CUADERNO DE PRÁCTICAS

“PROCESAMIENTO
CITOLÓGICO Y TISULAR”

I.E.S Los Colegiales

2º Anatomía Patológica
María Gallardo Gómez
08/12/20
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

ÍNDICE

PRÁCTICA 1:“PREPARACIÓN DE FORMOL TAMPONADO”…………………...………2

PRÁCTICA 2:“PREPARACIÓN DE ALCOHOLES DE 70º Y 80º” ………………..……..5

PRÁCTICA 3:“PREPARACIÓN DEL REACTIVO HEMATOXILINA DE HARRYS”…….7

PRÁCTICA 4:“PREPARACIÓN DEL REACTIVO EOSINA Y”…………………..………10

PRÁCTICA 5:“TINCIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA”……………………………..……12

PRÁCTICA 6 “PREPARACIÓN REACTIVOS ROJO SIRIO”……………………………15

PRÁCTICA 7:“TINCIÓN ROJO SIRIO”…………………………………………………….17

PRÁCTICA 8:“PREPARACIÓN REACTIVO ORCEÍNA”…………………………………19

PREPARACIÓN DE ORCEINA………………………………………………………...…...19

PREPARACIÓN DE PICROCARMÍN………………………………………………………20

PRÁCTICA 9:“TINCIÓN ORCEÍNA”………………………………………………………..22

PRÁCTICA 10:“PREPARACIÓN REACTIVO TRICRÓMICO DE MASSON”………….24

PRÁCTICA 11: “TINCIÓN TRICRÓMICO DE MASSON”………………………...….....33

PRÁCTICA 12:"PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DEL PAS"..36

PRÁCTICA 13: “TINCIÓN DEL PAS”………………………………………………………39

PRÁCTICA 14:“ELABORACIÓN DE BLOQUES DE PARAFINA”………………………42

TALLADO………………………………………………………………...……………………42

MUESTREO……………………………………………………………………….…………..43

PROCESADO…………………………………………………………………………………43

ELABORACIÓN DEL BLOQUE DE PARAFINA…………………………………………..44

LIMPIEZA…………………………………………………………………………………...…47

PRÁCTICA 15: CORTE EN MICROTOMO…………………...…………………………..48

1
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 1
“PREPARACIÓN DE FORMOL TAMPONADO”

 OBJETIVO.
Conservar los tejidos.
 CÁLCULOS.
Preparar 250ml de formol tamponado cuya fórmula es:
Na₂HPO₄  6g Pm= 142g/mol  Anhídrido
NaH₂PO₄  4g Pm= 120g/mol;
Formalina pura (30%-40%)  100ml
Agua destilada c.s.p.  1000ml

En laboratorio: el monobásico lo tenemos con 2 molécula de agua

Pm=158g/mol (ocon1 molécula Pm=138g/mol)
6g Na₂HPO₄ → 1000ml
x → 250ml
250 · 6
x= = 1,5g Na₂HPO₄
1000

4g NaH₂PO₄ ⟶ 1000ml
x ⟶ 250ml
250 · 4
x= = 10g NaH₂PO₄
1000

10g NaH₂PO₄ ⟶ 120g/mol

x ⟶ 156g/mol NaH2PO4.2H2O
138 · 1
x= = 1,15g NaH₂PO₄; x = 1,3g NaH₂PO₄ · 2H₂O
120

100ml Formalina (40%comercial) ⟶ 1000ml

x ⟶ 250ml
250 · 100
x= 1000
= 25ml de Formalina

2
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

250 · 4
Ó bien: 250 · 4% = V · 40%  x = = 25ml de Formalina
40

250ml – 25ml = 225ml de H₂O destilada

 MATERIALES.
-Matraz Erlenmeyer
-Matraz aforado 250ml
-Pipetas
-Propipetas
-Probetas
-Agitador magnético
-Balanza digital
-Vidrio de reloj
-Papel de filtro
-Imán
-Cucharilla/Espátula
- Espátula
-Frasco lavador
-Embudo

 PROCEDIMIENTO.
1) Medimos los reactivos y pesamos las sales que vamos a necesitar.
2) Añadimos 2/3 de agua destilada (≈75ml) al matraz Erlenmeyer y
seguidamente añadimos la formalina.
3) Añadimos el fosfato disódico (Na2HPO4), cuando este disuelto añadimos el
fosfato mono sódico (NaH2PO4) y termino de disolver.
4) Una vez disuelto añadimos el resto de agua, guardando unos 50ml de agua
en la probeta para el posterior enrase.
5) Trasvasamos la disolución del matraz Erlenmeyer al matraz aforado con la
ayuda de un embudo y enrasamos hasta el aforo con la pipeta.
6) Envasamos la disolución etiquetando correctamente el producto con nombre,
fecha y grupo.

3
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 OBSERVACIONES.
No han aparecido cristales durante la agitación, lo que quiere decir que la
práctica se ha realizado correctamente.
Unos grupos han realizado la práctica añadiendo 1/3 y luego los 2/3 y otros lo
hemos hecho al contrario, añadiendo 2/3 y luego 1/3y y da igual cómo se haga
primero, de las dos maneras sale bien.

 IMÁGENES.

4
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 2
PREPARACIÓN DE ALCOHOLES DE 70% Y 80%.
 MATERIALES.
- Propipetas
- Probetas de 250ml y 100ml
-Alcohol de 96°
-Embudo
-Etiquetas y frascos para envasar
-Pipetas
-Agua destilada
-Alcohol absoluto
-Papel de filtro

 CÁLCULOS.
1) Preparar 250ml de alcohol de 70° a partir de alcohol de 96°
V·C=V’·C’
𝑣´·𝑐´ 250·70
V= = = 182,30ml
𝑐 96

Resultado=182,30ml de alcohol 96º + 67,70ml de H₂O destilada

2) Preparar 250 ml de alcohol de 80° a partir de alcohol de 96º.

V · C = V′ · C′
𝑣´·𝑐´ 250·80
V= = = 208,333ml de alcohol
𝑐 96

Resultado=208,333ml de alcohol+ 41,67 ml de H₂O destilada

 PROCEDIMIENTO
1) Se miden los reactivos en su probeta correspondiente y luego añadimos el
agua al alcohol (no es necesario seguir las pautas solido/liquido).
2) A continuación envasaremos en un frasco normal que habremos etiquetado
poniendo el nombre del reactivo, fecha de elaboración y número de grupo.

5
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 OBSERVACIONES
Esta práctica nos ha servido para diluir alcoholes, a partir de alcohol 96º obtener
de 70º y 80º. Muy útil para cuando queremos hidratar o deshidratar en las
tinciones.

 IMÁGENES

6
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 3
“PREPARACIÓN DEL REACTIVO HEMATOXILINA DE HARRYS”

 FUNDAMENTO
Este reactivo tiñe el núcleo de la célula. La hematoxilina es ácido y el núcleo es
ácido (porque posee grupos fosfatos) y a este mecanismo se le denomina
mecanismo fisicoquímica de atracción electrostática.

 Para preparar los 250ml de Harrys, sabiendo que su fórmula es:

1º Hematoxilina cristalizada  1g (HTL)
2º Etanol Absoluto  10ml
3º Alumbre potásico  20g (SO₄)₂ ALK
4º Agua destilada  200ml
5º Óxido rojo de mercurio (II)  0,5g (Acidificar)
6º Ácido acético glacial  10ml (mordiente)

SUMA VOLUMEN = 220ml

1º HTL 1G HTL – 220ml x = 1,136g de HTL

X - 250ml

2º Etanol 10ml Etanol – 220ml x = 11,36 ml Etanol

X - 250ml

3º Alumbre 20g (SO₄)₂ ALK – 220ml x = 22,73 g (SO₄)₂ ALK

X - 250ml

4º H₂O destilada 200ml – 220ml x = 227,27 H₂O

X - 250ml destilada

5º Óxido rojo 0,5g – 220ml x = 0,568 óxido rojo

X – 250ml

6º Ácido acético 10ml – 220ml x = 11,36ml Ácido

X - 250ml acético

Masa mol Alumbre potásico  KAL (SO₄)₂ = 258,39g/mol

Si tenemos 12 moléculas de H₂O  12 · 18 = 216g/mol

7
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

KAL (SO₄)₂ · 12 moléculas de H₂O = 474,39g/mols

 MATERIALES
- Probeta
- 2 Matraces Erlenmeyer
- Vidrio de reloj
- Balanza
- Espátula/Cuchara
- Agitador
- Filtro pliegue
- Pinzas/Guantes
- Vaso topacio
- Tapea

 PROCEDIMIENTO
1º Pesar: HMT – 1,136g
Alumbre – 41,71g
Óxido Hg – 0,5g
2º Medir volumen en la probeta.
3º Matraz 1: 2/3 partes H₂O destilada (150ml) – Reservar 230ml para óxido de
mercurio.
+
Alumbre - Agitadores Magnéticos (300rpm, 40ºC)
Matraz 2: 2/3 partes Etanol (7,5ml)
+
Hematoxilina + Resto Etanol – Agitador Magnético (<40ºC, 300rpm, Agitar)
4º Cuando está totalmente disuelto el alumbre, añadimos sobre el la
hematoxilina. Se mantiene en calor y se agita. La mezcla se lleva a ebullición
pero retirar antes de que hierva; y se añade el óxido de Hg (Se retira el calor)
Obtenemos el color púrpura.
5º Batea + Hielo – Disolución y que enfríe en la oscuridad.
6º Filtramos

8
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

7º Añadimos ácido acético glacial.

