UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE LABORATORIO CLÍNICO

ARTICULO CIENTIFICO

TEMA:

CITOTOXICIDAD

ASIGNATURA: INMUNOLOGIA I

DOCENTE: DC. JORGE CAÑARTE ALCÍVAR

ESTUDIANTE: CEVALLOS MACIAS DAYANA LISBETH

PARALELO: B

PERIODO ACADÉMICO
NOVIEMBRE 2020 – MARZO 2021
 Citotoxicidad
Resumen

La evaluación de las propiedades toxicológicas y citotóxicas de las sustancias químicas

mediante ensayos in vitro, se ha convertido en una alternativa competitiva a la
experimentación in vivo, como consecuencia de los cuestionamientos éticos que a este
tipo de evaluaciones han hecho las organizaciones protectoras de los animales y por
razones de índole económico.

La citotoxicidad es la cualidad de algunas células para ser tóxicas frente a otras que
están alteradas. La citotoxicidad constituye uno de los mecanismos efectores de ciertas
poblaciones celulares especializadas del sistema inmunitario, consistente en la capacidad
para interaccionar con otras células y destruirlas.

Las alteraciones de la división celular generalmente se asocian al bajo crecimiento de

la raíz, pero sobre todo a la alteración del desarrollo normal del tejido meristemático
radicular que se puede comprobar con el diagnóstico microscópico, para establecer el
índice mitótico e índice de aberraciones cromosómicas presentes (Kumari et al., 2009).
A. cepa L.

Conclusión: Gracias a la investigación sobre la citotoxicidad se logro entender y

comprender algunos puntos importantes que son beneficiario para cada persona, este es
un tema muy importante ya que así se logra en entender que tan toxicas son algunas
células y que daño puedan causar.

Abstrac

The evaluation of the toxicological and cytotoxic properties of chemical substances

through in vitro tests has become a competitive alternative to in vivo experimentation, as
a consequence of the ethical questions that animal protection organizations have made of
this type of evaluation and for reasons of an economic nature.

Cytotoxicity is the quality of some cells to be toxic compared to others that are altered.
Cytotoxicity constitutes one of the effector mechanisms of certain specialized cell
populations of the immune system, consisting of the ability to interact with and destroy
other cells.

Alterations in cell division are generally associated with low root growth, but
especially with the alteration of the normal development of the meristematic root tissue
that can be verified with microscopic diagnosis, to establish the mitotic index and index
of chromosomal aberrations present .

Conclusion: Thanks to the research on cytotoxicity, it was possible to understand and

understand some important points that are beneficial for each person, this is a very
important issue since it is thus possible to understand how toxic some cells are and what
damage they can cause.

Palabras claves: Citotoxicidad, in vitro, in vivo, etnofarmacología,

quimiosistemática, benzoquinonas, fenilpropanoides.
 Introducción

En el amplio espectro de enfermedades que cursan con alteración y desregulación del

ciclo celular, el cáncer ocupa un lugar importante. Según estimados de la Organización
Mundial de la Salud, en 2015 habrían muerto cerca de 84 millones de personas si no se
toman acciones preventivas (Imilla Casado HernándezI, 2016).

En los países desarrollados, el cáncer representa más del 20 % de todas las muertes.
Cada año, más de 11 millones de personas son diagnosticadas con cáncer en todo el
mundo. No obstante, se conoce que más del 70 % de las muertes por esta enfermedad
ocurren en países del tercer mundo.

Aunque las causas particulares que desencadenan esta enfermedad no son todavía
suficientemente conocidas, el estudio de su biología ha permitido asumir estrategias para
la evaluación de nuevos principios activos que conducirán al descubrimiento de
novedosas dianas terapéuticas y permitirán su tratamiento efectivo. (Fagan V)

Los productos naturales han probado ser la fuente más segura y económica de nuevas
y efectivas drogas o metabolitos secundarios con propiedades farmacológicas,
especialmente de agentes anticáncer. El 63 % de este tipo de drogas introducidas en los
últimos 25 años, son productos naturales o han sido esbozados a partir de fuentes
naturales.

