En este punto, comenzamos nuestras discusiones sobre vías metabólicas específicas considerando

la glucólisis (griego: glykos, dulce; lisis, aflojamiento), la vía por la cual la glucosa se convierte a
través de la fructosa-1,6-bisfosfato en piruvato con la generación de 2 mol de ATP por mol de
glucosa.

Esta secuencia de 10 reacciones enzimáticas, que es probablemente la vía bioquímica más

entendida, juega un papel clave en el metabolismo energético al proporcionar una porción
significativa de la energía utilizada por la mayoría de los organismos y al preparar glucosa, así
como otros carbohidratos, para la degradación oxidativa.

En nuestro estudio de la glucólisis, y de hecho de todo el metabolismo, intentaremos comprender

la vía en cuatro niveles:

1. Los pasos de la interconversión química, es decir, la secuencia de reacciones mediante las cuales
la glucosa se convierte en los productos finales de la vía.

2. El mecanismo de conversión enzimática de cada camino intermedio a su sucesor.

3. La energética de las conversiones.

4. Los mecanismos que controlan el flujo (tasa de flujo) de metabolitos a través de la vía.

El flujo de metabolitos a través de una vía es notablemente sensible a las necesidades del
organismo de los productos de la vía. A través de una red exquisitamente compleja de
mecanismos de control, el flujo a través de una vía es tan grande como se requiere.

1 EL CAMINO GLICOLÍTICO

En la figura 17-1 se muestra una descripción general del metabolismo de la glucosa. En

condiciones aeróbicas, el piruvato formado por glucólisis se oxida aún más por el ciclo del ácido
cítrico (Capítulo 21) y la fosforilación oxidativa (Capítulo 22) a CO2 y agua. Sin embargo, en
condiciones anaeróbicas, el piruvato se convierte en un producto final reducido, que es lactato en
el músculo (fermentación homoláctica; una fermentación es un proceso de reacción biológica
anaeróbica) y etanol. CO2 en levadura (fermentación alcohólica).

A. Perspectiva histórica

La fermentación de glucosa a etanol y CO2 por levadura (fig. 17-2) ha sido un proceso útil desde
antes de los albores de la historia registrada. La elaboración del vino y la panadería aprovechan
este proceso. Sin embargo, la investigación científica del mecanismo de la glucólisis no comenzó
hasta la segunda mitad del siglo XIX.

En los años 1854 a 1864, Louis Pasteur estableció que la fermentación es causada por
microorganismos. Sin embargo, no fue hasta 1897 que Eduard Buchner demostró que los
extractos de levadura exentos de células también pueden llevar a cabo este proceso.

Este descubrimiento refutó la entonces extendida creencia de que la fermentación, y todos los
demás procesos biológicos, estaban mediados por alguna "fuerza vital" inherente a la materia viva
y, por lo tanto, trajo la glucólisis al ámbito de la química. Este fue un paso importante en el
desarrollo de la bioquímica como ciencia. Aunque, en principio, el uso de los extractos libres de
células permitieron una "disección" sistemática de las reacciones involucradas en la vía, la
elucidación completa de la vía glucolítica era todavía un proyecto a largo plazo porque las técnicas
analíticas para el aislamiento y la identificación de intermedios y enzimas debían desarrollarse al
mismo tiempo.

En los años 1905 a 1910, Arthur Harden y William Young hicieron dos descubrimientos
importantes:

1. El fosfato inorgánico es necesario para la fermentación y se incorpora a la fructosa-1,6-

bisfosfato, un intermedio del proceso.

2. Un extracto de levadura libre de células se puede separar, por diálisis, en dos fracciones que son
necesarias para la fermentación: una fracción termolábil no dializable que llamaron zimasa; y una
fracción dializable y termoestable que llamaron cosymasa. Más tarde, otros demostraron que la
zimasa es una mezcla de enzimas y que la cosymasa es una mezcla de cofactores: coenzimas como
NAD !, ATP y ADP, también como iones metálicos.

En sus esfuerzos por identificar los intermediarios de las vías, los primeros investigadores de la
glucólisis desarrollaron una técnica general de investigación metabólica que se utiliza hoy en día:
Se encuentran reactivos que inhiben la producción de productos de la vía, lo que provoca la
acumulación de metabolitos que luego pueden identificarse como intermedios de la vía. Durante
años de investigación que intentó identificar intermedios glucolíticos, se encontraron varios
reactivos que inhiben la producción de etanol a partir de glucosa en extractos de levadura. El uso
de diferentes inhibidores da como resultado la acumulación de diferentes intermedios. Por
ejemplo, la adición de yodoacetato a los extractos de levadura en fermentación provoca la
acumulación de fructosa1,6-bifosfato, mientras que la adición de iones fluoruro induce la
acumulación de 3-fosfoglicerato y 2-fosfoglicerato:

Los mecanismos por los cuales actúan estos inhibidores se describen en las secciones 17-2Da y 17-
2I, respectivamente.

Un hallazgo notable de estos estudios fue que los mismos intermediarios y actividades enzimáticas
podrían aislarse no solo de la levadura, sino de una gran variedad de otros organismos. Con pocas
excepciones (consulte el problema 11 de este capítulo), todos los seres vivos metabolizan la
glucosa por vías idénticas. A pesar de su enorme diversidad, comparten una bioquímica común.

Para 1940, los esfuerzos de muchos investigadores habían dado sus frutos con la elucidación de la
vía completa de la glucólisis. El trabajo de tres de estos individuos, Gustav Embden, Otto Meyerhof
y Jacob Parnas, se ha conmemorado en el sentido de que la glucólisis se conoce alternativamente
como la vía Embden-Meyerhof-Parnas. Otros contribuyentes importantes a la elucidación de esta
vía fueron Carl y

Gerty Cori, Carl Neuberg, Robert Robison y Otto Warburg.

B. Descripción general de la vía

Antes de comenzar nuestra discusión detallada de las enzimas de la glucólisis, dediquemos un

momento a examinar la vía general, ya que encaja con el metabolismo animal en su conjunto. La
glucosa por lo general surge en la sangre como resultado de la descomposición de polisacáridos
superiores (secciones 11-2B, 11-2Db y 18-1) o de su síntesis a partir de fuentes no carbohidratos
(gluconeogénesis; sección 23-1). El destino de las hexosas no glucosas se analiza en la sección 17-
5. La glucosa ingresa a la mayoría de las células por medio de transportadores específicos que la
transportan desde el exterior de la célula al citosol (sección 20-2E). Las enzimas de la glucólisis
están ubicadas en el citosol, donde solo están débilmente asociadas, si es que lo hacen, con
estructuras celulares como las membranas. Sin embargo, existe una considerable evidencia
circunstancial de que las sucesivas enzimas de la vía glucolítica se asocian libremente,
presumiblemente para facilitar la transferencia eficiente de intermedios entre enzimas. Estas
asociaciones de enzimas relacionadas funcionalmente se han denominado metabolones. Sin
embargo, todavía no se han aislado complejos reales de enzimas glicolíticas.

La glucólisis convierte la glucosa en dos unidades C3 (piruvato) de menor energía libre en un

proceso que aprovecha la energía libre liberada para sintetizar ATP a partir de ADP y Pi. Este
proceso requiere una vía de reacciones de transferencia de fosforilo acopladas químicamente
(secciones 16-4 y 16-6). Por tanto, la estrategia química de la glucólisis es:

1. Agregue grupos fosforilo a la glucosa.

2. Convierta químicamente los intermedios fosforilados en compuestos con altos potenciales de

transferencia de grupos fosfato.

3. Acopla químicamente la posterior hidrólisis de sustancias reactivas a la síntesis de ATP.

Las 10 reacciones de glucólisis catalizadas por enzimas se esquematizan en la figura 17-3. Tenga en
cuenta que el ATP se usa al principio de la ruta para sintetizar compuestos de fosforilo (reacciones
1 y 3), pero luego se resintetiza (reacciones 7 y 10).

Por tanto, se puede considerar que la glucólisis se produce en dos etapas:

Etapa I (reacciones 1-5): etapa preparatoria en la que la hexosa glucosa se fosforila y se escinde
para producir dos moléculas de la triosa gliceraldehído-3-fosfato.

Este proceso utiliza dos ATP en una especie de inversión energética.

Etapa II (reacciones 6 a 10): las dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato se convierten en

piruvato, con la generación concomitante de cuatro ATP. Por lo tanto, la glucólisis tiene una
ganancia neta de dos ATP por glucosa: la etapa I consume dos ATP; La etapa II produce cuatro ATP.