8º Envasamos en frasco topacio y etiquetar.

 OBSERVACIONES
Finalmente obtenemos el color púrpura deseado, con el que teñiremos los
núcleos de las células.

9
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 4
“PREPARACIÓN DEL REACTIVO EOSINA Y”

 CÁLCULOS
Prepara 250ml de eosina acuosa a partir de una disolución madre que contiene.
5g de eosina y 100ml de H₂O destilada.
Sabiendo que la eosina acuosa se hace con una parte de la disolución madre y
cuatro partes de H₂O.
Disolución madre (5g de E + 100ml H₂O)  100ml
Eosina acuosa (1 parte disolución madre 100ml) + 4 partes de H₂O (400ml) 
500ml
H₂O 500ml disol. – 400ml H₂O X = 200ml H₂O
dest.
250ml disol. - x H₂O
dest.
Disolución madre 500ml disol. – 100ml disol. X = 50ml disolución
Madre madre
250ml disol. - x disol.
Madre

Una vez calculadas las cantidades, procedemos a calcular las cantidades que
se utilizarán para preparar la disolución madre.
H₂O Destilada 100ml disol. Madre – 100ml H₂O X = 50ml H₂O Destilada
dest.
50ml disol. Madre – x ml H₂O
dest.
Eosina 100ml disol. Madre – 5g Eosina X = 2,5g Eosina
50ml disol. Madre - x g Eosina

 MATERIALES
-Balanza - Campana de extracción
-Espátula/Cuchara - Embudo
- Vidrio reloj - Filtro pliegues
- Probeta - Pinza
- Frasco topacio - Etiquetas
- Agitador magnético - Vaso precipitado
- Baño agua fría

10
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 PROCEDIMIENTO
Se pesa 2,5g de eosina y medimos el agua en una probeta 250ml. Disolvemos
el sólido en 2/3 partes (167ml) agitamos con el agitador magnético, si es
necesario.
Pasamos la disolución a un matraz aforado, añadimos el agua a enrasar, se
envasa y se etiqueta.

 OBSERVACIONES.
Finalmente obtenemos una tinción para teñir los citoplasmas de las células.

11
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 5
“TINCIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA”
 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Teñir el núcleo de las células con hematoxilina y el citoplasma de la célula con
eosina para poder verla al microscopio óptico.
 FUNDAMENTO
Ambos colorantes actúan por un mecanismo físico-químico por transferencia de
electrones.
(La hematoxilina está cargada positivamente básica y se ve atraída por las
cargas negativas ácidas de los grupos fosfatos del ADN nuclear).
Hematoxilina (+) básica ----- ácido (-) PO³⁻₄ del ADN nuclear
(La eosina está cargada negativamente ácida y se ve atraída por las cargas
positivas básicas de los grupos aminos por las proteínas que hay en el
citoplasma).
Eosina (-) ácido ----- básico (+) NH⁺₃ de la proteína citoplasma.
 TEJIDOS SELECCIONADOS
Estos colorantes se aplican a casi todos los tejidos. Es considerada una tinción
universal.
Intestino, riñón, oreja, hígado, cerebro, lengua, animales de laboratorio.
 MATERIALES
- Estufa.
- Batería de tinción.
- Botes de plásticos.
- Cubetas de tinción.
- Cestilla de tinción.
- Botes.
- Reactivos.
- Agua destilada y corriente.
- Pipeta Pasteur.
- (Lo que necesitemos en la preparación podemos incluirlo)

 PROCEDIMIENTO
1º Desparafinamos: (15-20 min) cuando esté blanda la parafina se retira de la
estufa (60º) y cuando la toquemos y se quede pegada está lista, hay que retirarla.
A continuación se pasa por tres baños de Xilol:
- Un primer baño de xilol: 3 minutos.
- Un segundo baño de xilol: 3 minutos.
- Un tercero baño de xilol: 3 minutos.

12
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

2º Hidratación del tejido: la realizamos con baños de alcohol en concentraciones

decrecientes. (1 PASE: introducir y sacar el porta 10 veces) (1PASE = más o
menos a 1MINUTO)
- 1ª baño de alcohol absoluto (100º) y se hacen 3 pases.
- 2ª baño de alcohol absoluto (100º) y se hacen 3 pases.
- 3ª baño de alcohol (96º) y se hacen 3 pases.
- 4ª baño de alcohol (96º) y se hacen 3 pases.
- 5ª baño alcohol (70º) y se hacen 3 pases.
Tras hidratar ponemos dos o tres baños de agua destilada, en los que
enjuagaremos la muestra para eliminar el alcohol. Estará bien hidratada cuando
el portaobjetos no tenga aspecto grasiento y estará lista para pasar al siguiente
paso.
3º Tinción:
- Filtramos la hematoxilina. (Cada vez que se usa la hematoxilina hay que
filtrarla)
- Introducimos los portas durante 3 minutos.
- Enjuagar en dos e tres baños de agua corriente.
- Consiguiendo el azulea miento de la muestra.
- Al aumentar el PH de la misma manteniéndola en agua corriente se
conseguirá un color azul. Aquí conseguimos que el color púrpura pase
azul.
- Tinción con eosina: pasamos los portas por la eosina durante 2 minutos y
los enjuagamos con dos o tres baños de agua destilada hasta que salga
clara el agua.
4º Deshidratación: deshidratamos la muestra con sucesivos baños de alcoholes
de concentración creciente.
- 1 baño con alcohol de 96º, 3 pases.
- 2 baño con alcohol de 96º, 3 pases.
- 3 baño con alcohol de 100º, 3 pases.
- 4 baño con alcohol de 100º, 3 pases.
5º Aclarado: de la muestra que se hace con xilol.
- 1 baño con alcohol de 100º + xilol en proporción 1/1, en 3 pases.
- 2 baño con xilol, en 3 pases.
- 3 baño con xilol, en 3 pases.
6º Montaje de la muestra: poniendo sobre el cubreobjetos un poco de DPX (una
gota con pipeta pasteur)
7º Observación de la muestra al microscopio óptico de los núcleos de las células
del tejido teñidos de azul y los citoplasmas teñidos de color rosa o rosado.

13
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 OBSERVACIONES.
Finalmente, observamos al microscopio la muestra teñida, donde los núcleos se
verán azul negruzco, mientras que los citoplasmas se verán rosa-rojizo.
Hay que tener cuidado en montar en DPX ya que se pueden formar burbujas
entre el tejido y el cubreobjetos.
Pd: Con agua corriente cambia el PH y por tanto el color.

 IMÁGENES.

14
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 6
“PREPARACIÓN REACTIVOS ROJO SIRIO”
 FUNDAMENTO.
Colorante citoplasmático que actúa por mecanismo Físico-Químico de
atracción electrostática-
- Ácido Pícrico es un colorante citoplasmático.
- Rojo Sirio. Tiñe el colágeno por mecanismo de impregnación y atracción
electrostática.

