografista es lograr unos
picos estrechos tanto como sea posible, para lograr mejores separaciones.
La simetrı́a de los picos se puede clasificar como Tailing o Fronting
dependiendo de la localización de la asimetrı́a. El alcance de la asimetrı́a
es definido como Tailing Factor (TF).

b
TF =
a
Tanto a como b son medidos sobre el 10% de la altura del pico. Figura
1.5 en la página 14. De acuerdo a la ecuación (1.7) un pico con tailing
tendrı́a un TF mayor que la unidad, y un pico con fronting su TF es
menor que la unidad. Todos los picos que necesiten ser medidos deben
ser simétricos con un TF en el rango de 0,9 a 1,5.

1.8 Tipos de fuerzas que están presentes en un

sistema cromatográfico
En un sistema cromatográfico existen varios tipos de interacciones, a
saber:

1. Interacciones iónicas

2. Enlaces de hidrógeno

3. Repulsión

4. Van Der Walls

1.8.1 Interacciones iónicas

Ocurren entre el soluto y una fase o ambas, cuando tienen cargas per-
manentes. Este tipo de interacciones me da la cromatografı́a iónica, que
resulta de la interacción entre los iónes de soluto y los iones de la fase
estacionaria.

1.8.2 Fuerzas de enlaces de hidrógeno

Ocurren entre moléculas que tienen el hidrógeno unido a un pequeño
átomo bastante electronegativo como los alcoholes, aminas y agua los
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 14 — #24

14 E.Lans

Figura 1.5: Asimetrı́a de un pico cromatográfico

cuales pueden ser donores o aceptores de protones. Los ésteres,

aldehı́dos, cetonas y éteres solo pueden ser aceptores de protones y for-
man enlace de hidrógeno con compuestos donores de protones

1.8.3 Fuerzas de repulsión

Las fuerzas de repulsión se dan entre cargas iguales, la energı́a de ori-
entación aumenta con forme aumenta el momento dipolar.

1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls

Las fuerzas de Van Der Walls son de tres tipos:

1. Orientación o Keesom. Se dan entre moléculas con dipolo perma-

nente.

2. Inducción o Debye. Dipolo inducido-dipolo

3. Dispersión o London. Dipolo inducido-dipolo inducido

Las fuerzas de London son débiles y se dan entre moléculas simétricas

ej: SO3 , SO2 , O2 , N2 , Br2 etc. ocurren entre una fase y el soluto donde
ambas son neutros o polarizables.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 15 — #25

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 15

1.9 Bases fı́sicas de la cromatografı́a

Entre más grande la razón de los coeficientes de partición mas grande
es la separación entre los componentes de una mezcla.
Las ecuaciones(1.5) y (1.5) relaciona el tiempo de retención, coeficiente
de partición y el volumen de las fases estacionaria y móvil.
′ ′
Debido a que tr αK αK la retención relativa (α) puede ser expresada
como:
t,
′
Kr2 K2
α = r2 = ′ =
t,r1 Kr1 K1

1.9.1 Eficiencia
Existen dos factores que contribuyen a la eficiencia de una separación.
1-La diferencia del tiempo de elución entre picos, entre mas grande es
esta diferencia mejor la separación.
2-El ancho de los picos. Entre mas ancho sean los picos mas pobre es
la separación.
La eficiencia de una columna se mide por la altura de plato H. El nombre
proviene de la teorı́a de la destilación, en la cual la separación puede
ser llevada a cabo en escalones discretos llamados Altura equivalente o
un plato teórico.
El ensanchamiento de banda (ancho de los picos)también se produce
como consecuencia de la velocidad finita con la que ocurren los distintos
procesos de transferencia de masa durante la migración de una especie
√ a
lo largo de la columna. La desviación estándar de una banda σ = 2Dt.
De donde D = coeficiente de difusión
t = tiempo
Si un soluto viaja a una distancia x a una velocidad de flujo lineal
m
= µx el tiempo que gasta este al viajar por una columna serı́a:
s
x
t = , por lo tanto:
µx
x 2D 2D
σ 2 = 2D = x, si = H ⇒ σ 2 = Hx
µx µx µx
σ2
H=
x
Del análisis anterior podemos concluir que la altura de plato es la con-
stante de proporcionalidad entre la varianza σ 2 de la banda y la distan-
cia (x)que ha viajado.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 16 — #26

16 E.Lans

Fı́sicamente NO EXISTEN estos platos en cromatografı́a, de tal manera

que uno debe considerar la altura de plato como un término que rela-
ciona el ancho de una banda con la distancia recorrida en una columna.
La altura de plato H es proporcional a la varianza de una banda cro-
matográfica. Cuanto mas pequeño es la altura de plato mas estrecho es
el ancho de una banda.

La capacidad que tiene una columna para separar una mezcla de com-
ponentes es mejorada por la disminución en la altura de plato.

Diferentes solutos que pasan a través de una misma columna, tienen

diferentes alturas de plato, por que ellos tienen diferentes coeficientes
de difusión.

Las alturas de platos en cromatografı́a de gas son aproximadamente de

0,1 a 1mm, en HPLC ∼ 10µm y < 1µm en electroforésis capilar.
La altura de plato; donde σ es la desviación estándar de la curva gau-
siana y x es la distancia que viaja a través de la columna.

1.9.2 Ecuación de Van Deemter

La ecuación de Van Deemter nos dice como la columna y la velocidad
de flujo afecta la altura de plato. La eficacia de las columnas cro-
matográfica pueden evaluarse por la ecuación 1.9.2

B
H ≈A+ + Cux
µx

H= altura de plato en cm A= término de los múltiples pasos, factor

de tortuosidad, o difusión de Eddy. Cux = término de transferencia
de masas, es decir tiempo finito requerido para que el soluto alcance el
equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria.
cm
µx = velocidad lineal de la fase móvil .
s
B = difusión longitudinal.

La altura de plato debido al término de transferencia de masa es:

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 17 — #27

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 17

′
K d2 × µx
H= ≅ Cux
(K ′ + 1)2 D
′
K = factor de capacidad d = espesor de la fase estacionaria D = coe-
ficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria
La altura de plato es reducida con el término de transferencia de masas
disminuyendo el espesor de la fase estacionaria y aumentando la tem-
peratura, ya que ası́ se aumenta el coeficiente de difusión del soluto en la
fase estacionaria. Las alturas de plato en cromatografı́a lı́quida son un
orden de magnitud menores que las que se encuentran en cromatografı́a
de gas; sin embargo en cromatografı́a lı́quida el largo de las columnas
no son mayores de 25 a 50 cm, ya que no se pueden mantener la alta
presión a longitudes mas grandes; cosa que no ocurre en cromatografı́a
de gas. Ası́ vemos que esta contraresta a la H pequeño en cromatografı́a
lı́quida dado que en cromatogrfı́a de gas las columnas pueden alcanzar
hasta 50cm de longitud, las H y por ende la eficacia de la columna son
mayores con frecuencia en cromatografı́a de gas.
La expresión 1.9.2 es llamada ecuación de Van Deemter la cual se usa
para tratar de explicar las complejas interacciones fı́sicas y los efectos
que conducen al ensanchamiento de banda.
Si cambiamos la columna y la fase estacionaria cambian tambien los val-
ores de A, B y C. Según la ecuación de Van Deemter hay mecanismos
de ensanchamiento de la banda que son proporcional, e inversamente
proporcional e independiente a la velocidad de flujo. Figura 1.6

En las columnas empacadas todos los tres términos contribuyen al en-

sanchamiento de banda. Para las columnas open tubular el término A
es 0, de modo que el ancho de banda disminuye, aumentando por tanto
la resolución.
Cuando la altura de plato es mas pequeña, más estrecha es la banda;
ası́ que la ecuación de Van Deemter nos dice como afecta la velocidad
de flujo y la columna la altura de plato.

En electroforésis capilar tanto el término A como el C son 0 dismin-

uyendo la altura de plato a valores considerablemente bajos hasta nive-
les de micrómetros produciendo un poder extraordinario de separación.

Una gráfica de Cs versus Cm (a una temperatura dada) es llamada

isoterma. Figura 1.7
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 18 — #28

18 E.Lans

Figura 1.6: Aplicación de la ecuación de Van Deemter en cromatografı́a de gas

Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 19 — #29

Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados 19

En la figura 1.7 la isoterma de la izquierda ocurre cuando ha sido agre-

gado demasiado soluto a la columna, sobrecargándola. Cuando la con-
centración del soluto se incrementa es porque el soluto es mas soluble
en la fase estacionaria ; hay tanto soluto en la fase estacionaria que ésta
tiende a parecerse al soluto.(semejante disuelve semejante).
Una cola surge cuando algunos sitios de la fase estacionaria retienen so-
luto mas fuertemente que otros. En cromatografı́a se pueden presentar a
menudo cromatogramas con picos no muy bien definidos, presentándose
picos con cola, como se puede ver en la parte inferior de la figura 1.7
La isoterma de abajo en la figura ocurre cuando pequeñas cantidades
de soluto son retenidas mas fuertemente que cantidades grandes.

Como se dijo anteriormente, sitios que retienen solutos fuertemente cau-

san cola ; ası́ los grupos hidróxilos que forman enlaces de hidrógenos con
solutos polares producen colas muy marcadas. La silanización reduce
las colas porque bloquean a los grupos hidroxilos con otros grupos no
polares, como el trimetilsilil. Figura 1.8

Las columnas de vidrio o de sı́lice usadas en cromatografı́a de gas o

lı́quida también se pueden silanizar para minimizar la interacción del
soluto con los puntos activos de la columna.

1.10 Ejercicios
1. Considere un experimento cromatográfico en la cual dos compo-
nentes con factores de capacidad de 4,0 y 5,0 respectivamente, son
inyectados en una columna con 1x103 platos teóricos. El tiempo
de retención para el compuesto menos retenido es tr1 = 10,0 min.

Figura 1.8: Silanización

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 20 — #30

20 E.Lans

a)Calcular el tm y tr2
b) Encontrar W1/2 y W
c)Calcular la resolución de los dos picos.

Rta.
a)tm = 2 min.; tr2 = 12 min.
b)w2 = 1, 52 min. ;W1 = 1, 26;w1/2 pico 1 = 0, 74;w1/2 pico 2 =
0,89
c) Resolución = 1,44

2. La retención relativa de dos compuestos en cromatografı́a de gas

es 1,068 en una columna con una altura de pico de 0,520 mm. El
factor de capacidad para el compuesto 1 es 5,16.
a)¿Cual serı́a la longitud de la columna requerida para separar los
compuestos con una resolución de 1?
b) El tiempo de retención para el aire en la columna(a) es de 2.0
min.. Si el número de platos es el mismo para ambos compuestos.
Encontrar los tiempos de retención y la anchura de cada uno de
los picos.
c) Si la razón fase estacionaria fase móvil es 0,30, encontrar el
coeficiente de partición para el componente 1.

Rta.
a) L = 2,71 m
b) tr1 = 12, 32 min. ; tr2 = 13, 02 min. ; W1 = 0, 68 min. ;
W2 = 0, 72 min.
c) K = 17

3. Las áreas de picos obtenidas por cromatografı́a de gases para una

mezcla de acetato de metilo, propionato de metilo y n-butirato de
metilo fueron 17.6, 44.7 y 31.1 respectivamente.Calcular el por-
centaje de cada compuesto si las respectivas respuestas de de-
tección relativa fueron 0.65, 0.83 y 0.92
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 21 — #31

Capı́tulo 2

CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA

La cromatografı́a en capa fina se basa en la preparación de una capa

uniforme de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales para la cromatografı́a en capa fina
son : un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las
placas durante la extensión, otro para aplicar la placa de adsorbente y
una placa en la que se desarrollan las placas cubiertas. La fase móvil es
lı́quida y la fase estacionaria un sólido.

La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo

general menos polar que la fase estacionaria, de modo que los solventes
que se desplacen con mayor velocidad serán menos polares figura 2.1.
Durante décadas se ha perfeccionado esta técnica hasta tal punto que
hoy dı́a existe la cromatografı́a en capa fina de alta eficiencia ” HPTLC
” la cual se basa en la utilización de un adsorbente con un tamaño de
partı́culas mucho menor 5 a 17 µm que el que se utilizarı́a normalmente
lo cual implica el uso de un volumen de muestra mas pequeño. El uso
de silica gel refinada con tamaño de partı́cula de 5 µm ha contribuido al
desarrollo de la HPTLC. En los actuales momentos se ha desarrollado
buena instrumentación, hasta tal punto que se puede aplicar la muestra
automática; por ello es considerada una herramienta indispensable en el
control de calidad y en laboratorios de investigación. La técnica es fácil
de aprender, rápida versátil y en muchas ocasiones puede se preferida a
las técnicas de GC y HPLC.

21
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 22 — #32

22 E.Lans

Figura 2.1: Placa cromatográfica

2.1 Ventajas de la cromatografı́a en capa fina

1. La instrumentación utilizada es mas simple.

2. El tiempo para conseguir las separaciones es mucho menor.

3. El método es simple y los resultados son reproducibles, lo que la

hace un método adecuado para fines analı́ticos.

2.2 Adsorbentes
Al elegir un adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partı́-
culas. Cuanto más finamente dividido esté, mayor será su adhesión al
soporte.

2.2.1 Proceso de adsorción

La muestra aplicada en la capa, es adsorbida en la superficie del material
por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van Der Waals).
Luego cuando la placa es expuesta a un flujo por acción capilar, se
inicia una competencia de enlaces entre sitios activos del adsorbente y
la sustancia con el solvente.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 23 — #33

Grupo de Investigación “GIAMP” 23

2.2.2 Adsorbentes utilizados

Los adsorbentes más utilizados son la celulosa, el almidón, los azucares,
sı́lica gel entre otros, oxido de aluminio (alúmina) entre otros.

