UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

INSTITUTO DE GEOLOGÍA

MANEJO INTEGRAL DE ECOSISTEMAS

CARACTERIZACIÓN DE CIANOBACTERIAS EN MICROBIALITAS DEL LAGO

CRÁTER ALCHICHICA EN UN GRADIENTE DE PROFUNDIDAD

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRESENTA:

BERNARDO ÁGUILA SALGADO

TUTOR PRINCIPAL: DRA. ROCÍO JETZABEL ALCÁNTARA HERNÁNDEZ

INSTITUTO DE GEOLOGÍA, UNAM

COMITÉ TUTOR: DRA. LUISA ISAURA FALCÓN ÁLVAREZ

INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM

DR. GUSTAVO ALBERTO MONTEJANO ZURITA

FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM

MÉXICO, CD. MX., JUNIO 2018

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
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Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
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ii
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

INSTITUTO DE GEOLOGÍA

MANEJO INTEGRAL DE ECOSISTEMAS

CARACTERIZACIÓN DE CIANOBACTERIAS EN MICROBIALITAS DEL LAGO

CRÁTER ALCHICHICA EN UN GRADIENTE DE PROFUNDIDAD

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRESENTA:

BERNARDO ÁGUILA SALGADO

TUTOR PRINCIPAL: DRA. ROCÍO JETZABEL ALCÁNTARA HERNÁNDEZ

INSTITUTO DE GEOLOGÍA, UNAM

COMITÉ TUTOR: DRA. LUISA ISAURA FALCÓN ÁLVAREZ

INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM

DR. GUSTAVO ALBERTO MONTEJANO ZURITA

FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM

MÉXICO, CD. MX., JUNIO 2018

iii
 UN M iiI.)(i COORDINACiÓN
posa DO!'-~
OFIC IO CPCBl43012018

Asunto : Oficio ele Jurado para Examen de Grado.

Ue.lyo nne Ram lra: Wence

Olrectora Genlral de Adm inistración Escolar, UNAM
Presen t e

Me permito informar a usted, que el Subcomité de Ecolog la y Manejo In tegra l de Ecosistema s

del Potgrado en C iene"las Biológicas , erl su sesión o rdi nar~ del dla 16 de abrM de 2018, aprobó el
Jurado para le presen tació n de su exame n pa ra obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS
BIOL.ÓGICAS del alumno ÁGUILA SALGADO BERNARDO con nlimero de cuente 100137840
con 1, tesis titu lada " CARACTERIZACiÓN DE ClANOBACTERIAS EN MICROBIAL.ITAS DEL
LAGO CRÁTER ALCHICHICA EN UN GRADIENTE DE PROFUNDIDAD", reabzada baJO la
dirección de la ORA. Rocío JETZABEL ALCÁNTARA HE RNÁ NOEZ:

Pres idente o R MARTIN MERI NO IBARRA

Vocal" DRA. tTZEL BECERRA ABSALO N
SecretimO ORA. LUISA ISAURA FA LCÓN ALVA REZ
Sup lente: ORA. PATRICIA MARGARITAVALOESPINO CASTILLO
Sup lente OR GUSTAVO AlBERTO MONTEJ AN O ZU RITA

Sin o tro pa rticular. me es gra to enviarle un eord ra l saolu do

Atent &men te
"POR MI RAZA HABLARÁ EL Es plRITU ~
Cd. Universit&ria, Cd. Mx., & 1. de mayo de 2018.

oR. ADOLFO GERARoO VARRO SIGOeNZA

COO R DI NAD ~ L PROGRAMA

l'mdad de Pos¡rado · COOrdtnaClÓII del Posando en Ciencias BIol ógicas Ed1 ficio D. ler. PI<iO. CIrcUI to de Posgntdos Cd. Lmver5l tarla
Dc1cpcIUn CO)-'03cin CP. 045 LO Cd. Mx Tel. 5623 7002 hup .pcblol posgndo unam.1I1X

iv
 AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos institucionales

Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas, por las herramientas y conocimientos otorgados, indispensables
en mi formación academica. Agradezco también su apoyo en todos los trámites realizados, por su rápida y
eficiente respuesta en los mismos.

Esta investigación fue realizada gracias al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación
Tecnológica con el proyecto: “El componente bacteriano y su potencial biogeoquímico en sedimentos y
microbialitas de un sistema salino alcalino” UNAM-DGAPA-PAPIIT IA209516. Gracias a CONACYT por el
Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado, por la Beca otorgada durante la realización de este trabajo.
Tambien agradezco el apoyo PAEP 2017-2 otorgado, asi como el apoyo de la Coordinacion de Estudios de
Posgrado para la Impresión de Tesis y Estimulo a la graduación oportuna 2018-2. Gracias al Instituto de
Geología por el equipo e instalaciones proporcionadas en el desarrollo de este trabajo

Agradezco a mi tutora principal la Dra Rocío Jetzabel Alcántara Hernández y a los miembros de mi comité
tutor la Dra Luisa Isaura Falcón Álvarez y al Dr. Gustavo Montejano Zurita del Posgrado de Ciencias Biológicas.

v
Agradecimientos personales
Quisiera agradecer especialmente a mi directora de tesis, la Dra. Rocío Alcántara, por su paciencia y su
disponibilidad, por su gran amabilidad y hacerme sentir bienvenido dentro de la UNAM, por hacer del grupo
BiogeoMi una segunda familia, de igual manera agradezco a la Dra. Luisa Falcón por abrirme las puertas y
darme la gran oportunidad de pertenecer a su excelente grupo de trabajo, quisiera agradecerle por sus
inspiradoras clases y sabios consejos, igualmente por su paciencia.

Quiero agradecer mucho al Dr. Gustavo Montejano y a la Dra. Itzel Becerra por su disponibilidad, por
contagiarme su enorme pasión hacia las cianobacterias, que igualmente considero uno de los organismos más
fascinantes de la Tierra, gracias por su accesibilidad, apoyo técnico y disposición hacia mí. Gracias a la M. en
B. Maria Eugenia Muñiz Diaz de León del Departamento de Biologia Comparada de la Facultad de Ciencas por
su apoyo con el nanodrop. Agradezco a Rafael López Martínez por su apoyo técnico. Así como a las M. en C.
Osiris Gaona e Iris Suárez también por el apoyo técnico para el desarrollo de esta tesis.

Quisiera agradecer de gran manera a mis compañeros de la maestría: Eduardo Aguilar, Jazmín Santillán y Jesús
Torres por su ayuda en el procesamiento de muestras y compartimiento de datos, así como a mis compañeros
del cubo Jair, Katia, Chuchin, Ely, Teresita y David por su constante ayuda, por crear un ambiente ameno en
el cubo. Doy las gracias a mi compañero Tadeo Martínez, a Yislem Beltrán, Patricia Valdespino, Andrés
Sánchez y Osiris Gaona por su apoyo en el laboratorio de Ecología microbiana. Gracias también al Dr. Rafael
López y a su equipo de buceo, por proporcionar las muestras de microbialita. Gracias a María Rodríguez por
su gran amabilidad y disposición ante todos los trámites relacionados al Posgrado de Ciencias Biológicas.

En lo personal quisiera agradecer a mi novia Gaby Cruz que me ayudó con sus consejos, cariño y apoyo en
todos los ámbitos, al igual que mi familia que siempre estuvieron ahí para aconsejarme y ayudarme en lo que
fuese necesario, gracias a Miriam Rebeca Hernández por facilitarme el departamento para vivir en la ciudad
de México, gracias a Laura Ramírez, Ileana Zapata, Graciela Colunga por sus consejos, platicas y apoyo.

vi
Índice general Página

1 Introducción…………………………………………………………………………………………………….….. 1

1.1 Generalidades y particularidades de las microbialitas ………………………………………….….... 1

1.1.1 Definición, origen, formación y clasificación.……………………………………………………….….. 1
1.1.2 Distribución de microbialitas………..…………………………………………………………………...……. 3
1.1.3 Las microbialitas del lago cráter Alchichica……………………………………………………...………. 4
1.2 Las cianobacterias y su relevancia en la formación de las microbialitas
1.2.1 Generalidades y clasificación taxonómica……………………………………………………………….. 6
1.2.2 Importancia de las cianobacterias en la formación de microbialitas……………………….. 7
1.2.3 Adaptaciones diferenciales a la intensidad y calidad de luz…………………………………….. 7
1.3 Técnicas para la identificación de cianobacterias
1.3.1 Observaciones por microscopía………………………………………………………………………………. 9
1.3.2 Aislamiento por cultivos en medios líquidos y sólidos…………………………………………….. 10
1.3.3 Técnicas moleculares.…………………………………………………………………………………………….. 10

2 Planteamiento y justificación del problema……………………..……………………. 14

3 Hipótesis de trabajo ……………………………………………………………………………..…………. 14

4 Objetivos
4.1 Objetivo general……………………………………………………………………………..…………..….….………… 15
4.2 Objetivos particulares…………………………………………………………………………….………………..…… 15

5 Materiales y Métodos
5.1 Colecta de muestras …………………………………………………………………….………..…....…………. 16
5.2 Extracción, visualización y cuantificación de ácidos nucleicos ……...…...…………..………. 16
5.3 Amplificación fragmentos 16S rRNA…………………………………………..……….………………..…. 16
5.4 Librería de clonas………………..…………………………….………………………………..…...…………….. 17
5.5 Análisis de secuencias……………….........……………………...……………………………………………… 18
5.6 Establecimiento de cultivos y aislamiento de cianobacterias………………………..………….. 18
5.7 Identificación por microscopía y morfometría………………………..……………………...………… 19

i
6 Resultados
6.1 Identificación por microscopía en microbialitas…………….………………………………...……..… 21
6.1.1 Profundidad 3 metros z=3…………………………………………………………………………………….. 22
6.1.2 Profundidad 10 metros z=10…………………………………………………………………………………. 23
6.1.3 Profundidad 20 metros z=20…………………………………………………………………………………. 24
6.1.4 Profundidad 30 metros z=30…………………………………………………………………………………. 25
6.2 Obtención de cultivos de cianobacterias
6.2.1 Cultivos en recipientes plásticos……………………………………………………………………………. 28
6.2.2 Cultivos en matraces……………………………………………………………………………………………… 28
6.2.3 Cultivos en medio sólido……………………………………………………………………………………….. 30
6.2.4 Aislamiento en medio líquido………………………………………………………………………………… 31
6.2.5 Secuenciación de cultivos aislados………………………………………………………………………... 34
6.3 Caracterización de cianobacterias por librería de clonas………………………………….……….. 34
6.4 Comparación de técnicas dependientes e independientes de cultivo……..……….….……. 37

7 Discusión
7.1 Observaciones a microscopía…………….………………………….………………………….………………. 40
7.2 Adaptación y morfotipos de cultivos………………..……………………………………..…….…………… 42
7.3 Consorcios involucrados en la precipitación de carbonatos ……..……………………..………… 43
7.4 Análisis de secuencias 16S rRNA………………………………………………..………………………………..44
7.5 Problema de anotación en base de datos y clasificación……………………………………………. 45

8 Conclusión ………………………………………………………………………………………….………..…….. 47

9 Perspectivas……………………………………………………………………………………….………..…….. 47

10 Bibliografía……………………………………………………………………………………………………..…… 48

ii
Índice de Figuras

Figura 1. Cronograma de la aparición de microbialitas hace 3500 Ma. y su decrecimiento poblacional

hace 1000 Ma ….………………………………………………………………………………………………..…………………………..1
Figura 2. Clasificación de microbialitas por génesis………………………………………………………………………….2
Figura 3. Clasificación de microbialitas por morfología estructural……………….…………………………………2
Figura 4. Ubicación del lago cráter Alchichica………………………………………………………………………….………4
Figura 5. Paisaje del lago cráter Alchichica octubre 2016……………….….……………………………………………5
Figura 6. Microbialitas de profundidad en el lago Alchichica …..……………………………………………………..5
Figura 7. Órdenes de cianobacterias y sus principales características estructurales…………………………6
Figura 8. Absorbancias de diferentes clorofilas y fotopigmentos….…………………………………………………8
Figura 9. Diagrama de la fotosíntesis en cianobacterias………………………………………………………………….8
Figura 10. Regiones hipervariables del 16S rRNA procarionte.………………………………………………………11
Figura 11. Metodología general para la construcción de librería de clonas …………………………………...12
Figura 12. Zona de muestro de las profundidades 3, 10, 20 y 30 metros………….……………………………16
Figura 13. Recipientes de plástico de 300 ml con fragmentos de microbialita después de 5 meses de
crecimiento …………………………………………………………………………..…………….……………………………………….18
Figura 14. Diagrama de flujo de la metodología……………………………………………………………………………20
Figura 15. Microscopía óptica de microbialitas encontradas a 3 m de profundidad ……………………….22
Figura 16. Microscopía óptica de microbialitas encontradas a 10 m de profundidad ..………………….23
Figura 17. Microscopía óptica de microbialitas encontradas a 20m de profundidad………..……………24
Figura 18. Microscopía óptica de microbialitas encontradas a 30 m de profundidad…..………………..25
Figura 19. Cultivos de microbialitas de 10 y 20 m de profundidad en matraz Erlenmeyer….………….28
Figura 20. Microscopía de los cultivos en matraz Erlenmeyer de 10 m y 20 m…………………………………29
Figura 21. Cultivos a los 6 meses de inoculación ordenados por profundidad ………………….…………..30
Figura 22. Aislados en frascos con respirador………………………….……………………………………………………31
Figura 23. Microscopía óptica de cultivos aislados ….…………..………………………………………………………32
Figura 24. Dibujos de cianobacterias a escala visualizadas e identificadas por microscopía óptica….33
Figura 25. Gel de electroforesis en agarosa de fragmentos 16S rRNA amplificados ….…………………….35
Figura 26. Abundancias de OTUs por profundidad ……………………………….………………………………………35
Figura 27. Agrupación por similitud de distancias usando BioNeighbor Joining (BioNB) ……………….36
Figura 28. Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA de Nostocales…..……………………………....37

iii
Figura 29 Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA para Chroococcidiopsidales y
Pleurocapsales…………………………………………………………………………………………………………………….……….37

Figura 30 2 Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA para Oscillatoriales………………………....38