 CÁLCULOS.
250ml de Rojo Sirio
- Rojo Sirio 1%  10ml
- Ácido Pícrico, solución saturada 1,7%  90ml
UT: 100ml solución
100ml solución --- 10ml Rojo Sirio 1%
X = 25ml Rojo Sirio 1%
250ml solución --- x

100ml disolución --- 90ml Ác Pícrico

X = 225ml Ác. Pícrico
250ml disolución --- x

100ml --- 1gr Rojo Sirio

X = 0,25gr (sólido)
25ml --- x

100ml disolución --- 1,7gr Ác. Pícrico

X = 3,825gr Ác. Pícrico
225ml disolución --- x

15
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 MATERIALES.
-Matraz Erlenmeyer.
-Embudo.
-Frasco lavador.
-Frasco topacio.
-Cuchara-espátula.
-Pipetas
-Agitador magnético.
-Balanza.
-Varilla de vidrio.
-Etiquetas.
 PROCEDIMIENTO.
1º Pesar reactivos sólidos en vidrio de reloj (Rojo Sirio y Ác. Pícrico)
2º Medir el líquido: agua destilada en probeta. Agregar 1/3 del agua en el
matraz Erlenmeyer.
3º Añadir el Rojo Sirio con el embudo arrastrando el resto de vidrio.
4º Disolver con agitador magnético.
5º Cuando el Rojo Sirio este completamente disuelto añadimos el Ác. Pícrico
(se arrastra nuevamente con agua) y agitar.
6º Añadimos casi todo el agua al matraz guardando un poco para enjuagar el
matraz a envasar.
7º Observamos que el Ác. Pícrico no se disuelve completamente porque es
una solución saturada.
8º Envasamos en frasco topacio (arrastrando con el agua restante).
9º Etiquetamos.

16
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 7
“TINCIÓN ROJO SIRIO”
 OBJETIVO
Tinción para las fibras colágenas.
 FUNDAMENTO
Teñir los citoplasmas por el mecanismo físico-químico de atracción electrostática
entre cargas positivas y negativas, y mediante mecanismo físico de
impregnación. (Impregna la gruesa red de colágeno con el colorante coloidal
“Rojo Sirio”
 TEJIDOS SELECCIONADOS
- Oreja
- Lengua
- Intestino
- Riñón

 PROCEDIMIENTO
1. Desparafinado. Introducir la muestra en la estufa calentada a 60º
aproximadamente 15 – 30 minutos. La parafina estará preparada cuando
se pega el dedo.
2. – 3 baños de Xilol.
Xilol (I)  3 minutos – 3 pases
Xilol (II)  3 minutos – 3 pases
Xilol (III)  3 minutos – 3 pases
3. Hidratación en escala de alcoholes descendentes:
Alcohol 100º (I) – 3 pases
Alcohol 100º (II) – 3 pases
Alcohol 96º (I) – 3 pases
Alcohol 96º (II) – 3 pases
Alcohol 70º (I)- 3 pases
Enjuagamos con agua destilada hasta eliminar el alcohol (2 o 3 baños)
4. Tinción:
NÚCLEO- colorante hematoxilina férrica (10 minutos). Enjuagamos con
agua destilada hasta que salga el agua limpia.
CITOPLASMA – un baño de rojo sirio y ácido pícrico (30 minutos).
Enjuagamos de nuevo en agua destilada.
5. Deshidratar en escala de alcoholes ascendentes:
Alcohol 96º (I) – 3 pases
Alcohol 96º (II) – 3 pases
Alcohol 100º (I) – 3 pases
Alcohol 100º (II) – 3 pases

6. Aclaramiento
1/2 alcohol 100 + ½ Xilol (I)

17
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

Xilol (I) – 3 pases

Xilol (II) – 3 pases
7. Montaje. Colocar el cubreobjetos pegándolo con el DPX. (Tener cuidado
con que no se quede aire)

 OBSERVACIONES.
Núcleo: aparece de color azul violáceo por la hematoxilina férrica de Weigert.
Citoplasma: se observa en amarillo por el ácido pícrico
Fibras colágenas: rojas por el rojo sirio.

18
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 8
“PREPARACIÓN REACTIVO ORCEÍNA”
 FUNDAMENTO.
La tinción de Orceína se utiliza para ver las fibras elásticas y cuenta con dos
reactivos: orceína y picrocarmín índigo.
 Mecanismo de atracción electrostática entre las cargas ácidas de las
fibras elásticas y las cargas básicas del colorante.
1º ORCEÍNA
 OBJETIVO
Teñir las fibras elásticas
 CÁLCULOS
Preparar 250ml de Orceína sabiendo que para ello necesitamos:
- Orceína – 1gr
- Alcohol 70º -- 99ml
- HCL – 0,6ml
Volumen aproximado de 100ml
100ml disolución --- 99ml Alcohol 70º
X= 247, 5ml Alcohol 70º
250ml disolución --- x Alcohol 70º

100ml disolución --- 0,6ml HCL

X = 1,5ml HCL
250ml disolución --- x ml HCL

100ml disolución --- 1g Orceína

X = 2,5gr Orceína
250ml disolución --- Xg Orceína

 MATERIAL
- Balanza.
- Vidrio de reloj.
- Espátula.
- Probeta.
- Agitador magnético y el imán.

19
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

- Campana de extracción de gases.

- Frasco topacio.
- Etiquetas.
- Embudo.
- Pinzas.
- Vaso precipitado.
- Filtro de pliegues.
- Baño agua fría.

 PROCEDIMIENTO.
Se procede de igual forma que en cualquier disolución. La diferencia es que en
este caso el disolvente es el alcohol en lugar del agua. Además el ácido
clorhídrico “siempre se echa al final cuando la disolución está terminad”

 OBSERVACIONES.
Si fuera necesario coger dos embudos o una varilla de vidrio, para desatascar el
embudo y para machacar el reactivo sólido.

2º PICROCARMÍN ÍNDIGO.
 OBJETIVO
Es una tinción de contraste que tiene por objetivo de este es teñir el citoplasma
celular
 FUNDAMENTO
Mecanismo de atracción electrostática entre las cargas positivas del citoplasma
y las negativas del colorante.
 CÁCULOS.
Preparar 250ml de Picrocarmín índigo.
Solución Ácido Pícrico --- 100ml
Carmín índigo --- 0,4gr
Con un volumen total de 100ml
100ml disolución --- 100ml ácido pícrico 1,7%
X = 250ml Ácido Pícrico
250ml disolución --- x ml ácido pícrico 1,7%

100ml disolución --- 1,7gr Ácido Pícrico

X= 4,25 Ácido Pícrico
250ml disolución --- X gr Ácido Pícrico

20
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

+ 250ml H2O destilada y Enrasar

100ml disolución --- 0,4 gr Carmín Índigo

X = 1gr Carmín Índigo
250ml disolución --- X gr Carmín Índigo

 MATERIALES
- Balanza.
- Vidrio de reloj.
- Espátula.
- Probeta.
- Agitador magnético y el imán.
- Frasco topacio.
- Etiquetas.
- Embudo.
- Pinzas.
- Vaso precipitado.
- Filtro de pliegues.
- Baño agua fría.

 PROCEDIMIENTO
Los reactivos sólidos se pesan en vidrio de reloj. Posteriormente le añadimos las
2/3 partes del reactivo líquido, mezclamos hasta su completa disolución y se
añade el tercio restante lavando por arrastre el vidrio de reloj y la espátula por si
ha quedado algo de reactivo.
 OBSERVACIONES
Para facilitar la disolución el reactivo podrá ser machacado con una varilla,
desatascar el embudo con la varilla.

21
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 9
“TINCIÓN ORCEÍNA”
 OBJETIVO
Teñir fibras elásticas.
 FUNDAMENTO
Mecanismo físico-químico de atracción electrostática entre los ácidos del núcleo
y los grupos básicos del colorante.
 TEJIDOS
- Pulmón
- Vasos sanguíneos en general.

 PROCEDIMIENTO.
1. Desparafinado. Introducir la muestra en la estufa calentada a 60º
aproximadamente 15 – 30 minutos. La parafina estará preparada cuando
se pega el dedo.
2. – 3 baños de Xilol.
Xilol (I)  3 minutos – 3 pases
Xilol (II)  3 minutos – 3 pases
Xilol (III)  3 minutos – 3 pases
2 o 3 baños de agua destilada hasta que pierda el aspecto graso (que deje
de hacer espejos)
Hidratación en escala de alcoholes descendentes:
Alcohol 100º (I) – 3 pases
Alcohol 100º (II) – 3 pases
Alcohol 96º (I) – 3 pases
Alcohol 96º (II) – 3 pases
Alcohol 70º (I)- 3 pases
Enjuagamos con agua destilada hasta eliminar el alcohol (2 o 3 baños)
3. Tinción:
- FIBRAS ELÁSTICAS – con baños de Orceína (30 minutos)
Enjuagamos con agua destilada hasta que salga limpia (hacerlo rápidamente
para que no se desprenda)
- CITOPLASMA – se va a teñir con un baño de Picrocarmín de Índigo 45
segundos. (Ahora no lavar, pasamos rápidamente a deshidratar)
4. Deshidratar en escala de alcoholes ascendentes:
Alcohol 96º (I) – 3 pases
Alcohol 96º (II) – 3 pases
Alcohol 100º (I) – 3 pases
Alcohol 100º (II) – 3 pases
En este punto mirar al microscopio para ver si ha teñido bien el picrocarmín de
índigo (nos va a dar el contraste) Si ha teñido bien, seguimos los siguientes
pasos.