La reacción general es:

Glucose + 2NAD+ + 2ADP +2Pi  2NADH + 2 pyruvate + 2ATP + 2H2O + 4H+

a. ¡El poder oxidante de NAD!

El NAD + es el principal agente oxidante de la glucólisis. El NADH producido por este proceso (Fig.
17-3, Reacción 6) debe reoxidarse continuamente para mantener la vía abastecida con NAD !. Hay
tres formas comunes en que esto ocurre (Fig. 17-1, abajo):

1. En condiciones anaeróbicas en el músculo, ¡NAD! se regenera cuando NADH reduce el piruvato

a lactato (fermentación homoláctica; Sección 17-3A).
2. En condiciones anaeróbicas en levadura, el piruvato se descarboxila para producir CO2 y
acetaldehído y este último se reduce con NADH para producir NAD. y etanol (fermentación
alcohólica; Sección 17-3B).

3. ¡En condiciones aeróbicas, la oxidación mitocondrial de cada NADH a NAD! produce 2,5 ATP
(Sección 22-2A).

Por tanto, en la glucólisis aeróbica, el NADH puede considerarse un compuesto de "alta energía",
mientras que en la glucólisis anaeróbica su energía libre de oxidación se disipa en forma de calor.

LAS REACCIONES DE LA GLICOLISIS

Ver Exploración guiada 14: Descripción general de la glucólisis En esta sección examinamos las
reacciones de la glucólisis más de cerca, describiendo las propiedades de las enzimas individuales y
sus mecanismos. En la Sección 17-3 consideramos el destino anaeróbico del piruvato. Finalmente,
en la sección 17-4 consideramos la termodinámica de todo el proceso y abordamos el problema de
cómo se controla el flujo de metabolitos a través de la vía. Al estudiar las enzimas glucolíticas
individuales, encontraremos muchos mecanismos de reacción orgánicos (Sección 16-2). De hecho,
el estudio de los mecanismos de reacción orgánicos ha sido invaluable para comprender los
mecanismos por los cuales las enzimas catalizan las reacciones.

Tenga en cuenta que se ha informado de la estructura de rayos X de cada una de las 10 enzimas
glicolíticas. Todas estas enzimas son homodímeros u homotetrámeros con simetría D2 (sección 8-
5B), cuyas subunidades consisten principalmente en dominios! / "(Sección 8- 3Bi).

A. Hexoquinasa: primera utilización de ATP

La reacción 1 de la glucólisis es la transferencia de un grupo fosforilo del ATP a la glucosa para

formar glucosa-6-fosfato (G6P) en una reacción catalizada por la hexoquinasa (HK):

Una quinasa es una enzima que transfiere grupos fosforilo entre el ATP y un metabolito (Sección
16-4C). El metabolito que actúa como aceptor del grupo fosforilo para una quinasa específica se
identifica en el prefijo del nombre de la quinasa.

La HK es una enzima relativamente inespecífica contenida en todas las células que cataliza la
fosforilación de hexosas como Dglucosa, D-manosa y D-fructosa. Las células hepáticas también
contienen glucoquinasa, que cataliza la misma reacción pero que participa principalmente en el
mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre (sección 18-3Fa). El segundo sustrato de HK, al
igual que con otras quinasas, es un complejo Mg2 + –ATP. De hecho, el ATP no complejado es un
potente inhibidor competitivo de HK. A continuación, rara vez nos referiremos a este requisito de
Mg2 +, pero tenga en cuenta que es esencial para la actividad enzimática de la quinasa (otros
iones metálicos divalentes como Mn2 + a menudo satisfacen los requisitos de iones metálicos de
las quinasas in vitro, pero el Mg2 + es la especie fisiológica normal ).

Cinética y mecanismo de la reacción de la hexoquinasa

La hexoquinasa tiene un mecanismo Random Bi Bi en el que la enzima forma un complejo ternario

con glucosa y Mg2 + –ATP antes de que ocurra la reacción. Se cree que el Mg2 +, al formar
complejos con los átomos de fosfato de oxígeno, protege sus cargas negativas, lo que hace que el
átomo de fósforo sea más accesible para el ataque nucleófilo del grupo de la glucosa (fig. 17-4).

Una pregunta mecanicista importante es ¿por qué HK cataliza la transferencia de un grupo

fosforilo del ATP a la glucosa para producir G6P, pero no al agua para producir ADP + Pi (hidrólisis
de ATP)? El agua es ciertamente lo suficientemente pequeña como para caber en el sitio de unión
enzimática del grupo aceptor de fosforilo. Además, la transferencia de fosforilo del ATP al agua es
más exergónica que a la glucosa (cuadro 16-3), en particular porque [H2O] =55,5M y [glucosa]= 5 a
10 mM in vivo. Sin embargo, HK cataliza la transferencia de fosforilo a glucosa 40.000 veces más
rápido que al agua.

La respuesta fue proporcionada por Thomas Steitz a través de estudios estructurales de rayos X de
la levadura HK. La comparación de las estructuras de rayos X de HK y el complejo glucosa-HK indica
que la glucosa induce un gran cambio conformacional en HK (fig. 17-5). Los dos lóbulos que
forman la hendidura de su sitio activo se balancean juntos hasta 11,5 Å para engullir la glucosa de
una manera que sugiere el cierre de las mandíbulas. Este movimiento coloca al ATP muy cerca del
grupo de glucosa y excluye el agua del sitio activo (catálisis por efectos de proximidad; Sección 15-
1E). Si los grupos catalítico y reactivo estuvieran en la posición adecuada para la reacción mientras
la enzima estaba en la posición abierta (Fig.17-5a), la hidrólisis de ATP sería casi con certeza la
reacción dominante. Esta conclusión se ve confirmada por la observación de que la xilosa, que se
diferencia de la glucosa solo por la falta del grupo, aumenta en gran medida la tasa de hidrólisis de
ATP por HK (presumiblemente la xilosa induce el cambio conformacional activador mientras que el
agua ocupa el sitio de unión del grupo hidroximetilo faltante) . Claramente, este cambio
conformacional inducido por el sustrato en HK es responsable de la especificidad de la enzima.
Además, la polaridad del sitio activo se reduce por exclusión de agua, lo que acelera el proceso de
reacción nucleofílica. Otras quinasas tienen la misma estructura profundamente hendida que HK
(p. Ej., Sección 17-2G) y experimentan cambios conformacionales al unirse a sus sustratos. Esto
sugiere que todas las quinasas tienen mecanismos similares para mantener la especificidad.

B. Fosfoglucosa isomerasa

La reacción 2 de la glucólisis es la conversión de G6P en fructosa-6-fosfato (F6P) por la

fosfoglucosa isomerasa (PGI; también llamada glucosa-6-fosfato isomerasa). Esta es la
isomerización de una aldosa a una cetosa:

Dado que tanto G6P como F6P existen predominantemente en sus formas cíclicas (la figura 11-4
muestra estas estructuras para los azúcares no fosforilados), la reacción requiere la apertura del
anillo, seguida de isomerización y posterior cierre del anillo. La determinación de la dependencia
del pH de la enzima condujo a una hipótesis de participación de la cadena lateral de aminoácidos
en el mecanismo catalítico. La velocidad catalítica exhibe una curva de dependencia del pH en
forma de campana con pK característicos de 6.7 y 9.3, lo que sugiere la participación catalítica
tanto de His como de Lys (Sección 14-4). De hecho, la comparación de las secuencias de
aminoácidos de PGI de varios organismos diferentes revela que se conservan tanto His como Lys.
Sin embargo, también se conserva un residuo de Glu y, como hemos visto para la lisozima (Sección
15-2Ba), Glu puede tener un pK inusualmente alto en determinadas condiciones. De hecho, la
estructura de rayos X de PGI revela que Glu 216 e His 388 forman una díada catalítica con enlaces
de hidrógeno (que se asemeja a la interacción de los residuos de Asp e His en la tríada catalítica de
serina proteasas; figura 15-20), lo que facilita la acción de His 388 como catalizador ácido-base.

Un mecanismo de reacción propuesto para la reacción de PGI implica la catálisis ácido-base

general por la enzima (figura 17-6):

Paso 1 Unión del sustrato.

Paso 2 Un ácido, presumiblemente el grupo Lys ε-amino, cataliza la apertura del anillo.

Paso 3 Una base, presumiblemente la porción imidazol de la díada His-Glu, extrae el protón ácido
de C2 para formar un intermedio cis-enediolato (este protón es ácido porque lo es! A un grupo
carbonilo).