Debido a su amplio espectro estructural, los productos naturales aportan “compuestos

líderes” o nuevas entidades químicas (NEQ) para el mejoramiento terapéutico, por
modificación molecular. Por otra parte, la combinación de productos tóxicos naturales y
anticuerpos monoclonales o polímeros acarreadores, pudiera convertirse en una terapia
“diana” más eficaz.

Aunque la biodiversidad del mundo garantiza una fuente ilimitada de diversidad

estructural para la bioprospección por programas internacionales de descubrimiento de
drogas, muchas fuentes de productos naturales permanecen desaprovechadas. No
obstante, esta búsqueda de biodiversidad predictiva supone un desafío y la incorporación
de otras disciplinas como la etnofarmacología, la quimiosistemática, la ecología y la
genómica.

Como estructuras químicas relevantes se destacan, por su amplia distribución en el

mundo animal, las benzoquinonas, que han sido identificadas en varias familias del orden
Artrópoda. Entre la gran gama estructural de señales químicas se destacan las secreciones
defensivas de dichos organismos, que constituyen una de las manifestaciones más
extraordinarias de la diversidad molecular y estructural en el espacio químico de la
biodiversidad. Específicamente los milípedos -como representantes de nuestra fauna- se
destacan por la eyección de secreciones tóxicas a otros animales, las que podrían ser
fuente apreciable de importantes sustancias con propiedades desconocidas.

La evaluación de las propiedades toxicológicas y citotóxicas de las sustancias químicas

mediante ensayos in vitro, se ha convertido en una alternativa competitiva a la
experimentación in vivo, como consecuencia de los cuestionamientos éticos que a este
tipo de evaluaciones han hecho las organizaciones protectoras de los animales y por
razones de índole económico. Los logros alcanzados en el cultivo de líneas celulares, las
mejoras en los modelos manipulados genéticamente, el aumento de la especificidad y la
sensibilidad de los biomarcadores bioquímicos, morfológicos, electrofisiológicos, y el
desarrollo en las técnicas de biología molecular, han favorecido el desarrollo de los
estudios de citotoxicidad in vitro. (Miguel Del Corral JM)

Desarrollo

La citotoxicidad es la cualidad de algunas células para ser tóxicas frente a otras que
están alteradas. La citotoxicidad constituye uno de los mecanismos efectores de ciertas
poblaciones celulares especializadas del sistema inmunitario, consistente en la capacidad
para interaccionar con otras células y destruirlas.

Sustancias que son tóxicas para las células; pueden estar involucradas en la inmunidad
o pueden estar contenidos en los venenos. Estos se distinguen de los agentes citostáticos
en el grado de efecto. Algunos de ellos se usan como antibióticos citotóxicos. (Riss TL,
2004)

Citotoxicidad mediada por células

La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC en inglés)

describe la habilidad de ciertos linfocitos para atacar células; esto requiere que la célula
a atacar sea antes marcada por anticuerpos.

La citotoxicidad por linfocitos no es mediada por anticuerpos; ni por citotoxicidad de

complemento (CDC).

Se distinguen dos grupos de linfocitos citotóxicos:

 Linfocitos T citotóxicos
 Linfocitos NK

Citotoxicidad mediada por sustancias biológicas

Estudios bioquímicos de las hojas de Plantago major ("llantén") han mostrado la

presencia de flavonoides, ácidos fenoles, fenilpropanoides, iridoides, taninos y
mucílagos. Algunas de estas sustancias muestran efectos citotóxicos frente a células
cancerosas (M., y otros, 2018).

Las alteraciones de la división celular generalmente se asocian al bajo crecimiento de

la raíz, pero sobre todo a la alteración del desarrollo normal del tejido meristemático
radicular que se puede comprobar con el diagnóstico microscópico, para establecer el
índice mitótico e índice de aberraciones cromosómicas presentes (Kumari et al., 2009).
A. cepa L. al presentar pocos cromosomas (2n=16) facilita la evaluación de los posbiles
daños y/o alteraciones cromosómicas en el ciclo de la división celular (Correa et al., 2016;
Rodriguez et al., 2018).

