CENTRO DE CIENCIAS BASICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
ACADEMIA DE BIOLOGIA
MOLECULAR
LABORATORIO DE
DIAGNOSTICO MOLECULAR
Practica1. USO Y REVISIÓN DE MATERIAL DE
LABORATORIO PARA DIAGNÓSTICO
MOLECULAR.
ALUMNA: Victoria Elizabeth Vargas Andrade
ID: 1897848
PROFESOR: Dr. José Antonio González Gutiérrez
FECHA DE ENTREGA: 14/02/2021
Resultados:
Manual de uso para el laboratorio de diagnóstico molecular
Micropipeta Tipos de micropipetas:
Tipos de Primero se tiene que asegurar que se este
micropipetas: usando la micropipeta correcta para el
volumen que se necesita al igual que la
P1000 es útil ventana de volumen para la recolección del
para volúmenes líquido.
de 200 hasta
1000 µL Colocar correctamente la punta desechable,
no se use sin punta ya que se puede
P200 es útil contaminar la micropipeta si no se usa. Cada
para volúmenes micropipeta tiene sus propias puntas ya que
de 20 hasta 200 estas cambian dependiendo del volumen de la
µL. micropipeta.
P20 es útil para Para llenar la micropipeta, se oprime el
volúmenes de embolo hasta el 1er tope después se introduce
0.5 hasta 20 µL la punta dentro del liq sin tocar el fondo y así
lentamente se suelta poco a poco el embolo
hasta arriba nuevamente esto para no generar
burbujas.
para la expulsión de la muestra se coloca la
punta en la pared del recipiente donde se
desechará esta y ahora si se presiona el
embolo hasta el segundo tope igualmente con
suavidad.
Microcentrífug Se abre la microcentrífuga y se colocan los
a tubos de manera en que siempre haya el
mismo espacio entre todos los tubos, a veces
se tienen que colocar tubos vacíos para hacer
un equilibrio entre estos.
Se fija la tapa del rotor y después la de la
microcentrífuga. Se selecciona la velocidad y
el tiempo con el que se desea trabajar
dependiendo de la practica que se este
realizando. Terminando el tiempo se deja que
se pare por completo la centrifugadora y se
pueden recolectar los tubos.
Cámara de Previamente se tiene que preparar el gel de
electroforesis agarosa.
horizontal
Se coloca el portagel en una superficie plana
para evitar burbujas cuando el gel se vierta.
Se vierte el gel frio por entre los dientes del
peine y la base del portagel dejando 1 o 2 mm
para evitar perforaciones del gel.
Se encajan los peines en las ranuras
dependiendo de cuantas cargas se quieren
realizar también son el número de peines.
Dejar que se solidifique el gel por 30min. El
gel se tiñe con bromuro de etidio para la
documentación fotográfica de la muestra. Se
retira con cuidado la cinta adhesiva de los
extremos abiertos de la agarosa al tampón. Se
retiran los peines.
Se cargan las muestras en los pocillos
inclinando la punta de la micropipeta para
evitar perforaciones del gel. Se debe de poner
un carril con puro marcador para comparar
con las muestras que se esté corriendo.
Se cierra la tapa de la cubeta y se conecta a la
fuente de alimentación. Y se ajustan los
voltajes dependiendo del tiempo en que se
quiera dejar correr las muestras.
Una vez finalizada la carrera, presionar el
interruptor de PARADA de la fuente de
alimentación y apagarla antes de desconectar
los cables de conexión de la cubeta.
El portagel transparente al UV con el gel se
puede colocar directamente en un
transiluminador para la visualización de las
bandas.
Proceda a la tinción del gel, con solución de
bromuro de etidio u otro colorante adecuado
para geles de agarosa
Discusión:
Cuando se trabaja en el laboratorio de Diagnostico molecular se ocupan tener resultados
muy específicos y esto es gracias a materiales y equipos especiales que se encuentran en el
laboratorio, pero por lo mismo que son especiales se ocupa tener el conocimiento correcto
del uso de estos materiales. Obviamente como en cualquier laboratorio las medidas de
seguridad generales son indispensables como el utilizar prendas de vestir adecuadas,
preferiblemente que permitan aislar el 100 % de nuestro cuerpo y así evitar accidentes por
derramamiento de reactivos o el uso inadecuado del material del laboratorio esto es la bata
de manga larga, zapato cerrado, lentes de seguridad y en casos en donde se tiene contacto
directo con sustancias toxicas o dañinas por ejemplo el bromuro de etidio se necesitan
guantes y equipos como la campana de extracción para no tener problemas en la salud.