Paso 4 El protón se reemplaza en C1 en una transferencia de protones general. Los protones

extraídos por bases son lábiles y se intercambian rápidamente con protones solventes. Sin
embargo, Irwin Rose confirmó este paso demostrando que [2- 3H] G6P se convierte ocasionalmente
en [1-3H] F6P por transferencia de protones intramolecular antes de que el 3H haya tenido la
oportunidad de intercambiarse con el medio.

Paso 5 Cierre del anillo para formar el producto, que posteriormente se libera para producir
enzima libre, completando así el ciclo catalítico. La PGI, como la mayoría de las enzimas, cataliza
reacciones con una estereoespecificidad casi absoluta. Para apreciar esto, comparemos el
mecanismo de reacción enzimático propuesto con el de la isomerización catalizada por bases no
enzimáticas de glucosa, fructosa y manosa (Fig. 177). La glucosa y la manosa son epímeros entre sí
porque difieren solo con respecto a su configuración en un centro quiral, C2 (Sección 11-1A). En el
intermedio enodiolato, así como en la forma lineal de fructosa, C2 carece de quiralidad. Por lo
tanto, en sistemas no enzimáticos, la isomerización de glucosa catalizada por bases también da
como resultado la racemización de C2 con la producción de manosa. Sin embargo, en presencia de
PGI, las mediciones de 1HNMR indican que la velocidad de la reacción de isomerización es varios
órdenes de magnitud mayor que la de la reacción de epimerización. Evidentemente, PGI blinda el
rostro del enodiolado al que H! debe agregarse para formar manosa-6-fosfato.

C. Fosfofructoquinasa: segunda utilización de ATP

En la reacción 3 de la glucólisis, la fosfofructoquinasa (PFK) fosforila F6P para producir fructosa-

1,6-bisfosfato [FBP o F1,6P; anteriormente conocido como fructosa-1,6-difosfato (FDP)]:

Esta reacción es similar a la reacción de la hexoquinasa (reacción 1 en la figura 17-3; sección 17-
2A). PFK cataliza el ataque nucleófilo por el grupo de F6P en el átomo de fósforo electrófilo del
complejo Mg2 + -ATP.

La PFK juega un papel central en el control de la glucólisis porque cataliza una de las reacciones
que determinan la velocidad de la vía. En muchos organismos, la actividad de la PFK aumenta
alostéricamente por varias sustancias, incluido el AMP, y es inhibida alostéricamente por varias
otras sustancias, incluidos el ATP y el citrato. El control de PFK es exquisitamente complejo; el
mecanismo por el cual regula la vía glucolítica se examina en la Sección 17-4F.

D. Aldolasa
La aldolasa cataliza la Reacción 4 de la glucólisis, la escisión de FBP para formar las dos triosas
gliceraldehído-3-fosfato (GAP) y dihidroxiacetona fosfato (DHAP):

Esta reacción es una escisión aldólica (condensación retroaldólica) cuyo mecanismo catalizado por
bases no enzimáticas se muestra en la figura 17-8. Tenga en cuenta que la escisión aldólica entre
C3 y C4 de FBP requiere un carbonilo en C2 y un hidroxilo en C4. Por tanto, la "lógica" de la
Reacción 2 en la vía glucolítica, la isomerización de G6P a F6P, es clara. La escisión aldólica de G6P
habría dado como resultado productos con una longitud de cadena de carbono desigual, mientras
que la escisión aldólica de FBP da como resultado dos compuestos C3 interconvertibles que, por lo
tanto, pueden entrar en una ruta degradativa común. El enolato intermedio en la reacción de
escisión del aldol se estabiliza por resonancia, como se muestra, como resultado del carácter
atrayente de electrones del átomo de oxígeno del carbonilo.

Tenga en cuenta que en este punto de la ruta cambia el sistema de numeración de átomos. Los
átomos 1, 2 y 3 de la glucosa se convierten en los átomos 3, 2 y 1 de DHAP, invirtiendo así el
orden. Los átomos 4, 5 y 6 se convierten en los átomos 1, 2 y 3 de GAP (figura 17-3).

a. Hay dos clases mecanicistas de aldolasas

La escisión del aldol se cataliza estabilizando su intermedio enolato mediante una mayor
deslocalización de electrones.

Hay dos tipos de aldolasas que se clasifican según la química que emplean para estabilizar el
enolato. En las aldolasas de clase I, que se encuentran en animales y plantas, la reacción ocurre de
la siguiente manera (figura 17-9):

Paso 1 Unión del sustrato.

Paso 2 Reacción del grupo carbonilo FBP con el grupo e-amino del sitio activo Lys 229 para formar
un catión iminio, es decir, una base de Schiff protonada.

Paso 3: ruptura del enlace que da como resultado la formación de enamina y la liberación de GAP.
El ion iminio, como vimos en la sección 16-2E, es un mejor grupo captador de electrones que el
átomo de oxígeno del grupo carbonilo precursor.

Por tanto, la catálisis se produce porque el intermedio de enamina (figura 17-9, paso 3) es más
estable que el correspondiente intermedio de enolato de la reacción de escisión aldólica catalizada
por base (figura 17-8, paso 2).

Paso 4 Protonación de la enamina a un catión iminio.

Paso 5 Hidrólisis de este catión iminio para liberar DHAP, con la regeneración de la enzima libre.

La prueba de la formación de la base de Schiff en el Paso 2 se proporcionó al "atrapar" DHAP

marcado con 14C en la enzima al hacerla reaccionar con NaBH4, que reduce las iminas a aminas:

El producto radiactivo se hidrolizó e identificó N6 -B-glyceryl lysine.

Inicialmente se pensó que los residuos de Cys e His actuaban como catalizadores ácidos y básicos
que facilitan las transferencias de protones en la reacción de la aldolasa porque los reactivos
específicos de grupos apropiados inactivan la enzima al reaccionar con estos residuos. Por
ejemplo, la reacción de un residuo Cys específico de aldolasa con ácido yodoacético inactiva la
enzima y da como resultado la acumulación de FBP observada en los primeros estudios de
inhibición de la glucólisis (Sección 17-1A). Sin embargo, la mutagénesis dirigida al sitio a Ala del
residuo de Cys que se cree que está involucrado en la actividad catalítica no produce pérdida de la
función enzimática. La modificación de este residuo de Cys aparentemente previene los cambios
conformacionales requeridos para la unión productiva del sustrato.

Una estructura de rayos X temprana de la aldolasa sugirió que una cadena lateral de Tyr estaba
posicionada para actuar como el catalizador ácido-base del sitio activo y que el His era en cambio
necesario para el mantenimiento de la orientación catalíticamente activa de Tyr. Un nuevo
examen de los datos de rayos X provocó otra modificación más del mecanismo. El Tyr
originalmente visto en el sitio activo ha cambiado de posición en este nuevo análisis de modo que
está fuera del alcance del sitio activo. Asp 33 y Lys 229 parecen actuar ahora como catalizadores
ácido-base.

Estos residuos se conservan evolutivamente y su mutagénesis elimina la actividad enzimática. Este

es un excelente ejemplo de la precaución que se debe tener en la interpretación de la
modificación química y los datos estructurales, y el poder de la mutagénesis dirigida al sitio en el
estudio de los mecanismos enzimáticos (aunque consulte la Sección 15-3Ba).

Las aldolasas de clase II, que se encuentran en hongos, algas y algunas bacterias, no forman una
base de Schiff con el sustrato. Más bien, un catión divalente, generalmente Zn2 $ o Fe2 $, polariza
el oxígeno carbonilo del sustrato para estabilizar el intermedio enolato de la reacción (figura 16-
12d):

segundo. ¿Por qué dos clases de aldolasa?

Dado que la glucólisis supuestamente surgió muy temprano en la historia evolutiva, la existencia
de dos clases de aldolasa es inesperada. Originalmente se había postulado que dado que las
aldolasas de Clase I se encuentran en organismos superiores, las aldolasas de Clase II deben ser la
forma de enzima más primitiva, es decir, menos capaces metabólicamente que las enzimas de
Clase I.

Sin embargo, el descubrimiento de que algunos organismos expresan simultáneamente ambas

clases de aldolasa sugiere que ambas clases de enzimas son evolutivamente antiguas e igualmente
hábiles para llevar a cabo sus funciones metabólicas. Por tanto, la expresión de ambas clases de
aldolasa en algunos organismos probablemente representa una antigua redundancia metabólica
que la evolución ha eliminado en la mayoría de los organismos contemporáneos.