22
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

Si no ha teñido bien, volvemos hacia atrás, paso a paso, a la hidratación.

5. Aclaramiento
1/2 alcohol 100 + ½ Xilol (I)
Xilol (I) – 3 pases
Xilol (II) – 3 pases
6. Montaje. Colocar el cubreobjetos pegándolo con el DPX. (Tener cuidado
con que no se quede aire)

 OBSERVACIONES.
Las fibras elásticas van a estar teñidas con la Orceína de color marrón-
granate-rojizo y el citoplasma y todo lo demás van a estar teñidas con
Picrocarmín y se observa de color azul-verde-verdoso.
Si hay bronquio se va a ver rosado.

23
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 10
“PREPARACIÓN REACTIVO TRICRÓMICO DE MASSON”
 OBJETIVO
Contrastar el tejido conjuntivo diferenciado, del núcleo, citoplasma y músculo.
Para ello hay que preparar Escarlata de Biebrich – fucsina ácida (producto A).
1º ESCARLATA DE BIEBRICH-FUCSINA ÁCIDA (PRODUCTO A)
 FUNDAMENTO
Teñir los citoplasmas por mecanismos físicos-químicos de atracción
electrostática entre cargas negativas del colorante y las cargas positivas del
citoplasma.
 CÁLCULOS
Prepara 250ml de Escarlata de Biebrich-fucsina ácida sabiendo que partimos de:
- Escarlata de Biebrich-fucsina ácida al 1%  90ml
- Fucsina ácida en solución acuosa 1%  9ml
- Ácido acético glacial (puro)  1ml

VOLUMEN TOTAL 
100ml

100ml de producto A --- 90ml Escarlata 1%

X= 225ml al 1%
250ml de producto A --- x

100ml disolución --- 1g Escarlata (pura)

X= 2,25g Escarlata (pura)
225ml disolución --- x

*Enrasamos hasta 225ml de H₂O destilada (Soluto) 2,25 + (Disolvente) 225

100ml de producto A --- 9ml Fucsina ácida

X = 22,5ml Fucsina 1%
250ml de producto A --- x

24
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

100ml de disolución --- 1g Fucsina (pura)

X= 0,225g Fucsina (pura)
22,5ml disolución --- x

*Enrasamos a 22,5ml + 0,225g de fucsina (pura)

100ml disolución – 1ml ácido acético glacial (puro)

X = 2,5ml Ácido Acético
250ml disolución --- x

 MATERIAL
- Balanza
- Vidrio de reloj
- Probeta
- Frasco topacio
- Agitador magnético + imán
- Campana
- Embudo
- Filtro pliegues
- Pinzas
- Etiquetas
- Vaso precipitado
- Pipeta
- Cremallera
- Matraz Erlenmeyer

 PROCEDIMIENTO
1º Medimos en una probeta 250ml de H₂O destilada con la ayuda de una pipeta
quitamos el volumen correspondiente del ácido acético glacial (2,5ml), así
tendremos el resto de H₂O destilada (247,5).
2º Echamos 2/3 partes de H₂O destilada en el Matraz Erlenmeyer y a
continuación echamos los colorantes (da igual el orden)
3º Agitamos manualmente y echamos el resto del H₂O destilada lavando los
restos del matraz y vidrio de reloj.
4º Por último añadimos el ácido acético glacial.
5º Envasamos en vaso topacio.
6º Enjuagamos el matraz y etiquetamos.

25
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

2º ÁCIDO FOSFOTÚNGSTICO Y FOSFOMOLÍBDICO (PRODUCTO B)

 OBJETIVO
Ambos son mordientes y su función consiste en bloquear los residuos básicos
que existen en el tejido, excepto, los fuertemente básicos de las fibras de
colágeno, donde luego actuará el colorante Escarlata de Biebrich.
 MATERIAL
Matraz Erlenmeyer 250ml Matraz aforado 250ml
Embudo Pipeta Pasteur
Balanza digital Espátula o cucharilla
Agitador magnético e imán Frasco topacio
Papel de filtro Etiquetas

 CÁLCULOS.
1º MORDIENTE PARA LA TINCIÓN VERDE LUZ
Preparar 250ml de ácido fosfotúngstico al 5% y lo disolvemos en H₂O destilada,
sabiendo que nuestro ácido fosfotúngstico está hidratado con una molécula de
H₂O.
Nosotros tenemos en el laboratorio el ácido fosfotúngstico hidratado (1mol H₂O)
Pm [Link] = 2880,17g/mol
Pm Hidratado (1 molécula H₂O) = 2898,17g/mol
100ml --- 5g A.F
X = 12,5g A.F anhidro
250ml --- x

2880,17g/mol --- 2898,17g/mol

X = 12,58g A.F Monohidratado
12,5g --- x

 PROCEDIMIENTO

26
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

Tomo 12,55g del ácido fosfotúngstico monohidratado y añado agua destilada

hasta 250ml.

2º MORDIENTE PARA LA TINCIÓN DE AZUL DE ANILINA.

(Ácido fosfotúngstico y Ácido fosfomolíbdico)
Preparar 250ml de ambos ácidos al 2,5% cada uno en la misma disolución
El ácido fosfomolíbdico al igual que el ácido fosfotúngstico los tenemos en el
laboratorio monohidratado.
Pm Fosfomolíbdico = 1843,25g/mol
Pm Fosfotúngstico = 1825,25g/mol
100ml ---- 2,5g A.F
X = 6,25g ácido F.T
250ml ---- x
2880,17g/mol --- 2898,17g/mol hidratado
X = 6,29g ácido fosfotúgstico
6,25g --- x

100ml --- 2,5g A.F.F.M

X = 6,25g A.F.F.M anhidro
250ml --- x

1843,25g/mol hidratado --- 1825g/mol anhidro

X= 6,31g A.F.F.M hidratado
Xg --- 6,25g anhidro

 MATERIAL.
Matraz Erlenmeyer 250ml Matraz aforado 250ml
Embudo Pipeta Pasteur
Balanza digital Espátula o cucharilla
Agitador magnético e imán Frasco topacio
Papel de filtro Etiquetas

 PROCEDIMIENTO.

27
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

1º Medimos en una probeta 250ml de H₂O destilada con la ayuda de una pipeta
quitamos el volumen correspondiente del ácido acético glacial (2,5ml), así
tendremos el resto de H₂O destilada (247,5).
2º Echamos 2/3 partes de H₂O destilada en el Matraz Erlenmeyer y a
continuación echamos los colorantes (da igual el orden)
3º Agitamos manualmente y echamos el resto del H₂O destilada lavando los
restos del matraz y vidrio de reloj.
4º Por último añadimos el ácido acético glacial.
5º Envasamos en vaso topacio, enjuagamos el matraz y etiquetamos.

Nota: el material y el modo de operar va a ser igual en la preparación de cualquier

reactivo, tanto en esta como en otras prácticas.
C) TINCIÓN VERDE LUZ (PRODUCTO C).
 OBJETIVO Y FUNDAMENTO.
Es la tinción que tiñe la fibra colágena mediante un mecanismo físico de
impregnación y físico-químico de atracción electrostática entre las fibras
colágenas (son básicas) y el colorante ácido (verde luz).
 CÁLCULOS.
Prepara 250ml de Verde Luz
- Verde Luz amar – 2 gr
- H₂O destilada – 99ml VT = 100ml
- Ác. Acético glacial – 10ml

* Verde Luz
100ml – 2gr
X = 5gr de Verde Luz
250ml – X

* H₂O destilada
100ml -- 99ml H₂O
X = 247,5ml H₂O
200ml -- X
 MATERIALES.

28
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

Matraz Erlenmeyer 250ml Matraz aforado 250ml

Embudo Pipeta Pasteur
Balanza digital Espátula o cucharilla
Agitador magnético e imán Frasco topacio
Papel de filtro Etiquetas

 PROCEDIMIENTO.
1º Medimos en una probeta 250ml de H₂O destilada con la ayuda de una pipeta
quitamos el volumen correspondiente del ácido acético glacial (2,5ml), así
tendremos el resto de H₂O destilada (247,5).
2º Echamos 2/3 partes de H₂O destilada en el Matraz Erlenmeyer y a
continuación echamos los colorantes (da igual el orden)
3º Agitamos manualmente y echamos el resto del H₂O destilada lavando los
restos del matraz y vidrio de reloj.
4º Por último añadimos el ácido acético glacial.
5º Envasamos en vaso topacio.