Cuando las células del tejido meristemático de A. cepa se encuentran en equilibrio

proliferativo, la duración de cada uno de los períodos del ciclo celular permanece
constante; de esta forma, el número de células que están en una fase determinada es
también constante y proporcional a la duración en tiempo de la misma; pero cuando se
lleva a cabo en presencia de sustancias de desconocido efecto, la división celular de los
meristemos radiculares puede inhibirse o acelerarse.

La nanociencia se define como el estudio de los fenómenos y la manipulación de

materiales a escala nanométrica, abarcando el diseño, caracterización y aplicación de
estructuras, dispositivos y sistemas complejos mediante el control de forma, tamaño y
propiedades de la materia a escala nanométrica (Uribe & Rodriguez, 2007). En esta
escala, la materia exhibe algunas propiedades que pueden ser diferentes de las
propiedades tanto de átomos y moléculas como del material macroscópico. La aparición
de estas propiedades se relaciona con la gran energía superficial y el mayor número de
átomos superficiales, ya que cuanto más pequeña es una partícula, la fracción de átomos
en la superficie aumenta.

Las nanopartículas se caracterizan por tener un tamaño muy pequeño, en el orden de

1 a 100 nm y poseen propiedades únicas en relación con su naturaleza, tamaño,
distribución, morfología y tendencia a la aglomeración (Uskokovic, 2013). Son utilizadas
en diversos ámbitos como la industria, medicina, cosméticos, y otros productos
comerciales, siendo liberadas potencialmente en diversas concentraciones al medio
ambiente lo que puede convertirse en un problema ecotoxicológico en un corto tiempo .

Las nanopartículas de diferentes metales como las nanopartículas de cobre (NPsCu),

exhiben excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño
nanométrico. Las propiedades antimicrobianas del cobre, en general, han sido
ampliamente demostradas frente a Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica,
Clostridium difficile y Mycobacterium tuberculosis. Por otro lado, presenta acción
antiviral a bajas concentraciones, contra virus influenza A y virus de inmunodeficiencia
humana; además, tiene acción antifúngica demostrada contra Candida albicans. Esta
característica ha permitido que puedan ser utilizadas y aplicadas en diversas áreas como
industrial, sanitaria y médica.

Es importante entonces determinar el efecto de las diferentes nanopartículas en

sistemas biológicos ya que su reciente y creciente empleo nos hace propensos al contacto
con ellas, ya sea por bioacumulación en los vegetales que consumimos o por contacto
directo; por lo que en la presente investigación se buscó determinar el efecto citotóxico y
genotóxico de diferentes concentraciones de NPsCu sobre poblaciones celulares de tejido
meristemático radicular de Allium cepa. (Paredes1, 2020)

Evaluación citotoxicidad

La citotoxicidad se ha evaluado usando la línea celular THP1-XBlue-CD14

(invivogen). Se han incubado 50.000 células/pocillo en placas multipocillo de 96 pocillo,
con PBS (control) y las concentraciones de 10, 50, 100 y 200 mg/l del extracto de
polifenoles en DMS, durante 24 horas a 37oC y 5% de CO2. Trascurrido el período de
incubación se evalúa la viabilidad celular mediante el ensayo colorimétrico con el
reactivo AlamarBlue (invitrogen)21. Se mide la absorbancia a 570nm. El AlamarBlue®
es un indicador de la viabilidad celular demostrado que utiliza el poder natural de la
reducción de las células vivas para convertir resazurina a la molécula resorufin. El
principio activo de AlamarBlue® (resazurina) es un compuesto no tóxico, la célula es
permeable al colorante de color azul y no fluorescente de forma virtual. Al entrar en las
células, se reduce la resazurina a resorufin, que produce un compuesto de color rojo. Las
células viables convierten continuamente la resazurina a resorufin, generando así una
medida cuantitativa de la viabilidad y citotoxicidad. Dada la relación directa entre
absorbancia y viabilidad celular, el cálculo de la viabilidad se realiza respecto a las células
control (sin tratamiento) mediante la fórmula: % viabilidad = (Abs muestra/Abs control)
x 100. (C. Veciana Galindo1, 2014)