En este laboratorio se trabaja con muestras biológicas de origen animal o bien cultivos
bacteriológicos y a veces se trabaja con microorganismos genéticamente modificados los
cuales se deben también tener precauciones para evitar infecciones por el ambiente y a las
personas dentro del laboratorio, estas muestras son a escalas pequeñas por lo que se
trabajan con las micropipetas.
La garantía de los resultados esperados en los procedimientos moleculares se necesitan
también cantidades exactas de reactivos, y por ello una de las principales practicas
introductoras es el uso de la micropipeta, este nos permite tomar y transferir volúmenes
pequeños de líquidos; hablando de rangos como (0.1-1 µL, 0.5-10 µL, 10-100 µL, 20-200
µL, 100-1000 µL, 1000-5000 µL, entre otros); esto depende del tipo de micropipeta y
muchas veces de la casa comercial.
Siempre hay que tener cuidado con la selección de micropipeta dependiendo del volumen
que se va a ocupar y utilizándolas siempre en el rango de volúmenes para que el que ha sido
fabricada ya que se puede descalibrar o dañar si se le adiciona menos o mas volumen de lo
marcado. Es importante que se trabaje con cuidado ya que es muy fácil que se pueda
contaminar tanto la micropipeta como las muestras.
Otro equipo de laboratorio del que se tuvo conocimiento fue de la microcentrifuga que es
importante para cualquier practica dentro de este laboratorio esta tiene como función de
rotar muestras de laboratorio almacenadas en tubos capilares, de esta manera separa sus
componentes ya sean líquidos o sólidos de acuerdo con su densidad. Regla importante de
este aparato es que los tubos se deben de acomodar equilibradamente con los mismos
espacios entre estos.
Y bueno uno de los últimos equipos que se ocupan es la cámara de electroforesis
horizontal, como se sabe la electroforesis es una técnica para la separación de moléculas,
según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la
técnica que se use permite analizar los ácidos nucleicos y proteínas; determinar los
tamaños moleculares de los ácidos nucleicos; analizar los fragmentos cortados con
enzimas de restricción; comparar los tamaños de distintos tipos de DNA; aislar y
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonaciones moleculares; analizar
productos de PCR; poder estudiar y detectar diferentes tipos de patógenos y enfermedades.
Además, permite encontrar deformaciones o irregularidades dentro de la cadena de ADN.
El manejo de la cámara de electroforesis no es complicado, con lo que se debe de tener
cuidado es con el daño al gel de agarosa y con la transferencia de muestras a este ya que es
muy sensible y es esencial para no tener causas de error en los resultados; estos errores casi
siempre son por:
• Contaminación de la muestra: cuando se realiza la extracción y la preparación de la
muestra se puede presentar: ausencia en las bandas de DNA; estén curvadas o estén
borrosas; migración anómala de las bandas; escasa diferencia en la intensidad de las
bandas cuando se usan patrones de cuantificación en geles teñidos con bromuro de etidio
[4].
• Problemas con el gel: en primer lugar, una concentración de gel incorrecta puede hacer
que este corra demasiado rápido o no corra en absoluto; también puede haber
inconvenientes con la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel. La
uniformidad de la temperatura a través del gel mientras ocurre la corrida electroforética,
generalmente elimina el efecto de la deformación de las bandas en forma de “sonrisa”.
• Velocidad de polimerización: una polimerización muy rápida puede deformar las bandas,
porque ocurre una contracción no uniforme del gel; en este caso debe reducirse el TEMED
y el persulfato de amonio o adicionar ferricianuro de potasio, con el objetivo de hacer más
lenta esta.
• Pureza de los reactivos: el empleo de reactivos de alta calidad y agua desionizada es un
prerrequisito para hacer geles reproducibles y de alta resolución.
Los laboratorios de diagnóstico molecular son espacios en donde se comprueban muestras
biológicas de origen de animal, vegetal o bien microorganismos genéticamente modificados
para esto debe existir un ambiente completamente preparado para poder estudiarlos y
manejarlos de la forma correcta con los equipos especiales por eso es de gran importancia
estas practicas previas para no fallar con los futuros resultados.
Cuestionario:
• Explica detalladamente los efectos que tiene el bromuro de etidio en la salud
humana, y que medidas se deben tomar para evitarlos.
Efectos en la salud:
o Inhalación: La inhalación del polvo irrita las vías respiratorias.
o Ingestión: Tóxico por ingestión.
o Contacto de piel: Causa la irritación de la piel. Puede provocar la inflamación y/o la
decoloración de la piel después del contacto. El contacto manchará la piel de color
púrpura.
o Contacto con los ojos: Provoca irritación, enrojecimiento y dolor ocular.
o Exposición crónica: Puede provocar daños genéticos hereditarios (mutágeno).