D) TINCIÓN AZUL ANILINA (PRODUCTO D)

 OBJETIVO Y FUNDAMENTO
Es el mismo que para el verde luz.
 CÁLCULOS.
Azul Anilina – 2,5 gr
H₂O destilada – 98 ml VT = 100ml
Ácido Acético glacial – 2 ml
* Anilina
100ml – 2,5 gr
X = 6,25gr Anilina
250ml – X

* H₂O destilada
100ml – 98 ml H₂O
X = 245ml H₂O
250ml -- X
*Ácido acético glacial

29
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

100ml – 2ml Ácido acético

X = 5ml Ácido acético glacial
250ml – X

 MATERIALES.
Matraz Erlenmeyer 250ml Matraz aforado 250ml
Embudo Pipeta Pasteur
Balanza digital Espátula o cucharilla
Agitador magnético e imán Frasco topacio
Papel de filtro Etiquetas

 PROCEDIMIENTO.
1º Medimos en una probeta 250ml de H₂O destilada con la ayuda de una pipeta
quitamos el volumen correspondiente del ácido acético glacial (2,5ml), así
tendremos el resto de H₂O destilada (247,5).
2º Echamos 2/3 partes de H₂O destilada en el Matraz Erlenmeyer y a
continuación echamos los colorantes (da igual el orden)
3º Agitamos manualmente y echamos el resto del H₂O destilada lavando los
restos del matraz y vidrio de reloj.
4º Por último añadimos el ácido acético glacial.
5º Envasamos en vaso topacio.

Nota: Se añade ácido acético glacial con el objetivo de acidificar el medio. De

esta forma la coloración se realiza de forma correcta.
E) HEMATOXLINA FÉRRICA DE WEIGERT (PRODUCTO E)
 OBJETIVO Y FUNDAMENTO.
Tinción del núcleo de la célula.

 FUNDAMENTO.
Por mecanismo físico-químico de atracción electrostática entre el núcleo (básico)
y el colorante (ácido)

 CÁLCULOS.

30
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

250ml de Hematoxilina Férrica

* Soluciones Stock
1º Hematoxilina Cristalizada – 1 gr
VT = 100ml
Etanol 95% -- 100 ml
2º Cloruro férrico anhidro – 1,5 gr
VT = 100ml
H₂O destilada – 100 ml

* Solución trabajo
- Mezclar a partes iguales solución 1 y 2 – 200ml
- Añadir H₂SO₄ cc – 1ml

Para preparar 250ml:

200ml Solución – 1 ml H₂SO₄
X = 1,25 ml H₂SO₄
250ml Solución -- X
 Nota 1: Se añade H₂SO₄ al final de la disolución.
 Nota 2: como necesitamos 250ml de Hematoxilina Férrica y la solución
1 y 2 se mezclan a partes iguales, habrá que preparar 125ml de cada
solución.
* Solución 1º (125ml)
100ml solución – 1 gr HF
X= 1,25gr H + 125ml Etanol 95%
125ml solución -- X
 Nota: hay que preparar alcohol de 95º

* Solución 2º (125ml)
100ml solución – 1,5 gr
X = 1,8gr FeCl₃ + 125ml agua destilada
125ml solución -- X

31
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 MATERIAL.
Matraz Erlenmeyer 250ml Matraz aforado 250ml
Embudo Pipeta Pasteur
Balanza digital Espátula o cucharilla
Agitador magnético e imán Frasco topacio
Papel de filtro Etiquetas

 PROCEDIMIENTO.
1º Medimos en una probeta 250ml de H₂O destilada con la ayuda de una pipeta
quitamos el volumen correspondiente del ácido acético glacial (2,5ml), así
tendremos el resto de H₂O destilada (247,5).
2º Echamos 2/3 partes de H₂O destilada en el Matraz Erlenmeyer y a
continuación echamos los colorantes (da igual el orden)
3º Agitamos manualmente y echamos el resto del H₂O destilada lavando los
restos del matraz y vidrio de reloj.
4º Por último añadimos el ácido acético glacial.
5º Una vez se mezclan soluciones a partes iguales (solución 1 y 2) se tornan la
solución de negro azulado a pardo negruzco. A continuación se le unen el 1,25
gr ml de ácido sulfúrico.
6º Envasamos en vaso topacio y etiquetamos.

32
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 11
“TINCIÓN TRICRÓMICO DE MASSON”
Mordientes: Ácido fosfotúngstico y fosfomolíbdico.
 OBJETIVO.
Teñir las fibras de colágeno.
 FUNDAMENTO.
Los dos colorantes tienen el mismo mecanismo de actuación, el mecanismo
físico químico de atracción electrostática y el mecanismo físico de
impregnación.
 TEJIDOS SELECCIONADOS.
Se usará lengua, oreja e intestino.
 PROCEDIMIENTO.
1. Desparafinado. Introducir la muestra en la estufa calentada a 60ºC
aproximadamente entre 15-20 minutos.
La parafina está preparada cuando se pega al dedo.
A continuación se pasa por tres baños de Xilol. Cada uno de os baños
debe durar 5 minutos.
2. Hidratación del tejido:
La hidratación del tejido se realiza con baños de alcohol en
concentraciones decrecientes.
Se realiza una serie de pases (1 pase* introducir y sacar el porta 10 veces,
debe durar un minuto).
En el primer y segundo baño se realizará 3 pases en cada uno en alcohol
absoluto (100º).
En el tercer y cuarto baño se realizará 3 pases cada uno en alcohol 96º.
En el quinto baño se realizará 3 pases en alcohol 70º.
Tras hidratar, pasamos la muestra por dos otres baños de agua destilada para
enjuagar y eliminar el alcohol.
Estará bien hidratada cuando el portaobjetos no tenga aspecto grasiento.
3. Tinción:
3.1 Tinción del núcleo con hematoxilina férrica durante 10`y se enjuaga
en dos o tres baños de agua corriente hasta que salga limpia.
3.2 Tinción del citoplasma introduciendo los portas en baño de
Escarlata de Biebrich durante 5 minutos. Enjuagamos en agua
destilada.
3.3 Mordientes:
- Para la tinción del Verde Luz  1 baño en ácido fosfotúngstico durante
15´.

33
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

- Para la tinción de Azul de Anilina  1 baño de ácido fosfotúngstico +

ácido fosfomolíbdico duracte 15´.
3.4 Tinción de fibras de colágeno:
- Para el verde luz  1 baño de 6´.
- Para el Azul de Anilina  1 baño de 15´.
Enjuagar con agua destilada.
4. Acidificación. Para ello tenemos que preparar un baño de ácido acético
glacial al 1% manteniendo la cestilla durante 3´.
5. Deshidratación. La muestra se deshidrata con sucesivos baños de
alcoholes de graduación creciente.
En el primer baño se realizará 3 pases en alcohol 70º.
En el segundo y tercer baño se realizará 3 pases en cada uno en alcochol 96º.
En el cuarto y quinto vaño se realizará 3 pases en cada uno en alcohol absoluto
100º.
6. Aclarado. La clarificación de la muestra se realiza con Xilol.
En el primer baño se realiza 3 pases en alcohol 100º + Xilol 1/1.
En el segundo y tercerbaño se realiza 3 pases en cada uno en Xilol.
En el último o tercer baño de xilol entre 3´ - 5´.
7. Montaje de la muestra. Añadir una gota de DPX con ayuda de una pipeta
pasteur encima del portaobjetos. Poner el cubreobjetos encima con
cuidado de no crear burbujas.
8. Pasamos la muestra al microscopio óptico. Se observa la muestra.

 OBSERVACIONES.
El núcleo se presenta con un color pardo negruzco por la hematoxilina férrica.
El citoplasma se observará de color rojo debido a la Escarlata de Biebrich.
Las fibras de colágeno se teñirán con Verde Luz, por lo que se observarán de
color verde

34
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

35
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 12
"PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DEL PAS"
ÁCIDO PERYÓDICO (PRODUCTO A)
 FUNDAMENTO.
Actúa como oxidante y mordiente de la reacción y además actúa por el
mecanismo físico-químico.

 CÁLCULOS.
Preparar 250ml de ácido Peryódico al 0,5%

100ml -- 0,5 gr [Link].