Figura 31 Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA para Chroococales ……………………………..38

Figura 32. Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA para Synechococcales ……………………….39

Figura 33. Microscopía óptica de cambios morfológicos en cultivo de Rivularia …….…………………….42

Figura 34. Microscopía óptica de consorcio de Pleurocapsales ……………………………………………………..43

iv
Índice de Tablas

Tabla 1. Distribución de microbialitas por país ambiente y morfología…………………………….…………….3

Tabla 2. Tipos de microscopía……………………………….………………………………………………………………………..9

Tabla 3. Plataformas de secuenciación………………………………………………………………………………………….13

Tabla 4. Secuencia de primers usados amplificar regiones V4 de Cianobacteria …………………………….17

Tabla 5. Primers M13 usados para amplificar insertos del vector………………………………………………….18

Tabla 6. Cianobacterias identificadas en microbialitas y sus abundancias relativas……………21

Tabla 7. Tablas de morfometría sección I………………………………….………………………………………………….26

Tabla 8. Tablas de morfometría sección II…………………………………………………………………………………….27

Tabla 9. Cianobacterias asiladas en cultivo, amplificación y secuenciación 16S rRNA ……..…………..34

Tabla 10. Número de clonas, secuencias y OTUs obtenidos por profundidad óptica …………..…………35

Tabla 11. Cianobacterias detectadas por microscopía óptica en este estudio y aquellas reportada en
estudios previos……………………………………………………………………………………………………………………………41

Tabla 12. Tabla comparativa de detección de cianobacterias en microbialitas del lago Alchichica por
diferentes metodologías……………………………………………………………………………………………………………….46

v
Resumen

Las microbialitas son estructuras organo-sedimentarias microbianas formadas

por la acreción, precipitación y/o unión de minerales. Trabajos previos han
demostrado que la fotosíntesis por cianobacterias es un factor importante en
la precipitación de estos minerales y la formación de las microbialitas. La
fotosíntesis eleva el pH local a través de la asimilación de bicarbonato,
favoreciendo la precipitación de carbonatos. Se sabe también que, las
sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de las cianobacterias actúan como
soporte para la acreción y nucleación activa del material mineral. No obstante,
la formación de las microbialitas aún no se entiende completamente. Por lo
tanto, es crucial describir y estudiar a las cianobacterias para comprender la
formación de estas estructuras.
En este trabajo se describió y caracterizó la diversidad de cianobacterias en
microbialitas (morfotipo esponjoso) del lago cráter Alchichica (Puebla,
México), a lo largo de un gradiente de profundidad (z = 3 m, 10 m, 20 m y 30
m), empleando una aproximación polifásica. Para los métodos independientes
de cultivo, las muestras de microbialitas se examinaron mediante microscopía
óptica, y los taxones de cianobacterias se caracterizaron mediante
morfometría. Mientras que, para el análisis molecular, se analizaron
microbialitas a través de la amplificación del gen 16S rRNA, con cebadores
específicos para cianobacterias mediante metagenómica dirigida. También se
obtuvieron 6 cultivos monocianobacteriales de diferentes cianobacterias que
se caracterizaron por microscopía y secuenciación del gen 16S rRNA.
En este estudio se encontró una asociación taxonómica entre los grupos de
cianobacterias en microbialitas de profundidadades específicas. Los géneros
Calothrix, Rivularia y Leptolyngbya estuvieron asociados a la superficie (3-10
m); mientras que, los génereos Xenococcus, Stanieria, Chroococcidium y
Pleurocapsa se encontraron en todas las profundidades siendo más
abundantes en las zonas profundas (> 10 m). Chroococcus, Synechococcus,
Cyanobium y otras picocianobacterias también se encontraron distribuidas en
todas las profundidades pero sin un patrón de asociación específica al
gradiente de profundidad.
Este trabajo representa una contribución al estudio integral de las
cianobacterias en las estructuras biosedimentarias; donde las técnicas
microscópicas y moleculares se complementaron.

vi
Abstract

Microbialites are microbial organo-sedimentary structures formed either by

mineral accretion, precipitation and/or binding. Previous studies have shown
that cyanobacterial photosynthesis is an important factor for mineral
precipitation and microbialite formation, since photosynthesis elevates local
pH via bicarbonate assimilation, favoring carbonate precipitation. In addition,
cyanobacterial extracellular polymeric substances (EPS) act as a template for
mineral nucleation. Nonetheless, the microbialite formation process is not
fully understood to date. Therefore, it is crucial to describe and study the
cyanobacterial component to also understand the microbialite formation
process.
In this study, we described and characterized the cyanobacterial diversity in
spongy microbialites from lake Alchichica (Puebla, Mexico), along a depth
gradient in the water column (z=3 m, 10 m, 20 m, and 30 m), using a polyphasic
approach. For culture independent methods, microbialite samples were
examined by optical microscopy, and the cyanobacterial taxa were
characterized by standard morphological and morphometry identification.
While for molecular analysis, microbialites were analyzed by clone libraries
construction, through 16S rRNA specific primers for cyanobacteria. We
obtained 6 different cyanobacterial cultures which were characterized by
microscopy and through 16S rRNA gene sequencing.
We observed a taxonomic relationship between depth and cyanobacterial
genera. Calothrix, Rivularia, and Leptolyngbya were associated with shallower
depths (3-10 m); while Xenococcus, Stanieria, Chroococcidium and
Pleurocapsa were present in all samples, being more abundant at deeper
zones (> 10 m). In addition, Chroococcus, Synechococcus, Cyanobium and other
picocyanobacteria were also found along all depths, without any specific
distribution pattern.
This work represents a contribution to the integral study of cyanobacteria
in organosedimentary structures; where molecular and microscopic methods
complemented each other.

vii
1 INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades y particularidades de las microbialitas

1.1.1 Definición, origen, formación y clasificación

Las microbialitas son estructuras organosedimentarias formadas por la acreción, precipitación y/o
unión de material mineral en procesos mediados -activa o pasivamente- por la actividad microbiana
(Burne & Moore 1987). Su estructura laminada es semejante a aquella encontrada en los restos
fósiles de vida más antiguos conocidos hasta la fecha, con poco más de 3400 millones de años de
antigüedad (Flannery & Walter 2012).

Se ha sugerido que estas formas fósiles jugaron un papel importante en los ciclos biogeoquímicos
del carbono y del oxígeno a través de la historia evolutiva del planeta durante el Arqueano; desde
entonces, las microbialitas han cambiado su propia composición, forma, abundancia y
metabolismos microbianos (Merz et al. 1992) (Fig. 1). La evidencia fósil sugiere que en el
Precámbrico, las microbialitas eran una forma de vida ampliamente distribuida en la Tierra. Sin
embargo, desde hace 1000 millones de años sus poblaciones decrecieron notablemente (Awramik
1971), posiblemente por la depredación por foraminíferos; por lo que actualmente están confinadas
a lugares muy específicos (Bernhard et al. 2013).

Figura 1. Cronograma de la aparición de microbialitas hace 3500 Ma. y su decrecimiento poblacional hace 1000 Ma.
Posiblemente por la depredación de foraminíferos y organismos eucariontes que florecieron en la explosión cámbrica
hace 541 Ma (Modificado de Knoll et al. (2017) y Falcón (2017)).

Estas organizaciones microbianas bénticas son metabólicamente activas y se forman por una
sucesión microbiana en forma de estratos o capas. Contienen un componente orgánico y otro
mineral (Glunk et al. 2011). El componente orgánico se encuentra como un tapete microbiano
distribuido en los primeros milímetros de la superficie, donde las capas externas contienen
mayormente organismos fotótrofos y las capas internas contienen organismos heterótrofos y
quimiolitótrofos. Por otro lado, el componente inorgánico mineral está formado por carbonatos,
generalmente aragonita, calcita, dolomita, o magnesita; aunque también pueden ocurrir formas
carbonatadas de azufre, hierro, silicio y fósforo (Dupraz et al. 2009, Valdespino-Castillo et al. 2018).

Las microbialitas tienen diferentes mecanismos de formación que incluyen: i) Acreción, cuando los
microorganismos atrapan activamente materia orgánica, detritos o material mineral granulado
(Frantz et al. 2015); ii) precipitación, pudiendo ser por deposición inorgánica/sedimentación o
influenciada pasivamente por metabolismos microbianos (Fig. 2). Entre estos dos tipos de
precipitación orgánica e inorgánica existe la precipitación hibrida, donde se alternan litificaciones
de tapetes microbianos y estratos de precipitación abiogénica (Kaźmierczak et al. 2015).

1
Las microbialitas también pueden ser clasificadas por morfología estructural en: Estromatolitos
(laminados), Trombolitos (esponjosos, amorfos), Dendrolitos (dendríticos, ramificados) y Leiolitos
(afaníticos, grano fino) (Fig. 3.); aunque por la complejidad híbrida y morfológica de la mayoría de
las microbialitas, la practicidad de esta clasificación sigue en discusión (Riding et al. 2011).

Figura 2. Clasificación de microbialitas por génesis. Se dividen en 2 grandes grupos génesis por acreción/atrapamiento y
por precipitación, siendo esta última influenciada por actividad microbiana o por precipitación inorgánica (Modificado
de Riding 2011).

Figura 3. Clasificación de las microbialitas por morfología estructural. La capa verde representa la biopelícula creciendo
activamente, y en blanco se muestra la estructura microscópica a detalle (Modificado de Riding 2011).

2
1.1.2 Distribución de las microbialitas

Las microbialitas modernas actualmente se encuentran confinadas a sistemas de agua dulce,

lagunas hipersalinas, lagos salino alcalinos, manantiales termales, estuarios, pozas salinas, cuevas y
muy pocos sistemas marinos (Laval et al. 2000, Berelson et al. 2011, Centeno et al. 2012). Las
condiciones más importantes para su formación parecen estar dirigidas por una alta salinidad,
alcalinidad, y nutrientes bajos (sistemas oligotróficos). Así como una disponibilidad y calidad de luz
particular, incluso en algunos casos se ha observado a la temperatura como factor determinante de
formación (Riding. 2011).

Cabe aclarar que la mayor descripción de las microbialitas modernas se ha dado en sistemas
lacustres salinos o alcalinos (Dupraz et al. 2011) (Tabla 1).

Tabla 1. Distribución de las microbialitas por país, ambiente y morfología.

Lugar Ambiente Referencia

Lago Pavillon, Canadá Lago agua dulce Laval et al. 2000

Lago Van, Turquía Lago salino Kempe et al. 1991
Cayo Coco, Cuba Laguna hipersalina Bouton et al. 2016
Lago Clifton, Australia Estuario Burne et al. 1993
Sharkbay, Australia Marino Burns et al. 2004
Laguna Bacalar, México Laguna agua dulce Gischler et al. 2008
Cuatro Ciénegas, México Poza alcalina Breitbart et al. 2009
Tavera et al. 1996, Couradeu et al.
2011, Centeno et al. 2012, Beltrán et
Lago Alchichica, México Lago salino alcalino al. 2012, Valdespino-Castillo et al.
2014, Alcántara-Hernández et al.
2017
Cuenca de Santos, Brasil Marino Rezende et al. 2015
Lago Sarmiento, Chile Lago alcalino Solari et al. 2010
Lago Piramidal, Estados Unidos Lago salino Arp et al. 1999
Great Salt Lake, Estados Unidos Lago salino Reitner et al. 1997
Lago Cráter Satonda, Indonesia Lago salino Arp et al. 2003
Lago Huhejaran, China Lago salino Arp et al. 1998
Clinton Creek, Yukon Canadá Mina de asbesto Power et al. 2011
Isla Kauai, Hawaii Cueva marina Léveillé et al. 2000
Isla Andros, Bahamas Estuario, Marino Burne & Moore 1987

3
1.1.3 Las microbialitas del lago cráter Alchichica
El lago cráter de Alchichica es un lago salino alcalino que se encuentra en el Eje Neovolcánico
Transversal, en la Cuenca Oriental de Puebla (19° 24' N, 97° 24' O, 2300 m s.n.m) en México (Fig. 4).
La columna de agua es alcalina (pH 8.7-9.2) y salina (conductividad eléctrica 13 dS m-1). Los aniones
dominantes son los cloruros y bicarbonatos; mientras que los cationes dominantes son el sodio y
magnesio, sobre potasio y calcio (Alcocer & Lugo 2003, Armienta et al. 2008, Can 2011, Mancilla
2012). Debido a las microbialitas que contiene, este sistema lacustre ha sido de gran interés para
diferentes estudios hidrológicos, geológicos y de ecología microbiana (Tavera et al. 1998, Falcón et
al. 2002, Couradeau et al. 2011, Kaźmierczak et al. 2011, Beltrán et al. 2012, Centeno et al. 2012,
Valespino-Castillo et al. 2014, Alcántara-Hernández et al. 2017, Valespino-Castillo et al. 2018) (Fig.
5).

Figura 4. Ubicación del Lago cráter Alchichica (Imagen NASA Google Earth v 7.3.1, INEGI.org).

4
Figura 5. Paisaje del lago cráter Alchichica, octubre 2016. Se observan microbialitas columnares en el fondo saliendo del
lago y microbialitas esponjosas en primer plano.

Estudios han descrito que existen dos generaciones morfológicas de microbialitas en el lago. Por un
lado, existen domos o columnas ricas en aragonita y una mezcla de magnesio y calcita, datando de
1100 años antes del presente (AP). Por otro lado, existen microbialitas con morfología esponjosa
ricas en hidromagnesita, huntita y calcita datadas en 2800 años AP (Fig. 6) (Kaźmierczak et al. 2011).
Se cree que la diferencia en el tipo de morfología y composición mineral es resultado de diferentes
periodos que sufrió el lago, en donde las microbialitas esponjosas se relacionan con un periodo de
sequía y las microbialitas columnares se relacionan a un gran flujo de agua subterránea que diluyó
la concentración de Mg/Ca, formándose aragonita en lugar de hidromagnesita (Kaźmierczak et al.
2011). Varios trabajos han descrito la biodiversidad en las microbialitas en una distribución vertical
de profundidad. También se ha documentado una gran diversidad procarionte, en especial de
proteobacterias y cianobacterias en el lago (Tavera et al. 1998, Couradeau et al. 2011, Kaźmierczak
et al. 2011, Centeno et al. 2012). Se ha observado que existe una distribución diferencial de las
comunidades microbianas, en un gradiente de profundidad de 0 a 14 metros. Estos cambios en
función de la profundidad también están asociados a una pigmentación cambiante de las
microbialitas (Couradeau et al. 2011) (Fig. 6).