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales

de plantas y animales.

2.3 Preparación de placas

Para la preparación de las placas se sigue el siguiente procedimiento:

• Mezclar en un erlenmeyer el agua y el adsorbente

• Agitar fuertemente

• Extender la muestra sobre el soporte de vidrio

• Hacer oscilar la mezcla de un lado para otro

El espesor de la placa suele ser de 0.1 a 0,2 mm para separaciones

analı́ticas. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades que
afectarı́an el desarrollo del proceso cromatográfico. Las placas se dejan
en reposo un corto tiempo después de cubrirlas; luego se colocan en
bandejas metálicas. En este momento se puede activar el adsorbente,
bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente,
o calentándola durante 30-60 minutos a 105-110 grados Celsius, para
ası́ expulsar el aire.

2.4 Aplicación de las muestras

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible en un disol-
vente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficiente-
mente bajo para que se evapore después de su aplicación. Para sembrar
la muestra se utilizan micropipetas o un tubo capilar. El proceso de
siembra se hace tocando con la punta del capilar la placa preparada
dejando una distancia al borde inferior de un centı́metro aproximada-
mente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de
forma que en la placa sólo quedará la muestra a analizar.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 24 — #34

24 E.Lans

2.5 Elección del eluyente

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se
va a separar y del material en que la separación se llevará a cabo.
Entre los principales eluyentes en orden creciente de polaridad tenemos:
Eter de petróleo, éter dietĺico, ciclohexano, acetato de etilo, tetraclo-
ruro de carbono, piridina, benceno, etanol, cloroformo, metanol, di-
clorometano, agua y ácido acético.

Entre los factores para la elección del eluyente se encuentran: Pre-

cio,pureza, no utilizar mezclas de eluyente,no utilizar compuestos muy
volátiles, evitar que contengan trazas de metales (catalizadores)

La elección del eluyente se realiza de forma empı́rica. Hay que estudiar

la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez mas po-
lares hasta dar con el más apropiado.
Otra técnica para realizar consiste en sembrar varias muestras distan-
ciadas suficientemente y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes
sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente
radialmente por capilaridad, de tal forma que se aprecie el eluyente con
el cual la separación se realiza de una manera eficaz. Figura 2.2

2.6 Desarrollo de la cromatografı́a

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente
por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda
por una placa casi vertical, por la acción de la capilaridad.

Generalmente el eluyente se introduce en una cámara una hora antes

del desarrollo para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo
de desarrollo, por lo general no llega a los 30 minutos. Figura 2.3 Las
placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se
alcance una lı́nea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se
hace para estandarizar los valores de Rf. Frecuentemente esta distancia
es de 10 cms.

La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio

entre el origen y el frente del eluyente ya que permite separar las im-
purezas que se desplazan con mayor o menor velocidad.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 25 — #35

Grupo de Investigación “GIAMP” 25

Figura 2.2: Siembra de la muestra en una placa cromatográfica

Figura 2.3: Placa cromatográfica

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 26 — #36

26 E.Lans

2.7 Evaluación de un cromatograma de capa

fina
Para llevar a cabo una evaluación de un cromatograma en capa fina se
puede realizar por análisis cualitativo y análisis cuantitativo.

2.7.1 Análisis cualitativo

• Medida de Rf

• Comparación visual de color/intensidad.

2.7.2 Análisis cuantitativo

Comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha
contra una serie de manchas patrones de concentración conocida.

2.8 Localización de sustancias

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la
posición de dichos compuestos. Para ello existen dos métodos: Métodos
quı́micos y Métodos fı́sicos.

2.8.1 Métodos quı́micos

Consisten en realizar una reacción quı́mica entre un reactivo revelador
y los componentes separados. Para ello se atomiza la placa con los reac-
tivos reveladores con la ayuda de atomizador. Si el reactivo atomizador
es muy corrosivo o peligroso, la atomización deberá hacerse en una
vitrina de gases.Como reactivo revelador generalmente se utiliza yodo,
el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con
tonos amarillo-marrón) pero las manchas desaparecen con el tiempo por
lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reac-
ciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. El
tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de compo-
nente separado.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 27 — #37

Grupo de Investigación “GIAMP” 27

2.8.2 Métodos fı́sicos

El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente
de tal manera que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta,
y dependiendo del indicador y la longitud de onda aparecen manchas
fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.
Los compuestos que poseen fluorescencia se pueden detectar directa-
mente bajo la luz ultravioleta.

2.9 Constante Rf
La constante Rf (ratio of front) es simplemente una manera de expresar
la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal,
mide la retención de un componente. Se define como:

Rf= distancia recorrida desde el origen por el compuesto/distancia re-

corrida desde el origen por el compuesto de referencia

X
Rf =
f
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde
el centro de la mancha. Para que los Rf sean reproducibles se deben
fijar una serie de condiciones tales como espesor de la pelı́cula, fase
estacionaria, fase móvil y cantidad de muestra.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la
misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados
se calculan los Rf, y si son distintos puede decirse con toda seguridad
que no se trata del mismo compuesto.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la
misma placa con el mismo eluyente, u otros de menor polaridad, hasta
apreciar una separación mı́nima.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 28 — #38

Capı́tulo 3

ANALISIS
CUANTITATIVO Y
CUALITATIVO

3.1 Análisis cualitativo

Para identificar compuestos dos detectores son muy comunes. El es-
pectrómetro de masas y el IR con transformada de fourier. Un pico
puede ser identificado comparando su espectro con una biblioteca de
espectros que tiene el computador.

3.1.1 Co-Cromatografı́a
Es una forma mas adecuada de comparar tiempos de retención. Una
muestra autentica es agregada a una desconocida. Si el componente
agregado es idéntico a la desconocida, entonces el área relativa del pico
aumentará.

3.2 Análisis cuantitativo

En análisis quı́micos muchas veces se mide la respuesta que tiene el
método analı́tico con respecto a cantidades de analito (patrones o es-
tándares) presentes en una muestra dada.

Los métodos de cuantificación conocidos mas ampliamente son: la curva

de calibrado o estándar externo, método de la adición estándar, método

28
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 29 — #39

Grupo de Investigación “GIAMP” 29

del estándar interno y el método de la normalización de área.

3.2.1 Método de normalización de área

Como su nombre lo indica, la normalización de área realmente es un cal-
culo de porcentaje del área, el cual se asume como igual al porcentaje
en peso.
Si x es su sustancia de interés, entonces:

Ax
%área x = P × 100
(Ai )
i
donde Ax es el área de x y el denominador es la suma de todas las áreas.
Para que este método séa exacto se deben tener en cuenta los siguientes
criterios:

1. Todos los analitos deben ser eluı́dos

2. Todos los analitos deben se detectados

3. Todos los analitos deben tener la misma sensibilidad

Estas tres condiciones son raramente encontradas, pero este método es

simple y muy útil si el análisis semicuantitativo es suficiente o si alguno
de los analitos no ha sido identificado o no están disponibles en forma
pura (para uso en la preparación de estándares ).

Normalización de área con factor de respuesta

Si hay estándares disponibles el tercer criterio no se tiene en cuenta, para
ello se corre el estándar para obtener un factor de respuesta relativo f
Una sustancia ( puede ser un analito en la muestra) es escogido como
estándar y su factor de respuesta f se le da un valor arbitrario como
1.0. Se hacen mezclas en peso del estándar y otros analitos, y se realiza
el proceso cromatográfico. Luego se miden las áreas del estándar As y
del analito Ax y se calcula el factor de respuesta del analito ( fx ).
! !
As Wx
fx = fs × ×
Ax Ws
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 30 — #40

30 E.Lans

donde Wx /Ws es la razón de peso del analito y estándar. Los factores

de respuesta de algunos compuestos han sido publicados para los detec-
tores mas comunes en GC, pero para mayor exactitud en los cálculos se
debe determinar su propio factor de respuesta.
Cuando una muestra desconocida es corrida, cada área es medida y
multiplicada por su factor. Luego el porcentaje es calculado como se
dijo anteriormente, veamos

(Ax fx )
%x = P × 100
(Ai fi )
i

Ejemplo:
Considere una mezcla de etanol, hexano, benzeno y acetato de etilo que
se van a analizar utilizando un detector TCD.
Las áreas obtenidas se muestran en la tabla 3.2.1 Cada área es multi-
plicada por su factor de respuesta.

Para calcular el área corregida se multiplica el área del analito respec-

tivo dada directamente por el instrumento, por el factor de respuesta.
Hay que tener en cuenta que este factor es propio de cada analito en un
detector determinado; en el caso del etanol serı́a (5.0) × (0.64) = 3.2.
Ahora cada área debe ser normalizada para conseguir el porcentaje;
para el caso del etanol serı́a:

3.2
%etanol = × 100 = 17.6
18.5
El área de cada analito es normalizada como en el procedimiento ante-
rior

Tabla 3.1: Normalización de área con factor de respuesta

Compuesto Area fx Area corregida % peso % área Error

Etanol 5.0 0.64 3.20 17.6 20.0 +2.4
Hexano 9.0 0.70 6.30 34.7 36.0 +1.3
Benzeno 4.0 0.78 3.12 17.2 16.0 −1.2
Actato de etilo 7.0 0.79 5.53 30.5 28.0 −2.5
Total 25 18.15 100 100
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 31 — #41

Grupo de Investigación “GIAMP” 31

La tabla 3.2.1 en su última columna muestra los errores en que se incurre

cuando no se usa el factor de respuesta.

Método de la adición patrón

Consiste en añadir cantidades conocidas de analito al problema, cuyo
contenido en analito se requiere determinar.A partir del aumento de
señal se deduce cuanto analito habÃa en la muestra problema. Este
método requiere una respuesta lineal frente al analito.
La adición de patrón es especialmente apropiada cuando la matrı́z de
la muestra es compleja y afecta a la señal analı́tica. Se define matrı́z
como todo lo que hay en la muestra a demás del analito. Se define como
efecto de matr’iz el cambio que experimenta una señal analı́tica distinta
a la del analito.
El método de la adición estándar obedece a la siguiente ecuación:

Ix [X]i
=
Is+x [S]f + [X]f

Método del estándar interno

En cromatografı́a el análisis cuantitativo es llevado acabo agregando
una cantidad conocida de un estándar interno al desconocido. Después
se mide el factor de respuesta del estándar según la ecuación:

Ax /[×] = F (As /[S])

Donde:
Ax = Area de la señal del analito
As = Area de la señal del estándar
[X] = Concentración del analito en la mezcla
[S] = Concentración del estándar en la mezcla
F = Factor de respuesta
Para usar un patron interno primero se debe conocer la respuesta rel-
ativa del detector a las dos especies ( patrón y analito). Para ello se
prepara una mezcla de concentraciones conocidas tanto del estándar
como del analito. Normalmente el detector da una respuesta diferente
de ambas especies aun cuando sus concentraciones en la mezcla sean
iguales, de allı́ la importancia del factor de respuesta. Si el detector re-
sponde de igual manera al estándar que al analito entonces F = 1. Si el
detector responde con el doble de intensidad al analito que al estándar
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 32 — #42

32 E.Lans

F = 2. Si el detector responde intensidad a la mitad del analito con

respecto al estándar, entonces F = 0.5.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 33 — #43

Capı́tulo 4

CROMATOGRAFIA DE
GAS

En cromatografı́a de gas el analito es transportado a través de la co-

lumna por una fase móvil gaseosa llamada Carrier gas

4.1 Cromatografı́ gas lı́quido

Llamada también de partición, la fase estacionaria es un lı́quido no
volátil que cubre la parte interna de la columna, o está sobre un soporte
sólido.

4.2 Fase móvil

En cromatografı́a de gas la fase móvil es un gas generalmente He, N2 ,
o H2 y la fase estacionaria es generalmente un liquido no volátil y
algunas veces un sólido. El analito debe estar en forma gaseosa o como
un lı́quido volátil

La columna debe estar lo suficientemente caliente para proveer presión

de vapor del analito y pueda ser eluato en un tiempo razonable. El
detector es mantenido a una temperatura mas alta que la columna ası́
que todos los analitos serán gaseosos.
Existen dos clases de columnas en cromatogrfı́a de gas, las tubulares
abiertas llamadas también open tubular column y las empacadas.

33
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 34 — #44

34 E.Lans

Figura 4.1: Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gas

4.3 Columnas tubulares abiertas

La mayorı́a de los análisis usan open tubular column, largas y estrechas
hechas de sı́lica fundida (SiO2 ) y revestida con poliamida (un plástico
capaz de resistir hasta 350 o C) para soporte y protección de la humedad
atmosférica. El diámetro interno de las columnas esta entre 0.10–0.53
mm y la longitud de 15–100 m.

4.3.1 WCOT :wall coated tubular column

Caracterı́sticas:El espesor de la pelı́cula de la fase estacionaria en el

interior de la columna está entre 0.1–5µm. Disminuyendo el espesor
de la pelı́cula de la fase estacionaria aumenta la resolución, disminuye
el tiempo de retención y disminuye la cantidad de muestra. La fase
estacionaria esta adherida a las paredes internas de la columna.

4.3.2 SCOT: support coated open tubular column.

Caracterı́sticas:Partı́culas sólidas con la fase estacionaria liquida están

adheridas a las paredes internas de la columna.

4.3.3 PLOT: porous layer open tubular column

Caracterı́sticas:La fase estacionaria sólida está unida a las paredes

internas de la columna. Para aumentar el área de contacto se tratan las
paredes de la columna con HF, luego se deposita allá la fase estacionaria.
La eficiencia de las SCOT es intermedia entre las WCOT y las columnas
empacadas.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 35 — #45

Grupo de Investigación “GIAMP” 35

4.4 Ventajas de las open tubular column

comparadas con las columnas empacadas las open tubular ofrecen:alta
resolución,tiempo de análisis mas cortos,gran sensibilidad y mas baja
capacidad de muestra.
Las narrow open tubular column ofrecen mas alta resolución que las
wider open tubular pero requieren mas alta presión para operar y tienen
menos capacidad de muestra.