X=1,25gr ac. peryódico + H2O destilada hasta250ml
250ml -- X

 MATERIAL.
Se utiliza el mismo material que para cualquier disolución.

 PROCEDIMIENTO.
1. En ⅔ del volumen de agua se pone a disolver ácido peryódico, si es
necesario se disuelve con agitador magnético.
2. Una vez disuelto, se envasa enfrasco topacio y se añade el resto del agua,
para arrastrar los posibles restos de reactivo sólido.
3. Se etiqueta adecuadamente.

REACTIVO B SCHIFF (PRODUCTO B)

 FUNDAMENTO.
Es el colorante principal de la técnica. Se une a los grupos carbonilo contiguo
que vienen delimitados por un grupo alcohol o amino. Previamente el tejido ha
sido oxidado con el ácido peryódico.

 CÁLCULOS.
No son necesarios porque el reactivo de Schiff ya que viene preparado para su
uso.

 OBSERVACIONES.
Una vez se abre el bote, debe conservarse en frío.
Si se usa una pipeta para extraer el volumen, no debe de volverse ningún resto
al frasco una vez extraído.

 MATERIAL.
Se utiliza el mismo material que para cualquier disolución.

 CÁLCULOS.
Ninguno.

36
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

SOLUCIÓN DE ÁCIDO SULFUROSO (PRODUCTO C)

 FUNDAMENTO.
La fucsina básica es tratada con ácido sulfuroso, siguiendo la H2SO3, para hacer
desaparecer el doble enlace del grupo cromóforo, transformándolo en el reactivo
de Schiff incoloro, pero cuando reacciona con los grupos carbonilos contiguos y
delimitados por los grupos hidroxilos (-OH), aparece de nuevo el doble enlace y
con ello el color rojo-fucsia-magenta.

 CÁLCULOS.
Necesitamos tres baños de ácido sulfuroso (cada uno de 250ml) por lo que
prepararemos un volumen de 750 ml totales de disolución. En laboratorio
tenemos HCl al 37% con una densidad de 1,19g/ml. Además el metabisulfito
sódico (Na₂S₂O₅) se encuentra en estado sólido.

HCl 1N -- 5 ml
Metabisulfito sódico al 10% -- 6 ml Volumen total = 111 ml
H2O destilada -- 100 ml

* Metabisulfito
111ml disoución -- 6ml metab.
X = 40,54 ml de mitabis. al 10%
750ml disolución - X

En el laboratorio el metabisulfito sódico está puro:

*100ml disolución -- 10gr de metab.

X = 4,1 gr de metabisulfito + H₂0
destilada hasta 40,54ml
40,54 ml disolución -- X

*HCl 1 Normal.
111 ml disolución -- 5 ml HCl
X = 33,78ml HCl 1N aprox. 34ml
750ml disolución -- x ml HCl

El peso molecular de HCl es 36,5gr/mol

Cómo la cantidad que tenemos que tomar es pequeña, vamos a preparar un
volumen de 100ml de HCl 1 normal, y de este tomaremos 34 ml necesarios para
esta preparación.

111 ml -- 100 ml H2O destilada

X = 675,67ml H2O destil.
750 ml disol. -- X ml H2Odestil

37
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

 PROCEDIMIENTO.
Tomo 8,30 ml de HCl al 37% y añado agua destilada hasta un volumen total de
100 ml. De esta solución tomaré los 34 ml que me son necesarios.

 MATERIAL.
Igual que en prácticas anteriores.

SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA HARRIS (PRODUCTO D)

Ya preparada en la práctica 3.

38
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 13
"TINCION DEL PAS
 OBJETIVO.
Teñir mucopolisacáridos neutros, glucógeno, almidón, mucoproteínas,
mucolípidos, lipofucsinas, etc.

 FUNDAMENTO.
Mecanismo histoquímica en el que oxidamos el tejido con ácido peryódico para
incrementar el número de grupos carbonilla delimitados por OH, los cuales se
van a unir al reactivo Schiff teñiendo esas estructuras.

 TEJIDOS SELECCIONADOS.
Intestino (grueso y delgado) y estómago.

 PROCEDIMIENTO.
1. Desparafinar a 60º durante 15 minutos. El tejido está listo cuando la
parafina se pega en el dedo. Con esto conseguimos que el tejido se
adhiera bien al vidrio y se desprenda.
2. 3 baños de Xilol:

Xilol (I)  3 minutos – 3 pases

Xilol (II)  3 minutos – 3 pases
Xilol (III)  3 minutos – 3 pases

3. Hidratación en alcoholes de graduación descendiente.

Alcohol 100º (I) – 3 pases
Alcohol 100º (II) – 3 pases
Alcohol 96º (I) – 3 pases
Alcohol 96º (II) – 3 pases
Alcohol 70º (I)- 3 pases

4. Realizamos 2 o 3 baños de agua destilada hasta que desaparezca el

alcohol y el porta salga limpio (sin góticas de grasa ni que haga espejos
de colores, irisaciones…)
5. Oxidante y mordiente. Prepara un baño de ácido peryodico 5 min. (no dar
pases) Luego se lava con agua destilada 2 o 3 baños.
6. Tinción - no hay pases:
 Necesitamos un baño de reactivo schiff - 30min (colorante principal)
Un baño de ácido sulfuroso - 2min
Segundo baño de ácido sulfuroso - 2min
Tercer baño de ácido sulfuroso - 2min

39
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

Nota: Con esto lo que hacemos es eliminar los dobles enlaces de los grupos
cromóforos.

Lavar con agua corriente, 2 baños:

- El primer baño 2min
- Segundo baño 3min.
Con esto eliminamos el ácido sulfuroso.

 Baño de Hematoxilina de Harry (colorante secundario) 1 min.

Hay que filtrar previamente la hematoxilina.
Lavamos en dos baños otra vez de agua corriente ñ, un baño de 2min y otro de
30min.
(Objetivo: Azulear la hematoxilina)

7. Deshidratar y aclarar. Se deshidrata en escala de alcoholes crecientes.

Alcohol 96º (I) – 3 pases
Alcohol 96º (II) – 3 pases
Alcohol 100º (I) – 3 pases
Alcohol 100º (II) – 3 pases

8. Aclaramiento
1/2 alcohol 100 + ½ Xilol (I) – 3 pases
Xilol (I) – 3 pases
Xilol (II) – 3 pases

9. Montaje. Colocar el cubreobjetos pegándolo con el DPX. (Tener cuidado

con que no se quede aire)

 RESULTADOS.
Los MPN se observan de color rosa-rojo-fucsia-magenta teñidos por el reactivo
schiff. Los núcleos se verán de color azul por la hematoxilina de Harris.

40
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

[Link] Estómago Bazo

41
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 14
“ELABORACIÓN DE BLOQUES DE PARAFINA”
1-. TALLADO
a) OBJETIVO
Obtener muestras representativas de la pieza para su inclusión en parafina y su
posterior realización del bloque.
Previamente se hará un tallado realizado por el patólogo en el que se
seleccionara y fijara el tejido.
Las normas para la fijación de tejido son las siguientes:
1) Abrir o cortar la pieza para que se fije.

3) Vísc
fijador mediante agujas o catéteres.

citológico o bioquímico y el interior se rellena con fijador.

5) Piezas de
cantidad de tejido blando y óseo y se realizan cortes transversales de las zonas
más importantes o bien separar las partes blandas de las óseas, fijando las
primeras.
6) Los límites de la resección quirúrgica se marcaran con tinta china sobre todo
si proceden de neoplasia por su transcendencia diagnostica o terapéutica para
posterior orientación del patólogo.
7) Las piezas de tamaño muy pequeño: biopsias, endoscopias, cilindros por
punción, etc. se fijan e incluyen directamente. Cuando el tamaño de la pieza es
milimétrico se coloca en cestillos de malla muy fina y se pueden colorear con
Hematoxilina o Mercurio para su mejor visualización, o bien introducirlas en
casetes normales sujetando la pieza con esponjillas porosas.
8) Los tejidos muy duros como el útero o las grasas deben estar un par de días
más en formol que el resto antes de procesarla.
9) Algunas muestras requieren orientación como aquellas que tienen una cara
luminar.

2-. MUESTREO.

