VII Curso online de toxina botulínica tipo A y su uso en medicina estética

Módulo 2 de 9. Sobre la inmunogenicidad de la neurotoxina botulínica (Dr. Michael U. Martin)

1. Inmunogenicidad de la neurotoxina botulínica (NTBo)

La inmunogenicidad describe la capacidad de una sustancia, un antígeno, de ocasionar una respuesta
inmune adaptativa, lo que originalmente significa la formación de anticuerpos. En el contexto de este
capítulo, la inmunogenicidad de la NTBo describe la capacidad de la proteína bacteriana de inducir una
respuesta inmune adaptativa que, en última instancia, resulta en la formación de anticuerpos
específicos para esa toxina.

1.1. ¿Por qué preocuparse por la inmunogenicidad de la NTBo?

Normalmente, los anticuerpos neutralizantes de las proteínas farmacológicas son de gran importancia,
dado que su presencia limita el uso de las proteínas farmacológicas en el paciente. Sin embargo, en el
caso de la NTBo los anticuerpos neutralizantes no siempre son malos (Fig. 1). De hecho, la NTBo es una
de las toxinas naturales más potentes que se conocen e incluso hoy se puede producir una intoxicación
de forma natural (casos infrecuentes de intoxicación alimentaria). Asimismo, se teme que la NTBo pueda
ser utilizada como arma biológica por terroristas. En ambos casos, se desean anticuerpos que
neutralicen la NTBo. Aunque la protección mediante vacunas es altamente deseable, en la actualidad
no existe ninguna vacuna protectora (vacunación activa), y el uso clínico de anticuerpos neutralizantes
preformados para la NTBo (inmunización pasiva) se debe efectuar al inicio de los síntomas clínicos para
que sea eficaz.

La NTBo es una toxina tan severa porque inhibe la neurotransmisión en las uniones neuromusculares
(analizado en [Rosetto O et al. Nat Rev Microbiol 2014]. Esta inhibición ocasiona una parálisis flácida
relativamente duradera de los músculos afectados. El efecto inhibidor de la neurotransmisión se puede
aprovechar clínicamente para tratar las afecciones que son causadas por la sobrerreacción de los
músculos, como la distonía, entre muchas otras. Además, las preparaciones con NTBo se utilizan
ampliamente en aplicaciones cosméticas y de medicina estética en todo el mundo. La mayoría de estas
aplicaciones requieren un tratamiento de largo plazo con inyecciones repetidas, dado que la actividad
inhibitoria de la NTBo tiene un límite de tiempo y se reduce gradualmente. El motivo es sencillo: el
componente bioactivo de la NTBo es una proteína enzimáticamente activa (una proteasa) que se degrada
continuamente en la terminación nerviosa. Para lograr un efecto duradero, se debe inyectar
periódicamente durante todo el tratamiento, ya sea por indicación clínica o en un contexto de medicina
estética. Si la NTBo se usa deliberadamente como una proteína farmacológica, no se desean
anticuerpos que la neutralicen. Una vez que aparezcan anticuerpos neutralizantes en un paciente, la
toxina será menos eficiente o, en el peor de los casos, el paciente ya no responderá al tratamiento. Por
lo tanto, la formación de anticuerpos neutralizantes de la NTBo en pacientes es altamente indeseable
y deben tomarse todas las medidas posibles para impedirla.

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Figura 1: Los anticuerpos para la neurotoxina botulínica no siempre son malos.

El dios romano de dos caras Jano simboliza los dos aspectos opuestos de los anticuerpos neutralizantes contra
la neurotoxina botulínica. En caso de intoxicación accidental o intencional, los anticuerpos protectores son
bienvenidos (lado izquierdo). Los anticuerpos neutralizantes de la NTBo son indeseados en la medicina clínica
y estética porque abrogan el uso posterior de esta valiosa proteína farmacológica.

Por lo tanto, la inmunogenicidad de la NTBo es un tema de importancia clínica que sin duda merece
nuestra atención. Si queremos proteger a los pacientes de las graves consecuencias de la intoxicación
accidental o intencional, debemos saber cómo lograr la alta inmunogenicidad de esta proteína
bacteriana a fin de generar una buena respuesta de anticuerpos protectora durante la vacunación. Por
otro lado, si el médico desea usar esta proteína farmacológica durante un tiempo prolongado de manera
satisfactoria en un paciente, debe saber exactamente qué define la inmunogenicidad del producto
utilizado. En consecuencia, debe conocer las medidas que pueden tomarse para minimizar el riesgo de
formación de anticuerpos, que puede limitar o incluso abrogar el uso de este fármaco altamente eficaz
en el paciente.