A) B) C)

Figura 6. Microbialitas de profundidad en el lago Alchichica. A) Microbialita a 30 m en el sitio. Cambio de coloración en

función de la profundidad. B) 3 metros de profundidad. C) 20 metros de profundidad.

5
1.2 Cianobacterias y su relevancia en la formación de microbialitas

1.2.1 Generalidades y clasificación taxonómica

Las cianobacterias son un filo del dominio Bacteria. Son los únicos procariontes que llevan a cabo la
fotosíntesis oxigénica Sus células superan a la mayoría de las otras bacterias en tamaño, siendo
desde 0.5 micrómetros (µm) a 40 µm de diámetro (Rippka et al. 1979). Su envoltura se caracteriza
por tener una pared de mureína o peptidoglicano y una envoltura de exopolisacáridos como
mucilago (Hoiczyk & Hansel 2000). Las cianobacterias fueron responsables de cambiar la atmósfera
terrestre durante el Arqueano, de un estado reductor a un estado oxidante, en el llamado Gran
Evento Oxidativo (Schirrmeister et al. 2013). En la actualidad, las cianobacterias son uno de los
productores primarios más importantes de sistemas marinos y lacustres, aunque también se les
encuentra en sistemas terrestres como suelos, desiertos y cuevas (Büdel 2011).

La clasificación de cianobacterias aún es un tema en discusión, pero pueden dividirse en 8 órdenes:

1) Ocillatoriales, 2) Nostocales, 3) Gloeobacteriales, 4) Chroococcales, 5) Pleurocapsales, 6)
Chroococcidiopsidales, 7) Synechococcales y 8) Spirulinales (Fig. 7) (Komárek et al. 2014). Según su
morfología celular pueden clasificarse en cocales y filamentosas, pueden crecer en colonias o ser
unicelulares, dividiéndose por fisión binaria o fisión múltiple, con planos de división o sin planos
definidos. Dentro de las cianobacterias filamentosas pueden presentarse células especializadas
como acinetos, heterocistos; así como pueden presentarse ramificaciones falsas o verdaderas.
Existen estructuras reproductoras características de orden como necridios, beocitos y hormogonios
(Rippka et al. 1979, Komárek 1992).

Figura 7. Órdenes de cianobacterias y sus principales características estructurales (Modificado de Komaréck et al. 2014;
fotos: algaebase.org).

6
1.2.2 Importancia de las cianobacterias en la formación de estructuras
organosedimentarias

Trabajos previos han demostrado que la fotosíntesis, principalmente asociada a cianobacterias, es

uno de los metabolismos más relevantes involucrados en la precipitación mineral de las
microbialitas. La fotosíntesis conduce al balance de alcalinidad hacia la precipitación de carbonatos,
consume bicarbonatos y aumenta el pH localmente (Dupraz et al. 2009).

También se ha descrito que las sustancias poliméricas extracelulares o EPS (por sus siglas en inglés,
Extracellular Polymeric Substances) producidas por las cianobacterias, secuestran cationes de calcio
y magnesio, favoreciendo la acreción de carbonatos (Baumgartner et al. 2006, Braissant et al. 2007).
Las substancias poliméricas extracelulares son principalmente polímeros de carbohidratos que
tienen la función de envolver a las bacterias y protegerlas del medio con condiciones ambientales
adversas, así como conferir adhesión a substratos.

El EPS sirve también como soporte a otros microorganismos, como bacterias heterotróficas, que en
asociación con los organismos fotosintéticos autotróficos, pueden incrementar sus tasas de
crecimiento y materia orgánica particulada (POM, por sus siglas en inglés) (Brocke et al. 2015). A la
vez, la liberación de EPS y mucilago en biopelículas puede servir para excluir competitivamente a
otras bacterias, envolviéndolas para evitar que tengan acceso a nutrientes, ya que se ha observado
que existe un intercambio o trade off entre la producción de EPS y la capacidad de dispersión de
bacterias en biopelículas (Nadell et al. 2008). Se considera que esta capacidad de adhesión y
producción de EPS es uno de los mayores factores involucrados en la acreción mineral. Se ha
demostrado que Chroococcales junto con las Pleurocapsales son uno de los órdenes que producen
mayor cantidad de EPS (Pannard et al. 2016).

1.2.3 Adaptaciones diferenciales a la intensidad de luz y fotosíntesis

Se sabe que las cianobacterias sintetizan diferentes clorofilas y foto pigmentos como ficocianinas y
ficoeritrinas para absorber diferentes longitudes de onda, y poder llevar a cabo la fotosíntesis. Las
principales clorofilas en cianobacterias son las clorofilas a y b; sin embargo, también se han descrito
clorofila d en cianobacterias Synechococales de diversos sistemas marinos (Behrendt et al. 2011)
(Fig. 8). Así como clorofila f descrita en el orden Chrococcales en estromatolitos de Shark Bay
Australia (Chen et al. 2012) que absorben en el espectro infrarrojo (Trampe & Kühl 2016). Las foto
adaptaciones a la intensidad y longitud de onda del espectro, así como el tipo de clorofila y la
cantidad que producen los organismos fotótrofos, está directamente relacionada al hábitad y nicho
del organismo (Kühl et al. 2005).

En el lago Alchichica por ejemplo, se ha observado una coloración cambiante en las microbialitas
con relación a la profundidad del lago. Las microbialitas de superficie muestran coloraciones verdes
mientras que las de profundidad muestran pigmentos rojos, púrpuras y marrones (Couradeau et al.
2011, Kaźmierczak et al. 2011). Al analizar por microscopía y técnicas moleculares se ha reportado
que cianobacterias pertenecientes al orden Oscillatoriales dominan zonas de superficie, mientras
que Pleurocapsales dominan zonas profundas.

7
Otros estudios de microbialitas en lagos hipersalinos muestran resultados similares con una gran
diversidad del orden Synechococales distribuida en todas las profundidades, mientras que en
superficie se encuentran mayormente cianobacterias filamentosas como Oscillatoriales y
Nostocales. En lagos profundos (más de 30 m) pueden encontrarse microbialitas dominadas por
Chroococales o Pleurocapsales en el fondo, como el Lago Van en Turquía (Russell et al. 2014), el lago
Clifton en Australia (Burne et al. 2014), el lago Pavilion (Lopéz-García et al. 2005), entre otros. En
resumen, existe una relación taxonómica de cianobacterias con el tipo y calidad de luz disponible
para las microbialitas debido a su capacidad foto adaptativa.

Figura 8. Absorbancias de diferentes clorofilas y fotopigmentos (basado en Chen & Blankenship 2011).

La fotosíntesis oxigénica transforma la materia inorgánica (CO2 y HCO3-) en materia orgánica gracias
a la energía de la luz. La reacción inicia en el fotosistema II, donde la energía de los fotones es
absorbida por las clorofilas y fotopigmentos, que pasan la energía por resonancia a un centro de
reacción. Con la energía transportada se puede dividir una molécula de agua H2O, liberando oxígeno
(O2) en el proceso y quedándose con 2 hidrógenos (H+). Estos últimos pueden servir para obtener
poder reductor en forma de NADPH en el lumen de la membrana del tilacoide y/o para
transportarlos mediante una cadena de electrones y complejos proteicos de quinonas y citocromos
para generar un gradiente de protones que es usado por la ATP sintasa para obtener ATP. Tanto el
poder reductor en forma de NADPH y la energía en forma de ATP será usada después para la fijación
de carbono o en el anabolismo de hidratos de carbono, que posteriormente, podrán ser convertidos
en otros azúcares mediante respiración celular según requiera la célula (Vermaas 2001) (Fig. 9).

Figura 9. Diagrama de la fotosíntesis en cianobacterias. Modificado de Yang et al. (2016). Fotosistema II (PDB 2AXT),
ferrodoxin-NADP reductasa (PDB 1EWY), ferrorodoxina (PDB 4FXC), ferrodoxin NADP reductasa (PDB 2BSA), fotosistema
I (PDB 2WSC), ferrodoxina (PDB IGR1), plastocianina (PDB 1BYO), F-ATPasa (Loll et al. 2005).

8
1.3 Técnicas para identificación de cianobacterias

1.3.1 Observaciones por microscopía

Debido a su tamaño de entre 0.5 a 80 micras, una de las técnicas más ampliamente usadas para la
identificación de cianobacterias es la microscopía óptica. Asimismo, la microscopía electrónica de
barrido (scanning electron microscopy SEM) o de transmisión electrónica (transmission electron
microscopy TEM) ayudan a obtener detalles de estructuras como tilacoides, vainas y membranas.
Algunas técnicas de microscopía óptica pueden acoplarse a técnicas de infrarrojo o microscopía
confocal láser de barrido (confocal laser scanning microscopy, CLSM) para excitar clorofilas y
fotopigmentos y así, discernir a las cianobacterias de otras bacterias en muestras ambientales
(Hernández et al. 2004) (Tabla 2).

La morfología y morfometría pueden usarse para clasificar cianobacterias a nivel de género (Rogers
& Kadner 2018). Sin embargo, se sabe que las cianobacterias son capaces de sufrir rápidas e
importantes adaptaciones morfológicas, por lo que la recomendación universal es complementar
estas técnicas con caracterizaciones moleculares y de cultivo (Komáreck 2006, Larsson et al. 2011).

Tabla 2. Tipos de microscopía.

Principio Técnica Referencia

Microscopía Óptica De campo brillante Zenhausern et al. 1994
De campo oscuro Pluta & Maksymilian 1988
Contraste de fases Snigirev et al. 1995
Contraste de interferencia diferencial Hoffman & Gross 1970
Fluorescencia Leung & Chou 2011
Confocal, Láser Webb 1996
De dos fotones Denk et al. 1990
Microscopía Electrónica De transmisión Williams & Carter 1996
De barrido Unakar et al. 1981
Digital Daninoet al. 2001
Efecto túnel Binnig et al. 1982

1.3.2 Aislamiento de cultivos

El aislamiento en microbiología ha sido una técnica crucial para caracterizar microorganismos, el

cultivo de un microorganismo se usa para realizar diferentes pruebas morfológicas, bioquímicas,
fisiológicas y moleculares. Sin embargo, se estima que sólo 1% de las especies de bacterias pueden
ser cultivadas por medios tradicionales (Vartoukian et al. 2010). Una de las mayores dificultades
para aislar cianobacterias, es que muchos géneros descritos pueden encontrarse en estados viables
no cultivables, además de que sus tiempos de duplicación son largos pudiendo ser de horas hasta

9
días (Chen et al. 2012, Møller et al. 2014). Así mismo, el aislamiento se complica más cuando se
trabajan con muestras ambientales, donde el inóculo inicial está formado por una comunidad
diversa, y que por condiciones diferenciales del cultivo los organismos empiezan a excluirse
competitivamente unos a otros (Palinska & Krumbein 1998, Stuart et al. 2015).

En el caso de cianobacterias, factores importantes a considerar para cultivos son: luz, temperatura,
salinidad, pH y nutrientes. Los medios comúnmente usados son BG11, BG11o, BG11o-PGY, ASN-III
agar Difco-bacto, medio MLA, medio Zarrouk (Bolch & Blackburn 1996). Debido a que cada medio
de cultivo puede favorecer en cianobacterias cambios fenotípicos y genotípicos, debe darse un
seguimiento continuo en microscopía o técnicas moleculares a los cultivos para evidenciar cualquier
adaptación o cambio que sufran en el proceso de aislamiento y no confundir posibles
contaminaciones con plasticidad fenotípica (Acreman et al. 1994).

1.3.3 Técnicas moleculares para identificación de cianobacterias

Existen diferentes técnicas moleculares para identificar cianobacterias, pueden dividirse en tres
aproximaciones:

1) La primera aproximación se basa en un ensayo de ausencia/presencia, en donde se busca

amplificar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un biomarcador específico. Esta técnica
es útil para identificar pico cianobacterias difíciles de observar por microscopía. Pueden usarse
como biomarcadores genes de ciano-toxinas (Yen et al. 2012), genes nif involucrados en la fijación
de nitrógeno (Gaby & Bucley 2014) y otros genes asociados a fotosíntesis (Summons et al. 1999). Si
bien, estas técnicas no tienen una gran profundidad taxonómica descriptiva; es decir, no disciernen
filogenéticamente los tipos de cianobacterias, sí aportan información cuantitativa relativa, dando
información de la abundancia que hay del marcador en lugares específicos. Esta herramienta es muy
útil para comparar sitios, tratamientos diferenciales o expresión diferencial de genes asociados a
grupos específicos de cianobacterias (Savichtcheva et al. 2011).

2) La segunda aproximación se basa en una comparación de diferencias genéticas entre organismos,

en regiones específicas del genoma o fragmentos del mismo, se pueden identificar por ejemplo
patrones de bandeo al tratar enzimáticamente el genoma de diferentes organismos (cada especie
puede presentar un patrón especifico o huella genética) (Rasmussen et al. 1998). También pueden
compararse presencia o ausencia de secuencias específicas en un ensayo de hibridación al ADN
conocido como Chips de microarreglos (Rantala et al. 2008). Estas técnicas sirven para caracterizar
y discernir finamente organismos que son muy parecidos, por ejemplo, entre géneros o variedades
de cianobacterias, por lo que se requiere trabajar con cultivos monocianobacteriales (Bodrossy &
Sessitsch 2004).

3) La tercera aproximación se basa en la secuenciación de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ya

sea del genoma completo o regiones específicas del mismo (Shah et al. 2011). Estas técnicas de
secuenciación son las más utilizadas para describir nuevos géneros y especies de cianobacterias.
Actualmente existen diferentes plataformas de secuenciación y pueden dividirse en 3 grandes
grupos: secuenciación de primera generación, de segunda generación o de secuenciación masiva y
de tercera generación (Heather & Chain 2016). Cuando las técnicas de secuenciación se utilizan para
caracterizar muestras ambientales se les conoce como metagenómica (Petrosino et al. 2009).