42
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

a) MATERIAL
-Papel de filtro -Lápiz o rotulador -Tijeras de disección rectas
-Pinzas de disección -Bisturí -Batea
-Tabla de disección -Suero fisiológico

b) OBJETIVO.
O Se debe realizar sobre la totalidad del material recibido aunque una pequeña
parte será seleccionada para el estudio histológico.
O Se escogerán las zonas más significativas de las lesiones halladas sin repetir
áreas equivalentes y en un número de muestras según la apariencia
macroscópica, el sentido común y la experiencia.
O Normalmente se toma 2 muestras de los bordes quirúrgicos, 2 del tumor, 2 del
tejido normal y varias de ganglios.
O Las muestras que presentan tejidos diferentes se cortan de forma que en el
corte estén presentes todas las capas.
O Los fragmentos que se seleccionan para incluir en las cestillas o casetes no
deben tener un tamaño superior a 2-5mm de espesor, para facilitar la
impregnación de parafina.
O Cuidado de no incluir grapas, hilos de sutura, gasas, ni zonas calcificadas o
huesos sin descalcificar porque dañan la cuchilla del micrótomo y el bloque.

3-. PROCESADO
O Se preparan todos los líquidos de la procesadora. Para ello la encendemos y
extraemos la cesta de los casetes.
O Procedemos al llenado de los recipientes que tendremos ordenados para no
confundirlos y lo llenamos con su líquido correspondiente dentro de la campana.
O El llenado se realizara hasta el nivel que marcan las muescas metálicas. Si se
derrama algún reactivo se debe limpiar inmediatamente al igual que se limpiaran
los bordes del recipiente para que cierren bien y no escapen vapores.
O No tocar los bordes superiores de los recipientes de parafina.
O Los recipientes se colocan en el sentido de las agujas del reloj.
O El carrusel nunca debe girarse a mano.
O Una vez que la muestra está en su casette se extrae la cesta de su soporte y
se llena hasta la zona de los orificios (aprox 70 casetes).

43
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

O Después colocamos sobre el soporte y giramos hasta que la cesta este sobre
la estación número 1.
O Bajamos el carrusel, elegimos programa y la ponemos en funcionamiento.
O El procesado puede durar entre 12 y 16 horas, cuando termina la procesadora
emite una señal acústica.
O Desde que termina el procesado hasta que se va a elaborar el bloque de
parafina estas muestras deben permanecer a 60°C, que es la temperatura a la
que se encuentra en la procesadora.
4-. ELABORACIÓN DEL BLOQUE DE PARAFINA
a) OBJETIVO
Nuestro objetivo es confeccionar bloques de parafina que le proporcione al tejido
la dureza y consistencia necesarios para ser cortados en el micrótomo y obtener
cortes lo suficientemente finos para que la luz pueda atravesarlos y ser
observados al microscopio óptico.
b) REACTIVOS
-Parafina en lentejas
c) MATERIAL

-Papel de filtro -Dispensador de parafina -Placa fría -Placa caliente -Moldes

metálicos-
Casetes sin tapadera -Pinzas -Cerillas o mechero Etiquetas -Lápiz -Bolsa de
plástico

-Mechero de alcohol -Rotulador

d) PROCEDIMIENTO
1) Colocamos papel de filtro bajo el aparataje y la mesa para protegerla.
2) Se conectan los aparatos a la red eléctrica.
3) Limpiamos el contenedor de parafina con papel de filtro cuando esté caliente,
cuidando de no dañar la resistencia.
4) En el dispensado se echan lentejas de parafina, se tapan para que no pierdan
calor y esperamos a que estén totalmente fundidas (60°C).
5) Colocamos todo el material sobre la mesa.
6) Sobre la placa fría y caliente también se debe colocar un trozo de papel de
filtro para que el cambio brusco que se produce al pasar el bloque de parafina
de la placa caliente a la fría no haga que este se agriete.

44
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

7) Rotulamos los casetes con la abreviatura del órgano y el numero de

procesamiento.
8) Encendemos el mechero de alcohol rellenándolo con alcohol usado, encima
de la placa caliente se colocan los moldes metálicos limpios y parafinados.
9) Cuando la parafina está fundida se le echa una pequeña cantidad a cada uno
de ellos y se mantiene fundida en esa placa caliente.
10) Cuando lo tenemos todo dispuesto extraemos de la cubeta del procesador
automático la cestilla con los casetes, los ponemos en el depósito caliente con
algo de parafina fundida de la estación y comenzamos a confeccionar el bloque.
11) Extraemos un casete con las pinzas y lo situamos en la placa caliente
rápidamente lo abrimos y extraemos los fragmentos de tejido, que colocaremos
sobre un molde metálico que habremos situado sobre la placa caliente y que
contendrá en su interior la gota de parafina fundida, procedemos a orientar de
forma adecuada el tejido, recordando que el tejido debe estar en el centro del
molde y apoyado sobre la parte más plana del mismo que coincidirá con la zona
que se hizo el corte en el muestreo/macro.
Tendremos en cuenta que los tejidos o muestras con varias capas de tejido
deben quedar perpendiculares al molde.
12) Una vez orientados trasladamos el molde a la placa fría de forma que
sujetando el tejido con la pinza para que no flote hasta que la parafina solidifique.
Esta placa estará a unos 7°C (menos de 10°C).
13) Se tapa el molde con la tapadera del casete debidamente rotulado y legible.
14) Los moldes se terminan de rellenar de parafina, llenándolos bien para que al
solidificar y bajar de volumen no queden medio vacío.
15) Se coloca el molde sobre la placa fría y se deja solidificar entre 10° y 15°C
aproximadamente media hora (a menor temperatura se produce contracción
brusca que puede desquebrajar el tejido).
16) El molde por debajo no debe tener parafina derramada ya que esto impide
que el frio llegue adecuadamente al bloque. Por otro lado si el papel de filtro que
hay sobre la placa fría está demasiado lleno de parafina derramada también se
debe cambiar porque impide que el frio llegue al bloque.
17) Pasado un rato, si creemos que el bloque está suficientemente solidificado,
se coge el molde y se le da un ligero golpe sobre la palma de la mano, si el molde
está en “su punto” este saldrá sin esfuerzo, si no es así se deja más tiempo en
la placa fría. Esto es muy importante ya que si lo forzamos podemos agrietar el
bloque o doblar el molde por lo que ninguno de los dos nos será de utilidad.
18) Cuando ya tengamos todos los bloques realizados se introducen en una
bolsa de plástico etiquetada con el número de procesamiento y la fecha y se
guardan.

45
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

19) Se recoge y limpia todo el material utilizado, fundiendo la parafina cuando

sea necesario y con papel de filtro (nada de agua para quitar la parafina). La
cestilla del procesador que contenía los casetes se saca rápidamente de la
cubeta y con ayuda de papel de filtro se limpia en caliente, se guarda fuera de la
procesadora (la cestilla).
e) OBSERVACIONES

que han salido mal en el procesamiento.

caliente, cuando la parafina se haya ablandado, sacamos el tejido con unas

pinzas teniendo mucho cuidado de no dañarlos. A partir de aquí repetimos todo
el procedimiento del blocaje y guardamos el bloque junto con los demás.

solidifica en las pinzas y que entorpece el trabajo de orientación de las muestras,

porque hace que las muestras se peguen a las pinzas.
LIMPIEZA
Antes de pasar a la limpieza cerraremos el dispensador de parafina quedando la
placa de calor encendida al contrario que la placa de frío, la cual apagaremos.
Una vez hechos los bloques pasaremos a la limpieza del material utilizado.
En primer lugar limpiaremos la estación de inclusión, para ello utilizamos papel
y una espátula de plástico con la que eliminaremos los restos de parafina que
hayan quedado sobre las placas (fría y caliente).Posteriormente pasamos el
papel absorbente para eliminar totalmente la parafina incrustada en dicha
estación de inclusión. Por último, miraremos si hay suficiente parafina y si no
rellenamos la estación para que al día siguiente la parafina esté lista para ser
utilizada.
Pinza universal para casetes:
No limpiarla con xilol sino con sustituyente de xilol o con productos especiales
para quitar parafina (p. ej. "Para Gard").
También es posible poner la pinza en una estufa a una temperatura máxima de
65 °C hasta que la parafina se licúe y se escurra.
Quitar la parafina residual con un trapo seco.
Limpieza de los moldes: Para comenzar sacaremos la canastilla en la que
previamente han estado los cassettes que hemos incluido en parafina, y
meteremos en ella los moldes que hemos usado para la confección de los
bloques. Dicha limpieza se realizará en el procesador automático, en el que
consta un programa específico para la limpieza. También se puede limpiar la
pinza.