Cualquiera que sea la razón de la aparición de dos clases de aldolasas, el hecho de que las
aldolasas de Clase II no se presenten en mamíferos las convierte en un objetivo atractivo en el
desarrollo de fármacos antibacterianos.

C. La aldolasa es estereoespecífica

La reacción de la aldolasa proporciona otro ejemplo de la extraordinaria estereoespecificidad de

las enzimas. En la condensación aldólica no enzimática para formar hexosa-1,6-bisfosfato a partir
de DHAP y GAP, hay cuatro productos posibles dependiendo de si se elimina el hidrógeno pro-R o
pro-S en C3 de DHAP y si el carbanión resultante ataca a GAP en su cara o en su cara:

En la condensación enzimática aldólica (figura 17-9 al revés), la formación de carbaniones a partir

de la enzima-ion iminio DHAP (figura 17-9, paso 4 al revés) ocurre con la eliminación sólo del
hidrógeno pro-S. El ataque de este carbanión ocurre solo en la cara si del grupo carbonilo GAP
unido a enzima, de modo que solo se forma FBP (Fig. 17-9, Paso 3 al revés).

E. Triosa fosfato isomerasa

Sólo uno de los productos de la reacción de escisión aldólica, GAP, continúa a lo largo de la vía
glucolítica (fig. 17-3). Sin embargo, DHAP y GAP son isómeros de cetosa-aldosa al igual que F6P y
G6P. Por lo tanto, la interconversión de GAP y DHAP probablemente se produce a través de un
enodiol o un intermedio de enodiolato en analogía con la reacción de fosfoglucosa isomerasa (fig.
17-6). La triosafosfato isomerasa (TIM o TPI; figuras 8-19b y 8-52) cataliza este proceso en la
Reacción 5 de la glucólisis, la reacción final de la Etapa I:

El apoyo para este esquema de reacción proviene del uso de los análogos del estado de transición
fosfoglicohidroxamato y 2-fosfoglicolato, compuestos estables cuyas estructuras geométricas se
asemejan a las del enediol o intermedio de enediolato propuesto, ya que las enzimas catalizan las
reacciones al unir el complejo del estado de transición más fuertemente que el sustrato Sección
15-1F), el fosfoglicohidroxamato y el 2-fosfoglicolato deben unirse más estrechamente al TIM que
el sustrato. De hecho, el fosfoglicohidroxamato y el 2-fosfoglicolato se unen 155 y 100 veces más
firmemente a TIM que GAP o DHAP.

a. Glu 165 funciones como base general

La dependencia del pH de la reacción TIM es una curva en forma de campana con pK de 6.5 y 9.5.
La similitud de estos pK con las cantidades correspondientes de la reacción de fosfoglucosa
isomerasa sugiere la participación tanto de un ácido como de una base en la reacción TIM
también. Sin embargo, los estudios de pH solos, como hemos visto, son difíciles de interpretar en
términos de residuos de aminoácidos específicos, ya que el entorno del sitio activo puede alterar
el pK de un grupo ácido o básico.

Se han empleado reactivos de marcado de afinidad en un esfuerzo por identificar la base en el sitio
activo de TIM. Tanto el fosfato de bromohidroxiacetona como el fosfato de glicidol inactivan TIM
al formar ésteres de Glu 165, cuyo grupo carboxilato, según indican los estudios de rayos X, está
idealmente situado para extraer el protón C2 del sustrato (catálisis básica general). De hecho, el
reemplazo mutagénico de Glu 165 por Asp, que según los estudios de rayos X retira el grupo
carboxilato solo ~ 1 Å más lejos del sustrato que su posición en la enzima de tipo salvaje, reduce el
poder catalítico de TIM ~ 1000 veces. Tenga en cuenta que el pK de Glu 165 se altera
drásticamente desde el valor 4.1 del aminoácido libre al valor 6.5 observado. Esto proporciona
otro ejemplo sorprendente del efecto del medio ambiente sobre las propiedades de las cadenas
laterales de aminoácidos.

segundo. La reacción de TIM probablemente ocurre vía concertada Catálisis general ácido-base
que involucra enlaces de hidrógeno de baja barrera
La estructura de rayos X de la levadura TIM en un complejo con fosfoglicohidroxamato indica que
His 95 está unido por enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, está correctamente posicionado para
protonar el átomo de oxígeno del carbonilo de GAP (catálisis ácida general) :

Sin embargo, los estudios de RMN indican que His 95 está en su forma de imidazol neutra en lugar
de en su forma de imidazolio protonado. ¿Cómo puede un grupo imidazol, que tiene un pK muy
básico de ~ 14, protonar un átomo de oxígeno de carbonilo que, cuando está protonado, tiene un
pK muy ácido de # 0? Del mismo modo, ¿cómo puede el grupo carboxilato de Glu 165 (pK 6.5)
extraer el protón C2 de GAP (pK ~ 17)? Una respuesta plausible es que estos cambios de protones
se ven facilitados por la formación de enlaces de hidrógeno de barrera baja (LBHB). Estas
asociaciones inusualmente fuertes (+40 a +80 kJ! Mol! 1 vs! 12 a! 30 kJ! Mol! 1 para enlaces de
hidrógeno normales), como hemos visto en el caso de la tríada catalítica de serina proteasa
(Sección 15-3Dd ), se forman cuando los pK de los grupos donador y aceptor de enlaces de
hidrógeno son casi iguales. Pueden contribuir de forma importante a la mejora de la velocidad si
se forman únicamente en el estado de transición de una reacción catalizada enzimáticamente.

Al convertir GAP en el intermedio de enodiol (o enodiolato) (figura 17-10, izquierda), ¡el pK de la

forma protonada de su oxígeno carbonilo, que se convierte en un grupo hidroxilo, aumenta a! 14,
que se asemeja mucho al de His neutral 95. El LBHB resultante entre este grupo hidroxilo y His 95
permite que la cadena lateral del imidazol neutro protone el átomo de oxígeno. Asimismo, a
medida que se protona el oxígeno del carbonilo, el pK del protón disminuye a! 7, cercano al pK del
carboxilato de Glu 165. Por lo tanto, parece que la reacción se produce mediante la abstracción
simultánea de protones por Glu 165 y la protonación por His 95 (catálisis ácido-base general
concertada). Se cree que los LBHB que se postulan para formarse en el estado de transición, pero
no en el complejo de Michaelis, entre Glu 165 y C2¬H y entre His 95 y el átomo de oxígeno del
carbonilo, proporcionan algo de la estabilización del estado de transición necesaria para catalizar
la reacción. Se cree que la cadena lateral cargada positivamente de Lys 12, que probablemente es
responsable del 9.5 pK observado en el perfil de velocidad de pH de TIM, estabiliza
electrostáticamente la estado de transición cargado negativamente. La conversión del intermedio
de enediol (ato) en DHAP también se ve facilitada por la formación de LBHB en estado de
transición (fig. 17-10, derecha). De hecho, en la estructura de rayos X de alta resolución (1,2 Å) de
TIM en complejo con DHAP, determinada por Ann McDermott y Liang Tong, el enlace de
hidrógeno entre His 95 y O2 de DHAP tiene una distancia inusualmente corta de 2,6 Å. Además, un
átomo de oxígeno carboxilato de Glu 165 forma contactos extraordinariamente estrechos de! 3,0
Å con C1 y C2 de DHAP.

C. Un bucle flexible une y protege preferentemente el Enediol Intermedio

La comparación de la estructura de rayos X del complejo TIM-fosfoglicohidroxamato con la del TIM

solo revela que un bucle de 10 residuos, que está cerrado sobre el sitio activo en el complejo
enzima-sustrato, se invierte en el sitio activo desocupado como una tapa con bisagras, un
movimiento que implica cambios de cadena principal de $ 7 Å (fig. 17-11). Un segmento de cuatro
residuos de este bucle forma un enlace de hidrógeno con el grupo fosfato del sustrato. La escisión
mutagénica de estos cuatro residuos no distorsiona significativamente la proteína ni altera mucho
la unión del sustrato. No obstante, el poder catalítico de la enzima mutante se reduce 105 veces y
solo se une débilmente al fosfoglicohidroxamato.
Evidentemente, el circuito cerrado estabiliza preferentemente el estado de transición similar al
enodiol de la reacción enzimática.