10
En la secuenciación de primera generación, se infiere el orden de cada base al realizar reacciones
de síntesis de ADN y terminarlas a diferentes tiempos, con bases terminadoras marcadas radio o
fluorométricamente, que después al correr en un gel de electroforesis o capilar podrán visualizarse
en orden de tamaño (Sanger & Coulson 1978, Klindwort et al. 2013). Pueden secuenciarse regiones
pre amplificadas de un genoma o genomas cortos, de entre 500 a 1000 pares de bases (pb). A este
límite en pb se le conoce como longitud de lectura o read y será establecido por la plataforma de
secuenciación (Wommack et al. 2008). Una de las más grandes ventajas que presenta la
secuenciación clásica es la de calidad y precisión de los reads, ya que cada secuencia se trabaja
individualmente (Schuster. 2007). Estas técnicas de secuenciación se utilizan cuando cepas de
cianobacterias están aisladas, mediante PCR de las regiones hiper-variables de la subunidad 16
ribosomal (16S rRNA), que sirven para clasificar taxonómicamente grupos bacterianos. Gracias a que
existen cebadores o primers específicos para la amplificación de regiones 16S rRNA de
cianobacterias (Neiland 1995, Nubel 1997) se puede discriminar de otros grupos bacterianos. Se ha
establecido la región hípervariable V4 como un sitio deseable para análisis taxonómicos en
cianobacterias (Fig. 10) (Komáreck 2014, Yang et al. 2016). Aunque, debido a que el genoma de
cianobacterias es altamente variable en tiempos generacionales cortos (reflejo de sus rasgos
adaptativos y de desarrollo), muchas veces un sólo análisis de la secuencia 16S ribosomal no es
suficiente y se recomienda comparar otros clúster de genes simultáneamente (Larsson et al. 2011,
Shih et al. 2013).

Figura 10. Regiones híper variables del 16S rRNA procarionte (Modificado de Singer et al. 2016).

También se han desarrollado derivaciones de métodos para trabajar metagenomas con

secuenciación de primera generación, como la librería de clonas, que permite separar diferentes
secuencias en diferentes clonas para secuenciarse independientemente. La librería se basa en
insertar por trasformación fragmentos pre-amplificados, por ejemplo, regiones del 16S de
cianobacterias en células competentes -generalmente en Escherichia coli-. Esta técnica toma el
supuesto de que cada colonia transformada, viene de una clona que contiene una secuencia 16S
rRNA diferente. Al secuenciar independientemente las colonias se obtendrá un conjunto de
secuencias que representan la diversidad parcial de la muestra de estudio (Fig. 11).

Esta técnica permite mayor resolución cuando se acopla a secuenciación de primera generación,
aunque su información de abundancias es pobre (Kawata et al. 1998, Heijs et al. 2007, Quail et al.
2012). Las librerías de clonas de meta genomas siguen siendo un recurso importante en trabajos de
de diversidad y función genética de grupos específicos mega diversos, como es el caso de las
cianobacterias (Wommack et al. 2008).

11
Figura 11. Metodología general para la construcción de librería de clonas (basado en Ackkermans et al. 1995).

Por otra parte, la secuenciación de segunda generación o secuenciación masiva, se basa en medir
en tiempo real metabolitos secundarios durante la síntesis de ADN, como el pirofosfato acoplado a
una reacción con luciferasa (Pirosecuenciación 454), terminadores reversibles marcados (Illumina
HiSeq y MiSeq), cambios de pH (Ion Proton) o mediante ADN ligasas (SOLiD). El ADN a secuenciar se
fija en una base sólida o emulsión aceitosa para crear librerías y poder identificar los productos de
la síntesis o ligación. La ventaja de estas técnicas es que pueden procesarse paralelamente cientos
de pequeños fragmentos de ADN de entre 100 a 700 pb, según la plataforma, reduciendo los
tiempos de secuenciación y costos de reactivos (Quince et al. 2017).

Las secuencias o reads pueden ensamblarse posteriormente por un análisis computacional, lo que
a veces puede dificultar la identificación de secuencias únicas por sub-representación, o generar
quimeras de ADN (Wommack et al. 2008), por esta razón la metagenómica total se limita a
ensambles de genomas de novo o a información metabólica/funcional de grupos generales de
organismos (Shih et al. 2013). A pesar de estos problemas, las diferentes plataformas Next-gen cada
vez mejoran en costo y calidad de secuencias (Alvarenga et al. 2017) (Tabla 3).

Para una aproximación taxonómica procarionte de mayor cobertura existe la metagenómica

dirigida, en donde se secuencian solamente las regiones del 16S rRNA seleccionados mediante una
pre-amplificación con PCR (Cuvelier et al. 2010, Caporaso et al. 2012). Esta técnica da información
tanto de diversidad taxonómica como de abundancias relativas (Wang et al. 2009).

12
Gracias a la metagenómica dirigida se ha podido describir una enorme diversidad procarionte en
diversos ecosistemas. Se discute que, aunque la metagenómica dirigida es una herramienta muy
poderosa para caracterización taxonómica de muestras ambientales, éstas se deben contrastar con
técnicas de secuenciación de primera generación, que permitan corroborar las secuencias
identificadas y evitar la sobre o sub representación de datos genómicos (Shah et al. 2011).

Las tecnologías de 3ra generación se basan en la secuenciación de una sola cadena en tiempo real
con reads desde 3000 a 15000 pb, por lo que se utilizan en paralelo con NGS para funcionar como
andamios en el ensamble de genomas de Novo, aunque sus plataformas todavía tienen un
porcentaje de error y precio alto, estas tecnologías aún siguen en desarrollo, por lo que se espera
su constante mejora (Heather & Chain 2016).

Tabla 3. Plataformas de secuenciación.

Tamaño de las
Generación Plataforma Principio químico secuencias (pb)
Tiempo Ventaja
Terminación de la Reads alta
1ra Sanger 300-1000 1-2 días
cadena calidad
2da 454 Roche GS Piro secuenciación 500-700 8-23 hr Reads largos
Illumina MiSeq y
2da Terminadores marcados 100-400 2 días Bajo costo
HiSeq
Reads alta
2da SOLiD Ligación 0-85 8 días
calidad
2da Ion Proton Detección pH 100-200 2 hr Rápido

3ra Pac Bio Detección tiempo real 3000-15000 20 min Reads largos

Cabe aclarar que el mayor problema que existe en los análisis moleculares de secuenciación se
presenta por la calidad y cantidad del ADN extraído. Ya que dependiendo del medio donde se extrae,
el ADN puede contener diferentes sales y metales que interfieran en el proceso de amplificación o
secuenciación (Goldberg et al. 2016). Para cianobacterias se sabe en especial que los órdenes
Chrococcales, Pleurocapsales y Nostocales son difíciles para extraer DNA por sus gruesas paredes
de celulares y su abundante EPS (Pannard et al. 2016), lo que muchas veces puede sesgar las
abundancias de comunidades cianobacterianas (Luna et al. 2006).

13
2 PLANTEMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA

Las cianobacterias son microorganismos importantes en la acreción y precipitación de minerales

carbonatados, como aragonita, hidromagnesita, entre otros. También se sabe que existe una
estrecha interacción entre estos organismos fotótrofos y la formación de microbialitas.

Aunque trabajos previos sobre microbialitas del lago Alchichica aportan un panorama general de la
descripción de la diversidad de procariontes y cianobacterias (Tavera & Komárek. 1996, Couradeau
et al. 2011, Kaźmierczak et al. 2011, Centeno et al. 2012, Valdespino-Castillo et al. 2018), se necesita
un conocimiento más detallado de las cianobacterias en microbialitas a profundidades mayores de
14 metros. Por tanto, el interés de este trabajo radica en dar continuidad en la identificación de la
biodiversidad de cianobacterias desde superficie hasta 30 m de profundidad, identificando
finamente por microscopía y comparando con diferentes métodos moleculares, para caracterizar
cianobacterias en las diferentes profundidades que pueden estar favoreciendo la precipitación
mineral en las microbialitas del lago cráter de Alchichica.

3 HIPÓTESIS DE TRABAJO

La diversidad de las cianobacterias a nivel género será mayor en microbialitas someras, y

será menor al aumentar la profundidad, ya que existirán más cianobacterias adaptadas a
vivir a mayor intensidad de luz.

14
4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Describir y caracterizar las cianobacterias presentes en microbialitas esponjosas del lago

cráter Alchichica a lo largo de un gradiente de profundidad (de 3 a 30 m) empleando
métodos independientes y dependientes de cultivo.

4.2 Objetivos Particulares

• Detectar las cianobacterias presentes en las microbialitas esponjosas del lago a

diferentes profundidades por métodos independientes de cultivo (>3 m).
• Obtener cultivos de cianobacterias a partir de muestras >3 m.
• Caracterizar los cultivos de cianobacterias obtenidos por análisis tanto morfológico
cmo molecular (16S rRNA)

15
5 MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Colecta de muestras de microbialitas en un gradiente de profundidad

Se colectaron muestras vivas de microbialitas en la zona norte del lago (para un fácil acceso del
equipo de buceo) de 4 profundidades: 3, 10, 20 y 30 m en marzo y octubre de 2016 (Fig. 12). Al
momento de ser colectadas las muestras se separaron para los diferentes análisis en: i) microscopía
(100 g en frascos con papel secante), ii) establecimiento de cultivos (100 g en botellas de agua
con medio circundante, por duplicado) y 3) extracción de ácidos nucleicos (5 g congeladas al
momento en nitrógeno líquido).

A) B)

Figura 12. Zona de muestro de las profundidades 3, 10, 20 y 30 metros. A) Localización del sitio de muestreo en un
gradiente verical. B) Zona de descenso para el buceo.

5.2 Extracción, visualización y cuantificación de ácidos nucleicos.

La extracción de ADN metagenómico se realizó con el Kit DNAeasy PowerSoil (Qiagen), a partir de
250 mg de muestra y siguiendo las especificaciones del fabricante. Para la extracción de DNA
genómico a partir de cultivos, se hizo con un pre tratamiento de 3 ciclos de congelamiento por
nitrógeno líquido y maceraciones de las células descritas según lo descrito en Palinka et al. (2006).
Posteriormente, se extrajo el DNA con el kit UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (Mobio, Carlsbad,
CA, Estados Unidos). El ADN obtenido se visualizó en geles de agarosa al 1% y fue cuantificado
mediante espectrofotometría (Nanodrop Thermofisher) y fluorometría (Qubit™ dsDNA HS Assay Kit,
Thermo Scientific).

5.3 Amplificación de fragmentos 16S rRNA

Para identificar las cianobacterias en las muestras de microbialitas por métodos independientes de
cultivo, se realizaron reacciones de PCR a partir del ADN metagenómico extraído de cada
microbialita a diferentes profundidades (z3, z10, z20 y z30). Para ello se utilizaron primers
específicos para cianobacteria: Cya359F y Cya781R (Nübel et al. 1997) (Tabla 4). Las reacciones de
PCR se llevaron a cabo en un volumen de 25 µl, con 2 l de ADN metagenómico (1-20 ng), 0.2 µl Taq
DNA Polimerasa (5 U/µl) (Invitrogen), 2.5 µl de MgCl2 (50 mM), 2.5 µl de Buffer 10X para Taq
Polimerasa (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 1 µl de cada primer (10 µM) y 0.5 µl de dNTPs
(200 mM).

16
 Tabla 4. Secuencia de los primers usados amplificar regiones V4 16S rRNA de Cianobacteria
(Nübel et al. 1997).
Nombre Secuencia (5’ – 3’)
CYA359Fc GGG GAA TYT TCC GCA ARG GG
Cya781Re GAG TAC TGG ATC TAA TCC CAT T

Las condiciones del protocolo de amplificación fueron una desnaturalización inicial a 94°C por 4 min,
seguida de 35 ciclos de 1) desnaturalización a 94°C por 30 segundos, 2) alineamiento a 60°C por 30
segundos, y 3) elongación a 72°C por 30 segundos. Con una extensión final de 72°C por 10 min. Las
reacciones se realizaron por quintuplicado para cada profundidad y los productos (ca. 380 pb) se
corrieron en un gel de agarosa 1% con SYBR safe (Invitrogen) y solución amortiguadora TAE al 1X
(80 V durante 40 min). Para visualizar el tamaño correcto de los productos se empleó un marcador
de tamaño molecular adecuado, una vez identificada las bandas se escindieron los productos del
tamaño requerido para purificarlos mediante el kit QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen), para
posteriormente ser utilizarlos en la construcción de los vectores para la librería de clonas.

Para identificar a las cianobacterias aisladas mediante 16S rRNA se utilizaron los primers CYA359Fc
y CYA781R (Nübel et al. 1997). Para ello, se para amplificaron por reacciones de PCR en un volumen
de reacción de 25 µl, con 2 l de ADN genómico (1-20 ng) bajo las condiciones de reacción y el
protocolo de amplificación anteriormente mencionados. Los amplicones se confirmaron por
electroforesis. Se cuantificó su concentración final mediante fluorometría con el kit fluorometria
(Qubit™ dsDNA HS Assay Kit, Thermo Scientific). Los amplicones se mandaron a secuenciar
directamente a Macrogen (Corea del Sur) y a la Unidad de síntesis y secuenciación de DNA, Instituto
de Biotecnología UNAM (IBT-UNAM).

5.4 Librería de clonas

Para determinar las secuencias de cianobacterias del ADN metagenómico en las diferentes muestras
(z3, z10, z20 y z30), se construyeron librerías mediante clonación. Para ello, los amplicones
purificados (4 l) se ligaron al vector pCR 2.1 TOPO (Invitrogen) siguiendo las especificaciones del
fabricante. Estos vectores circulares se emplearon para transformar células quimio competentes de
Escherichia coli TOP 10. Para obtener las clonas con inserto, se realizó una selección mediante -
complementación siguiendo los protocolos reportados por el fabricante. Para ello, las
transformantes (150 l) fueron plaqueadas en cajas Petri con medio LB con ampicilina (100 mg/ml)
y X-Gal (40 mg/ml). Las clonas con señal positiva de inserción, fueron seleccionadas, y la región
insertada (i.e. la region V4 cianobacterial) fue amplificada con los primers M13F:M13R (Tabla 5),
siguiendo los protocolos determinados (Invitrogen). Finalmente, los amplicones fueron enviados al
servicio de Macrogen (Corea del Sur) y secuenciados con el primer M13F.