4.5 Clases de fase estacionaria

(Diphenyl)x(dimethyl)1-x polysiloxane.
(Cyanopropylphenyl)0.14(dimethyl)0.86 polysiloxane: Polaridad inter-
media.
Carbowax (poly(ethyleneglycol)) :Fuertemente polar.
(biscyanopropyl)0.9((cyanopropylphenyl)0.1 polysiloxane: Fuerte pola-
ridad.

4.6 Escogencia de la fase estacionaria

La escogencia de una fase estacionaria dada para un problema dado se
basa en la regla: semejante disuelve semejante. Columnas no polares
son mejores para solutos no polares las de polaridad intermedia son
mejores para solutos de polaridad intermedia.
Advertencia:Las altas temperaturas y la exposición al oxı́geno causan
degradación de la columna y producen cola en los cromatogramas.
Entre sólidos usados para columnas PLOT tenemos alúmina Al2 O3 la
cual es una fase estacionaria que separa hidrocarburos en cromatografı́a
de adsorción gas sólido.
Para evitar daños a las columnas por impurezas de los gases, éstos
pueden ser secados utilizando trampas que contienen Mallas Molecu-
lares ya que el agua es fuertemente retenida por éstas. Las mayas
moleculares son material inorgánico o polı́meros orgánicos con grandes
cavidades dentro de las cuales pequeñas moléculas entran y son par-
cialmente retenidas. Moléculas, tales como H2 O2 CO2 CH4 pueden ser
separadas una de otras. Las mallas inorgánicas pueden ser regeneradas
calentando a 300o C al vacı́o o bajo flujo de N2 .
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 36 — #46

36 E.Lans

4.7 Columnas empacadas

Contienen un soporte sólido fino con un lı́quido no volátil como fase esta-
cionaria o sólo el soporte sólido puede actuar como fase estacionaria. Las
columnas son generalmente hechas de acero inoxidable, nı́kel o vidrio.
El diámetro interno es de 3 - 6 mm y la longitud es de 5 y 20 cm, el
soporte sólido a menudo es de diatomea que es silanizado..
En las columnas empacadas el tamaño uniforme de las partı́culas dismin-
uye el termino múltiples caminos (A) en la ecuación de VAN DEEMTER
reduciendo ası́ la altura de plato y aumentando por ende la resolución.

El pequeño tamaño de las partı́culas disminuye el tiempo requerido para

que el soluto alcance el equilibrio mejorando la eficiencia de la columna,
sin embargo entre mas pequeño es el tamaño de las partı́culas se requiere
mas presión para que la fase móvil pase a través de la columna.
El tamaño de las partı́culas se expresa en micrómetros o tamaños MESH
esto se refiere al tamaño del tamiz a través del cual las partı́culas son
pasadas o retenidas. Una partı́cula de 100/200 mesh pasa a través de
un tamiz de 100 mesh pero no a través de uno de 200. Es decir el mesh
da la apertura por pulgada lineal del tamiz.

4.8 Indice de retención

Los ı́ndices de retención de Kovats (I) para alcanos es igual a 100 veces
el número de átomos de carbono. Para el octano el (I) es de 800 para
el nonano es de 900.

4.9 Programación de temperatura y presión

En la programación de la temperatura, la temperatura de la columna
es subida durante la separación para incrementar la presión de vapor de
soluto y disminuir el tiempo de retención de los compuestos eluı́dos.
A temperatura constante en una mezcla los compuestos más volátiles
pueden emerger juntos y los menos volátiles pueden aún no ser eluı́dos
de la columna.
Si la temperatura es incrementada de 50 a 250 o C a una velocidad de 8
o C/min, todos los compuestos son eluı́dos y la separación de los picos

son uniformes. Hay que evitar subir la temperatura demasiado para

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 37 — #47

Grupo de Investigación “GIAMP” 37

prevenir descomposición térmica del analito o la fase estacionaria.

La programación de la presión es útil a analitos lábiles que no puedan

tolerar altas temperaturas.

4.10 Carrier gas

La eficiencia de la columna y el detector depende de la identidad del
gas soporte.
El HeN2 yH2 dan alturas de plato óptimos a una velocidad de flujo difer-
ente. (ver curva de van deemter)
Entre más rápidamente un soluto se difunde entre las fases, mas pe-
queños es la transferencia de masa, termino Cu en la ecuación de van
deempter.
Para la eficiencia de la columna y la velocidad de análisis el H2 es un
buen gas soporte. El H2 puede reaccionar catalı́ticamente con com-
puestos insaturados sobre superficies metálicas.
Las impurezas en el carrier gas degradan la fase estacionaria.
Se deben usar gases de alta calidad y aún ası́ estos deben pasarse a
través de filtros para remover el oxı́geno , agua y trazas de compuestos
orgánicos antes de que estos entren a la columna.

4.11 Inyección de la muestra

Los lı́quidos son inyectados con una jeringa a través de un serpentı́n
de caucho pasando por el glass liner silanizado. El gas soporte barre
la muestra vaporizada desde el puerto de inyección hacia la columna
cromatográfica. El volumen de inyección es tı́picamente 0,1 - 2 µ L de
muestra.
La muestra descompuesta y componentes no volátiles lentamente se
acumulan en el glass linner el cual debe ser reemplazado periódicamente.

4.11.1 Inyeción split

Medio de introducir pequeños volúmenes de muestra en columnas open
tubular. Este modo se utiliza si el analito de interés constituye mas
del 0.1% de la muestra . Para trabajos de alta resolución, los mejores
resultados son obtenidos con este modo de introducción de la muestra,
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 38 — #48

38 E.Lans

preferiblemente conteniendo menor o igual a 1.0 ng de cada uno de los

componentes.
Una inyección split libera solamente 0,2 -2% de la muestra en la colum-
na.

4.11.2 Inyección splitless

Modo de inyección preferido para análisis a nivel de trazas, el analito
constituye menos del 0,01% en la muestra.
La temperatura de inyección para el modo splitless es mas bajo que para
el modo split, aprox 220 o C por que la muestra gasta mucho mas tiempo
en el puerto de inyección y no queremos que ocurra descomposición
térrmica. El tiempo de residencia en el glass liner es aprox de 1 min
por que el gas soporte fluye a través del liner a la columna con una
velocidad de flujo aprox 1 mil/min. En este modo el 80% de la muestra
entra a la columna. Es mejor a niveles de trazas para solutos de alta
ebullición en solventes de baja ebullición. Figura 4.3

4.11.3 Inyección on column

Se usa para solutos térmicamente inestables, y solventes con alto punto
de ebullición. Es mejor para análisis cuantitativos que la inyeción split/
splitless. La solución es inyectada directamente en la columna. En este
procedimiento la muestra es sometida a la mas baja temperatura posible
para evitar la perdida de soluto.

4.12 Detectores
Un detector no identifica que está eluyendo de la columna, sino que algo
está emergiendo.

4.12.1 Clases de detectores

Detector de ionización por llama (FID)
Es un detector universal ya que responde a todos los compuestos orgá-
nicos, entre sus caracterı́sticas se encuentran:Sensibilidad, estabilidad,
excelente rango lineal,fácil operación, mantenimiento y amplia aplica-
bilidad. Todos estos detalles lo hacen el más popular de los detectores
en cromatografı́a de gas. (McNair & Miller 1998)
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 39 — #49

Grupo de Investigación “GIAMP” 39

Figura 4.2: Inyección split/splitless

Figura 4.3: Detector de ionización por llama

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 40 — #50

40 E.Lans

Principios:Se aplica un voltaje a la boquilla de la llama y al colec-

tor. El carrier gas que sale de la columna es mezclado con hidrógeno
y quemado en la punta de la boquilla, luego se aplica oxı́geno como
una mezcla de aire en la cámara de combustión para asegurar la efi-
ciencia de la ionización del efluente de la columna. Esta combustión
genera iones. El movimiento de estos iones desde la llama al colector
cargado positivamente produce una pequeña corriente, estando presente
siempre una señal de fondo. Al introducir un compuesto orgánico en la
llama produce unos iones que incrementa la corriente de base. FIGURA
Esta señal es procesada por el registrador en un correspondiente pico
cromatográfico.

Detector captura de electrones (ECD)

Es un detector de ionización que es especı́fico para compuestos que
capturan electrones. Es usado para análisis de compuestos halogenados
debido a la sensibilidad extrema para estos compuestos.
Principios:Una fuente de electrones de una fuente radiactiva Ni63 es
usado para bombardear el efluente de la columna pasando a través del
detector. El make up gas es ionizado por los electrones libres de la
fuente, produciéndose un plasma que contiene entre otras especies elec-
trones térmicos. Se aplica una diferencia de potencial a la celda del
detector, el cual permite la captura de iones cargados negativamente
y de electrones.Esto crea una corriente que es la base para todas las
medidas. Cuando llegan los compuestos afines a los electrones estos
son capturados produciéndose una diferencia de corriente que es reg-
istrada y transformada en una señal. La cantidad de corriente reducida
es una función de la cantidad de compuesto presente y su capacidad de
capturar electrones.FIGURA

Detector de conductividad térmica (TCD)

Es sensible a todos los compuestos, pero la sensibilidad y la naturaleza
casi universal del FID ha hecho la utilidad del TCD útil solamente
en áreas de aplicación limitada. Principios: Consiste en dos celdas
cada una con un filamento calentado cuya resistencia al flujo de corri-
ente es mantenida electrı́nicamente. El carrier gas con el compuesto de
interés pasar a través de una celda, mientras que la otra celda (refer-
encia) recibirá solamente el carrier gas que no ha pasado a través de la
columna. Los filamentos se calientan simultáneamente; cuando pasa la
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 41 — #51

Grupo de Investigación “GIAMP” 41

muestra con el carrier gas hay una absorción de calor por la muestra,
lo que origina una diferencia de temperatura entre los dos filamentos
de los dos compartimientos. FIGURA Un cambio en la temperatura es
medido por el correspondiente cambio en la resistencia del filamento.
El cambio resultante en la resistencia del filamento ( temperatura) es
comparado con el filamento de la celda de referencia. La diferencia entre
las corrientes de las dos celdas es la señal, que es enviada al registrador
para procesarlo en un pico cromatográfico.FIGURA

Detector nitrogeno fósforo (NPD)

Es un detector de ionización que es selectivo hacia compuestos que con-
tienen átomos de nitrógeno o fósforo.
Principios: Funciona casi similar a FID excepto que tiene una sal
alcalina sobre la llama en la cámara de combustión. Una bolita de
silicato de aluminio (sulfato de rubidio) es calentada eléctricamente a
600 - 800o C por aplicación de una corriente, produciéndose un plasma
sostenida por adición de hidrógeno y aire. Los iones del metal alcalino
son emitidos desde aquı́ interactuando con el efluente de la columna.Una
pequeña corriente es producida por los movimientos de iones generados
desde el plasma al colector cargada positivamente. La introducción de
nitrógeno o fósforo contenidos en los compuestos causa un aumento en
la corriente por encima de la corriente base. Esta señal es procesada
por el registrador en un pico cromatográfico.

Detector fotométrico de llama

Es un detector óptico y especı́fico para compuestos que contienen fósforo
y sulfuros.
Principios: Se combina H2 y aire O2 para producir una llama, el
compuesto azufrado que proviene del efluente de la columna se quema
en la llama y emite una longitud de onda caracterı́stica del S2 , lo cual
es seleccionado por un filtro, luego esta luz emitida es enviada a un
tubo foto multiplicador que la transforma en corriente, la cual es en-
viada al registrador para su procesamiento en el correspondiente pico
cromatográfico.
H2O2
Compuesto azufrado −−−−→ SO + producto
llama

SO + O3 −−→ SO2∗ + O2
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 42 — #52

42 E.Lans

SO2∗ −−→ SO2 + Energı́a

4.13 Preparación de la muestra

Es un proceso de transformar una muestra en una forma que sea ade-
cuada para el análisis.
El proceso podrı́a evaluar: extracción del analito en una muestra com-
pleja, preconcentración de analito muy diluida para su medición, re-
mover o enmascarar las especies interferentes, o transformar quı́mi-
camente el analito en una especie mas conveniente a una forma mas
fácilmente detectable. (derivatización.

Microextracción en fase sólida

Metodo por medio del cual se puede extraer compuestos de lı́quidos,

aire o lodo sin usar ningún solvente.

Purga y trampa

Es un método para remover analitos volátiles de lı́quidos o sólidos

(tal como aguas subterránea o suelos)concentrando el analito e intro-
duciéndolo en el cromatógrafo. En contraste con la SPME el cual re-
mueve una porción del analito de la muestra , el objetivo de purga y
trampa es remover el 100% del analito en la muestra. Se burbujea el
gas de purga He en el recipiente donde se encuentra la muestra, el cual
es calentado para ayudar a la evaporación del analito, el gas de purga
junto con el analito salen y pasan a través de un tubo de adsorción
que contiene tres capas de compuestos de adsorbente con fuerzas adsor-
bentes diferentes ( bajo, moderado y alto) luego es retirado el tubo con
los analitos adsorbidos e inyectados en el cromatógrafo de gas, donde
empieza la desorción.

4.13.1 Selección del método en cromatografı́a de gas

Para seleccionar un método en cromatografı́a de gas se debe tener
en cuenta lo siguiente:Objetivo del análisis,preparación de la mues-
tra,detector, columna y modo de inyección.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 43 — #53

Grupo de Investigación “GIAMP” 43

Objetivo del análisis

Que se requiere del análisis?: La identificación cualitativa de los com-

ponentes de una mezcla?. Requiere la separación una alta resolución
en todo el cromatograma? O una buena resolución en una porción de
este?. Puede sacrificar resolución por tiempo de análisis cortos?. Nece-
sita el análisis cuantitativo de uno o mas componentes?.Necesita alta
precisión?. Se encuentra el analito en concentración adecuada o necesita
técnicas especiales para ultra análisis (preconcentración y un detector
muy sensible).