Dicho eso, surgen algunas preguntas:

 ¿Existen anticuerpos contra la NTBo y, en ese caso, afectan el resultado del tratamiento?

 ¿Los anticuerpos contra la NTBo constituyen realmente un problema clínico?

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1.2. Resistencia a la NTBo

En general, pueden producirse dos tipos de resistencia: primaria y secundaria.

1.2.1. Resistencia primaria a la NTBo

La resistencia primaria a la NTBo significa que los pacientes no responden para nada al tratamiento, ni
siquiera en la primera aplicación. Además de los motivos triviales, como una dosis incorrecta de la
toxina, una manipulación inadecuada, errores durante su reconstitución y lugar de aplicación
inapropiado, una explicación para la resistencia primaria es la presencia de anticuerpos neutralizantes
preexistentes. La presencia de tales anticuerpos puede deberse a un botulismo infantil o botulismo
alimentario anterior asintomático y posiblemente no reconocido. Cabe mencionar que se informaron
muy pocos casos y no se han llevado a cabo estudios exhaustivos que refieran la frecuencia de dichos
anticuerpos preexistentes en pacientes que presenten resistencia primaria a la NTBo. La reactividad
cruzada de los anticuerpos neutralizantes con la toxina del tétanos, que está emparentada, se ha
analizado como una posible razón de la falta de respuesta primaria. Sin embargo, la bibliografía sobre
este tema es controvertida y los datos disponibles son bastante limitados.

1.2.2. Resistencia secundaria a la NTBo

La resistencia secundaria a la NTBo significa que los pacientes que en un principio habían presentado
efectos clínicos objetivos con resultados satisfactorios no responden en la misma medida o no tienen
respuesta alguna cuando la toxina vuelve a inyectarse más adelante. Los casos de no respuesta
secundaria son más frecuentes que los de no respuesta primaria y están bastante bien documentados.
Pueden mencionarse varios motivos que explican la no respuesta secundaria a la NTBo. La explicación
más sencilla es la formación de anticuerpos neutralizantes de la NTBo en el paciente después de
varias inyecciones de la proteína farmacológica. En general, los anticuerpos contra las proteínas
farmacológicas son bien conocidos y pueden aparecer con una frecuencia bastante alta. Sin embargo,
en el caso de las formulaciones modernas de NTBo-A disponibles en el mercado europeo
(onabotulinumtoxina A = Botox® / Vistabel®, abobotulinumtoxina A = Dysport® / Azzalure®,
incobotulinumtoxina A = Xeomin® / Bocouture®), los números oscilan entre el 0% y el ~6% según el
estudio que se considere y, lo que es más importante, según el tipo de aplicación. Las cifras en el caso
de la NTBo-B (rimabotulinumtoxina B = Myobloc®) son significativamente más altas y rondan el 40%. En
un meta-análisis reciente de 61 estudios se informó una frecuencia del 3,5% en todas las indicaciones
en 4282 pacientes [Fabbri M et al. Neurotox Res 2016]. En los pacientes con no respuesta secundaria,
la frecuencia de los anticuerpos neutralizantes de la NTBo fue del 53,5% (Fig. 2, panel superior). La
frecuencia fue distinta según la indicación (Fig. 2, panel medio) y también fue distinta para cada una
de las tres formulaciones disponibles de NTBo-A (Fig. 2, panel inferior). Este meta-análisis presenta
algunas deficiencias, dado que no considera los informes con menos de diez pacientes. La consecuencia
podría ser un sesgo en los resultados, dado que las pocas publicaciones sobre los pacientes con no
respuesta secundaria en el campo de la estética suelen informar una cantidad reducida de casos. El

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motivo probablemente sea la concentración más baja de NTBo aplicada en comparación con las
indicaciones clínicas, en las cuales es necesario utilizar dosis más altas de la toxina. Sin embargo, el
meta-análisis demuestra, en primer lugar, que los anticuerpos neutralizantes de la NTBo
efectivamente existen, aunque a una frecuencia bastante baja en comparación con otras proteínas
farmacológicas, y en segundo lugar, que los anticuerpos neutralizantes cobran importancia clínica
dado que limitan el uso posterior de NTBo en el paciente afectado. Los datos básicos de este meta-
análisis se resumen en la Figura 2.

Figura 2: Resumen de datos sobre la frecuencia de anticuerpos neutralizantes de la NTBo.