17
 Tabla 5. Primers M13 usados para amplificar insertos del vector.

Nombre Secuencia (5’ – 3’)

M13F GTA AAA CGA CGG CCA G
M13R CAG GAA ACA GCT ATG AC

5.5 Análisis de secuencias

Para el análisis de comunidades de cianobacterias, las secuencias obtenidas de librería de clonas, se
limpiaron, eliminando secuencias con mala calidad en el cromatograma, se eliminaron vectores, las
secuencias se alinearon y se colapsaron en OTUs (Unidad Taxonómica Operacional) con un cut-off
al 97% mediante el pipeline de Mothur (Schloss et al. 2009).

Cada OTU fue analizado mediante el programa BLAST (Kent. 2002) y mediante una agrupación por
similitud se construyó un dendograma en el programa Seaview por el método del vecino más
cercano (Neighbor Joining) con el modelo Kimura 2P y un bootstrap de 1000. Las secuencias OTUs
de la librería de clonas fueron comparadas mediante BLAST con 1) secuencias tipo de cianobacterias
de la base de datos NCBI, 2) secuencias cianobacterias no cultivadas repotadas en la base de datos
NCBI, 3) cianobacterias del lago Alchichica previamente reportadas por Couradeau et al. (2011), 4)
OTUs de secuenciaciones MiSeq del mismo grupo de trabajo, y 5) secuencias de cultivos aislados

Los análisis filogenéticos de las secuencias se llevaron a cabo usando el programa Mega v.7 (Tamura
et al. 2011). Los árboles se construyeron usando algoritmos de Neighbor Joining, Parsimonia y
Máxima Verosimilitud. El mejor modelo filogenético para Máxima Verosimilitud se calculó mediante
una matriz comparativa.

5.6 Establecimiento de cultivos y aislamiento de cianobacterias

En octubre 2016 se colocaron trozos de microbialita viva (de 10 y 20 m de profundidad) en
recipientes plásticos (8 x 8 cm) por duplicado, con 300 ml de agua del lago Alchichica, y se dejaron
crecer en condiciones de luz natural y temperatura ambiente. Los cultivos se mantuvieron creciendo
por dos años, hasta que por evaporación decayeron perdiendo coloración. En estos fragmentos se
encontraron organismos heterotróficos, así como larvas de insecto y nemátodos. En febrero 2017
se inoculó otro trozo de microbialita congelada de z=30 se dejó crecer igual en condiciones de
temperatura ambiente y luz natural (Fig. 13).

Figura 13. Recipientes de plástico de 300 ml

con fragmentos de microbialita después de 5
meses de crecimiento en condiciones de luz
natural y temperatura ambiente, de izquierda
a derecha dos de 10 m de profundidad (z=10),
dos 20 m de profundidad (z=20) y uno de 30 m
de profundidad (z=30) que se inoculó en marzo
2017.

18
Consecuentemente, se establecieron otras estrategias para aislar cianobacterias. De las muestras
tomadas en fresco en el muestreo, se sembraron fragmentos de microbialita de 2 cm en placas Petri
por triplicado por profundidad, enriquecidas con medio sólido Bayfolan, BG11, BG11 (0) y agua
filtrada de Alchichica (membranas de 0.2 μm, Millipore). Todas las cajas se dejaron crecer a
temperatura ambiente y condiciones de luz natural. Del tapete microbiano que se formó, se
separaron colonias por estiramiento y se aislaron por morfología y color durante año y medio, hasta
que se obtuvieron cultivos monocianobacteriales. Se resembraron los aislados de cajas Petri en
frascos de cultivo con respirador y medio líquido BG11 en condiciones de temperatura ambiente y
luz natural.

Independientemente, en matraces de 250 ml con agua de Alchichica (300 ml) se sembraron

directamente fragmentos de 2-5 cm de microbialita, se dejaron a temperatura ambiente y luz
natural. De los tapetes formados en matraz igualmente se resembraron y aislaron en cajas Petri para
su posterior análisis en microscopía y caracterización por técnicas moleculares. Paralelamente se
mantuvieron cajas Petri con BG11 en termostato 26°C.

5.7 Identificación por microscopía y morfometría

Para realizar observaciones al microscopio se hicieron preparaciones semipermanentes con una
solución fenol (20g/l) y glicerina (20 g/l) con muestras de microbialita secas y tratadas con ácido
acético al 5% para separar la fase orgánica de la mineral. Las observaciones se realizaron en un foto-
microscopio Olympus BXX51 con contraste interferencial diferencial DIC, y cámara digital DP 12. Se
utilizó el programa Sigma Scan Pro para tomar dimensiones y medidas. Las características de las
cepas se analizaron con base a las características morfológicas y morfométricas, i.e. color, ancho y
largo de las células, presencia o ausencia de vaina, de mucilago, estructuras reproductivas como
necridios, hormogonios o beocitos. La información recabada fue comparada con aquella reportada
en Komárek et al. (2014). Estas observaciones se realizaron en el laboratorio de Ficología de la
Facultad de Ciencias, UNAM. Por otra parte, se hizo microscopía de los cultivos durante el
aislamiento y se monitorearon las colonias cada 15 días con un microscopio Primo Star Zeiss en el
laboratorio de Ecología Microbiana en el Instituto de Ecología, UNAM. Posteriormente, los cultivos
monocianobacteriales fueron llevados al microscopio Olympus BXX51 para análisis morfométricos.

19
Figura 14. Diagrama de flujo de la metodología empleada en esta investigación.

20
6 RESULTADOS

6.1 Identificación de cianobacterias en microbialitas por microscopía óptica

En la identificación de las cianobacterias en las microbialitas por microscopía óptica, se realizaron
20 preparaciones fijas por profundidad (80 en total) y otras 30 preparaciones sin fijación (120 en
total) para observar la diversidad a través de las diferentes profundidades. Se compararon
microbialitas de los dos muestreos (marzo y octubre), pero no se encontró ninguna diferencia
significativa en las comunidades cianobacterianas de las profundidades de 10 y 20 m. Sin embargo,
se encontró una mayor cantidad de clorofitas, diatomeas y cianobacterias filamentosas en colectas
de octubre a 3 metros, patrón que ya se ha estudiado en florecimientos en la columna de agua
durante invierno (Alcocer et al. 2008). Las especies identificadas por microscopia, cultivos y
secuenciacion se describen en la Tabla 7, las observaciones microscópicas obtenidas en las Figsuras
15, 16, 17 y 18 y sus datos morfométricos en las Tablas 8 y 9.

Tabla 6. Cianobacterias identificadas en microbialitas y sus abundancias relativas.

Especie Características Abundancia

3 10 20 30

Nostocal más abundante en microbialita de 3m de profundidad, forma colonias radiales, 3 10

Rivularia sp.
heterocistos basales adheridos a detritos, gruesa envoltura de mucilago, tricomas atenuados.
Calothrix cf Presenta ramas falsas, crecimiento isopolar, coloraciones verdes olivo y pardas, abundante en
parietina. superficie, tricomas más anchos y menos atenuados que Rivularia sp.
Filamentos verdes y delgados de 2 micras de ancho, presenta enredamiento y formación de nudos
Nodosilinea sp.
característicos del género. Abundante en 3 y 20 metros.
Xenococcus Coloración violeta, células amorfas de 1 a 2 micras de diámetro, envueltas en beocitos o forma libre,
candelarie abundante a 30m de profundidad creciendo sobre detritos, no se encontraron fases epífitas.
Chroococcidium Células cocales amorfas de tamaños diferentes, presente en todas las profundidades, coloraciones
gelatinosum verdes, marrones en superficie, violetas en profundidad, división multiple.
Domina zonas de 20 m, presenta coloraciones verdes, negras y marrones, células amorfas envueltas
Pleurocapsa sp.
en vaina gruesa, pseudofilamentos, aveces crecimiento radial.
Coloracion morada-violeta, presenta gran producción de ficoeritrina en cultivo y beocitos grandes
Stanieria sp.
de hasta 20 micras de diámetro, siempre en consorcio con Chroococcidium y Pleurocapsa.
Chroococcidiopsis Pequeñas colonias cocales asimétricas de tamaño regular, presenta coloración marrón-café,
sp. abundante en 20 metros y cultivos.
Filamentos delgados de 2 micras de largo, necridios rectangulares, tricomas isopolares,
Phormidium sp.
hormogonios abundantes en cultivo, solo se detectó en superficie.
Chroococcus cf Muy rara solo en zonas intermedias 10 y 20 metros de profundidad se obtuvó abundante en cultivos
schizodermaticus pero no se pudo aislar.
Picocianobacterias en forma de bacilo, alargadas entre 1 y 2 micras de largo muy abundante en
Synechococcus sp.
secuencias 16S rRNA.
Pseudoanabaena De color roja, filamentos largos de 3 micras y delgados de 1 micra de ancho, forman filamentos
sp. trenzados, muy abundantes en cultivos pero apenas detectables en muestras de superficie.
Abundante en 3 y 10 metros de profundidad, cianobacteria de mayor biomasa en cultivos, se
Leptolyngbya sp.
perciben vainas de filamentos muertos hasta 30 metros de profundidad
Oculatella sp. Filamentos largos y delgados, en cultivo desarrollan punta con ficoeritrina característica.
Abundante a 3 y 20 metros de profundidad, vaina mucilaginosa gruesa y crecimiento en un plano de
Chlorogloea sp.
division
Entophysalis Abundante de 3 a 20 metros de profundidad envuelta en vaina de mucilago grueso y transparente,
atrata. presentan un plano de división y pseudofilamentos, coloraciones rojas verdes y moradas.
Muy rara en microbialita de 3 metros, pero abundante en cultivos, tamaño de 1 a 2 micras en
Cyanobium sp.
diámetro.
En 3 y 10 metros de profundidad células verdes envueltas en mucilago, crecimiento en colonias
Aphanotece sp.
emvueltas. Debe compararse con Aphanocapsa sp.

21
Cianobacterias detectadas por microscopía en microbialitas a3 metros de profundidad

Figura 15. Microscopía óptica de cianobacterias encontradas en microbialitas a 3 m de profundidad, tratadas con ácido
acético al 1% y fijadas con formol. a) Dos tipos de cianobacterias filamentosas que se describieron como Calothrix cf
parietina (atrás) y Rivularia sp. (delante), por su característica de tricomas atenuados, formar ramas falsas y ser
heteropolares. b) Aphanotece sp. y atrás posibles filamentos de Leptolyngbya sp., Nodosilinea sp. u Oculatella sp. c) Ramas
falsas características de Calothrix cf parietina d) Células hijas de Chroococcidium gelatinosum y picocianobacterias posibles
Cyanobium sp. o Synechococcus sp. e) Fases de división de Chroococcidium gelatinosum. f) Rivularia sp. es la cianobacteria
Nostocal más abundante en 3 m como ya se ha reportado.

22
Cianobacterias detectadas por microscopía en microbialitas a 10 metros de profundidad

e) f)

Figura 16. Microscopía óptica de cianobacterias encontradas en microbialitas a 10 m de profundidad, tratadas con ácido
acético al 1% y fijadas con formol. a) posible Chroococcidiopsis sp. con picocianobacterias alargadas tipo Synechococcus
sp. b) Entophysalis atrata. y beocito de Stanieria sp. c) Entophysalis atrata en púrpura y posbile Chlorogloea sp., en verde,
alrededor filamentos muy tenues de otras cianobacterias posiblemente Leptolyngbya y picocianobacterias posibles
Synechococcus sp. d) Posible división de Pleurocapsa sp. e) consorcio de Pleurocapsales en verde Chrococcidium
gelatinosum, en morado Staineria sp. f) Microscopía de zona roja de microbialita, se observan detritos con células muertas
y restos de lo que pudo ser Entophysalis atrata.

23
Cianobacterias detectadas por microscopía en microbialitas a 20 metros de profundidad

Figura 17. Microscopía óptica de cianobacterias encontradas en microbialitas a 20 m de profundidad. a) Cuatro tipos
diferentes de Pleurocapsales, en verde se sigue un plano de división posiblemente Aphanothece sp., en morado se ve en
forma cocal Chroococcidium gelatinosum., en rosa oscuro y con morfología más grande parece distinguirse
Chroococcidiopsis sp., en marrón hay pequeñas células no distinguibles. b) Células irregulares de clorofitas c) clorofitas
mezcladas con Stanieria sp. y Entophysalis atrata.. abajo en un solo plano de division d) filamentos delgados de posible
Nodosilinea sp. y la fase inicial de Gloeocapsa sp. envuelta en mucilago. e) Cianobacterias filamentosas posiblemente
Leptolyngbya sp. f) En café pequeñas células de Aphanotece sp., en verde fases de división de Pleurocapsa sp. una de las
cianobacterias mas abundantes a 20 metros.

24
Cianobacterias detectadas por microscopía en microbialitas a 30 metros de profundidad

Figura 18. Microscopía óptica de cianobacterias encontradas en microbialitas a 30 m de profundidad, a) y b) Región

calcificada de cianobacterias filamentosas y diatomeas muertas con posible Aphanotece sp, c) y d) La diversidad de
cianobacterias se limita a Pleurocapsa sp, Chroococcidium gelatinosum y pocos Xenococcus candelariae a 30 m, también
fases de Cladophora son abundantes, e) Chroococcidium gelatinosum, f) Fases de división de Xenococcus candelariae.