Preparación de la muestra

La clave para una cromatografı́a exitosa en una muestra compleja es

limpiarla antes de entrar a la columna, para ello se usa la técnica
SPME o purga y trampa. Otros métodos incluyen extracción lı́quida,
extracción fluidos supercrı́ticos, extracción en fase sólida, desorción tér-
mica de volátiles de un material sólido. Estas técnicas aı́slan el analito
deseado de sustancias interferentes y pueden además concentrar anali-
tos diluidos hasta niveles detectables. Si la muestra no se limpia bien
pueden aparecer un gran numero de picos no resueltos y sustancias no
volátiles pueden arruinar su costosa columna cromatográfica.

Escogencia del detector

Para ello se hace necesario si quiere un detector especı́fico para un

elemento en particular, o para una clase particular de compuesto ej:
el FID requiere que la muestra contenga mayor o igual a 10 ppm de
cada analito para la inyección split. El de conductividad térmica de-
tecta toda clase de compuestos pero no es suficientemente sensible para
análisis alta resolución y columnas open tubular de diámetro estrecho.
El ECD es especı́fico para moléculas que contienen halógenos, carboni-
los conjugados, nitrilos, y compuestos nitro. La muestra debe contener
concentración mayor o igual a 100 ppb de cada analito. El detector
de fotoionización es especı́fico para compuestos aromáticos. NPD para
compuestos con nitrógeno y fósforo, FPD para compuestos que con-
tienen sulfuros.Fotométrico de llama para elementos como S, P , Pb o
Sn.

MS e IR son utilizados para identificar los eluatos.

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 44 — #54

44 E.Lans

Selección de la columna

Para ello hay que tener en cuenta: la fase estacionaria, el diámetro

de la columna, la longitud y el espesor de la fase estacionaria. Las
columnas pueden ser de polaridad intermedia, no polar y altamente
polar: por ejemplo: Para compuestos altamente polar se necesita una
columna fuertemente POLAR. Una columna con fase estacionaria inter-
media hará las mayorı́as de las separaciones que la columnas no polar
no pueden hacer. La mas alta resolución es alcanzada con columnas
estrechas y una fase estacionaria con espesor muy delgado. Esta combi-
nación minimiza la resistencia a la transferencia de masa termino C en la
ecuación de van deemter, la fase estacionaria y la móvil reducen la altura
de plato. Columnas de pelı́culas delgada, estrechas son especialmente
buenas para separaciones de mezclas de compuestos de alto punto de
ebullición que son retenidos demasiado fuertemente sobre columnas con
pelı́culas gruesas. El tiempo de retención corto provee alta velocidad de
análisis, sin embargo pelı́cula con espesor de pelı́culas delgado, diámetro
estrecho tienen muy poca capacidad de muestras y requieren un detector
con alta sensibilidad (el FID no es adecuado) no retienen compuestos
con bajo punto de ebullición y podr´a sufrir exposición de sitios activos
sobre la superficie de la sı́lice.Columnas con pelı́culas gruesa y estrecha
dan una buena combinación entre resolución y capacidad de muestra y
pueden ser usada con la mayorı́a de los detectores (excepto los TCD y
el IR) y con compuestos de alta volatilidad. Los tiempos de retención
son más largos que aquellos de columnas con pelı́cula delgada.
Columnas con diámetro grande y pelı́culas gruesa son sugeridas para
detectores de conductividad térmica TCD e IR ya que tienen alta ca-
pacidad de muestra y pueden manejar compuestos volátiles, pero dan
baja resolución y tiempos de retención muy largos. Si una columna
en particular satisface la mayorı́a de sus requerimientos pero no provee
suficiente resolución, entonces una columna mas larga del mismo tipo
podr´a ser usada. Doblando la longitud de la columna dobla el número
de platos y aumenta la resolución en 21/2, aunque esta no es la mejor
manera de aumentar la resolución por que dobla el tiempo de retención.
Al usar una columna mas estrecha o una fase estacionaria mas del-
gada incrementa la resolución sin perjudicar el tiempo de retención.
Cambiando completamente el tiempo de retención cambia tambión la
retención relativa de los componentes y podrı́a resolver los componentes
de interés.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 45 — #55

Grupo de Investigación “GIAMP” 45

4.14 Escogencia del modo de inyección

Inyección split
Es útil para analitos altamente concentrados, con este modo de inyección
se consigue alta resolución.

Inyección splitless
Es útil cuando las muestras están muy diluı́das, se consigue igualmente
alta resolución.

Inyección on column
Es mejor para análisis cuantitativo y compuestos térmicamente sen-
sibles. Es una técnica de baja resolución y no puede ser usada con
columnas cuyo diámetro interno sea menor de 0.25 mm. Puede manejar
soluciones diluidas o concentradas y volúmenes relativamente grandes o
pequeños.

4.15 Análisis cuantitativo y cualitativo

Para identificar compuestos dos detectores son muy comunes. El es-
pectrómetro de masas y el IR con transformada de fourier. Un pico
puede ser identificado comparando su espectro con una biblioteca de
espectros que tiene el computador.

4.15.1 Co-cromatografı́a
Es una forma más adecuada de comparar tiempos de retención. Una
muestra auténtica es agregada a una desconocida. Si el componente
agregado es idéntico al analito entonces el área del relativa del pico
aumenta.
Para llevar acabo un análisis cuantitativo se utilizan los métodos de
calibración estudiados en unidades previas.

Ejercicios
Las áreas de los picos obtenidos por cromatografı́a de gas para una mez-
cla de cetato de metilo, propionato de metilo y n-butirato de metilo
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 46 — #56

46 E.Lans

fueron: de 17.6, 44.7, 31.1 respectivamente. Calcular el porcentaje

de cada compuesto si las respectivas respuestas de detección relativas
fueron: 0.65, 0.83 y 0.92
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 47 — #57

Capı́tulo 5

ESPECTROMETRÍA DE
MASAS

La espectrometrı́a de masas da el nombre a un conjunto de técnicas

utilizadas para la medida de las masas de los iones y su abundancia en
la fase gaseosa.
El conjunto de técnicas llamadas espectrometrı́a de masas es una de las
mas versátiles e importantes instrumentos de análisis quı́micos

5.1 Cualidades de la espectrometrı́a de masas

5.1.1 Cualidades de indentificación
Puede identificar cualitativamente de forma inequı́voca casi cualquier
tipo de sustancia.

5.1.2 Cuantifica e identifica

Puede identificar y cuantificar la concentración de la sustancia bajo
estudio.

5.1.3 Sensibilidad
Detecta en el orden de ppq (ICP-MS) y tiene capacidad de separar
mezclas complejas.

47
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 48 — #58

48 E.Lans

5.1.4 Universal y especı́fica

Analiza sustancias o mezclas de sustancias sólidas, lı́quidas y gaseosas.
Es capaz de detectar y separar una sustancia en presencia de una matriz
compleja.

5.1.5 Información estructural

Suministra información estructural de la molécula.

5.1.6 Rapidez
Puede realizar un espectro en décimas de segundos.

5.2 Tecnicas de ionización

Dependiendo de la naturaleza del compuesto a analizar o del interés
del investigador se utilizan varias tćnicas de ionización. Ente ellas ten-
emos: Ionización por impacto electrónico(EI), ionización quı́mica(CI),
ionización por campo(FD), desorción por campo(FD), bombeo con á-
tomos rápidos(FAB), electrospray ( ES, ESI), ionización a presión atr-
mosférica. Las tres primeras fuentes requieren la volatilización de la
muestra antes de la ionización;a ellas se les llama fuentes de fase gas;
por tanto sólo se pueden usar para compuestos térmicamente estables
que tengan puntos de ebullición menores de 500 o C. Mayoritariamente
las fuentes de gas están limitadas a compuestos con PM menores de 103
daltons.

5.3 Ionización por impacto electrónico (EI)

Es el mas utilizado. Cuando las moléculas se encuentran en la cámara de
ionización son sometidas a un bombardeo con una corriente de electrones
provenientes de un filamento. El número de electrones es controlado
por la temperatura del filamento, mientras que su energı́a lo es por el
potencial a que se mantiene el filamento. El potencial del filamento se
puede variar. 70 eV es el mas usual.Figura 5.1

M + e− −−→ M + + 2 e−
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 49 — #59

Grupo de Investigación “GIAMP ” 49

Figura 5.1: Ionización por impacto electronico

5.4 Ionización quı́mica

En las fuentes de ionización quı́mica se utiliza un gas reactivo ( metano,
amonı́aco, argón, isobutano etc) para suavizar las condiciones de ion-
ización de la muestra . Por tal razón hay menos energı́a en exceso y por
ende menos fragmentación que el EI ( por encima de la que se necesita
para la ionización). Se introduce el gas en la cámara de ionización a
una presión de 10−3 torr, su concentración es mucho más alta que la de
la muestra. Se ioniza el gas con un haz de electrones y a través de su
subsiguientes reacciones acepta protones para formar iones moleculares.
Si se usa metano el ión primario formado es el CH5+ , este, transfiere
un protón a las moléculas de analito que tienen mayor afinidad por el
protón, mediante la reacción:

CH5 + + M −−→ MH+ + CH4

5.5 Ionización Quı́mica negativa

La reacción más frecuente es la abstracción protónica.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 50 — #60

50 E.Lans

MH + R− −−→ M− + RH + Energı́a
El exceso de energı́a producido en la reacción suele quedar en forma
de energı́a vibracional asociada al enlace R−H de la especie neutra
formada, lo que hace que la especie M − formada sea muy estable y
halla una ausencia casi total de fragmentación.

5.6 Ionización por campo

Aquı́ los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico el-
evado al aplicar altos voltajes (10 a 20 kV) a emisores que contienen
numerosas puntas finas de diámetros menores de 1µm. Estos emisores
adquieren la forma de un fino hilo de tungsteno en la cual se han he-
cho crecer centenares de agujas microscópicas de carbón por pirolisis de
benzonitrilo que emergen desde la superficie del hilo.
La muestra gaseosa se difunde en el área del campo elevado alrededor de
las micropuntas donde se concentra éste. En las micropuntas es donde
tiene lugar la ionización donde los electrones del analito son extraı́dos.
En este caso el analito adquiere poca energı́a vibracional y rotacional
por lo que se produce poca fragmentación.

5.7 Fuentes de desorción

Son aquellas donde no es posible la ionización de analitos térmicamente
inestables y no volátiles.
Los métodos de desorción prescinden de la volatilización y la poste-
rior ionización. En su lugar se suministra energı́a a la muestra lı́-
quida o sólida de modo que se provoca la formación directa de iones
gaseosos. Como consecuencia los espectros aparecen muy simplificados
y a menudo consisten sólo en el ión molecular o el ión molecular proton-
ado. Con esta técnica se puede obtener información sobre espectros de
masas de especies bioquı́micas y especies con PM por encima de 10.000
daltons.

5.8 Desorción por campo

Se utiliza un emisor con multiples puntas como se describió anterior-
mente. En este caso el electrodo se monta sobre una sonda que puede
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 51 — #61

Grupo de Investigación “GIAMP ” 51

separarse del compartimiento de la muestra y mojarse con una solución

de la muestra. Después la sonda se reinserta en el compartimiento de
la muestra, la ionización tiene lugar por la aplicación de un potencial
elevado a este electrodo.

5.9 Bombardeo por Átomos Rápidos (FAB)

Es importante para el estudio por espectrometrı́a de masas para com-
puestos de elevado peso molecular. La muestra condensada (a menudo
en glicerol) se ionizan por bombardeo con átomos de elevada energı́a
de xenón o argón. Tanto los iones negativos y positivos del analito son
expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorción.
Este procedimiento permite un calentamiento rápido de la muestra re-
duciendo su fragmentación.

5.10 Ionización electrospray

5.11 Espectrómetro de masas

Un espectrómetro de masas consta de:

1. Una fuente de ionización

2. Un analizador

3. Transductor(dectector)

5.11.1 Cámara de ionización

Zona donde se introducen la moléculas ( pueden ser gaseosas, lı́quidas
o sólidas), se evapora se ioniza y se aceleran (las muestras gaseosas se
ionizan entre dos placas cargadas). Los iones formados son de masas
diferentes.

Figura 5.2: Partes de un espectrómetro de masas

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 52 — #62

52 E.Lans

Figura 5.3: Esquema interno de un espectrómetro de masas

5.11.2 Analizador de masas

Después de ser acelerados los iones pasan al analizador de masas que
son de varios tipos, donde se separan de acuerdo a su masa. Figura 5.3.
En general en el analizador se necesita un vacı́o del orden 10−7 torr o
mejor. Para lograrlo se debe utilizar un sistema eficiente de bombeo.

5.12 Detectores
Como ya lo habı́amos dicho un detector es aquel que convierte una
propiedad quı́mica de un analito en una señal susceptible de ser me-
dida. En masas el detector más utilizado es el channeltron.El efecto es
muy parecido al fotomultiplicador. Es un tubo de vidrio abierto con un
cono en una terminación. Para la detección de iones positivos, el cono
es sometido a un alto potencial negativo (aproximadamente −3kV ).

5.12.1 Channeltron
Cuando los iones salen del analizador de masas, son atraı́dos por el
potencial negativo del cono. Cuando los iones chocan con su superfi-
cie,ası́ se originan uno o más electrones secundarios. El potencial dentro
del tubo varı́a continuamente con la posición, tal que los electrones se-
cundarios se mueven hasta llegar a otra zona donde se originan otros
electrones secundarios, y ası́ sucesivamente. Figura 5.4
El tubo está cubierto por un material semiconductor. La vida media
del multiplicador está determinada por la carga total acumulada.