La conformación de circuito cerrado en la reacción TIM proporciona un ejemplo sorprendente del

control estereoelectrónico que las enzimas pueden ejercer sobre una reacción (Sección 15-1Eb).
En solución, el intermedio de enediol se degrada fácilmente con la eliminación del fosfato en C3
para formar el compuesto tóxico metilglioxal (fig. 17-12a). En la superficie de la enzima,

sin embargo, esta reacción se evita porque el grupo fosfato está sostenido por el asa flexible en el
plano del enodiol, una posición que no favorece la eliminación del fosfato. Para que ocurra esta
eliminación, el enlace al grupo fosfato debe estar, como se muestra en la figura 17-12a, en el
plano perpendicular al del enodiol. Esto se debe a que, si se eliminara el grupo fosfato mientras
este enlace estaba en el plano del enodiol como se muestra en el diagrama de la figura 17-12b, el
grupo CH2 del producto enólico resultante se retorcería 90 ° fuera del plano del enol. resto de la
molécula. Tal conformación es energéticamente prohibitiva porque previene la formación del
doble enlace del enol al eliminar la superposición entre los orbitales p de su componente. En la
enzima mutante que carece del asa flexible, el enodiol puede escapar:! 85% del intermedio de
enodiol se libera en una solución, donde se descompone rápidamente en metilglioxal y Pi. Por lo
tanto, el cierre del asa flexible también asegura que el sustrato se transforme eficientemente en
producto.

Sobre la base de las estructuras de rayos X anteriores, se había asumido ampliamente que la unión
del sustrato a TIM está activada por ligando, es decir, induce el cierre del bucle. Sin embargo, si
este fuera el caso, la reversibilidad de la reacción TIM y el parecido químico de su reactivo y
producto (GAP y DHAP) dificultan la racionalización de cómo se podría liberar el producto. Sin
embargo, las mediciones de RMN de John Williams y McDermott revelan que, de hecho, el
movimiento del bucle todavía se produce cuando TIM se une al glicerol-3-fosfato (un análogo del
sustrato) o al 2-fosfoglicolato (un análogo del estado de transición) y es suficientemente rápido
(en una escala de tiempo de 100! s) para tener en cuenta la velocidad de reacción catalítica (un
tiempo de rotación de 230! s). Este es un claro ejemplo de cómo la información complementaria
proporcionada por los métodos de rayos X y RMN ha

arrojó importantes conocimientos sobre un mecanismo enzimático que ninguna técnica por sí sola
podría haber proporcionado.

re. TIM es una enzima perfecta

TIM, como demostró Jeremy Knowles, ha logrado la perfección catalítica en el sentido de que la
velocidad de reacción bimolecular entre la enzima y el sustrato está controlada por difusión; es
decir, la formación del producto ocurre tan rápidamente como la enzima y el sustrato pueden
colisionar en solución, de modo que cualquier aumento en la eficiencia catalítica de TIM no
aumentaría la velocidad de reacción (Sección 14-2Bb). Debido a la alta eficiencia de
interconversión de GAP y DHAP, estos dos metabolitos se mantienen en equilibrio: K "[GAP] /
[DHAP]" 4,73 + 10 $ 2; es decir, [DHAP] %% [GAP] en equilibrio. Sin embargo, a medida que se
utiliza GAP en la siguiente reacción de la vía glucolítica, se convierte más DHAP en GAP, de modo
que estos compuestos mantienen su relación de equilibrio. Por tanto, una vía común explica el
metabolismo de ambos productos de la reacción de la aldolasa.
Hagamos ahora un balance de dónde nos encontramos en nuestros viajes por la vía glucolítica. En
esta etapa, la glucosa, que se ha transformado en dos GAP, ha completado la etapa preparatoria
de la glucólisis. Este proceso ha requerido el gasto de dos ATP. Sin embargo, esta inversión ha
resultado en la conversión de una glucosa en dos unidades C3, cada una de las cuales tiene un
grupo fosforilo que, con un poco de arte químico, puede convertirse en un compuesto de "alta
energía" (Sección 16-4Ba) cuya energía libre de hidrólisis se puede acoplar a la síntesis de ATP.
Esta inversión de energía se compensa doblemente en la etapa final de la glucólisis en la que las
dos unidades de C3 fosforiladas se transforman en dos piruvatos con la síntesis acoplada de cuatro
ATP por glucosa.

F. Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa:

La primera reacción de formación intermedia de “alta energía” 6 de la glucólisis implica la

oxidación y fosforilación de GAP por NAD. y Pi catalizado por gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH;

Figs. 8-45 y 8-53b):

Este es el primer ejemplo del arte químico aludido.

por arriba. En esta reacción, la oxidación del aldehído, una reacción exergónica, impulsa la síntesis
del fosfato de acilo. 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG; anteriormente llamado 1,3-difosfoglicerato).
Recuerde que los fosfatos de acilo son compuestos con alto potencial de transferencia de grupos
fosfato (Sección 16-4Ba).

a. Estudios mecanicistas

Varios experimentos enzimológicos clave han contribuido a dilucidar el mecanismo de reacción de

GAPDH (fig. 17-13):

1. GAPDH se inactiva por alquilación con cantidades estequiométricas de yodoacetato. La

presencia de carboximetilcisteína en el hidrolizado de la enzima alquilada resultante (fig. 17-13a)
sugiere que GAPDH tiene un grupo sulfhidrilo Cys de sitio activo.

2. ¡GAPDH transfiere cuantitativamente 3H de C1 de GAP a NAD! (Fig. 17-13b), por lo que se

establece que esta reacción se produce mediante transferencia directa de hidruros.

3. GAPDH cataliza el intercambio de 32P entre [32P] Pi y el producto análogo acetilfosfato (fig. 17-
13c).

Tales reacciones de intercambio de isótopos son indicativas de un intermedio de acil-enzima

(Sección 14-5D).

David Trentham ha propuesto un mecanismo para GAPDH basado en esta información y los
resultados de estudios cinéticos (Figura 17-14):

Paso 1 GAP se une a la enzima.

Paso 2 El grupo sulfhidrilo esencial, que actúa como nucleófilo, ataca al aldehído para formar un
tiohemiacetal.
Paso 3 El tiohemiacetal se oxida a un tioéster de acilo por transferencia directa de un hidruro a
NAD! Este intermedio, que ha sido aislado, tiene un alto potencial de transferencia de [Link]
energía de oxidación del aldehído no se ha disipado pero se ha conservado a través de la síntesis.
del tioéster y la reducción de NAD! a NADH.

Paso 4 ¡Otra molécula de NAD! reemplaza a NADH.

Paso 5 El intermedio tioéster sufre un ataque nucleofílico por Pi para regenerar la enzima libre y
formar 1,3-BPG. Este anhídrido mixto de "alta energía" genera ATP a partir de ADP en la siguiente
reacción de glucólisis.

G. Fosfoglicerato quinasa: primera generación de ATP

La reacción 7 de la vía glucolítica da como resultado la primera formación de ATP junto con 3-
fosfoglicerato (3PG) en una reacción catalizada por la fosfoglicerato quinasa (PGK):

(Nota: el nombre "quinasa" se le da a cualquier enzima que transfiera un grupo fosforilo entre el
ATP y un metabolito. No hay nada implícito en cuanto a la dirección exergónica de la
transferencia).

Herman Watson determinó la estructura de rayos X de la levadura PGK en complejo con Mg2! –
ATP y 3PG, su complejo enzima-producto (fig. 17-15a). Nótese su llamativa apariencia bilobular y
la proximidad entre el grupo fosfato del ATP y uno de los átomos de oxígeno carboxilato del 3PG.
El 3PG y el Mg-ATP son respectivamente unidos a los dominios N- y C-terminales de PGK.

La estructura de rayos X de PGK del termófilo Thermotoga maritima en complejo con 3PG y el
análogo de ATP no hidrolizable AMPPNP (ATP con el átomo de O puenteando sus grupos # y
fosfato reemplazados por un grupo NH) revela que sus dos dominios han oscilado relativamente a
los de la levadura PGK 50% idéntica (Fig.15b). Esto forma el sitio catalítico y permite que los
sustratos reaccionen en un ambiente libre de agua, como ocurre con la hexoquinasa (Sección 17-
2Aa).

La figura 17-16 indica un mecanismo de reacción para PGK que es consistente con su cinética
secuencial observada. El oxígeno fosforílico terminal del ADP ataca nucleofílicamente al átomo de
fósforo C1 de 1,3-BPG para formar el producto de reacción.

Aunque la reacción GAPDH es endergónica, la naturaleza fuertemente exergónica de la

transferencia de un grupo fosforilo de 1,3-BPG a ADP hace que la síntesis general de NADH y ATP a
partir de GAP, Pi, NAD !, y ADP favorable.