25
 Rivularia sp. A) Calothrix cf parietina B)
Largo heterocisto basal Alto célula Ancho célula Largo heterocisto basal Largo célula Alto célula

Promedio 11.96 2.574 3.997 Promedio 5.443 3.311 4.125

Dv Est 5.072 1.115 1.806 Dv Est 0.993 0.994 1.271
Err Est 1.23 0.142 0.228 Err Est 0.217 0.217 0.24
95% Conf 2.608 0.283 0.455 95% Conf 0.452 0.452 0.493
99% Conf 3.593 0.377 0.605 99% Conf 0.617 0.617 0.665
n 37 62 63 n 30 28 28
Min 5.624 0.145 1.651 Min 3.321 1.581 1.656
Max 21.617 5.515 7.354 Max 7.62 5.97 5.778

C) D)
Nodosilinea sp.
Xenococcus candelariae
Ancho con vaina Ancho célula Alto célula
Diámetro célula madre D beocitos D vaina
Promedio 2.254 1.706 0.801
Promedio 6.348 2.467 6.748
Dv Est 0.281 0.278 0.299 Dv Est 2.081 0.564 2.481
Err Est 0.038 0.037 0.037 Err Est 0.264 0.075 0.664
95% Conf 0.076 0.074 0.075 95% Conf 0.528 0.15 0.928
99% Conf 0.101 0.099 0.099 99% Conf 0.703 0.199 1.103
n 55 56 64 n 62 57 62
Min 1.763 1.213 0.309 Min 2.652 1.312 3.052
Max 2.867 2.317 2.089 Max 12.322 3.723 12.722

Chroococcus cf
E) F) G)
Leptolyngbya sp.
schizodermatic Phormidium sp.
Ancho Ancho Alto
Alto célula Alto célula Ancho célula
célula
Promedio 1.061 2.021 Promedio 1.117 0.863
Promedio 1.122 2.157
Dv Est 0.366 0.316 Dv Est 0.279 0.294
Dv Est 0.308 0.361
Err Est 0.045 0.038 Err Est 0.037 0.039
Err Est 0.042 0.049
95% Conf 0.091 0.075 95% Conf 0.074 0.077
95% Conf 0.083 0.098
99% Conf 0.12 0.099 99% Conf 0.099 0.103
99% Conf 0.111 0.13
n 65 71 n 57 58
n 35 35
Min 0 1.2 Min 0.451 0.319
Min 0.528 1.337
Max 1.596 1.627
Max 1.834 2.884
Max 2.118 3.076

Tabla 7. Tabla de morfometría sección I. Dimensión en micrómetros de cianobacterias identificadas por microscopía
óptica. Se utilizó un foto-microscopio Olympus BX 51 equipado con DIC (Contraste interferencial, diferencial), y el
programa Sigmascan Pro para obtener las morfometrías, se realizaron aproximadamente 60 observaciones, de al menos
5 fotografías de microbialitas y de cultivos para cada posible género de cianobacterias, las características fueron
comparadas con la información de la página CyanoDB, Komarek y Agnostidis (1998). A) Rivularia, B) Calothrix cf parietina,
C) Nodosilinea sp. D) Xenococcus candelarie E) Chroococcus cf schizodermaticus, F) Phormidium sp. y G) Leptolyngbya sp.

26
 H) J)
Pseudoanaba
Oculatella sp.
I) Synechococ
cus sp.
ena sp.
Alto célula Ancho célula Alto célula Ancho célula
Alto célula Ancho célula
Promedio 2.248 1.249 Promedio 1.748 0.899
Promedio 2.304328358 0.984
Dv Est 0.595 0.244 Dv Est 0.482 0.144
Dv Est 0.764477612 0.195
Err Est 0.08 0.031 Err Est 0.043 0.021
Err Est 0.086044776 0.026
95% Conf 0.161 0.061 95% Conf 0.021 0.034
95% Conf 0.171268657 0.051
99% Conf 0.214 0.081 99% Conf 0.044 0.061
99% Conf 0.227089552 0.068
n 55 64 n 55 64
n 5.895522388 58
Min 1.331 0.743 Min 0.069 0.455
Min 1.119402985 0.567
Max 4.551 2.032 Max 1.468 1.015
Max 7.014925373 1.469

Entophysalis
K) L)
atrata. Pleurocapsa sp.
Ancho
Alto célula Ancho célula Ancho Alto Ancho vaina
vaina
Promedio 3.325 2.055 2.955 Promedio 5.359 5.076 5.859
Dv Est 0.712 0.383 0.383 Dv Est 1.209 1.829 1.209
Err Est 0.096 0.052 0.052 Err Est 0.163 0.236 0.163
95% Conf 0.193 0.104 0.104 95% Conf 0.327 0.473 0.327
99% Conf 0.256 0.138 0.138 99% Conf 0.435 0.629 0.435
n 55 55 55 n 55 60 55
Min 1.629 1.205 2.105 Min 3.123 1.445 3.623
Max 5.925 2.815 3.715 Max 7.944 9.383 8.444

M) N) O)
Stanieria Chroococcidium Cyanobium
sp. gelatinosum sp.
Diámetro Base Ancho
Diámetro vaina Alto célula
célula Alto célula célula célula
Promedio 10.121 10.721 Promedio Promedio 1.748 0.899
5.557 6.345
Dv Est 1.692 1.692 Dv Est Dv Est 0.482 0.144
1.426 1.812
Err Est 0.228 0.228 Err Est Err Est 0.043 0.021
0.187 0.24
95% Conf 0.457 0.457 95% Conf 95% Conf 0.021 0.034
0.375 0.481
99% Conf 0.609 0.609 99% Conf 99% Conf 0.044 0.061
0.499 0.64
n 55 55 n n 55 64
58 57
Min 6.352 6.952 Min Min 0.069 0.455
2.652 0.281
Max 14.022 14.622 Max Max 1.468 1.015
9.246 10.219

Tabla 8. Tabla de morfometría sección II. Continuación de tabla 6. Las unidades están dadas en micrómetros. H)
Pseudoanabaena, I) Oculatella, J) Synechococcus, K) Entophysalis atrara, L) Pleurocapsa sp, M) Stanieria sp, N)
Chroococcidium gelatinosum y O) Cyanobium sp. Cabe aclarar que para Aphanotece sp., no se alcanzó una n mayor a 30
por lo que no se proporcionan sus medidas.

27
6.2 Obtención de cultivos de cianobacterias
6.2.2 Crecimiento en matraces
En octubre 2016, se inocularon 4 matraces Erlenmeyer de 150 ml con fragmentos de 1 cm de
microbialita (z=10 y 20 m) por duplicado. Se adicionó 100 ml de agua de Alchichica y se dejaron
crecer en condiciones ambientales (Fig. 19a). Tres matraces (dos de z=10 y uno de z=20) mostraron
crecimiento de cianobacterias en enero 2017, formando un biofilm o biopelícula en el fondo del
frasco (Fig. 19b).

Figura 19. Cultivos de cianobacterias de microbialitas de 10 y 20 m de profundidad en matraz Erlenmeyer. a) Matraces a

los 3 meses de inoculación con crecimiento de diatomeas en el fondo. b) Matraces a los 4 meses de inoculación con tapete
microbiano en el fondo.

Por microscopia se observó que las cianobacterias en matraz coincidían con las observadas
previamente en las muestras de microbialita fresca (Fig. 20). Aunque las abundancias cambiaron, se
mantuvo una alta diversidad de cianobacterias. En Junio 2017, se usaron algunos trozos de tapete
para cultivar en medio sólido, y tratar de aislar en paralelo con los demás cultivos. Para Septiembre
2017, la diversidad en los matraces sólo se limitó a consorcios de Pleurocapsales como Staneiria sp
Pleurocapsa sp y Chroococcidiopsis sp. junto con otras clorofitas.

28
Figura 20. Microscopía de las cianobacterias encontradas en cultivos de microbialitas de 10 y 20 m en matraz. a) Tres tipos
de Pleurocapsales se identificaron como persistentes en todas las profundidades de las microbialitas esponjosas. b) Un
tipo de clorofita, posiblemente Cladophora. c, d, e) Posibles comunidades de Xenococcaceae o Chrococcidium (en violeta),
un tipo de Acharyochloris en verde y una Pleurocapsa sp. en negro café. f) Un nemátodo con diatomeas alimentándose de
cianobacterias y materia orgánica.

29
6.2.3 Aislamiento de cianobacterias en medio sólido
En noviembre (2017) se cultivaron trozos de microbialita de aproximadamente 2 cm x 1 cm cada
uno, y de cada profundidad (3, 10, 20 y 30 m;) en cajas Petri de 5 ml. Cada profundidad se cultivó
por triplicado con dos medios de cultivo: BG11 y Bayfolan; y con dos condiciones ambientales: en
termostato a 28°C con fotoperiodos 12/12 hrs, 200 Lúmenes de intensidad lumínica y a temperatura
ambiente con luz natural.

Los cultivos que se incubaron a temperatura ambiente con condiciones de luz natural crecieron a
los 3 meses. Los cultivos que se dejaron en termostato no crecieron. Para algunos cultivos funcionó
el medio Bayfolan, pero se optó por mantener el medio BG11. Las cajas Petri se rehidrataron
contantemente con medio BG11 (2- 3 ml) cada 15 días (Fig. 21).

Las inoculaciones y resiembras que se hicieron siguieron el siguiente calendario:

 Enero 2017: se inoculó con las biopelículas que crecieron en los matraces.
 Marzo 2017: se inocularon medios sólidos con agua del lago Alchichica (i.e. agua del lago
Alchichica estéril y agar), con microbialitas de un contenedor plástico.
 Abril 2017: resiembras de los cultivos de las biopelículas que crecieron en los matraces.
 Diciembre 2017: se resembraron 8 cajas de cepas puras.

Figura 21. Cultivos de cianobacterias a los 6 meses de inoculación. Las fotografías se ordenan por profundidad, los
puntos amarillos indican aislamiento en monocultivo.

30
6.2.4 Obtención de monocultivos en medio líquido

A partir de los cultivos en medio sólido, se inocularon 16 frascos de cultivo con respirador de 25 ml
con medio BG11 (abril 2017) (Fig. 22). Se dejaron en condiciones de luz natural a temperatura
ambiente. Se agregaron 20 ml de BG11 cada 15 días. Los frascos sin monocultivo se desecharon, y
los puros se siguieron sembrando para obtener la mayor cantidad de biomasa posible. En diciembre
2017, se hicieron pases de cultivos puros a 10 frascos nuevos.

Figura 22. Aislados en frascos con respirador, se obtuvieron en total 20 frascos de los cuales se fueron haciendo
traspases a medio sólido y de nuevo a medio líquido.

En agosto 2017, los cultivos fueron resembrados en medio sólido a partir de este medio líquido de
abril. En octubre 2017 se aisló mediante capilar cepas de interés bajo supervisión de la Dra. Itzel
Becerra Absalón. Algunos cultivos de medio sólido se mantuvieron en condiciones de termostato
(28°C) en el laboratorio del Dr Gustavo Montejano. En la Figura 23 se muestran las microscopías de
los cultivos aislados.

31
 a) b) c)

d) e) f)

g) h) i)

Figura 23. Microscopía óptica de cultivos aislados. a) Nodosilinea sp. característica por presentar enrollamiento y nudos
en filamentos. b) Rivularia sp. característica de heterocistos y división polar con filamentos apicales. c) Leptolyngbya sp.
filamentos delgados. d) Chroococcidiopsis sp. presenta división múltiple simétrica. e) Pleurocapsa sp. presenta beocitos y
divisiones asimétricas en varios planos y crecimiento en pseudofilamentos. f) Pseudanabaena sp. presenta filamentos
delgados y células largas sin vainas, sus filamentos se trenzan. g) Phormidium sp. delgada presenta necridios y
hormogonios. h) Stanieria sp. con beocitos grandes y circulares regulares. i) Oculatella sp. presenta pigmentos rojos en la
punta del filamento.

32
Gracias a los cultivos en líquido se pudieron finalmente identificar 9 géneros mediante microscopía:
Rivularia, Pleurocapsa Nodosilinea, Oculatella, Phormidium, Pseudnabaena, Chroococcidiopsis,
Stanieria, y Leptolyngbya (Fig. 24). Estos cultivos se mantienen para continuar con análisis
moleculares.

Entophysalis

Figura 24. Esquema de cianobacterias visualizadas e identificadas por microscopía óptica, en muestras frescas de
microbialita y cultivos. Los dibujos se utilizan para presentar en una sola imagen y a una sola escala varios planos detallados
a la vez, que no se pueden observar en una fotografía.

33
6.2.5 Identificación de cultivos por secuenciación del 16S ribosomal
Sólo 10 diferentes cianobacterias aisladas desarrollaron suficiente biomasa para poder extraer ADN
genómico y mandar a secuenciar la región V4 del 16S ribosomal (Tabla 8). Debido a la dificultad para
extraer ADN de cultivos se emplearon 2 técnicas, mediante el Kit DNA Easy PowerSoil (Qiagen) y
mediante una molienda previa con nitrógeno líquido. De las extracciones de ADN, sólo 8 diferentes
pudieron ser amplificadas empleando los primers de Nübel et al. (1997). De éstos, sólo se obtuvieron
5 secuencias con calidad para hacer alineamientos mediante BLAST.

Tabla 9. Cianobacterias asiladas en cultivo, amplificación y secuenciación 16S rRNA

Extracciones de 16S rRNA 16S rRNA

Aislado Género
ADN realizadas amplificado secuenciado
F1 Phormidium sp. 2 1 1
F2 Oculatella sp. 1 1 1
F4 Rivularia sp. 4 3 0
F5 Pseudoanabaena sp. 2 1 1
F6 Leptolyngbya sp. 1 1 0
F18 Nodosilinea sp. 1 1 1
F19 Stanieria sp. 1 0 0
F20 Chroococcidiopsis sp. 3 3 1
Fx Pleurocapsa sp. 1 0 0
F30 Cyanobium sp. 1 0 0

6.3 Caracterización de cianobacterias por librería de clonas

Para identificar a las cianobacterias presentes en las microbialitas se realizaron librerías de clonas.
Primeramente, se llevaron a cabo con productos 16S rRNA obtenidos con los primers 27F y 23Sr
(Lane et al. 1991). Sin embargo, estos productos de 1400 pb resultaron tener muy bajo
rendimiento en el proceso de ligación al vector. Como resultado, en la primera librería no se obtuvo
ninguna clona y en la segunda librería, sólo pudieron obtenerse 10 clonas de z3.

Por esta razón, se decidió emplear los primers CYA359F y CYA781R (Nübel et al. 1997), que dan un
producto de 380 pb; y con ello se mejoró la eficiencia de transformación (Fig. 25). De esta forma
se obtuvieron 22 clonas para z3, 24 clonas para z10, 84 clonas para z20, y 76 clonas para z30 (Tabla
9).