5.12.2 Copa de faraday

El analizador del gas consiste en una fuente del Ion, un espectrómetro
total, y una sección de la medida. Se ioniza el gas residual cuando choca
con los filamentos termoelectrónicos cargados de alta temperatura, y
los iones que se crean, se aceleran y convergen sobre el espectrómetro

Figura 5.4: Detector channeltron

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 53 — #63

Grupo de Investigación “GIAMP ” 53

Figura 5.5: Copa de faraday

total. En el espectrómetro total, los voltajes de la corriente alterna

se aplican a los cuatro electrodos cilı́ndricos (quadrupolo), que permite
que los iones sean separados de acuerdo a su realción masa/carga. Los
iones separados son detectados como corriente eléctrica por la Copa de
Faraday. La corriente del ón es proporcional a la masa (presión parcial)
del gas. Figura 5.5

5.13 MÉTODOS ACOPLADOS A MASAS

Aunque la espectrometrı́a de masas es una poderosa herramienta para
la identificación de compuestos puros es insuficiente para el análisis
de incluso mezclas simples ya que la identificación está limitada por el
inmenso número de fragmentos de diferentes valores m/z producidos.

5.13.1 Cromatografı́a gas/masas- lı́quida/masas

Es una buena herramienta para el análisis de mezclas orgánicas y bio-
quı́micas complejas. En este caso se efectúan los espectros de los com-
puestos que salen de la columna cromatográfica;los cuales son almace-
nados en un ordenador para el siguiente proceso.
Los espectrómetros de masas también se pueden acoplar a cromatografı́-
a lı́quida MS/LC para el análisis de muestras que tienen constituyentes
no volátiles. El inconveniente que se presenta en los acoplamientos an-
teriores es que la muestra en el cromatógrafo está diluı́da por el gas o
el lı́quido portador de la columna; por lo que es necesario eliminar el
eluyente antes de la introducción de la muestra en el espectrómetro de
masas.

El detector de masas mas simple para cromatografı́a de gases es el de-

tector de trampa de iones (ITD)

5.13.2 Espectrometrı́a de masas en tandem MS/MS

Consiste en acoplar un espectrómetro de masas a otro. El primer es-
pectrómetro sirve para aislar los iones moleculares de varios compo-
nentes de una mezcla. Estos iones se introducen uno de tras otro en
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54 E.Lans

un segundo espectrómetro de masas. En un instrumento en tandem

el primer espectrómetro está equipado con un método de ionización
suave( ionización quı́mica) para que la salida sea mayoritariamente de
iones moleculares o iones moleculares protonados.Estos iones pasan en-
tonces a la fuente de ionización del segundo espectrómetro. Esta fuente
de iones consiste en una cámara de colisiones sin campo en la que se
bombea helio. Las colisiones entre los iones progenitores y los átomos de
helio producen fragmentaciones de iones progenitores dando numerosos
iones hijos. El espectro de estos iones hijos se efectúa por un segundo
espectrómetro. El primer espectrómetro tienen la misma función que la
columna en GC/MS o GC/LC.

5.13.3 Aplicaciones: Espectrometrı́a de masas en tandem

La espectrometrı́a de masas en tandem parece ofrecer las mismas ven-
tajas que GC/MS y LC/MS pero es más rápida.
La espectrometrı́a de masas en tandem es potencialmente más sensible
que las dos técnicas cromatográficas acopladas, ya que el ruido asociado
a su uso es menor.

5.13.4 Aplicaciones
Se ha utilizado en la determinación cualitativa y cuantitativa de los com-
ponentes de una amplia variedad de materiales complejos encontrados
en la naturaleza y la industria.Ejemplos

1. Identificación y determinación de metabolı́tos de drogas.

2. Feromonas de insectos.

3. Alcaloides en las plantas.

4. Trazas de contaminantes en el aire.

5. Secuencia de polı́meros.

6. Compuestos petroquı́micos.

7. Bifenilos policlorados.

8. Gases de escape de automotores.

9. Olores en aire.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 55 — #65

Grupo de Investigación “GIAMP ” 55

5.13.5 Desventajas
Una desventaja de la cromatografı́a de masas en tandem con respecto
a los otros procedimientos cromatográficos es el alto costo del equipo
requerido.

5.13.6 Identificación de compuestos por espectrometrı́a

de masas
El espectro de masas de un compuesto puro nos da información a cerca
de:

1. Peso molecular del compuesto.

2. De su formula quı́mica.

3. Sobre la presencia de varios grupos funcionales, estudiando el

modelo de fragmentación y comparando el espectro del compuesto
con uno conocido hasta su total coincidencia.

4. Relación con los picos debido a impurezas. Cuando existen dudas

se deben utilizar los espectros de ionización quı́mica o ionización
por campo.

5.13.7 Analizador de trampas de iones

En este instrumento, los iones se generan a partir de la muestra eluı́da,
por impacto electrónico o ionización quı́mica y luego se almacenan en
un campo de radiofrecuencia. A continuación los iones atrapados se
expulsan del área de almacenamiento hacia un detector multiplicador
de electrones. La expulsión se lleva a cabo de tal forma que es posible
un barrido en función del cociente/masa carga.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 56 — #66

Capı́tulo 6

CROMATOGRAFÍA
LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)

La cromatografı́a lı́quida es muy importante porque la mayorı́a de los

compuestos no son lo suficientemente volátiles para analizarse por cro-
matografı́a de gas.
En HPLC se usa alta presión para forzar el solvente a pasar a través
de una columna que contiene unas partı́culas muy finas que dan alta
resolución a las separaciones. El sistema HPLC involucra:

1. Un sistema de entrega de solvente.

2. Una válvula de inyección de la muestra.

3. Una columna que resiste alta presión.

4. Un detector.

5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa

un sistema para el control de la temperatura.

6.1 Proceso cromatográfico

En cromatografı́a de gas para incrementar la eficiencia se incrementarı́a
la velocidad de transferencia de masas entre la fase estacionaria y el

56
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 57 — #67

Grupo de Investigación “GIAMP” 57

analito. Para una columna open tubular esto es adecuado ya que dis-
minuyendo el espesor de la pelı́cula de la fase estacionaria y reduciendo
el diámetro de la columna las moléculas pueden difundirse rápidamente.

La difusión de los lı́quidos es 100 veces mas lento que la difusión de los
gases. Por tanto en cromatografı́a lı́quida no es generalmente factible
usar columnas open tubular, por que el diámetro de los canales del
solvente es demasiado grande para ser atravesado por una molécula de
soluto en corto tiempo. De modo que la cromatografı́a lı́quida es llevada
a cabo en columnas empacadas.

6.1.1 Efectos del tamaño de las partı́culas en HPLC

La eficiencia de una columna empacada se incrementa cuando el tamaño
de las partı́culas de la fase estacionaria decrece ya que disminuye la al-
tura de plato. En condiciones óptimas el número de platos teóricos en
una columna de longitud L (cm) es: N = 3.500L(cm)/dp(µm)
dp = tamaño de las partı́culas en micrómetro.

Una razón de porque las partı́culas pequeñas dan mejor resolución es

que ellas proveen un flujo mas uniforme a través de la columna, por
tanto reducen el termino de múltiples pasos A en la ecuación de Van
Deempter.
Una segunda razón es que la distancia a través de la cual el soluto
debe difundirse en la fase móvil entre partı́culas se debe al tamaño
de éstas. Cuando las partı́culas son pequeñas, hay menos distancia
entre ellas, para que el soluto se difunda mejor en la fase móvil. Este
efecto disminuye el término C en la ecuación de Van Deemter, dando
un tiempo finito entre equilibrio.
El inconveniente del pequeño tamaño de las partı́culas es la resistencia
al flujo del solvente, es por ello que requiere alta presión ( 70-400 atm).

6.1.2 Columnas
Las columnas en HPLC pueden ser de plástico, vidrio o acero inoxidable
con longitudes entre 5 y 30 cm, con un diámetro interno de 1-5 mm.
Las columnas son costosas, fácilmente degradables debido al polvo o
partı́culas que se encuentran en la muestra o el solvente, por lo que se
requiere de un guarda columna. Un guarda columna es una columna
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 58 — #68

58 E.Lans

corta que contiene la misma fase estacionaria que la columna principal.

Las partı́culas finas e impurezas son retenidas por el guarda columna,
la cual es periódicamente reemplazado.
Si se calienta la columna generalmente disminuye la viscosidad del sol-
vente, aumentando su velocidad de flujo y reduciendo la presión re-
querida.
Igualmente incrementando la temperatura disminuye el tiempo de re-
tención mejorando la resolución, ya que aumenta la difusión del so-
luto; no obstante este aumento de temperatura puede degradar la fase
estacionaria disminuyendo la vida útil de la columna.Si calentamos la
columna unos pocos grados sobre la temperatura ambiente, mejora , la
precisión (reproducibilidad y repetibilidad) del análisis cuantitativo y
el tiempo de retención.
Mientras en GC se necesitan muchas columnas para abarcar el rango de
separaciones posibles en HPLC con una sola columna podemos separar
sustancias polares, ionizables y no polares simplemente modificando la
composición de la fase móvil.

6.1.3 Columnas analı́ticas

El tamaño de las partı́culas de relleno en esta columnas son de 3-10 µm.

La columna más utilizada es la de 25 cm con tamaño de partı́culas de
5 µmy diámetro interno de 4.6 mm.
Estas columnas alcanzan unas alturas de platos teóricos de 40.000 a
60.000.

6.1.4 Fase estacionaria

Existen dos tipos básicos de relleno pelicular y de partı́cula porosa.

La mas común son partı́culas microporosas esféricas de sı́lica que son
permeables al solvente y tienen un área de superficie bastante grande.
Las esferas son de vidrio o polı́meros con diámetro de 30 a 40 µm. En la
superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de sı́lice,
alúmina o resina de intercambio iónico.Estas esferas también se pueden
tratar quı́micamente para obtener una capa superficial orgánica.
Los tı́picos rellenos de partı́culas porosas en cromatografı́a de lı́quidos
están formados por micro partı́culas porosas con diámetros de 3 a 10
µm.
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Grupo de Investigación “GIAMP” 59

6.1.5 Proceso de elución

En la cromatografı́a de adsorción las moléculas de solvente compiten con
las moléculas de solutos por los sitios activos de la fase estacionaria.
Las capacidades relativas de los diferentes solventes para eluir un soluto
dado del adsorbente son casi independiente de la naturaleza del soluto.
La elusion se puede describir como un desplazamiento de soluto a través
la fase estacionaria por el solvente.

Fuerza del eluente ε0

Es una medida de la energı́a de adsorción del solvente, la cual es cero

(0) para el pentano para adsorción sobre sı́lica. Entre más polar es el
solvente más fuerza de elusión tiene sobre la sı́lica. Entre mas grande
sea la fuerza del eluente mas rápidamente será eluı́do de la columna.
La cromatografı́a de adsorción sobre sı́lica bare es un ejemplo de cro-
matografı́a en fase normal en la cual usamos una fase estacionaria polar
y un solvente menos polar. Un solvente mas polar tiene una fuerza de
eluente mas alta.

6.2 Clasificación de la cromatografı́a lı́quida

La cromatografı́a lı́quida la podemos clasificar en cromatografı́a lı́quido
- sólido o de adsorción, cromatografı́a lı́quido-lı́quido o de partición,
cromatografı́a de intercambio iónico, y cromatografá de exclusión por
tamño.

6.2.1 Cromatografı́a lı́quido - lı́quido o de partición

Aquı́ las moléculas de soluto se distribuyen entre los dos lı́quidos,uno
de ellos hace las veces de fase estacionaria y el otro de fase móvil.
Esta última se encuentra distribuı́da homogéneamente sobre un soporte
sólido.
Este tipo de cromatografı́a presentó inconvenientes mayores debido a
que: 1-Se requerı́a presurizar la fase móvil con la fase estacionaria.
2- Era necesario disolver la muestra en la fáse móvil presaturada con
fase estacionaria.
3-No se podia llevar acabo gradiente de elución.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 60 — #70

60 E.Lans

6.2.2 Cromatografı́a lı́quido-sólido o de adsorción

En este tipo de cromatografı́a se emplea un fase estacionaria polar como
la sı́lica gel y una fase móvil no polar como el hexano.

6.3 Cromatografı́a en fase reversa

Es la mas común donde el solvente es polar y la fase estacionaria es
apolar o ligeramente polar. Aquı́ un solvente menos polar tiene una
fuerza de elución mayor. Generalmente el solvente es un hidrocarburo.
En la cromatografı́a en fase reversa se eliminan picos con cola (tail-
ing) por que la fase estacionaria tiene pocos sitios que puedan adsorber
fuertemente al soluto como para producir el tailing. La cromatografı́a
en fase reversa es menos sensible a las impurezas polares (como agua) en
el eluente. En esta cromatografı́a los componentes mas polares apare-
cen primero y un aumento en la polaridad de la fase móvil disminuye el
tiempo de elución.

6.4 Cromatografı́a en fase normal

Aquı́ la fase estacionaria es polar y la fase movil apolar. En cro-
matografı́a en fase normal el soluto menos polar se eluye primero debido
a que es más soluble en la fase móvil y un aumento en la polaridad en
la fase móvil aumenta el tiempo de elución.