La frecuencia total de anticuerpos neutralizantes de la NTBo en pacientes es bastante baja, aunque es mucho
más alta en los pacientes con no respuesta secundaria (panel superior). Las frecuencias difieren según la
indicación (panel medio) y la formulación de NTBo (panel inferior). Los datos resumidos aquí fueron tomados
y adaptados de [Fabbri, M. et al.: Neurotox Res (2016) 29: 105-117].

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Una segunda explicación posible para la no respuesta secundaria es un poco más indirecta, pero también
se apoya en los anticuerpos específicos contra la NTBo. Los anticuerpos no neutralizantes contra la NTBo
pueden unirse a la NTBo y formar un complejo de anticuerpo y toxina, y de esa manera reducir la
disponibilidad de la toxina libre. El tamaño claramente afecta la velocidad con la cual una proteína
puede difundirse a través del tejido. Si un solo anticuerpo IgG se une a una molécula de NTBo-A, el
tamaño del complejo resultante se duplica. Esto reduce la capacidad de la toxina de difundirse desde
el lugar de la inyección hacia el lugar de la acción, es decir la terminación nerviosa. Asimismo, la toxina
acomplejada con anticuerpo puede ser eliminada más rápido por los macrófagos y otras células
fagocíticas mediante un proceso llamado "captación mediada por receptores Fc". El resultado es una
concentración efectiva reducida de toxina libre en el lugar deseado, es decir la terminación nerviosa, y
por lo tanto, una bioactividad reducida. El paciente y el médico interpretarían la pérdida de eficacia
resultante como un caso de no respuesta secundaria. Sin embargo, en la sangre del paciente no se
detectaría ningún anticuerpo neutralizante de la NTBo. No existen estudios sobre la presencia de
anticuerpos no neutralizantes contra la NTBo-A en pacientes, sencillamente porque nadie mide este
parámetro. No obstante, desde el punto de vista inmunológico, no existen motivos para pensar que
todas las respuestas de anticuerpos a la proteína bacteriana deben dar lugar a anticuerpos
neutralizantes; por el contrario, una respuesta policlonal es mucho más probable (ver más adelante).

Una tercera posibilidad sería que los receptores de la toxina en las células neuronales se regulen hacia
abajo por motivos que no estén directamente relacionados con el tratamiento con NTBo, sino debido a
otros fármacos, el estado de salud en general, infecciones paralelas, etc.

Además, en medicina cosmética es posible que las expectativas del cliente en cuanto a las mejoras
posibles sean demasiado altas. Esto puede ocurrir sobre todo si se logra un efecto pronunciado en la
primera sesión que, según la percepción del cliente, no se repite en la misma medida cuando se vuelve
a aplicar NTBo. Esta situación también sería interpretada como una no respuesta secundaria subjetiva
por parte del paciente.

Por último, es sumamente difícil atribuir la no respuesta a la presencia o formación de anticuerpos

neutralizantes si no se extrae sangre y si no se han realizado las pruebas tediosas (y costosas) para
detectarlos. Por este motivo, se debe tener en cuenta que las pruebas para la detección de anticuerpos
neutralizantes suelen emplear estudios en animales completos con ratones, o con material recién
aislado de ratones, o experimentos con cultivos celulares. Todo esto requiere conocimientos especiales,
y no es posible excluir del todo la posibilidad de resultados falsos negativos.

En resumen, los anticuerpos neutralizantes de la NTBo se generan a una frecuencia baja, pero
detectable.

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1.3. Implicaciones de los anticuerpos neutralizantes de la NTBo

Los anticuerpos neutralizantes de la NTBo afectan el tratamiento a largo plazo de estos pacientes en
las indicaciones clínicas así como en la medicina estética. Una vez formados, los anticuerpos
neutralizantes no permitirán el uso de NTBo con fines clínicos ni estéticos. Por supuesto que el perder
esta opción de tratamiento es mucho más grave para el paciente en indicaciones clínicas, como distonía,
que en la medicina estética electiva. No obstante, los anticuerpos neutralizantes de la NTBo que se
generan durante las aplicaciones estéticas abrogan el uso futuro de este valioso fármaco para posibles
indicaciones clínicas más adelante en la vida de la persona. Este es un motivo por el cual los anticuerpos
neutralizantes en medicina estética deben tomarse en serio, aunque la frecuencia sea muy baja.