34
 a) b)

Figura 25. Gel de electroforesis en agarosa de fragmentos 16S rRNA amplificados. a) Productos de PCR (Nübel et al. 1997)
obtenidos a partir de ADN metagenómico de z3 (3 m), z10 (10 m), z20 (20 m) y z30 (30 m). PM= marcador molecular de
1000 pb, banda esperada 420 pb aprox. b) Purificación de fragmentos 16S rRNA en gel de agarosa 1%.

Tabla 10. Número de clonas, secuencias y OTUs obtenidos por profundidad

Profundidad Número de clonas Clonas secuenciadas OTUs* detectados

3m 22 22 7
10 m 24 24 10
20 m 84 76 26
30 m 76 76 16
Total 206 198
* OTUs obtenidos a 3% cut-off.

Finalmente, se analizaron los OTUs en un dendograma empleando el modelo del vecino más cercano
(BioNeighbor-Joining), considerando todos los OTUs obtenidos: 5 OTUs de librería z3(27F:23Sr) y 32
OTUs de z3, z10, z20, z30(CYA359F:CYA81R). Dando un total de 37 OTUs por las 3 librerías de clonas
(Fig. 26). Las secuencias se analizaron en conjunto con secuencias de la base de datos NCBI para ver
la distribución de los diferentes OTUs en las diferentes profundidades (Fig. 27).
Frecuencia

Figura 26. Abundancias de OTUs obtenidos por profundidad.

35
 JN825334 Uncultured cyanobacterium clone A1chichica z3 zIO 80
6S 092 TY Nodosil inea nodulosa UTEX2910 EF1226001
63 Otu32A11 -------------------------------------------------------------
"IL--- JNB25336 Uncu ltured cyanobacterium clone A1chichica
~2 0lu31 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
0lu3O

. L_ _
66 0lu19
-::I JN825333 Uncu ltured cyanobacterium clone A1chichica
97 0Iu13 ------------------------------------------------------------- 2
' - - - Otu'8 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
JF423358.1 Uncu ltured Chroococcales mesocosms in Cuatro Cienegas

17

" 0','6
)g
Olu06
0lu14
0lu10
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ :•
•
KU841588.1 Uncu ltured Synechococcus sp. clone CH29
. 0Iu05 ----------------------------------------------
0lu22
424 TY ProchlOfococCUS marinus-NCOO5072
DQ398286. 1 Uncultured cyanobacterium clone FAlLScyano03G09
O1u01

(-_ _ _ _ _ _ _ _ _...,,'" JN825304 Uncultured cyanobacterium clone A1chich ica

10 0 G loeomargarita l ithophora-JQ733894

r - - - 130 TYG Stan iera cyanosphaera-AF132931

'.•
66 044 TYG Cyanobacterium stan iefi-AF132782
Otu33C9
Otu37G8 ------------------------------------------------
" N825321 .1 Uncu ltured cyanobaclerium done A1ch ichica AOl 1 lC 12
Olu07
Otu26
78 Rivularia

• Otu38 H8 ::;;:;;;;;;;-;~:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
r------....::i::::;;:::..:.:.:~
98
Otu39 K15
99 JN825310 Uncultured cyanobacterium done A1chichica
MF507175.1 Uncultured cyanobacterium clone WW CYA OTU0139
63 JN825327
Otu24 -----------------------------------------------
" JN825326.1 Uncultured cyanobacterium clone AL61 2CY 27

" ~1 Otu23
Otu02 --::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ,
~ JN825324
8 5 Otu08 ----------------------------------------------------

JN825325

99 Olu29
Olu09 :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ,
87 JNB25313.1 Uncultured cyanobacterium clone A1ch ich ica AQ1 2 1B 46

r-__-"',5 Otu17 ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

Otu28
~2 JN825331 .1 Uncu ltured cyanobacterium clone A1ch ichica AL33 1 lB 32

••
KJ611379.1 Uncultured Oscillatoriales cyanobacterium clone Cl 9

'.
"
"
r~"~0~4 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
0,,27
Otul1
Otu15
' -_____ 107 Ha lomicronema D0058890
FM995185 .1 Uncu ltured Acaryoch loris sp. partial
JN825339 Uncu ltured cyanobacterium done A1ch ichica
Otu03 ~:;~::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
l____-;~~~~~':'~~~. 0" _2_0___________________________________________
Otu12
JN825322

Figura 27. Agrupación por similitud de distancias de secuencias 16S rRNA de cianobacterias. Se empleó BioNeighbor
Joining (BioNB) con un bootstrap de 1000 y un modelo Kimura 2-parameter (K2P), que asume que las transiciones son más
comunes que las transversiones. Sólo se incluyen los OTUs obtenidos y las secuencias más parecidas de la base de datos.
En cada círculo se indica el número de secuencias que corresponden a ese OTU y la profundidad de donde se obtuvieron.

36
6.4 Comparación de técnicas dependientes e independientes de cultivo.
En el grupo de trabajo se llevó paralelamente una secuenciación por Ilumina MiSeq del DNA
metagenómico de microbialitas dirigido a genes procariontes con los primers 515F y 806R (Caporaso
et al. 2012). Con los datos de secuencias de librería de clonas, secuencias de cultivos y secuencias
de Illumina MiSeq se construyeron árboles filogenéticos mediante Neighbor-Joining (BioNeighbor-
Joining), Parsimonia (Maximun Parsimony) y Máxima Verosimilitud (Maximun Likehood). Las
secuencias se alinearon junto con secuencias tipo de cianobacterias y secuencias anotadas de
cianobacterias no cultivadas de la base de datos NCBI. También se agregaron también secuencias
de cianobacterias un trabajo previo (Couradeau et al. 2011) (Figs. 28-32).

Nostocales

Figura 28. Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA de Nostocales. Se usó el K2P y un bootstrap de 1000, las
secuencias fueron de 250 pb. OTU= OTUs de las 3 librerías de clonas, Mi_: OTUs obtenidos por Ilumina MiSeq, TS:
Secuencias tipo, JN82: Secuencias de cianobacterias reportadas (Couradeau et al. 2011). Cultivo: secuencias de cultivos.
El bootstrap en negro representa el obtenido por Neighbor-Joining; en rojo, Máxima Parsimonia y naranja, Máxima
Verosimilitud. La ausencia de Bootstrap indica que estadísticamente no se conservó esa rama.

Chroococcidiopsidales y Pleurocapsales

Figura 29 Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA de Chroococcidiopsidales y Pleurocapsales. Se usó el K2P y un
bootstrap de 1000, las secuencias fueron de 250 pb. OTU= OTUs de las 3 librerías de clonas, Mi_: OTUs obtenidos por
Ilumina MiSeq, TS: Secuencias tipo, JN82: Secuencias de cianobacterias reportadas (Couradeau et al. 2011). Cultivo:
secuencias de cultivos. El bootstrap en negro representa el obtenido por Neighbor-Joining; en rojo, Máxima Parsimonia y
naranja, Máxima Verosimilitud. La ausencia de Bootstrap indica que estadísticamente no se conservó esa rama.

37
Oscillatoriales

Figura 30. Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA de Oscillatoriales Se usó el K2P y un bootstrap de 1000, las
secuencias fueron de 250 pb. OTU= OTUs de las 3 librerías de clonas, Mi_: OTUs obtenidos por Ilumina MiSeq, TS:
Secuencias tipo, JN82: Secuencias de cianobacterias reportadas (Couradeau et al. 2011). Cultivo: secuencias de cultivos.
El bootstrap en negro representa el obtenido por Neighbor-Joining; en rojo, Máxima Parsimonia y naranja, Máxima
Verosimilitud. La ausencia de Bootstrap indica que estadísticamente no se conservó esa rama.

Chrococcales

Figura 31. Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA de Chrococcales. Se usó el K2P y un bootstrap de 1000, las
secuencias fueron de 250 pb. OTU= OTUs de las 3 librerías de clonas, Mi_: OTUs obtenidos por Ilumina MiSeq, TS:
Secuencias tipo, JN82: Secuencias de cianobacterias reportadas (Couradeau et al. 2011). Cultivo: secuencias de cultivos.
El bootstrap en negro representa el obtenido por Neighbor-Joining; en rojo, Máxima Parsimonia y naranja, Máxima
Verosimilitud. La ausencia de Bootstrap indica que estadísticamente no se conservó esa rama.

38
Synechococcales

Figura 32. Árbol Neighbor-Joining de secuencias 16S rRNA para Synechococcales. Se usó el K2P y un bootstrap de 1000,
las secuencias fueron de 250 pb. OTU= OTUs de las 3 librerías de clonas, Mi_: OTUs obtenidos por Ilumina MiSeq, TS:
Secuencias tipo, JN82: Secuencias de cianobacterias reportadas (Couradeau et al. 2011). Cultivo: secuencias de cultivos.
El bootstrap en negro representa el obtenido por Neighbor-Joining; en rojo, Máxima Parsimonia y naranja, Máxima
Verosimilitud. La ausencia de Bootstrap indica que estadísticamente no se conservó esa rama.

39
7 DISCUSIÓN

7.1 Observaciones mediante microscopía

Las observaciones en microscopía confirmaron la mayoría de especies identificadas en otros
estudios (Tavera et al. 1997, Kaźmierczak et al. 2011, Couradeau et al. 2011). Encontramos el mismo
patrón y diversidad de cianobacterias en donde Synechococcales y Nostocales, dominan zonas
superficiales de 3 y 10 m, y sus abundancias van decreciendo en profundidades de 20 y 30 metros.
Las Pleurocapsales por otra parte, se encuentran en todas las profundidades y son el orden
dominante a profundidades de 30 m.
Las cianobacterias observadas con mayor biomasa en observaciones de 3 metros corresponden a
Nodosilinea sp. y Leptolyngbya sp., junto con géneros de la familia Rivulariacae, como Rivularia sp.
y Calothrix cf parietina. Cabe aclarar que aún está la posibilidad de que los diferentes géneros
puedan ser morfotipos pertenecientes a un solo género de Nostocales la única diferencia se
presento en el ancho y coloración de las celulas. En superficie también se reportaron
picocianobacterias que no pudieron identificarse por simple morfometría, las cuales se sospecha
pertenecen al orden Synechoccocales. También se encontró en menor proporción Phormidium sp,
que en un inicio fue confundida con Leptolyngbya sp. o Pseudoanabaena sp, estas últimas se
encontraron desde 3 hasta 20 m de profundidad. También se encontraron cianobacterias
Pleurocapsales en menor proporción como Pleurocapsa sp. y Chroococcidium gelatinosum.
A 10 metros de profundidad se notó la ausencia de Nostocales, y se encontraron Pleurocapsales y
Chroococcidiopsidales. Se identificó a Chroococcidium gelatinosum, y algunos Xenococcus
candelaria. A esta profundidad todavía se observaron filamentos de posibles Leptolyngbya sp. o
Phormidium sp. Debido al pretratamiento con ácido acético muchas cianobacterias filamentosas
perdieron coloración y forma, por lo que fue difícil observar filamentos definidos pero sus vainas
aun eran notorias.
A 20 metros de profundidad se observó un incremento en la diversidad de cianobacterias
Pleurocapsales. Pudo observarse en abundancia Chroococcidium gelatinosum y Xenococcus
candelarie, así como fases reproductivas de Stanieria sp. Por otra parte Pleurocapsa sp. fue muy
abundante a 20 metros, Chlorogloea sp y Entophysalis sp. se encontraron en menor medida. Se notó
un mayor número de picocianobacterias que en 10 metros. También se observaron vainas y restos
de cianobacterias filamentosas en mayor cantidad que en 10 metros, como Leptolyngbya sp.,
Oculatella sp. y Phormidium sp. Finalmente, a 30 metros sólo se observaron Pleurocapsales como
Xenococcus candelaria, Pleurocapsa sp. y Chroococcidium gelatinosum; así como restos muertos de
células filamentosas y diatomeas. Fue de notar una presencia abundante de fases reproductiva de
Cladophora en esta profundidad.
Hubo algunos géneros de cianobacterias no encontrados en microscopía de descripciones previas.
La mayoría por ser epifitas de Cladophora tales como Chamaesiphon, Heteroleibleinia y Mantellum;
tampoco se encontró Nodularia, ni Anabaena (Tavera et al. 1996).
Trabajos previos han sugerido el papel de Gloeomargarita en la precipitación intracelular de
carbonato de calcio en el lago Alchichica (Couradeau et al. 2011). Sin embargo, una revisión más
actual confirmó la importancia del orden Pleurocapsales y su papel en la precipitación extracelular
de carbonatos como el mecanismo más relevante en la formación de microbialitas en el lago
Alchichica (Saghaï et al. 2015).

40
Con los datos observados por microscopía, se realizó una tabla comparativa de ausencia/presencia
por profundidad (Tabla 10). En esta se resumen los resultados encontrados y aquellos reportados
previamente.

Tabla 11. Cianobacterias detectadas por microscopía óptica en este estudio y aquellas
reportada en estudios previos.
Géneros reportados Detección
Orden
previamente
3m 10 m 20 m 30 m
Nostocales Calothrix cf parietina x
Rivularia sp. x x
Pleurocapsales Xenococcus candelaria x x x
Stanieria sp. x x x
Cyanocistis sp.
Pleurocapsa sp. x x x
Chroococcidopsidales Chroococcidium gelatinosum X x x x
Synechococcales Chroococcus sp. X x x x
Synechococcus sp. X x x
Leptolyngbya sp. X x x
Nodosilinea sp.
Chamaesiphon sp.
Gloeomargarita litohpora
Oscillatoriales Oscillatoria sp.
Phormidium sp. x x
Chroococales Gloeocapsa sp.
Aphanothece sp. x x
Chroococcopsis sp. x x
Entophysalis sp. x x
Chlorogloea sp. x x
Cyanodermatium sp.