Ejemplos

El siguiente ejemplo muestra el comportamiento de elución de los dis-

tintos componentes teniendo en cuenta su polaridad y la clase de po-
larografı́a utilizada.(Skoog & Holler 1998)

6.5 Cromatografı́a de adsorción

Llamada cromatografı́a liquido-sólido. Las únicas fases que se utilizan
en HPLC lı́quido-sólido son la sı́lice y la alúmina, siendo la sı́lice la que
más es utilizada, se usa para casi todas las aplicaciones debido a su
mayor capacidad de carga y mayor diversidad de presentaciones.
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Grupo de Investigación “GIAMP” 61

Figura 6.1: Cromatografı́a fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad)

Polaridad de los componentes: A>B>C

Figura 6.2: Cromatografı́a fase normal.(Fase móvil de polaridad media)

Figura 6.3: Cromatografı́a en fase normal.(Fase móvil de polaridad media)

Polaridad de los componentes: A>B>C
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62 E.Lans

Figura 6.4: Cromatografı́a en fase inversa.(Fase móvil de alta polaridad )

En cromatografı́a lı́quido-sólido la única variable que se puede utilizar

para optimizar K y α es la composición de la fase móvil.

La cromatografı́a de adsorción es más adecuada para compuestos no

polares con masas moleculares inferiores a 5000.
Esta cromatografı́a es mas adecuada para muestras que son solubles
en disolventes no polares, por lo que tiene una solubilidad limitada
en los disolventes acuosos, utilizados en cromatografı́a de fase inversa.
Una caracterı́stica particular de la cromatografı́a de adsorción es su
capacidad de diferenciar isómeros.

6.5.1 Elección del solvente

Para elegir el solvente adecuado se varı́a la relación entre los disolventes
′
y se obtiene ası́ un valor adecuado de k . Se ha encontrado que un
aumento de 0,05 unidades en el valor de εo por lo general disminuye 3
′
o 4 veces el valor de k .
Con estas combinaciones se pueden encontrar la relación que favorezcan
los tiempos de retención para cualquier mezcla, pero por desgracia la
relación de volumen no es lineal con εo .

6.6 Gradiente de dilusión isocrática

La elución isocrática es llevada a cabo con un solo solvente (o mezcla
constante de solvente). Cuando un solvente no es capaz de dar una
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 63 — #73

Grupo de Investigación “GIAMP” 63

elución rápida de todos los componentes, entonces se usa el gradiente

de elución, que no es mas que hacer cambios continuos en la
composición del solvente para aumentar su fuerza.
El gradiente de elución en HPLC es análogo a la programación de tem-
peratura en cromatografı́a de gas.Aumentando la fuerza del solvente se
eluye más rápidamente el soluto retenido.

6.7 Selección del modo de separación

Hay varias formas de separar un componente de una mezcla dada. En
cualquier caso la primera pregunta que se debe hacer es si es soluble en
agua o en un solvente orgánico.
Si el soluto se disuelve en un solvente no polar o débilmente polar, usare-
mos la cromatografı́a en fase reversa. Si el peso molecular del soluto es
mayor de 2000 y son solubles en solventes orgánicos con diámetro molec-
ular menor de 30 nm escogemos cromatografı́a fase reversa (C18 , C8 , C4 ).
Si el peso molecular es mayor de 2000 y es soluble en solvente orgánico
y el tamaño molecular está entre 30-400 nm la cromatografı́a a escoger
es la exclusión por tamaño.
Si el peso molecular del soluto es menor de 2000 y es soluble en agua y
es iónico la cromatografı́a a escoger es la iónica.

6.8 Solventes
Se requieren solventes grados HPLC muy puros para evitar la degra-
dación de la columna debido a las impurezas y minimizar la señal de
fondo del detector debido a contaminantes.
Para evitar esto se utilizan filtros para retener las partı́culas con tama-
ños de las micra.
La muestra y el solvente son pasados a través de un guarda columna.
Aún contando con un guarda columna se recomienda el lavado periódico
de la columna analı́tica para prolongar su vida útil.
Antes del uso del solvente estos son purgados con He para remover el
aire disuelto, ya que las burbujas de aire les causan problemas a las
bombas,a las columnas y detectores. Las separaciones en fase normal
son muy sensibles al agua en el solvente.

Una buena cromatografı́a con fases móviles interactivas, requiere un

equilibrio adecuado entre las fuerzas intermoleculares entre los tres par-
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 64 — #74

64 E.Lans

ticipantes activos en el proceso de separación soluto, fase móvil

y fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares se describen en
términos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos.
Para una separación cromatográfica de reparto la polaridad de la fase
estacionaria ha de ser similar a la del analito y para la elusión se requiere
entonces una fase móvil de una polaridad considerablemente distinta.
La polaridad de los grupos funcionales viene dada:
hidrocarburos<eteres < esteres <cetona<aldehı́dos<amidas <aminas
<alcoholes. En conclusión podemos decir que para que ocurra una
buena separación las polaridades del soluto, fase móvil y la fase esta-
cionaria deben armonizarse, por que si el soluto tiene mucha mas a-
finidad con la fase móvil, los tiempos de retención serán demasiado
cortos para fines prácticos, y si tiene demasiada afinidad con la fase
estacionaria los tiempos de retención se hacen demasiado largos.

6.9 Criterios para una buena separación

El factor de capacidad es una medida del tiempo de retención (tr ) en
unidades de tiempo.
Separaciones razonables demandan que el factor de capacidad para to-
dos los picos deben estar en el rango 0,5-20. Si el factor de capacidad
es demasiado pequeño el primer pico es distorcionado por el frente del
solvente. Si el factor de capacidad es demasiado grande el tiempo de
análisis es muy prolongado.
Cuando no se observa perturbación en la lı́nea base de un cromatograma
el tiempo muerto se puede estimar con la ecuación :

Ldc
tm =
2F
Donde L = longitud de la columna
dc = diámetro interno de la columna
F = velocidad de flujo

En cromatografı́a en fase reversa el tm puede ser medido pasando un

soluto no retenido (por ej. uracil detectado a 260 nm) a través de la
columna.
Para la cuantificación una resolución mı́nima entre dos picos vecinos
de 1.5 es deseada. Para mayor robustez una resolución de 2 es mucho
mejor.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 65 — #75

Grupo de Investigación “GIAMP” 65

Otro criterio para una adecuada separación cromatográfica es no ex-

ceder la presión de operación por encima de 15 MPa (150 atm) esto
prolonga la vida de la bomba, válvulas, sellos y el automuestreador.
Todos los picos que necesiten ser medidos deben ser simétricos con un
factor de asimetrı́a A/B en el rango de 0.9-1.5

6.9.1 Atributos de una buena separación

Para que se produzca una buena separación, se deben cumplir las sigu-
ientes condiciones:
′
1. 0,5 6 K 6 20

2. Resolución ≥ 2

3. 0.96 factor asimetrı́a 6 1.5

4. Presión de operación 6 15 MPa ( 150 atm)

6.10 Optimización con un solvente

A esta longitud de onda un gran número de analitos presentan absorción.
El metanol es el segundo solvente escogido por que tiene una alta vis-
cosidad y un cut-off en el UV mas grande.
El THF es la tercera mezcla escogida por que tiene un rango menor
utilizable en el UV, es lentamente degradado por oxidación y se equilibra
mas lentamente con la fase estacionaria.

6.10.1 Orden de escogencia de un solvente orgánico

1. ACETONITRILO

2. METANOL

3. HF 1

1
El acetonitrilo es un reactivo peligroso por lo que sus desechos deben ser
hidrolizados con acetato de sodio y vertidos al drenaje.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 66 — #76

66 E.Lans

6.11 Optimización con dos o tres solventes or-

gánicos
Cuando se requieren dos o tres solventes orgánicos, se requiere primer-
amente una optimización, para ello se deben seguir los siguientes pasos:
Paso 1: Se optimiza la separación con acetonitrilo/buffer para generar
un cromatograma A.
Paso 2: Se optimiza la separación con metanol/buffer para generar un
cromatograma B.
Paso 3: Se optimiza la separación con THF/buffer, para generar un
cromatograma C. Paso 4: Se mezclan los solventes, de los pasos 1,2 y
3 en proporciones 1:1 para generar los cromatogramas D, E y F.
Paso 5: hacer una mezcla de acetonitrilo, metanol y THF en proporción
1:1:1 para generar un cromatograma G.
Paso 6: si alguno de los resultados mostrados en los cromatogramas
de A a G, es adecuado, selecciónelo.
Si la separación no se consigue con ninguno de los pasos anteriores
es necesario que usted pruebe una columna diferente u otra forma de
cromatografı́a.

6.12 Temperatura como una variable en sepa-

raciones isocrática
Cambiando la temperatura de la columna puede afectar la retención
relativa de los diferentes compuestos en una mezcla, la temperatura
tiene mucha influencia en compuestos iónicos( cationes amonio, cationes
carboxilatos)y moléculas con múltiples sustituyentes polares.
Para elevadas temperaturas de operación, el pH debe estar por debajo
de 6 para retardar la disolución de la fase estacionaria de sı́lica.

6.12.1 ¿Como se consigue una buena separación?

Para hacer una buena separación se debe aumentar la resolución, para
ello usted debe:

1. Disminuir la velocidad del flujo

2. Incrementar la longitud de la columna.

3. Disminuir el tamaño de las partı́culas en la columna.

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 67 — #77

Grupo de Investigación “GIAMP” 67

∆tr ∆tr
Resolución = =
Wav 1.70w 1
2

∆tr = Separación entre picos

Wav =Promedio del ancho de la lı́nea base
W 1 =Promedio del ancho de pico a la mitad de la altura
2
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Capı́tulo 7

CROMATOGRAFÍA DE
FLUÍDOS
SUPERCRÍTICOS

La cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos es una técnica de separación

llamada también estracción supercrı́tica. La cromatografı́a de fluı́dos
supercrı́ticos tiene importancia por que permite la separación y la de-
terminación de un grupo de compuestos que no se pueden analizar ade-
cuadamente ni por cromatografı́a de gas ni por cromatografı́a lı́quida
Los fluı́dos supercrı́ticos combinan caracterı́sticas de gases y lı́quidos
Ej.: los coeficientes de difusión y viscosidad de los FSC son semejantes
a la de los gases de arrastre en cromatografı́a de gas, mientras que sus
densidades se aproximan a la de los lı́quidos.
Estos compuestos son los no volátiles o térmicamente lábiles a los que
no se pueden aplicar los procedimientos de cromatografı́a de gas y aque-
llos que no contienen grupos funcionales que hagan posible su detección
por las técnicas espectroscópicas o electroquı́micas que se utilizan en
cromatografı́a lı́quida
En CFS es posible hacer variar tres condiciones que son similares a los
que se hacen variar en HPLC: Temperatura, composición del eluyente
y la velocidad de la fase móvil
• Fluı́do supercrı́tico (FSC): Cuando un sustancia se encuentra
a valores superiores a los de su punto critico se le conoce como
fluidos supercrı́ticos. En estas condiciones no se lı́cua por mas
que se aumente la presión, ni se vaporiza por mas que se eleve la
temperatura, por tanto la fase lı́quida no se puede distinguir de

68
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 69 — #79

Grupo de Investigación “GIAMP” 69

la fase de vapor.
Un fluido supercrı́tico se comporta como un gas como un lı́quido,
es decir se difunde como un gas y puede disolver sustancias como
un lı́quido. Los FSC se carácterizan por el amplio rango de den-
sidades que pueden adoptar.
Por encima de las condiciones crı́ticas pequeños cambios en la
presión y la temperatura generan grandes cambios en la densidad.
• Temperatura crı́tica: Temperatura por encima de la cual un gas
miscible no puede ser licuado independientemente de la presión.
Los gases no se pueden licuar por encima de la temperatura crı́tica,
porque en este punto las caracterı́sticas de los gases y los lı́quidos
son las mismas, no habiendo bases sobre la cual distinguirlos.
• Presión crı́tica: La presión de vapor que adquiere una sustancia
a temperatura crı́tica se denomina presión crı́tica. La presión de
vapor de una sustancia nunca es superior a su temperatura critica.

• Punto crı́tico: Temperatura y presión superiores próximas a la

presión y temperatura crı́tica.
La tabla 7 muestra la temperatura, presión critica y punto de ebullición
de algunos compuestos
Los valores experimentales de temperatura critica y presión crı́tica de
una sustancia se pueden calcular utilizando las constantes a y b en la
ecuación de Van Der Walls 7.1
(p + an2 )
(v − nb) = nRT (7.1)
v2

Tabla 7.1: Temperatura crı́tica, presión crı́tica y punto de ebullición de algunos

compuestos comunes
Gas Tc Pc(atm) P. Ebullición
He −267.96 2.61 −268.94
H2 −240.17 12.77 −252.76
N2 −146.89 33.54 −195.81
CO −140.23 34.53 −191.49
CO2 31.04 72.85 −78.44
NH3 132.4 111.3 −33.42
O2 −118.38 50.14 −182.96
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 70 — #80

70 E.Lans

las constantes a y b sse pueden calcular a partir de su presión y tem-

peratra crı́tica, de a cuerdo a la siguiente ecuación:

27R2 T c2
a=
64P c

7.1 Carácterı́sticas de un fluı́do supercrı́tico

• Gran poder disolvente junto con una enorme capacidad de pene-
tración en sólidos, lo que permite el agotamiento rápido y prácti-
camente total de los sólidos extraı́bles.

• A diferencia en HPLC y GC en los FSC el aumento de presión a

una temperatura dada incrementa la densidad la cual aumenta la
solubilidad de la mayorı́a de los analitos.

Otra caracterı́stica de los FSC es que un aumento de temperatura a

determinada presión produce una menor densidad del fluı́do, lo que
conduce a una menor solubilidad. Como resultado, incluso cuando la
temperatura y la composición del eluyente son constantes, la caı́da de
presión desde la entrada hasta la salida de la columna significa que las
solubilidades de los analitos disminuye conforme estos avanzan por la
columna. Para resumir podemos decir que el método es menos sencillo
que en GC y HPLC.