H. Fosfoglicerato mutasa

En la Reacción 8 de la glucólisis, el 3PG se convierte en 2-fosfoglicerato (2PG) por la fosfoglicerato

mutasa (PGM):

Una mutasa cataliza la transferencia de un grupo funcional de una posición a otra en una
molécula. Esta reacción es una preparación necesaria para la siguiente reacción en la glucólisis,
que genera un compuesto de fosforilo de "alta energía" para su uso en la síntesis de ATP.

a. Mecanismo de reacción de PGM

A primera vista, la reacción catalizada por PGM parece ser una simple transferencia de fosforilo
intramolecular. Sin embargo, este no es el caso. La enzima activa tiene un grupo fosforilo en su
sitio activo, que transfiere al sustrato para formar un intermedio bisfosfato. Este intermedio luego
refosforila la enzima para formar el producto y regenerar la fosfoenzima activa. Los siguientes
datos experimentales permitieron dilucidar la enzima enzimática de PGM.

mecanismo:

1. Se requieren cantidades catalíticas de 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG; anteriormente conocido

como 2,3-difosfoglicerato) para la actividad enzimática; es decir, 2,3-BPG actúa como cebador de
reacción.

2. La incubación de la enzima con cantidades catalíticas de 2,3-BPG marcado con 32P produce una
enzima marcada con 32P. Zelda Rose demostró que esto era el resultado de la fosforilación de un
residuo de His:

3. La estructura de rayos X de la enzima muestra His en el sitio activo (fig. 17-17). En la enzima
activa, His 8 está fosforilado.

Estos datos concuerdan con un mecanismo en el que la enzima activa contiene un residuo de
fosfo-His en el sitio activo (fig. 17-18):

Paso 1 3PG se une a la fosfoenzima en la que His 8 está fosforilado.

Paso 2 ¡Este grupo fosforilo se transfiere al sustrato, dando como resultado un 2,3-BPG
intermedio! complejo enzimático.

Pasos 3 y 4 El complejo se descompone para formar el producto 2PG con regeneración de la

fosfoenzima.

Por lo tanto, el grupo fosforilo en 3PG termina en el C2 del siguiente 3PG en reaccionar.

En ocasiones, el 2,3-BPG se disocia de la enzima (figura 17-18; paso 5), dejándola en forma
inactiva. Por lo tanto, siempre deben estar disponibles trazas de 2,3-BPG para regenerar la
fosfoenzima activa mediante la reacción inversa.

El 2,3-BPG se une específicamente a la desoxihemoglobina y, por lo tanto, altera la afinidad por el

oxígeno de la hemoglobina (sección 10-1D). La concentración de 2,3-BPG en eritrocitos es mucho
más alta (! 5 mM) que las trazas requeridas para su uso como cebador de PGM. Los eritrocitos
sintetizan y degradan el 2,3-BPG mediante un desvío de la vía glucolítica, que se muestra en el
diagrama de la figura 17-19. La bisfosfoglicerato mutasa cataliza la transferencia de un grupo
fosforilo de C1 a C2 del 1,3-BPG. El 2,3-BPG resultante se hidroliza a 3PG por la 2,3-
bisfosfoglicerato fosfatasa. fLa tasa de glucólisis afecta la afinidad por el oxígeno de la
hemoglobina a través de la mediación del 2,3-BPG. En consecuencia, los defectos hereditarios de
la glucólisis en los eritrocitos alteran la capacidad de la sangre para transportar oxígeno (fig. 17-
20). Por ejemplo, la concentración de intermedios glucolíticos en eritrocitos deficientes en
hexoquinasa es menor de lo normal porque la hexoquinasa cataliza la primera reacción de
glucólisis. Esto da como resultado una disminución de la concentración de 2,3-BPG y, por lo tanto,
una mayor afinidad por el oxígeno de la hemoglobina. Por el contrario, la deficiencia de piruvato
quinasa disminuye la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno a través del aumento de 2,3-BPG
resultante del bloqueo de la última reacción en la glucólisis. Por lo tanto, aunque los eritrocitos,
que carecen de núcleos y otros orgánulos, tienen un metabolismo mínimo, este metabolismo es
fisiológicamente significativo.

I. Enolase: segundo "de alta energía"

Formación intermedia En la Reacción 9 de la glucólisis, el 2PG se deshidrata a fosfoenolpiruvato

(PEP) en una reacción catalizada por enolasa:

La enzima forma un complejo con un catión divalente como Mg2 + antes de que se una al sustrato.
Luego, un segundo ion metálico divalente se une a la enzima. Como se menciona en la Sección 17-
1A, el ion fluoruro inhibe la glucólisis, lo que resulta en la acumulación de 2PG y 3PG. Lo hace
inhibiendo fuertemente la enolasa en presencia de Pi. ¡F “y Pi forman un complejo fuertemente
unido con el Mg2! en el sitio activo de la enzima, bloqueando la unión del sustrato y por lo tanto
inactivando la enzima. El sustrato de Enolasa, 2PG, por lo tanto, se acumula y, al hacerlo, se
equilibra con 3PG por PGM.

a. Mecanismo catalítico de la enolasa

La deshidratación (eliminación de H2O) catalizada por enolasa puede ocurrir de una de estas tres
formas (figura 16-9a): (1) El grupo ¬OH en C3 puede salir primero, generando una carbonatación
en C3; (2) el protón C2 puede salir primero, generando un carbanión en C2; o (3) la reacción puede
concertarse. Los estudios de intercambio de isótopos de Paul Boyer demostraron que el protón C2
de 2PG se intercambia con disolvente 12 veces más rápido que la tasa de formación de PEP. Sin
embargo, el oxígeno C3 se intercambia con el disolvente a una velocidad aproximadamente
equivalente a la velocidad de reacción general, lo que sugiere el siguiente mecanismo (figura 17-
21):

Paso 1 Formación rápida de carbaniones en C2 facilitada por una base general de la enzima. El
protón extraído puede intercambiarse fácilmente con el solvente, lo que explica su rápido tipo de
cambio observado.

Paso 2 Eliminación del grupo que limita la velocidad en C3. Esto es consistente con la lenta tasa de
intercambio de este grupo hidroxilo con solvente.

La reacción enolasa (fig. 17-21) es de interés mecanicista porque implica la abstracción del protón
decididamente no ácido en C2 (pK # 30), seguida de la eliminación de un OH! ion, que es un grupo
saliente pobre. La estructura de rayos X de la enolasa de levadura en un complejo con dos iones
Mg2 "y una mezcla de equilibrio de 2PG y PEP (sustrato y producto de enolasa), determinada por
George Reed e Ivan Rayment, revela que la enolasa se une a 2PG en un complejo intrincado que
involucra a ambos Mg2". iones. Los estudios mutagénicos y enzimológicos indican que la reacción
involucra a la cadena lateral Lys 345 funcionando como una base general.

y la cadena lateral Glu 211 funcionando como un ácido general.

Se cree que Lys 396 y los dos iones Mg2 "estabilizan la carga negativa aumentada que se desarrolla
en el ion carboxilato en el intermedio carbanión deslocalizado.
J. Piruvato Quinasa: Segunda Generación de ATP En la Reacción 10 de la glucólisis, su reacción
final, la piruvato quinasa (PK) acopla la energía libre de la hidrólisis de PEP a la síntesis de ATP para
formar piruvato:

a. Mecanismo catalítico de la PK La reacción de la PK, que requiere la participación de cationes

monovalentes (K!) Y divalentes (Mg2!), Se produce de la siguiente manera (fig. 17-22):

Paso 1 El oxígeno fosforílico del ADP ataca nucleófilamente al átomo de fósforo de la PEP,
desplazando así al enolpiruvato y formando ATP. Esta reacción conserva la energía libre de la
hidrólisis de la PEP.

Paso 2 El enolpiruvato se convierte en piruvato. Esta tautomerización enol-ceto es

suficientemente exergónica para impulsar la síntesis endergónica acoplada de ATP (Sección 16-
4Ba). Ahora podemos ver la "lógica" de la reacción enolasa. ¡La energía libre estándar de hidrólisis
de 2PG (# G ° ¿) es de solo $ 17,6 kJ! mol $ 1

, que es insuficiente para impulsar la síntesis de ATP (# G ° ¿% 30.5 kJ! mol $ 1 para la síntesis de
ATP a partir de ADP y Pi). La deshidratación de 2PG da como resultado la formación de un
compuesto de "alta energía" capaz de tal síntesis [el ¡La energía libre estándar de hidrólisis de PEP
es de $ 61,9 kJ! mol $ 1 (figura 16-25)]. En otras palabras, PEP es un compuesto de “alta energía”,
2PG no lo es.