7.2 Adaptaciones y morfotipos de cultivos

Como era de esperarse, durante el establecimiento de cultivos pudieron observarse varios cambios
morfológicos y características como foto adaptaciones y plasticidad fenotípica, debido a las
condiciones diferenciales de cultivo. Por ello se evaluaron constantemente los cambios de los
cultivos puros. El caso más notable se documentó en los cultivos de Rivularia sp. en donde éste
cambió a una coloración marrón y negra; y se observó pérdida de heterocistos en medio BG11, pero
recuperación de los mismos en BG11(0) (Fig. 33). En algunos otros casos se observaron heterocistos
múltiples en lugar de basales, pérdida de polaridad de crecimiento, pérdida de filamentos apicales,
pareciéndose más a la morfología de Nostoc. Otros cambios comunes fueron la producción de
ficoeritrinas, ya reportados en la literatura (Zapomělová et al. 2008). También se observó un
incremento en el tamaño en las células de Stanieria sp. llegando a medir hasta 20 micras en
diámetro, así como una gran producción de ficoeritrina. Lo mismo sucedió con los cultivos de
Pleurocapsa sp., cambios también ya previamente reportados (Tandon et al. 2016).

41
 A) B)

C) D)

E) F)

Figura 33. Microscopía óptica de cambios morfológicos en cultivo de Rivularia. A) Rivularia en microbialita z=3. B) Pérdida
de heterocistos en BG11. C, D) Recuperación de heterocistos, pérdida de polaridad y cambio de coloración en BG11(0). F
y G) Cambio de morfología, coloración y pérdida de filamentos apicales.

42
7.3 Consorcios involucrados posiblemente en la precipitación de carbonatos
Se pudo observar por microscopía un consorcio de cianobacterias Pleurocapsales en muestras de
microbialita presente en todas las profundidades. Gracias a la librería de clonas se pudieron
confirmar estas asignaciones con al menos 5 OTUs específicos para Pleurocapsales, en muestras de
20 y 30 m.
Estudios previos (Couradeau et al. 2011) mostraron especial interés en el papel de Gloeomargarita
como el organismo principal asociado a precipitación de carbonatos y formación de microbialitas.
Por las caracterizaciones realizadas en este trabajo no pudimos confirmar una presencia importante
de Gloeomargarita por microscopía en muestras de profundidad de 20 y 30 metros, y en ninguna
profundidad por métodos moleculares en muestra de microbialita, aunque en otro estudio de
nuestro grupo de trabajo, métodos moleculares si la detectaron en sedimento.
Interesantemente, el consorcio de Pleurocapsales pudo mantenerse en medio de cultivo. A pesar
de los esfuerzos por separar los consorcios de Pleurocapsales, los cultivos parecieron mostrar
resistencia a permanecer y crecer sólo en consorcio. Pudo aislarse por dos meses Chroococcidiopsis
sp, pero el cultivo decayó, al igual que Stanieria sp. y Pleurocapsa sp., los cuales sólo pudieron
mantenerse aislados temporalmente en medio sólido, pero no desarrollarse en medio líquido. El
consorcio en matraz debe mantenerse para escalarse, ya que existe especial interés en realizar
pruebas físico químicas del mismo, debido a una alta actividad metabólica del cultivo observada. Se
cree que estos consorcios están más asociados a la precipitación activa de material mineral y
formación de microbialitas de profundidad de lago Alchichica (Fig. 34).
Este patrón de cianobacterias Pleurocapsales dominantes en zonas de profundidad ya ha sido
reportado previamente en microbialitas del lago Pavillon en Canadá y en el Lago Van Turquía (López-
García et al. 2005, Russell et al. 2015). Un análisis comparativo sería interesante. Es importante
observar que también existen otros grupos asociados a la formación de microbialitas a esas
profundidades, como son foto sintetizadores anoxigénicos, (bacterias púrpuras y verdes del azufre),
clorofitas y otros microorganismos eucariontes. En el caso del lago Alchichica es de llamar la
atención de fases de Cladophora muy abundante en todas las profundidades.

Figura 34. Izquierda. Microscopía óptica de consorcio de Pleurocapsales en muestra de microbialita de 20 metros, derecha
consorcio de Pleurocapsales en cultivo, se observa material mineral precipitado.

43
7.4 Análisis de las secuencias 16S rRNA

Nostocales
En el orden de Nostocales pudieron encontrarse dos OTUs derivados de la librería de clonas de
microbialitas a 3 m de profundidad. Es de remarcar que estas secuencias concuerdan con lo
observado en la microscopía. La familia Rivulariaceae, -en específico los géneros Rivularia y Calothrix
están bien representados y dominan zonas superficiales, lo que concuerda con trabajos previos
(Couradeau et al. 2011). El género Scitonematopsys observado por microscopía no se encontró en
secuencias de ningún tipo por lo que se descartó. Cabe aclarar que los cultivos aislados de Rivularia
sp. sí se secuenciaron, pero sus secuencias fueron de mala calidad por lo que no se agregaron al
árbol.

Chroococcidopsidales y Pleurocapsales
Para el orden de Chroococcidopsidales se encontraron 2 OTUs cercanos en la librería de clonas de
20 metros de profundidad. En cambio, para el orden Pleurocapsales se encontró una gran
descripción de OTUs distribuidos en todas las profundidades; lo cual coincide con las observaciones
por microscopía. Interesantemente, el cultivo identificado como Pleurocapsa sp. se soporta bien
(bootstrap de 95) dentro de secuencias tipo del género Xenococcus sp. Esto cuadra con las
observaciones a microscopio, ya que las Pleurocapsales se encuentran distribuidas en todas las
profundidades y sus abundancias aumentan a profundidades mayores de 20 metros. En trabajos
previos en las microbialitas de Alchichica se ha mencionado su presencia (Couradeau et al. 2011).

Oscillatoriales
Para el orden Oscillatoriales corresponden secuencias de un cultivo identificado como Phormidium
sp., así como 3 OTUs de la librería de clonas (z=3 m). La clasificación de este Orden es un ejemplo
de la complejidad histórica que representa la taxonomía de cianobacterias, ya que hay grupos de
investigación que clasifican a Leptolyngbya dentro de Oscillatoriales y en la clasificación empleada
para este trabajo se consideran como Synechococcales (Komarék 2014). Cabe aclarar que la
secuencia del cultivo Phormidium tiene la misma similitud (93%) entre una secuencia tipo de
Leptolyngbya (Leptolyngbya sp. CENA134) y una secuencia tipo Phormidium (Phormidium sp.
NTDV11). En un inicio el cultivo obtenido también fue clasificado como Leptolyngbya por su tamaño,
pero fue reclasificado debido a la presencia de necridios, lo que permitió diferenciar a este cultivo
como un Phormidium sp. pequeño. Aún debe esclarecerse la base de datos de la secuencia
Leptolyngbya sp. CENA134 (GenBank: HQ730083.1), ya que viendo el árbol en general, este cultivo
tiene mayor coherencia dentro del grupo Oscillatoriales.

Chrococcales
En el orden Chrococcales se encontraron similitudes con Prochlorococcus y Cyanobium en todas las
profundidades. También se encontraron seceuncias de Chroococcus, Synechocystis y
Halomicronema en superficie, es importante mencionar que, aunque se obtuvo un cultivo de
Pseudoanabaena sp, este no correspondió con secuencias de librería de clonas pero si con MiSeq,

44
Synechococcales
El orden de Synechococcales fue el más diverso y pudo distinguirse claramente un cultivo de
Nodosilinea nodulosa y otras especies de Nodosilinea en profundidades de 3 y 10 metros. También
pudo identificarse el cultivo de Oculatella sp. En las secuencias MiSeq se identificaron grupos de
Acharyochloris y Leptolyngbya (z=3 m). El resto de la diversidad se distribuyó en picocianobacterias
como Synechococcus y otros géneros aún no descritos con una baja similitud con las secuencias tipo.
No se pudieron obtener cultivos monocianobacteriales de estas picocianobacterias, aunque en
muestras de microbialita y cultivos se observaron constantemente, por su pequeño tamaño no
pudieron llegarse a separar muchas cianobacterias del orden Synechococcales. En ninguna de las
secuencias de librería de clonas y MiSeq de microbialitas se identificó Gloeomargarita, como se ha
reportado en trabajos previos. Sin embargo, en el grupo de trabajo sí se pudo identificar
Gloeomargarita mediante secuenciación masiva pero en muestras de sedimentos superficiales (0-1
cm) obtenidas a 30 m de profundidad.

7.5 Problemas de anotación en las bases de datos y reclasificación de grupos

cianobacterianos
El problema con los estudios previos a 2013, radica en reasignaciones a diferentes órdenes de
cianobacterias. Por ejemplo, Leptolyngbya sp., una de las cianobacterias más abundantes en
superficie fue descrita dentro del orden Oscillatoriales en el trabajo de Couradeau et al. (2011),
cuando en la nueva clasificación pertenece a Synechococcales (Komáreck 2014). Igualmente,
trabajos previos que han hecho énfasis en una gran diversidad de Oscillatoriales deben revisarse
con cuidado y tomar en consideración la nueva clasificación. En concreto especies dentro de los
órdenes Gloeobacteriales, Oscillatoriales, Synechococcales y Chroococales. Muchos de los análisis
metagenómicos toman estas bases de datos en automático, considerando ensayos de abundancias
relativas sin una revisión de clasificaciones por secuencia ni contrastes en muestras por microscopía.
Lo anterior puede generar una mala interpretación o mala caracterización de grupos
cianobacterianos reportados.
También existen secuencias tipo y secuencias de OTUs no cultivados anotadas de manera diferencial
entre NCBI y GreenGenes. Estas secuencias que no han pasado por una revisión minuciosa, es por
esto que, aunque las técnicas moleculares aportan sustancialmente conocimiento de la diversidad
microbiana a grosso modo, deben ser en la medida de lo posible contrastadas con técnicas de
microscopía y cultivo. Así, las secuencias deben anotarse debidamente y evitar mal interpretaciones
como es el caso de muchos géneros en el orden Chrococcales, tal como Acharyochloris, que siempre
aparece en todos los análisis.
Es importante evaluar constantemente los diferentes morfotipos en cultivos y adaptaciones debido
a que muchas de las clasificaciones aún se basan en características morfológicas. Para técnicas
moleculares se ha sugerido incluso que un Cut-off al 95% para asignar entidades a nivel género en
cianobacterias puede no ser suficiente (Stackebrandt & Ebers 2006). Fue gracias a los cultivos
secuenciados que se pudo dar mayor coherencia a los árboles filogenéticos obtenidos.

45
En este trabajo con el arreglo de técnicas utilizadas, se pudo corroborar la precensia de la mayoría
de especies identificadas en otros estudios (Tavera et al. 1997, Kaźmierczak et al. 2011, Couradeau
et al. 2011). Encontramos el mismo patrón y diversidad de cianobacterias en donde Calothrix cf
parietina y Rivularia sp dominan zonas superficiales de 3 y 10 m, donde sus abundancias van
decreciendo en profundidades de 20 y 30 metros. Por otra parte Xenococcus candelariae, Stanieria
sp, Chroococcidium gelatinosum y Pleurocapsa sp, se encuentran en todas las profundidades y son
el orden dominante a profundidades de 30 m, aunque en biomasa también se encuentre
abundantemente clorofitas. Para contrastar las caracterizaciones tanto de microscopía de
microbialitas, cultivos, librería de clonas y secuencias obtenidas por secuenciación masiva, se realizó
una tabla comparativa de ausencia presencia (Tabla 11).

Tabla 12. Tabla comparativa de detección de cianobacterias en microbialitas del lago Alchichica
por diferentes metodologías.

Microscopía Cultivos Librería de clonas MiSeq

Nostocales Calothrix cf parietina X x x
Rivularia X x X x
Pleurocapsales Xenococcus candelarie X X x
Stanieria sp. X x X x
Chroococcidium
gelatinosum X x X
Pleurocapsa sp. X x x x
Chroococcidopsidales Chroococcidiopsis sp. X x
Chroococcus cf
Synechococcales schizodermaticus X x
Cyanobium sp. X x x x
Synechococcus sp. X x x
Leptolyngbya sp. X x x x
Pseudoanabaena sp. X x x
Oculatella sp. X x x
Nodosilinea sp. x x x x
Acharyochloris x x
Gloeomargarita x
Oscillatoriales Oscillatoria x
Phormidium x x x x
Chroococales Gloeocapsa sp. x
Aphanothece sp x x
Entophysalis sp x
Microcystis sp x
Chlorogloea sp. x x

46
8 CONCLUSIONES

Se encontró una clara asociación funcional/taxonómica de cianobacterias a profundidades

específicas. Calothrix cf parietina y Rivularia sp. están asociadas a superficie junto con
Leptolyngbya sp. y otras cianobacterias filamentosas, mientras que Xenococcus candelaria,
Stanieria sp., Chroococcidium gelatinosum y Pleurocapsa sp. se encuentran en todas las
profundidades con abundancias dominantes en profundidades mayores a 10 metros.
Synechococcus sp. Cyanobium sp. y otras picocianobacterias se encuentran distribuidas en
todas las profundidades sin un patrón de distribución específico.
Es probable que la formación de microbialitas del lago cráter Alchichica esté dada en mayor
medida por precipitación extracelular de cianobacterias Pleurocapsales, como Xenococcus
candelaria, Stanieria sp. Pleurocapsa sp. y Chroococcidium gelatinosum sean clave en los
procesos de litificación a profundidades de 20 y 30 m.
Las técnicas microscópicas y moleculares fueron útiles y complementarias (tanto para
métodos independientes de cultivo como dependientes de cultivo) para describir la
diversidad de cianobacterias asociadas a microbialitas en un gradiente de profundidad. Las
picocianobacterias deben ser sometidas a una microscopía de mayor resolución, ya que los
análisis moleculares sí las detectan y muchas de estas secuencias pueden ser nuevos
géneros en el orden de Chrococcales y Synechococcales.

9 Perspectivas
Se necesita continuar la identificación de cultivos por técnicas bioquímicas y moleculares
que den mayor resolución en la descripción a nivel especie; así como es necesario
establecer un cepario de los cultivos ya aislados, para futuros trabajos. Es de especial interés
la caracterización del cultivo en matraz del consorcio de Pleurocapsales para análisis
metagenómicos, pruebas de mineralogía y ensayos fisiológicos, dado que no existen
estudios previos que diluciden los procesos fisiológicos en Pleurocapsales relacionados con
la precipitación de carbonatos y formación de microbialitas en el lago cráter Alchichica.

47
 9 BIBLIOGRAFÍA
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