7.2 Analitos
En la actualidad la CFS no es tan popular como GC o HPLC. Es una
técnica casi ideal para realizar separaciones de algunos surfactantes y
polı́meros. Se prefiere la CFS para estos compuestos por que no es nece-
sario la volatilización para obtener un gas, y la transferencia de masas
es un orden de magnitud mayor que en las fases móviles de HPLC. Esto
implica una reducción significativa del tiempo de análisis, pues logra un
equilibrio más rápido entre la fase móvil y la estacionaria. También se ha
demostrado que CFS es útil para separar algunos compuestos quirales.
El orden de retención suele ser el mismo que para HPLC quiral, pero
las separaciones son mas rápidas.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 71 — #81

Grupo de Investigación “GIAMP” 71

7.3 Fase Móvil

La fase móvil en CFS se inicia en un cilindro de gas a alta presión, pero

el fluı́do permanece comprimido y se calienta por encima de su temper-
atura critica, para ası́ obtener condiciones supercrı́ticas. El dióxido de
carbono es la fase móvil que se emplea con mayor frecuencia, debido a
su bajo costo, no es inflamable ni tóxico. Como no es polar se le agregan
modificadores polares para permitir el análisis de compuestos polares.

Los modificadores que se agregan con frecuencia incluyen metanol y

etanol, para sustancias básicas, aminas.
Los gradientes en CFS se obtienen cambiando las condiciones que mod-
ifican la solubilidad del analito en la fase móvil supercrı́tica.

7.4 Cosolventes

Sustancia que se le agrega al sistema para aumentar la selectividad y el

poder disolvente del fluı́do, con caracterı́sticas similares a las del soluto.
Se agrega en una concentración mayor que la del soluto pero menor que
la del disolvente.
Las diferencias de solubilidad de distintas sustancias en fluı́dos super-
crı́tico se deben a las caracterı́sticas de los solutos sólidos tales como
presión de vapor y a las interacciones particulares que se establecen
entre un soluto dado con el disolvente supercrı́tco.Como consecuencia de
esto moléculas muy parecidas pueden tener solubilidades muy diferentes
ej:La extraccón con CO2 supercrı́tico la cafeı́na de los granos del
café y de la teobromina de las hojas del té. Para el extracción
de la cafeı́na el proceso es excelente y no lo es ası́ para la extracción
de la teobromina del té a pesar de que la única diferencia entre ambas
moléculas es que donde tiene la teobromina un átomo de hidrógeno, la
cafeı́na tiene un grupo CH3 . La extracción de cafeı́na es uno de los
procesos más exitosos de extraccón supercrı́tica, mientras que la baja
solubilidad de la teobromina en CO2 supercrı́tico impide el uso de este
proceso para extraerla. Cerca de 100, 000 toneladas de café son tratadas
anualmente con CO2 supercrı́tico para extraerlo totalmente.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 72 — #82

72 E.Lans

7.4.1 Fluı́dos usados para extracción supercrı́tica

Para la extracción en fluı́dos supercrı́ticos se utilizan las siguientes fases

móviles: CO2 , H2 O, C2 H6 , C2 H4 , C3 H8 , Xe, N2 O.
El CO2 cuya temperatura crı́tica de 31, 2o C cercana a la ambiente, se
convierte en el disolvente apropiado para manejar sustancias lábiles a
pesar de que sus propiedades como disolvente son mucho más modesta
que las del agua. Por ejemplo son insolubles en CO2 , incluso a altas
densidades, las sustancias polares y muchas no polares. La solubilidad
de una sustancia en un disolvente supercı́tico es en general menor que
en los lı́quidos convencionales., esto se compensa por que cuando se em-
plean FSC la separación de soluto y disolvente le logra eficientemente
mediante un simple proceso de expansión. Esto evita tener que aumen-
tar la temperatura para eliminar el disolvente por evaporación, como
sucede con los disolventes adicionales.
Los procesos que emplean FSC son, en general, más caros que los con-
vencionales debido a costo de la etapa de compresión y del confinamiento
de los fluı́dos.

7.5 Forma e inyección de la muestra

La introducción del liquido en CFS es similar a la inyección en HPLC.

Las muestras en fase gaseosa no son adecuadas para CFS. Los sólidos
se extraen con los FSC y se concentra el extracto. El tipo de muestra
que se emplea en CFS con mayor frecuencia es una solución.

7.6 Columnas y fases estacionarias

Las columnas para CFS son prácticamente iguales a las de HPLC y

algunas columnas en GC. Son de acero inoxidable, y se empacan con
partı́culas de 5 µm; los calibres pequeños de 250 y 530 µm son los mas
comunes. Las fases estacionarias pueden ser del tipo que se emplean en
HPLC normal o fase reversa: sı́lica porosa, alúmina y sı́lica con grupos
orgánicos enlazados.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 73 — #83

Grupo de Investigación “GIAMP” 73

7.7 Detectores
Los detectores de gases FID y UV en HPLC deben estar construidos
para funcionar con el volumen relativamente grande de gas que se pro-
duce al despresurizar el fluı́do supercrı́tico.
Los detectores similares a los que se utilizan en HPLC se modifican para
tolerar las presiones necesarias para mantener a los fluı́dos supercrı́ticos.

7.8 Areas donde se utilizan los fluı́dos supercrı́-

tico
Un área de reciente interés en la aplicación de los FSC es la de los pro-
cesos de descontaminación o desctrucción de residuos tox́icos.
Suelos o sedimentos fluviales contaminados con pesticidas, como DDT y
otros contaminantes orgánicos han sido tratados exitosamente con CO2 ,
mientras que fenoles y productos relacionados han sido extraı́dos eficien-
temente de disoluciones acuosas. En lo relativo a los desechos tóxicos,
el agua supercrı́tica presenta una ventaja respecto a la incineración, ya
que esta última requiere temperaturas hasta de 1, 200o C, provocando
la emisión de sustancias que contaminan el ambiente, entre ellos las
dioxinas producidas por la incineración incompleta especialmente las
aromáticas policloradas.. Utilizando agua supercrı́tica a unos 500o C y
en presencia de un oxidante es posible quemar sustancias orgánicas com-
pletamente en una reacción térmicamente autosostenida, produciendo
sólo nitrógeno, dióxido de carbono y otras sustancias inorgánicas. El
inconveniente radica en la alta corrosividad del agua supercrı́tica sobre
los materiales utilizados, lo que obliga a utilizar aleaciones especiales
encareciendo el proceso.
Otras áreas de utilización de FSC son los métodos analı́ticos separa-
tivos en cromatografı́a, utilizando fluı́dos supercrı́tico. Obtención de
productos naturales y alimenticios(extracción de aceites vegetales
y grasa de semillas, drogas de plantas, aromas, sabores, perfumes y
especias, eliminación de nicotina del tabaco). Separación de hidro-
carburos pesados(desasfaltado de las fracciones pesadas del petróleo,
recuperación y purificación de lubricantes, licuefación del carbón etc).
Regeneración(carbón activado, adsorbentes, filtros y catalizadores).
Agua potable a partir de agua de mar(oxidación de corrientes
acuosas que contienen productos orgánicos).
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Capı́tulo 8

ELECTROFORÉSIS

8.1 Introducción
Una separación electroforética se lleva a cabo inyectando una pequeña
parte de la muestra a una disolución tampón que está alojada en un
tubo estrecho o en un medio de soporte poroso y plano, como un tubo
estrecho, papel o un gel semisólido. Seguidamente se aplica un elevado
potencial de corriente continua a través del tampón mediante dos elec-
trodos situados en los extremos del tampón. El potencial impulsa los
iones de la muestra a migrar hacia uno u otro extremo de los electrodos.
La velocidad de migración de un especie dada depende de su carga y su
tamaño.
Las separaciones en consecuencia se basan en las diferencias de la re-
lación tamaño-carga entre los diferentes analitos presentes en la mues-
tra.Cuanto mayor es esta relación más rápido migra un ión en el seno del
campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en un medio tamponado
que actúa simultáneamente como conductor de la corriente eléctrica y
controlando o fijando la carga eléctrica de las sustancias a analizar

8.2 Electroforésis
El término electroforésis se emplea para describir aquellas técnicas de
separación que se basan en la diferente movilidad que tienen las par-
tı́culas cargadas en el interior de un campo eléctrico. Es un método
de separación que se basa en la diferente velocidad de migración de las
especies cargadas, en el seno de una disolución amortiguadora, a través
de la cual se aplica un campo eléctrico constante.

74
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 75 — #85

Grupo de Investigación “GIAMP” 75

El parámetro más importante de esta técnica es el campo eléctrico,(E)

definido como el voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de
separación, de acuerdo a esto prodrı́amos decir que cuanto mayor sea el
campo eléctrico aplicado mayor serı́a la resolución que se podrı́a obtener,
puesto que mayor serı́a al velocidad de migración de los diferentes com-
ponentes de la muestra no obstante a campos eléctricos elevados, la
corriente eléctrica que circula por el medio de separación va a ser alta
y como consecuencia se va a generar una cantidad de calor. Este calor
es un inconveniente por varias razones a la hora de llevar a cabo una
separación por que puede generar gradientes de temperaturas, flujos de
convección del tampón que dificultarı́a la separación, desnaturalización
de proteı́nas o pérdidas de actividades enzimáticas etc.
Para solucionar estos problemas generados por el calor se han utilizado
varios procedimientos, entre ellos trabajar a campos eléctricos bajos,
pero podrı́amos obtener tiempos de separación muy grandes y mala
resolución. trabajar con medios anticonvectivos, como los geles de po-
liacrilamida o garosa que de acuerdo a su naturaleza microporosa son
resistentes a la circulación del tampón. trabajar a campos eléctricos al-
tos pero la separación se da dentro de un capilar relleno de tampón esto
último dió origen a la electroforésis capilar

8.2.1 Tipos de electroforésis

Existen dos tipos de electroforésis, electroforésis capilar y la electro-
forésis convencional.

8.2.2 Electroforésis convencional

Es utilizada para separar especies complejas, de elevado peso molecular,
de interés biológico y bioquı́mico.

En la electroforésis convencional, las separaciones se llevan a cabo sobre

una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que
contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. En estas placas se
pueden separar varias muestras simultáneamente como en cromatografı́a
en capa fina. Las muestras se disponen como manchas o bandas sobre la
placa y se aplica el potencial de corriente continua, a través de la placa,
durante un perı́odo de tiempo fijo. Cuando creemos que las separaciones
se ha completado se interrumpe el paso de la corriente, y las especies
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 76 — #86

76 E.Lans

separadas se tiñen para visualizarse.

La velocidad de migración de un ión en centı́metros por segundo, en
el seno de un campo eléctrico es igual al producto de la intensidad del
campo eléctrico por la movilidad electroforética.

ν = µe E

ν = velocidad de migración
E = campo eléctrico en (V cm−1 )
µe = movilidad electroforética en (cm2 V −1 S −1 )
La movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga
del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento. El potencial eléctrico actúa sobre los iones por lo que se
moverán a través del tampón. Las especies neutras no se separan.
Para iones del mismo tamaño la fuerza impulsora será mayor en el de
mayor carga, y tendrá una movilidad de migración mas rápida. Para
iones que tengan igual carga la velocidad de migración será más rápida
en el ión más pequeño. La relación tamaño-carga de los iones cambiarán
estos efectos.
La electroforésis convencional es lenta y laboriosa y además no propor-
ciona resultados cuantitativos precisos.
Finalmente podemos decir que la velocidad a la cual un soluto se mueve
en respuesta a un campo eléctrico aplicado se llama velocidad electro-
forética.

8.2.3 Electroforésis capilar

Los principios teóricos de la electroforésis capilar son bastante parecidos
a la electroforésis convencional.
La electroforésis capilar da lugar a separaciones con volúmenes de mues-
tra de 0.1 a 10 nL, contrario a la convencional que usa volumen de uL.
Aquı́ en vez de colorear, para identificar la sustancia se utilizan detec-
tores cuantitativos como los empleados en HPLC.

Velocidad de migración

La velocidad de migración depende de la intensidad del campo eléctrico

aplicado. El campo eléctrico (E) se determina por la magnitud del
potencial aplicado (V en voltios) y la longitud sobre la que se aplica.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 77 — #87

Grupo de Investigación “GIAMP” 77

V
ν = µe
L
Bajo ciertas condiciones el ión se moverá a velocidad constante, siendo
balanceado por la fuerza de fricción.

qE = 6πηrν

donde q = carga
η = viscosidad de la solución
r= radio hidrodinámico
ν = velocidad
La movilidad electroforética viene dada por:

q
µe =
6ηπr
lo que indica que a mayor carga mayor movilidad y viceversa.

Factores que determinan la resolución en electroforésis capilar

• Número de platos:

En cromatografı́a tanto la difusión longitudinal como la transferencia

de masas contribuyen al ensanchamiento de la banda. Como en electro-
forésis está implicada una sola fase, solo se considera la difusión longi-
tudinal. Para electroforésis el número de platos (N ) viene dado por la
siguiente expresión
V
N = µe
2D
D = Coeficiente de difusión del soluto en cm−2 S −1
Como la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, se
debe aplicar un elevado potencial para obtener mayores separaciones.
Obsérvese que aquı́ el número de plato no se incrementa con la longitud
de la columna.
La electroforésis capilar genera normalmente un número de platos com-
prendido entre 100.000 y 200.000 comparados con los 5.000 y 20.000
obtenidos en HPLC.