Evaluación bioseguridad

Se han testado las concentraciones de extracto con polifenoles a 1, 3,10, 30 y 100 mg/l
en agua con DMSO al 0,1%, más un grupo control (agua con DMSO al 0,1%) en
embriones de pez cebra. Para la realización del ensayo, se utilizaron únicamente aquellos
huevos fecundados que no presentaron ningún tipo de anomalía externa (asimetrías,
vesículas, membrana estuviera dañada). Se transfirió un huevo/pocillo con pipeta Pasteur
a una microplaca de 96 pocillos, de forma que los huevos no entraron en contacto con el
aire y de modo que cada pocillo contuviera un único huevo en un volumen de 100 μl de
las concentraciones de ensayo y del vehículo. Las placas se incubaron a 26 ± 1oC durante
24, 48 y 72 h. Tras cada periodo de incubación, se examinaron los
huevos/embriones/larvas mediante un estereomicroscopio y se anotaron los resultados
obtenidos según los criterios especificados a continuación: a) Parámetros letales, un
embrión se considera muerto si presenta alguno de los parámetros: huevos coagulados
que son opacos, desprendimiento de la cola, detección o no de ritmo cardiaco, formación
de somitas (series longitudinales del mesodermo que por delaminación, fusión y
migración se convierten en el esqueleto axial, la dermis y los músculos dorsales y la pared
del cuerpo y las extremidades). b) Parámetros subletales, si aparecen: Movimientos
espontáneos, cambios en la pigmentación, formación de edemas o formación de coágulos.
Y c) Parámetros teratogénicos: malformaciones en órganos y estructuras; escoliosis,
raquitismo o retardo generalizado del desarrollo. (C. Veciana Galindo1, 2014)

Citotoxicidad directa específica (mediatizada por linfocitos CTL)

El papel más importante de este mecanismo es el de eliminar células propias infectadas

por virus. Como veremos, los linfocitos TC en reposo, al activarse apropiadamente,
terminan diferenciándose a los llamados linfocitos T citolíticos (CTL), que son los
efectores de la inmunidad celular específica.

El 90% de estos linfocitos son CD8+, y están restringidos por el MHC-I propio. Son
capaces de reconocer a la mayoría de células nucleadas. Pero existe un 10% de linfocitos
TC que fenotípicamente son CD4+ y están restringidos por MHC-II.

La actuación de estas células la podemos considerar en dos fases:

Activación y diferenciación de los precursores TC hasta CTL

Fase efectora: destrucción de la célula diana, a su vez diferenciable en:

 adhesión y formación del conjugado entre el CTL y la célula diana

 golpe letal
 disociación del CTL
 destrucción de la célula diana. (Ordaz-Trinidad1, 2018)
 Citotoxicidad crónica y aguda

Citotoxicidad crónica: Las microplacas de 96 pozos están divididas en 12 columnas

y 8 filas; cada columna representa un tratamiento y cada una de las filas, las réplicas de
ese tratamiento. La columna 1 se empleó como blanco y contenía 200 µl de DMEM
suplementado. La columna 2 se empleó como control negativo y contenía 100 µl de
suspensión de células (3x103 células /ml) más 100 µl DMEM de suplemento. Los pozos
de las columnas restantes contenían 100 µl de una suspensión celular de 3x103 células/ml
a las cuales se les adicionó el glifosato en concentraciones crecientes, 0,9 a 8,5 mM para
las células GM38 y de 0,6 a 3,3 mM para las células HT1080, el volumen se completó a
200 µl con medio suplementado en cada pozo. Posteriormente se sometió la microplaca
a agitación orbital durante 15 minutos a 37°C para garantizar la distribución homogénea
de las células y del glifosato en cada pozo. Luego, se incubó a 37°C en atmósfera húmeda
con 5% de CO2 durante 72 horas. Después de las 72 horas de incubación, se retiró el
medio de cada pozo y se adicionaron 20 µl de metanol al 100% por 15 minutos y 15 µl
de cristal violeta (solución al 1% de cristal violeta en 50% de metanol) por 30 minutos.
Posteriormente, las placas fueron lavadas con agua destilada y se les adicionó en cada
pozo 50 µl de dimetilsulfóxido por 30 minutos. La densidad celular (viabilidad celular)
se determinó en un lector de micro placas (BIORAD) y con una longitud de onda de 595
nm.