Solo se debe manipular por personal capacitado, usando equipos de protección personal
(gafas, guantes, mascarilla, bata con manga larga, etc).
En estado sólido solo se debe de manipular en las vitrinas de gases, en disolución se puede
utilizar en entornos de trabajo bien ventilados. Una vez manipulado el EtBr se debe de lavar
las manos a fondo para eliminar cualquier residuo al igual que los materiales utilizados
mientras se trabajó con esta sustancia.
• ¿Cuáles son los riesgos al exponerse a la luz ultravioleta? ¿Qué medidas de
seguridad vas a tomar cuando tengas que hacer uso de ella?
La luz UV puede causar daños a la epidermis y en la cornea con tan solo 3 segundos de
exposición. Las lesiones más frecuentes causadas por el UV-C son las quemaduras de
córnea, eritemas y quemaduras de piel y también causa daño al DNA, RNA y proteínas de
todos los sistemas biológicos.
Es por eso por lo que como medidas de seguridad nunca se debe mirar directamente a la luz
UV, aun con protección, no exponer partes del cuerpo a la luz UV emanada de equipos de
esterilización. Siempre colocar un cartel indicativo de que la luz UV-C se encuentra
prendida y un breve resumen del riesgo. La luz ultravioleta puede causar daños a algunos
materiales, como por ejemplo el acrílico. El material quedará quebradizo y debe ser
descartado.
• Enlista las medidas de seguridad que se deben tomar cuando manipules a) muestras
de origen animal y b) cultivos bacteriológicos.
> La toma de muestras debe realizarse tomando las precauciones adecuadas y usando los
accesorios (agujas, jeringas, tubos, placas, gradillas, etc.) y los EPI’s (guantes, mascarilla,
gafas de seguridad, etc) adecuados.
Una muestra desconocida es una muestra potencialmente peligrosa. Es obligatorio el uso de
bata y guantes. Se exigirá el uso de gafas o pantallas antisalpicaduras si existe exposición a
riesgo de salpicaduras o proyección de líquidos corporales.
Toda muestra se transportará siempre en recipiente con tapa ajustable y cierre que impida la
salida de fluidos.
Si durante una operación de centrifugación se produce la ruptura de los tubos en el interior
del equipo, se esperará al menos durante 5 minutos para abrir la tapa de este.
Posteriormente, se desinfectarán equipos, materiales y superficies de trabajo con un
producto de efectividad contrastada. Se desecharán las jeringas y agujas de un solo uso en
contenedores especiales.
• ¿Por qué se debe tener especial cuidado al trabajar con microorganismos
manipulados genéticamente?
Los peligros potenciales (efectos dañinos) del trabajo que implican los MGMs pueden estar
asociados con el receptor primario u hospedero, otros receptores potenciales en el medio, o
el microorganismo donador. En muchos casos, las características del hospedero serán más
relevantes para el análisis de riesgo que aquellas del organismo donador. Algunos factores
para considerar durante la identificación de peligro incluyen la patogenicidad, la actividad
biológica o toxicidad del producto del gen extraño y la movilidad de vectores plásmidos o
virales. Como guía general, si un organismo donador se utiliza sólo como una fuente de
ADN bien caracterizada para un fenotipo seleccionable (resistencia a kanamicina o
actividad de ß-galactosidasa) o un promotor u otra secuencia de control, las características
del donador no necesitarán ser consideradas
Bibliografía:
1. Procedimiento estándar para trabajo con bromuro de etidio. Universidad Politécnica
de Valencia. 2010. https://www.sprl.upv.es/D7_2_11_b.htm (consultado por última
vez: 10/02/2021)
2. Costa da Cunha, Jefferson. Uso adecuado de lámparas Germicidas.
https://oftalmologos.org.ar/files/institucional/covid/uso-adecuado-de-lamparas-
germicidas.pdf (consultado por última vez: 10/02/2021)
3. Evaluación de riesgos en el laboratorio.
http://depa.fquim.unam.mx/bioseguridad/lineam/linea_evaluacion.html (consultado
por ultima vez: 10/02/2021)
4. https://servicios.unileon.es/gestion-de-residuos/wp-
content/blogs.dir/34/files/2014/03/guia-de-seguridad-y-buenas-practicas-en-el-
laboratorio.pdf (consultado por última vez: 10/02/2021)
5. Prototipo cámara de electroforesis. https://www.itm.edu.co/wp-
content/uploads/Comunicaciones/C%C3%A1mara-de-electroforesis.pdf (consultado
por ultima vez: 10/02/2021)