3 FERMENTACIÓN: EL DESTINO ANAERÓBICO DE PYRUVATE

Para que continúe la glucólisis, el NAD !, que las células tienen en cantidades limitadas, debe
reciclarse después de su reducción a NADH por GAPDH (fig. 17-3; Reacción 6). En presencia de
oxígeno, los equivalentes reductores de NADH pasan a las mitocondrias para su reoxidación
(capítulo 22). En condiciones anaeróbicas, por otro lado, el NAD! se repone mediante la reducción
de piruvato en una extensión de la vía glucolítica. ¡Dos procesos para la reposición anaeróbica de
NAD! son la fermentación homoláctica y alcohólica, que se producen en el músculo y la levadura,
respectivamente.

A. Fermentación homoláctica

En el músculo, particularmente durante una actividad vigorosa cuando la demanda de ATP es alta
y el oxígeno se ha agotado, la lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la oxidación de NADH por el
piruvato para producir NAD. y lactato. Esta reacción a menudo se clasifica como Reacción 11 de la
glucólisis:

LDH, al igual que otras enzimas que requieren NAD!, Cataliza su reacción con absoluta
estereoespecificidad: el hidrógeno pro-R (lado A) en C4 de NADH se transfiere
estereoespecíficamente a la superficie del piruvato en C2 para formar L- (o S -) lactato.

¡Esto regenera NAD! por participar en la reacción de GAPDH. La transferencia de hidruro a

piruvato es de la misma cara del anillo de nicotinamida que la del acetaldehído en la reacción de
alcohol deshidrogenasa (Sección 13-2A) pero de la cara opuesta (si) del anillo de nicotinamida a
GAP en la reacción de GAPDH ( Sección 17-2F).
Los mamíferos tienen dos tipos diferentes de subunidades de LDH, el tipo M y el tipo H, que juntos
forman cinco isoenzimas tetraméricas: M4, M3H, M2H2, MH3 y H4. Aunque estas formas híbridas
ocurren en la mayoría de los tejidos, la subunidad de tipo H predomina en los tejidos aeróbicos
como el músculo cardíaco, mientras que la subunidad de tipo M predomina en los tejidos que
están sujetos a condiciones anaeróbicas como el músculo esquelético y el hígado. La LDH H4 tiene
un KM bajo para el piruvato y es inhibida alostéricamente por niveles altos de este metabolito,
mientras que la isoenzima M4 tiene un KM más alto para el piruvato y no es inhibida por él. Las
otras isoenzimas tienen propiedades intermedias que varían con la proporción de sus dos. tipos de
subunidades. Por tanto, se ha propuesto, aunque no sin desacuerdo, que la LDH de tipo H está
mejor adaptada para funcionar en la oxidación de lactato a piruvato, mientras que la LDH de tipo
M es más adecuada para catalizar la reacción inversa.

¡La estructura de rayos X de la LDH H4 porcina en complejo con S-lac-NAD! (un análogo de
bisustrato en el que el átomo C3 de lactato está unido covalentemente al átomo C5 de
nicotinamida de NAD + a través de un grupo CH2) fue determinado por Michael Rossmann (Fig.
Fig. 8-54a). El átomo de lactato O2, su oxígeno hidroxílico, está unido por enlaces de hidrógeno a
las cadenas laterales de Arg 109 y His 195, mientras que el grupo lactato carboxilo en C1 está
doblemente unido por enlaces de hidrógeno a la cadena lateral de Arg 171. Sobre la base de esta
estructura y extensa evidencia enzimológica, Rossmann propuso lo siguiente

mecanismo de reducción de piruvato por LDH (Fig. 17-24):

¡El hidruro pro-R se transfiere del C4 del anillo de nicotianamina de NADH al C2 del piruvato con la
transferencia concomitante de un protón del resto imidazolio de His 195 al piruvato O2,
produciendo así NAD! y lactato. La transferencia de protones se ve facilitada por interacciones
repulsivas con la cadena lateral cargada positivamente asociada de Arg.

109. Estas interacciones también sirven para orientar adecuadamente el piruvato, al igual que el
puente de sal que forma el grupo carboxilo de piruvato con la cadena lateral de Arg 171.

El proceso general de glucólisis anaeróbica en el músculo se puede representar:

Gran parte del lactato, el producto final de la glucólisis anaeróbica, se exporta desde la célula
muscular a través de la sangre al hígado, donde se reconvierte en glucosa (sección 23-1C).

Contrariamente a la creencia generalizada, no es la acumulación de lactato en el músculo per se lo

que causa fatiga y dolor muscular, sino la acumulación de ácido generado glicolíticamente (los
músculos pueden mantener su carga de trabajo en presencia de altas concentraciones de lactato si
el pH se mantiene constante, pero vea la Sección 27-2B). De hecho, es bien sabido entre los
cazadores que la carne de un animal que se ha agotado antes de ser sacrificado tiene un sabor
amargo. Este es el resultado de la acumulación de ácido láctico en los músculos.

B. Fermentación alcohólica

En condiciones anaeróbicas en levadura, ¡NAD! se regenera de una manera que ha sido de

importancia para la humanidad durante miles de años: la conversión de piruvato en etanol y CO2.
El etanol es, por supuesto, el ingrediente activo del vino y las bebidas espirituosas; El CO2 así
producido fermenta el pan. Sin embargo, desde el punto de vista de la levadura, la fermentación
alcohólica tiene un beneficio práctico que la fermentación homoláctica no puede proporcionar: la
levadura emplea etanol como un tipo de antibiótico para eliminar los organismos competidores.
Esto se debe a que la levadura puede crecer en concentraciones de etanol "al 12% (2,5 M),
mientras que pocos otros organismos pueden sobrevivir en" etanol al 5% (recuerde que el etanol
es un antiséptico ampliamente utilizado).

a. TPP es un cofactor esencial de piruvato descarboxilasa

La levadura produce etanol y CO2 mediante dos reacciones consecutivas (fig. 17-25). La primera
reacción es la descarboxilación del piruvato para formar acetaldehído y CO2 catalizada por la
piruvato descarboxilasa (PDC; una enzima que no está presente en los animales). PDC contiene la
coenzima pirofosfato de tiamina [TPP; Fig. 17-26; también llamado difosfato de tiamina (ThDP)], al
que se une de forma estrecha pero no covalente. La coenzima se emplea porque la
descarboxilación de un cetoácido # como el piruvato requiere la acumulación de carga negativa en
el átomo de carbono del carbonilo en el estado de transición, una situación inestable: este estado
de transición puede estabilizarse mediante la deslocalización de la carga negativa en desarrollo en
una adecuado "sumidero de electrones". Los residuos de aminoácidos de las proteínas funcionan
mal en esta capacidad, pero TPP lo hace fácilmente.

El extremo "comercial" de TPP es el anillo de tiazolio (figura 17-26). Su grupo es relativamente

ácido debido al átomo de nitrógeno cuaternario cargado positivamente adyacente, que estabiliza
electrostáticamente el carbanión formado en la disociación del protón. Este carbanión dipolar (o
ilido) es la forma activa de la coenzima. El mecanismo de la catálisis PDC es el siguiente (figura 17-
27):

Paso 1 Ataque nucleofílico por la forma ilida de TPP en

el carbono carbonilo del piruvato para formar un aducto covalente.

Paso 2 Salida de CO2 para generar un aducto de carbanión estabilizado por resonancia en el que el
anillo de tiazolio de la coenzima actúa como sumidero de electrones.

Paso 3 Protonación del carbanión.

Paso 4 Eliminación del ilido TPP para formar acetaldehído y regenerar la enzima activa.

Este mecanismo ha sido corroborado por el aislamiento de el intermedio pirofosfato de

hidroxietiltiamina (fig. 17-27).

La estructura de rayos X de PDC en complejo con TPP (figura 17-28), que fue determinada por
William Furey y Martin Sax, ha sugerido un papel del anillo de aminopirimidina de TPP en la
formación del ilido activo. La formación de Ylid requiere una base para eliminar el protón C2. Sin
embargo, PDC no tiene una cadena lateral básica que esté correctamente posicionada para
hacerlo. El grupo amino del anillo de aminopirimidina de TPP unido a enzima está
convenientemente posicionado para aceptar este protón; sin embargo, su pK es demasiado bajo
para hacerlo de manera eficiente y uno de sus protones choca estéricamente con el protón C2. Por
tanto, se propone que la aminopirimidina se convierta en su forma imino tautomérica en la
superficie de la enzima en una reacción que implica la donación de protones por Glu 51 (fig. 17-
29). La imina, a su vez, acepta un protón de C2, formando así el ilido, con tautomerización de
nuevo a la forma amino. La participación de N1¿ y el grupo 4¿-amino de la aminopirimidina está
respaldada por experimentos que muestran que los análogos de TPP que carecen de cualquiera de
estas funcionalidades son catalíticamente inactivos.