Citotoxicidad aguda: En la microplaca de 96 pozos se sembraron 100 µl de

suspensión de células en una concentración de 3x105 células/ml y 100 µl de medio
DMEM con 5% de SBF en cada pozo; posteriormente, se incubó durante 24 horas a 37°C
en atmósfera húmeda con 5% de CO2. En el presente análisis se utilizó un título más alto
que en el ensayo anterior (3x103 células/ml), para garantizar una concentración adecuada
de células en un tiempo más corto de incubación antes de la exposición al glifosato
(citotoxicidad crónica, 72 horas; aguda, 24 horas). Luego de la incubación se aspiró el
medio y se lavó cada pozo con 50 µL de solución salina tampón (PBS- 1X).
Posteriormente, se adicionó el medio con suplemento (libre de suero bovino fetal) más
las concentraciones de glifosato en un rango entre 4,0 y 6,5 mM para las dos líneas
celulares, para un total de 25 µl en cada pozo. El control positivo fueron células expuestas
a una concentración de 50 ug/ml de etopósido VP 16 (Sigma) y el control negativo fueron
células tratadas con DMEM con suplemento, sin exposición al químico. Se incubó la
microplaca durante 4 horas a 37°C de acuerdo con el protocolo establecido (11,12) en
agitación orbital y, posteriormente, se le adicionaron 50 µl de tripsina (solución 1:10 -
0,1% tripsina: PBS 1X) a cada pozo para desprender las células, se incubó nuevamente
por 5 minutos a 37°C y se adicionaron 100 µl de DMEM con suplemento (Claudia Milena
Monroy, 2016)

Ensayo de citotoxicidad

La línea celular VERO (células de riñón de mono verde: Cercopithecus aethiops)

(ATCC:CCL-81) se mantuvo con medio DMEM, antibiótico/antimicótico 1X, L-
glutamina 1X, suero fetal bovino al 5% e incubado 37°C en 5% de CO2 en cajas de cultivo
celular Nunc® de 25 mL. Se realizó pase a placa de 96 pozos de 4.0 x 105 células/pozo
y se agregaron 100 μL de las muestras (compuesto en concentraciones de 1200 μg/mL en
DMSO 10% v/v, en dilución seriada hasta 37.5 μg/mL) y se mantuvieron en iguales
condiciones de suplementos e incubación por 48 horas, al cabo de este tiempo se realizó
conteo del número de células viables, por exclusión con azul Tripan. En cada caso se
determinó la concentración citotóxica media (CC50), concentración que reduce el número
de células viables al 50%. Como control negativo se utilizó el cultivo celular sin adición
de la muestra, al cual también se le hizo conteo celular como punto de comparación del
crecimiento logarítmico a las 48 horas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por
duplicado. (R.1, 2009)
 Conclusiones

Citotoxicidad directa específica es la llevada a cabo por los linfocitos citotóxicos (TC),
que están restringidos por el haplotipo propio MHC-I, y que poseen CD8+ como
moléculas correceptoras. (aunque algunas son CD4+ y están restringididas por MHC-II)

Citotoxicidad directa inespecífica las células agresoras naturales (NK) reconocen

determinantes inespecíficos de células tumorales o infectadas con ciertos virus.

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos es un mecanismo indirecto por el que

células matadoras como NK, eosinófilos, etc., interaccionan con el antígeno por medio
de puentes de anticuerpos previamente unidos a receptores para Fc de la célula.

Gracias a la investigación sobre la citotoxicidad se logro entender y comprender

algunos puntos importantes que son beneficiario para cada persona, este es un tema muy
importante ya que así se logra en entender que tan toxicas son algunas células y que daño
puedan causar.
 Bibliografía
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