46
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

LIMPIEZA DEL PROCESADOR AUTOMATICO

Llenar hasta la señal indicada cada vaso.
Diario: Cambiar el agua.
Miércoles viernes: Los vasos del lavado, xilol y alcohol absoluto.
Quincenal: Cambia todos los reactivos y la parafina, se cambiará de la siguiente
forma: se volcarán los dos primeros recipientes en unas bolsas de basura dobles
para que no se derramen y se tiraran a la basura, nunca por el fregadero.
Pasaremos los recipientes 3o y 4o a los primeros sin vaciarlos ya que esa
parafina está limpia y los vacíos los pondremos en su lugar y los llenaremos de
parafina líquida que estará en la estufa.
Volveré a llenar de parafina sólida los recipientes de la estufa para tenerlos
licuados para la próxima vez.
Una vez finalizado anotaremos en el almanaque la fecha del cambio.
Carbón: Se cambiará cada tres meses, se anota también en el almanaque.

47
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

PRÁCTICA 15
CORTE EN MICROTOMO
MEDIDAS GENERALES:
1. Colocar el micrótomo en un lugar estable, lejos de ráfagas de aire, puertas
y puntos de paso.
2. Es preferible utilizar un banco ajustable en altura y por tanto ergonómico.
3. Es muy importante que el personal no esté distraído al usar el micrótomo
por el riesgo de lesionarse con cuchillas que están extremadamente
afiladas.
4. Es preferible tener un suelo antideslizante en las inmediaciones de los
micrótomos porque, inevitablemente, los fragmentos de parafina caerán
al suelo y pueden originar una superficie resbaladiza.
PREPARACIÓN DEL MATERIAL:
1. Antes de sentarse para comenzar a trabajar, prepara todo el material que
sea necesario para la ejecución de dicha tarea:
o 1 ó 2 pinceles.
o Guía de archivos con portas albuminados.
o Cubierta de hielo
o Papel de filtro para debajo de: el micrótomo, el baño termostático,
la cubierta y la guía de archivos.
o Un trozo de papel de filtro para cuando tengas que aplicar vaho.
2. La parafina fría proporciona mejor soporte para los elementos duros en
una muestra, permitiendo que se obtengan secciones más delgadas. Por
esto, los bloques han de meterse en el frigorífico media hora antes de
iniciar los cortes y luego se procederá a mantener ese frío colocando los
bloques sobre una placa fría o sobre una superficie fría y húmeda (como
la superficie de hielo derritiéndose) durante unos minutos. El agua de ese
hielo derritiéndose penetra un poco en la cara del bloque, hinchando los
tejidos y haciéndolos más adecuados para cortarlos. Esto tiene particular
importancia en el caso de tejidos excesivamente deshidratados, secos o
que se desmigajan. No colocar los bloques en el congelador pues puede
ocasionar la rotura de la superficie, separándose el tejido de la parafina
que tiene alrededor.
3. Prepara el baño termostático: selecciona 60º y espera ½ hora. Asegúrate
de que el agua del baño termostático está limpia, que no tiene burbujas ni
residuos de anteriores cortes y que el baño esté en sus ¾ partes. No es
necesario cambiar el agua del baño constantemente, salvo en aquellas
ocasiones en las que este muy turbia. Es útil para el estirado de los cortes
echar unas gotas de alcohol de 70º en el agua del baño termostático.
PASOS PARA LA REALIZACIÓN DEL TRABAJO.
1. Ya estás en disposición de comenzar el trabajo, pero, antes de iniciar los
cortes, asegúrate siempre de que todos los mecanismos de sujeción
están apretados con seguridad.

48
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

2. Siéntate recto y a la altura más ergonómica.

3. Coloca el bloque en el portabloques (en sentido horizontal o vertical según
convenga)
4. Retira el portacuchillas y colócalo en una superficie firme.
5. Inserta la cuchilla lateralmente y vuelve a colocar el portacuchillas en su
lugar.
6. Comprueba el ángulo de corte de la cuchilla (5º).
7. Quita el bloqueo del volante y baja el portabloques.
8. Seguidamente quita el seguro del portacuchillas y acerca la cuchilla al
bloque pero ¡¡sin tocarlo!!
9. Comienza la serie de cortes con un movimiento uniforme y suave.
PRECAUCIONES EN LA TÉCNICA.
1. Se deben realizar los cortes en un máximo de 30 minutos. Si la cara del
bloque se calienta en exceso, es necesario volver a enfriarlo.
2. El micrótomo dispone de un sistema de avance, que tras un número de
vueltas, acaba su recorrido. Si siguiéramos girando, se rompería dicho
avance, cuando veamos que está muy adelantado el portabloques,
paramos y hacemos retroceder la manivela del sistema de avance, para
comenzar de nuevo.
3. El grosor real del primer par de cortes de una cinta puede ser mayor de lo
indicado, debido a la dilatación por calor al cortar un bloque frío.
4. Así mismo, es útil y es una práctica habitual aplicar el aliento (vaho) cálido
y húmedo sobre la cara de un bloque enfriado, justo antes de cortar cada
sección, pues hace las secciones más cohesivas y elimina la electricidad
estática, aunque ocasiona dilatación a causa del calor.
5. Los mejores cortes se obtienen con una carrera de corte uniforme y lenta.
6. Usa pincel en lugar de los dedos para coger las secciones o cortes de la
cuchilla.
7. Existe un bloqueo del volante que inmoviliza el portabloques, y se debe
utilizar cuando cambiamos de bloque o al realizar cualquier manipulación
del bloque mientras la cuchilla está colocada.
8. Es mejor colocar el bloque en posición horizontal que vertical.
9. No acercar demasiado el bloque a la cuchilla porque afecta y daña al
portacuchillas.
10. Colocar los cortes en la superficie del agua con un movimiento de barrido
suave.
11. Para evitar cualquier posibilidad de mezcla, haz flotar los cortes de un
mismo bloque o de un mismo tejido y por tanto elimina todos los cortes
realizando antes de cambiar el tejido.
12. Los cortes pueden dañarse con mucha facilidad a quitar las arrugas o
burbujas con el pincel. Hazlo con cuidado.
13. Examina cada corte mientras flota en la superficie del agua, ya que las
imperfecciones pueden verse fácilmente.
14. Deja la muestra en la superficie del agua tanto tiempo como sea suficiente
para que se alise.

49
Cuaderno de Prácticas PCT María Gallardo Gómez

15. Sumerge el porta verticalmente acercándolo al tejido de manera que al

extraerlo el tejido realice su adherencia lo más centrado posible en el
porta.
16. Antes de comenzar a tratar esos portas, es recomendable escurrirlos bien
en posición vertical para quitar el exceso de agua.
LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO DEL MICRÓTOMO.
1. Limpia el equipo diariamente. Al ser compartido por varios compañeros,
límpialo siempre que finalices tu tiempo de trabajo con él, y déjalo
preparado para la siguiente persona.
2. Si quedan residuos en la parte trasera de la cuchilla, estos dificultarán la
obtención de cintas cohesivas. Elimina dicha parafina utilizando un pincel
y arrastrando en sentido ascendente, intentando preservar la cuchilla lo
máximo posible.
3. Para una limpieza más exhaustiva extraeremos el portacuchillas y
limpiaremos con un cepillo de cerdas más gruesas.
4. La cuchilla debe extraerse del micrótomo cuando se limpia el equipo al
finalizar la jornada. La mejor manera de hacerlo es quitar la sujeción y
utilizar el expulsor de la cuchilla situado en un lateral para comenzar a
extraerla lateralmente. Si no dispone de él, coger con unas pinzas (y no
de los dedos) el lateral de la cuchilla y comenzar a extraerla de igual
modo. Se debe utilizar unas pinzas. Las cuchillas utilizadas deberían
desecharse en un contenedor de objetos punzantes o en la ranura de
cuchillas usadas, situadas en la base del dispensador de cuchillas.
5. Si el micrótomo estuviera equipado con una protección de cuchillas, se
utilizaría al finalizar la jornada o al dejar sin supervisión el micrótomo.
6. No dejar nunca una cuchilla en el lugar de trabajo. Si por casualidad
mientras trabajamos se cae una cuchilla, dejarla caer y no intentar cogerla
en ningún caso.
7. No limpies las superficies externas con alcohol o Xilol, ya que no son
resistentes a estos disolventes. Se recomienda usar una solución
específica para eliminar la parafina, detergentes comerciales suaves o
simplemente agua y jabón, sin que penetre ningún fluido en el interior del
aparato.
8. Mínimo una vez al año debe pasar por una inspección por un técnico
especializado, y debe de ser engrasado.

50