• Flujo electroomóstico
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78 E.Lans

Cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que con-

tiene un tampón, se origina un flujo llamado, flujo electroosmótico, gra-
cias al cual el solvente migra hacı́a el ánodo o el cátodo.
La causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se forma
en la interfase sı́lice/disolución. Figura 8.1
A valores de pH por encima de 3 la pared interna de un capilar de sı́lice
presenta carga negativa debido a la ionización de los grupos silanoles
(Si−OH) de la superficie. Los cationes del tampón se agrupan sobre
la superficie negativa de capilar de sı́lice para formar la doble capa
eléctrica.
Los cationes que están en la capa exterior de la doble capa, son atraı́dos
hacı́a el cátodo, y dado que los cationes están solvatados arrastran el
resto de la disolución con ellos a lo largo del capilar. La electroósmosis
conduce un flujo en la disolución que tiene un perfil plano, perpendicu-
lar al capilar, contrario del perfil parabólico del flujo en cromatografı́a
lı́quida, cuyo origen es la presión. Debido a este perfil plano el flujo
electrosmótico no contribuye al ensanchamiento de banda de manera
significativa, como sı́ ocurre con el flujo producido por la presión en
HPLC. Figura 8.2.
Aunque los analitos migran según su carga dentro del capilar, la ve-
locidad del flujo electrosmótico es normalmente suficiente como para
arrastrar todas las especies cargadas positivamente, los neutros y los car-
gados negativamente hacia el mismo extremo del capilar, de tal forma
que todos ellos pueden detectarse al pasar por un punto común. El
electroforegrama es similar a un cromatograma. La velocidad de flujo
electrosmótico viene dada por una ecuación similar a la anteriormente
vista, esto es:

ν = µeo E
Ası́ podemos definir la velocidad del flujo electros’mótico Veof como la
velocidad con el cual el soluto se mueve a través del capilar debido al
flujo electrosmótico.
La velocidad con el cual un soluto se mueve respecto al campo eléctrico
aplicado se llama velocidad electroforética.
En presencia de la electroósmosis la velocidad de un ión es la suma de
su velocidad de migración y de la velocidad del flujo electrosmótico ası́:

V = (µeo + µe )E (8.1)

µe = En caso de un anión tendrá signo negativo

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 79 — #89

Grupo de Investigación “GIAMP” 79

Figura 8.1: Flujo electroosmotico

Figura 8.2: Perfil del flujo electro osmótico

 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 80 — #90

80 E.Lans

Como consecuencia de la electroósmosis, el orden de elución en una sep-

aración por electroforésis capilar tı́pica es:

Primero los cationes más rápidos, seguido de los más lentos, segundo
las especies neutras en una zona y finalmente los aniones. Figura 8.3
En algunos casos la velocidad de flujo electrosmótico no es lo bastante
grande como para superar la velocidad a la cual se mueven algunos
aniones hacia el ánodo, en cuyo caso estas especies se desplazan hacia
el ańodo.

8.2.4 Cambio de sentido del flujo electroosmótico

Se logra agregando un tensoactivo catiónico al tampón. El tensoactivo
se adsorbe sobre la pared del capilar y hace que esta quede cargada
positivamente. Ahora los aniones del tampón se agrupan en las proxim-
idades de la pared y son arrastrados hacia el ánodo, electrodo positivo.
Esta estratagema se usa a menudo para acelerar la separación de los
aniones.
El flujo electrosmótico puede ser eliminado recubriendo la pared interna
del capilar con un reactivo como el trimetilclorsilano para eliminar los
grupos silanoles de la superficie.

8.3 Instrumentación
Consta de un capilar de sı́lice fundida con 10-100 µm de diámetro in-
terno de 40 a 100 cm. de longitud y que está lleno de un tampón
conectado entre si por dos recipientes que contienen el mismo tampón,
que también contienen dos (2) electrodos de platino.
La introducción de la muestra se lleva a cabo por uno de los extremos
y la detección por el otro extremo.Figura 8.4

8.3.1 Introducción de la muestra

Inyección electrocinética
Un de los recipientes del capilar se retira con su respectivo electrodo.
Luego este extremo es sumergido en el recipiente donde se encuentra la
muestra y se le aplica un potencial determinado hasta que la muestra
penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de los fenómenos
de migración iónico y flujo electrosmótico. Luego el extremo retirado se
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 81 — #91

Grupo de Investigación “GIAMP” 81

Figura 8.3: Dirección del flujo electroosmótico

Figura 8.4: Componentes básicos de un sistema de electroforésis capilar

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82 E.Lans

coloca nuevamente en la solución tamp

on original donde se mantiene durante el proceso de separación.Figura.
8.5

Inyección por presión

Se retira un extremo del capilar y se introduce en el recipiente de la
muestra, a la cual se le aplica una diferencia de presión. Esta diferencia
de presión proviene de aplicar vacı́o en el extremo del detector o de la
aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien
por elevación del extremo que contiene la muestra. En ambos casos el
volumen inyectado se controla por la duración de la inyección. 5-50 nL
son los mas comunes.

8.4 Sistema de detección

Los detectores son similares en diseño y función a los utilizados en
HPLC. La diferencia está en el comportamiento de éstos; en electro-
forésis capilar cada ión migra a una velocidad determinada debido a
su movilidad electroforética. Por tanto las bandas del analito llegan al
detector a diferentes velocidades, lo que hace que las áreas de los picos
sean dependientes del tiempo de retención. En cambio en HPLC todas
las especies pasan a través del detector a la misma velocidad de la fase
móvil, ası́ que las áreas de los picos son independientes de los tiempos
de retención.

8.4.1 Métodos de absorbancia

El camino óptico para las medidas de absorbancia es muy pequeño, y
para mejorar estas medidas se han propuestos varios métodos.
1. a) Celda tipo Z de 3 mm: Se dobla el extremo del capilar para
aumentar el camino óptico
2. b)Celda de tipo burbuja de 150 µm: Se forma una burbuja
cerca del capilar
3. c) Celda de reflexiones múltiples: En el extremo del capi-
lar se deposita un recubrimiento de plata reflectante , y la ra-
diación experimenta numerosas reflexiones antes de salir del capi-
lar. Figura.8.6
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 83 — #93

Grupo de Investigación “GIAMP” 83

Figura 8.5: Métodos de introducción de muestra

Figura 8.6: Diseños de celda para mejorar la sensibilidad de detección por

medida de absorbancia aumentando el camino óptico
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84 E.Lans

8.5 Modalidades de la electroforésis capilar

La electroforésis capilar es el nombre genérico para una familia de
técnicas relacionadas que tiene su origen en la electroforésis capilar
por zona (CZE) y son: electroforésis capilar por gel(CGE), enfoque
isoeléctrico capilar(CIEF), cromatografı́a capilar miscelar electrocinéti-
ca (MECC) y la isotacoforésis capilar(CITP). Aunque las técnicas di-
fieren significativamente una de otras, se pueden llevar a cabo con la
misma instrumentación básica.(?)

8.5.1 Electroforésis capilar por zona (CZE)

La composición del tampón es constante en toda la zona de separación.
El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de
la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en
zonas. El capilar es llenado solamente con el buffer y las separaciones
de los analı́tos ocurren basándose en la razón masa/carga.

8.5.2 Electroforésis capilar en gel (CGE)

Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso,
cuyos poros contienen una mezcla tampón en la que se lleva a cabo la
separación.

8.5.3 Isotacoforesis capilar

Las bandas de todos los analitos migran finalmente a la misma veloci-
dad, por eso recibe el nombre de ISO, igual y TACO velocidad. La
razón por la cual todas las bandas se mueven a la misma velocidad es
que el potencial se hace mas reducido para las bandas más móviles, y
se hace mas intensa para las bandas mas lentas, de tal forma que la
corriente es la misma en todas las zonas del tampón. (A. & F.J 1999)
En isotacoforésis un campo eléctrico es aplicado a un sistema elec-
trolı́tico que comprende un electrolı́to principal y un electrolı́to de ar-
rastre, y una alı́cuota de muestra, la cual es colocada entre los dos.
El electrólito principal es escogido de tal manera que su movilidad sea
mayor que algunos de los analitos, y el electrólito de arrastre sea el de
menor movilidad. Tanto aniones como cationes pueden ser analizados
pero no en la misma corrida. El capilar primero se llena con el electrólito
principal seguido de la muestra, un voltaje es aplicado y la separación
de las especies ocurren en los espacios entre el electrolito principal y el
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Grupo de Investigación “GIAMP” 85

electrolito de arrastre, de acuerdo con su movilidad electroforética.

8.5.4 Cromatografı́a capilar electrocinética miscelar (M-

ECC)
Se logra la resolución de los aniones, neutrones y cationes combinando
los efectos de la migración electroforética y la partición miscelar. Las
miscelas son agregados afipáticos moleculares llamados surfactantes los
cuales tienen una cadena molecular larga caracterizado por tener una
parte hidrofı́lica y la otra hidrofóbica (cabeza y cola). Las miscelas son
formadas en soluciones acuosas con una cola hidrofóbica orientado hacia
adentro y una cabeza hidrofı́lica orientada hacia afuera. Las miscelas
aunque cargadas negativamente migran hacia el cátodo bajo la influen-
cia del flujo electrosmótico (EOF).
Durante la migración las especies de interés pueden interactuar con las
miscelas a través de los procesos hidrofóbicos y electrostáticos. Ası́ las
moléculas se partirán dentro y fuera de la miscela basándose en su hidro-
fobocidad. Cuando el analito mas hidrofóbico se asocia con la miscela
y su velocidad de migración es desacelerada.
Los surfactantes mas comunes usados en MECC son anionicos y catió-
nicos.

8.6 Enfoque isoeléctrico capilar (CIEF )

Se usa para separar compuestos como aminoácidos, pétidos y proteı́nas,
compuestos que pueden existir como zwitterion1 sobre la base de su
punto isoelectrico(PI).
La columna capilar es llenada con una solución de anfolito soporte so-
bre la base de su punto isoeléctrico y la muestra; cuando se aplica un
voltaje al analito, éste es cargado y unos migrarán hacı́a el cátodo (el
cual está en contacto con una solución básica) y otros migrarán hacı́a
el ánodo (el cual estará en contacto con una solución ácida).
La migración se detiene cuando el anfolito alcanza su punto isoeléctrico
y ya no es cargado más. El anfolito mantiene un pH local que corre-
sponde a este PI, debido a su fuerte capacidad buffer.
1
Ión dipolar quı́micamente neutro
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86 E.Lans

Aquellos solutos como las proteı́nas también migran hacia el ánodo de-
pendiendo de su carga, hasta encontrar un pH donde su carga neta sea
cero. En este punto la migración se detiene y el soluto se dice que está
enfocado, luego las bandas de solutos son movilizadas y migran hacia
el detector. La movilización puede ir hacia el ánodo o hacia el cátodo
agregando una sal en el compartimiento del electrodo apropiado o us-
ando un flujo presurizado.
El EOF es eliminado en CIEF cubriendo las paredes del capilar, esta
técnica ha sido exitosa para la separación de inmunoglobina y hemoglo-
binas.

8.7 Aplicaciones
Podrı́a decirse que las aplicaciones de la electroforésis capilar son enor-
mes. Las eficiencias alcanzadas son bastante asombrosas, 2 × 105 platos
teóricos son generados en menos de 10 minutos de análisis.
Las separaciones se pueden lograr basándose en las diferencias de carga,
movilidad, tamaño, hidrofobocidad y clases de compuestos, lográndose
separaciones de nucleótidos, péptidos bioactivos, proteı́nas, vitaminas y
un gran número de productos farmacéuticos o incluso, iones orgánicos.
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 87 — #97

Bibliografia

A., B. & F.J, S. (1999), Chromatographic Methods, fifth edn, Kluwer

Academic Publishers.

McNair, H. M. & Miller, J. M. (1998), Basic Gas Chromatographic, 1

edn, John Wiley and Sons, INC.

Skoog, D. A. & Holler, F. (1998), Principles of Instrumental Analysis,

Vol. 1, fifth edition edn, Harcourt Brace and Company, Orlando
Florida.

87
 “Metodos” — 2015/8/12 — 10:26 — page 88 — #98

Índice Alfabético

Adsorbentes, 22 Difusión, 77
Aplicaciones, 54 Dioxinas, 73
Asimetrı́a, 12
Eficiencia, 15, 57
Co-cromatografı́a, 28 Electroforéris
Coeficiente de difusión, 6 capilar por zona
Coeficiente de partición, 11 en gel, 84
Columnas, 57 Electroforésis
empacadas, 36 capilar, 76
tubulares abierta, 34 convencional, 74
Columnas analı́ticas, 58 Eluato, 8
Constante de distribución, 12 Elución, 59
Constante RF, 27 Eluyente, 8, 24
Cosolventes, 71
Cromatografı́a, 1 Factor de capacidad, 8
capa fina, 21 Factor failing, 13
de fluı́dos supercrı́ticos, 4 Fluı́do supercrı́tico, 68
de gases, 2 Flujo electrosmótico, 78
fase reversa Fuerzas
fase normal, 60 iónicas
lı́quida, 3 enlaces de hidrógeno, 13
plana, 2 repulsión
Cromatografı́a de adsorción, 60 Van Der Walls, 14
Cromatograma, 8
Gradiente, 62
Desorción, 50
Detector, 52 Inyección
FID on column, 45
ECD, 38 por presión
Fotométrico de llamas, 41 electrocinética, 82
TCD split
NPD, 40 splitless, 45

88
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Grupo de Investigación “GIAMP” 89

Ionización
por bombardeo de átomos rápidos
electrospray, 51
quı́mica
quimı́ca negativa, 49
ionización, 51
EI, 48
Ionización por campo, 50
Isotacoforésis, 84
Isoterma, 19

Lábil, 72

Métodos
quı́micos
fı́sicos , 26
Masas, 47

Número de plato, 77

Placas, 23
Plato teórico, 9
Presión crı́tica, 69
Punto crı́tico, 69

Resolución, 4, 65, 77
Retención relativa, 7

Separación, 1, 66
Solventes, 63, 65
Supercrı́tico, 72
supercrı́tico, 73

Tailing, 13, 60
Tandem, 53
Temperatura crı́tica, 69
Tiempo
muerto
retención ajustado, 9

Van Deemter, 16