Los experimentos de intercambio H / D seguidos por análisis de 1HNMR de los productos de

intercambio indican que cuando TPP se une a PDC en complejo con el análogo del sustrato
piruvamida (CH3 + CO + CO + NH2), su tasa de intercambio para formar la especie activa (ilid) es
mucho mayor (! 6 "102 s # 1) que la tasa catalítica de la enzima (kcat $ 10 s # 1). Además, la
mutación de Glu 51 de PDC a Gln reduce la tasa de cambio de H / Dme a 1,7 s # 1, por lo que
apoyando la función postulada de Glu 51 de donar un protón al N1¿ del anillo de aminopiridina de
TPP.

b. El beriberi es una enfermedad por deficiencia de tiamina

La capacidad del anillo de tiazolio de TPP para agregar grupos carbonilo y actuar como un
"sumidero de electrones" lo convierte en la coenzima más utilizada en las descarboxilaciones de!
El TPP también participa en reacciones de descarboxilación que encontraremos en otras vías
metabólicas. En consecuencia, la tiamina (vitamina B1), que no es sintetizada ni almacenada en
cantidades significativas por los tejidos de la mayoría de los vertebrados, es necesaria en sus
dietas. Su deficiencia en humanos resulta en una condición finalmente fatal conocida como
beriberi (cingalés para debilidad) que se caracteriza por alteraciones neurológicas que causan
dolor, parálisis y atrofia (atrofia) de las extremidades, y / o insuficiencia cardíaca que resulta en
edema (la acumulación de líquido). en tejidos y cavidades corporales). El beriberi fue
particularmente frecuente a fines del siglo XIX y principios del XX en las áreas consumidoras de
arroz de Asia después de la introducción de las máquinas de molienda accionadas por vapor que
pulían los granos de arroz para eliminar sus capas exteriores gruesas pero que contenían tiamina
(los procedimientos de molienda utilizados anteriormente fueron menos eficientes y por lo tanto
dejaron suficiente tiamina en los granos). Sancochar el arroz antes de molerlo, un proceso común
en la India, hace que los granos de arroz absorban los nutrientes de sus capas externas,
disminuyendo así la incidencia de beriberi. Una vez que se reconoció la deficiencia de tiamina
como la causa del beriberi, se instituyeron procedimientos de enriquecimiento para que hoy en
día haya dejado de ser un problema, excepto en las áreas que sufren hambruna.

C. Energética de la fermentación

La termodinámica nos permite diseccionar el proceso de fermentación en sus partes componentes

y dar cuenta de los cambios de energía libre que ocurren. Esto nos permite calcular la eficiencia
con la que se utiliza la energía libre de degradación de la glucosa en la síntesis de ATP. La reacción
general de la fermentación homoláctica es ("G ° ¿se calcula a partir de los datos de la Tabla 3-4
usando las ecuaciones [3.19] y [3.21] adaptadas para iones 2H!). Para la fermentación alcohólica,
la reacción general es Cada uno de estos reacciones se acopla a la formación neta de dos ATP, que
requiere "G ° ¿#! 61 kJ! mol $ 1 de glucosa consumida (cuadro 16-3). Dividir el "G ° ¿de formación
de ATP por el de formación de lactato indica que la fermentación homoláctica es 31%" eficiente ",
es decir, 31% de la energía libre liberada por este proceso en condiciones bioquímicas estándar es
secuestrada en forma de ATP. El resto es

disipado en forma de calor, lo que hace que el proceso sea irreversible.

Asimismo, la fermentación alcohólica tiene una eficiencia del 26% en condiciones de estado
bioquímico estándar. En realidad, en condiciones fisiológicas, donde las concentraciones de
reactivos y productos difieren de las del estado estándar, estas reacciones tienen eficiencias de
energía libre de% 50%.

a. La glucólisis se utiliza para la producción rápida de ATP

La fermentación anaeróbica utiliza la glucosa de manera derrochadora en comparación con la

fosforilación oxidativa: la fermentación da como resultado la producción de 2 ATP por glucosa,
mientras que la fosforilación oxidativa produce 32 ATP por glucosa (capítulo 22). Esto explica la
observación de Pasteur de que la levadura consume mucha más azúcar cuando crece en forma
anaeróbica que cuando crece en forma aeróbica (el efecto Pasteur; Sección 22-4C). Sin embargo,
la tasa de producción de ATP por la glucólisis anaeróbica puede ser hasta 100 veces más rápida
que la de la fosforilación oxidativa. En consecuencia, cuando tejidos como el músculo

están consumiendo rápidamente glucólisis, para lo cual tienen una capacidad particularmente
grande.

Los músculos diseñados para contraerse lenta y constantemente, por el contrario, están
enriquecidos en fibras de contracción lenta que son ricas en mitocondrias y obtienen la mayor
parte de su ATP a través de la fosforilación oxidativa. (Las fibras de contracción rápida y lenta se
conocían originalmente como fibras blancas y rojas, respectivamente, porque el tejido muscular
de otro modo pálido, cuando se enriquece con mitocondrias, adquiere el color rojo característico
de sus citocromos que contienen hemo. Sin embargo, el color de la fibra ha Se ha demostrado que
es un indicador imperfecto de la fisiología muscular.) En un ejemplo familiar, los músculos de
vuelo de aves migratorias como patos y gansos, que necesitan un suministro continuo de energía,
son ricos en fibras de contracción lenta y, por lo tanto, estas aves tienen pechos oscuros. carne.
Por el contrario, los músculos de vuelo de los voladores menos ambiciosos, como los pollos y los
pavos, que se utilizan solo para ráfagas cortas (a menudo para escapar del peligro), consisten
principalmente en fibras de contracción rápida que forman carne blanca. En los humanos, los
músculos de los velocistas son relativamente ricos en fibras de contracción rápida, mientras que
los corredores de fondo tienen una mayor proporción de fibras de contracción lenta (aunque sus
músculos tienen el mismo color). Distancia de clase mundial

los corredores tienen una capacidad notablemente alta para generar ATP aeróbicamente. Esto se
demostró mediante la monitorización no invasiva de 31P NMR de los niveles de ATP, Pi,
fosfocreatina y pH en sus músculos del antebrazo en ejercicio pero no entrenados.

Estas observaciones sugieren que los músculos de estos atletas están mejor dotados
genéticamente para el ejercicio de resistencia que los de los individuos "normales".

Sin embargo, el beriberi se desarrolla ocasionalmente en alcohólicos crónicos debido a su

inclinación por beber pero no comer.

C. ¡Reducción de acetaldehído y regeneración de NAD!

El acetaldehído formado por la descarboxilación del piruvato se reduce a etanol por NADH en una
reacción catalizada por alcohol deshidrogenasa (ADH). ¡Cada subunidad de la levadura tetramérica
ADH (YADH) une un NADH y un Zn2! ion. El Zn2! El ion funciona para polarizar el grupo carbonilo
del acetaldehído (Fig. 17-30), para estabilizar la carga negativa en desarrollo en el estado de
transición del

reacción (el papel de los iones metálicos en las enzimas se analiza en la sección 15-1C). Esto facilita
la transferencia del hidrógeno pro-R de NADH (el mismo átomo que transfiere LDH) a la superficie
de acetaldehído, formando etanol con el hidrógeno transferido en la posición pro-R (Sección 13-
2A).

Tanto la fermentación homoláctica como la alcohólica tienen la misma función: ¡la regeneración
anaeróbica de NAD! para la glucólisis continua. Su principal diferencia está en sus productos
metabólicos.

La ADH de hígado de mamífero (LADH) funciona para metabolizar los alcoholes producidos
anaeróbicamente por la flora intestinal, así como los de fuentes externas (la dirección de la
reacción de ADH varía con las concentraciones relativas de etanol y acetaldehído). ¡Cada
subunidad de esta enzima dimérica se une a un NAD! y dos Zn2! iones, aunque solo uno de estos
iones participa directamente en la catálisis. Existe una similitud significativa en la secuencia de
aminoácidos entre YADH y LADH, por lo que es muy probable que ambas enzimas tengan el mismo
mecanismo general.