Por lo tanto, vale la pena describir las circunstancias inmunológicas que son responsables de la respuesta
inmune a la NTBo que tiene como resultado la generación de anticuerpos protectores/neutralizantes.
Si el médico comprende los mecanismos inmunológicos subyacentes de la formación de anticuerpos
contra esta proteína farmacológica, podrá tomar medidas para minimizar el riesgo de formación de
anticuerpos para la NTBo.

1.4. Objetivos de este capítulo

En el siguiente capítulo se describirá cómo se genera un anticuerpo contra una proteína bacteriana. Se
presentará el papel que cumplen los adyuvantes en mejorar las respuestas inmunes a los inmunógenos
débiles. Por último, estas consideraciones inmunológicas generales se aplicarán a la NTBo-A. Se
enumerarán los parámetros que deben cumplir las preparaciones con NTBo-A, ya sea como vacuna o
como agente farmacéutico.

El objetivo es brindar herramientas al médico para que pueda vacunar de manera satisfactoria,
generando anticuerpos protectores contra la toxina, o bien un neurólogo/dermatólogo exitoso que
prevenga la formación de anticuerpos neutralizantes de esta valiosa proteína farmacológica.

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2. Consideraciones generales sobre el funcionamiento del

sistema inmune
La principal tarea de nuestro sistema inmune es protegernos de los microbios que se encuentran en todo
lo que nos rodea a diario. Los microbios pueden ser peligrosos para los seres humanos porque, una vez
que atraviesan nuestras barreras mecánicas, es decir la piel y las superficies epiteliales de las mucosas,
invaden nuestros tejidos. Las bacterias y los hongos se multiplican rápidamente, mientras que los virus
infectan las células y las reprograman para que produzcan más partículas infecciosas. Y esto ocasiona
daños. Por este motivo, nuestro sistema inmune debe reaccionar rápido para identificar el peligro,
clasificar el tipo de problema e iniciar las respuestas adecuadas. En los seres humanos existen dos ramas
del sistema inmune: el sistema inmune innato y el adaptativo. Aunque cada uno cumple funciones
distintivas en la lucha contra los invasores con sus respectivos tipos de célula y moléculas solubles,
actúan conjuntamente de manera estrecha. En la figura 3 se presenta un resumen de las células y
moléculas del sistema inmune innato y el adaptativo.

Figura 3: Componentes del sistema inmune innato y el adaptativo de los seres humanos.

El sistema inmune se compone de dos ramas: la innata y la adaptativa. En ambas ramas, colaboran distintas
células y moléculas para protegernos de los ataques microbianos del entorno.

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2.1. ¿Quién decide cuándo reaccionar con una respuesta inmune, y en

qué se basa la decisión?
El sistema inmune básicamente emplea dos criterios para determinar si se necesita una respuesta
inmune. La primera decisión que toma rápidamente es si la sustancia que ingresó al organismo es
"peligrosa" o no. Los virus y bacterias son peligrosos porque, después de lograr ingresar a los tejidos,
pueden multiplicarse rápidamente. Esta situación debe controlarse sin demora mediante una respuesta
inmune veloz y eficaz para minimizar el daño. Por otro lado, muchas sustancias ingresan a nuestro
organismo diariamente con los alimentos. Aunque también son extrañas, no presentan ningún riesgo,
básicamente porque no tienen la capacidad de multiplicarse e infectarnos. Dado que no son peligrosas,
no se requiere una respuesta inmune.

La segunda decisión que debe tomarse es si una sustancia es "propia" o "ajena = extraña". Por definición,
todos los microbios son extraños y, por lo tanto, ajenos. Por otro lado, puede ocurrir que las células
propias del organismo cambien su comportamiento y se conviertan en células tumorales. Dichas células
también son peligrosas, aunque no son extrañas.

Para hacer frente a todas estas situaciones distintas, el sistema inmune utiliza una combinación de
ambos criterios, "peligroso" y "ajeno", para determinar qué tipo de respuesta inmune es apropiada
y necesaria para defender el organismo del ataque. Las dos decisiones son tomadas de manera
jerárquica por dos tipos de células inmunes.

2.1.1. La primera decisión, peligroso o no, por parte de las células dendríticas
Las decisiones deben ser rápidas para poder detener a los microbios invasores de inmediato. Las células
centinela como las células dendríticas, los macrófagos residentes y los mastocitos constituyen la
primera línea de defensa celular. Se encuentran en los puntos de entrada más probables de los
microbios, como la piel y las superficies de las mucosas en los pulmones y el tracto gastrointestinal.
Estos tipos de células están muy bien equipados con receptores para reconocer las estructuras
microbianas prototípicas, como los componentes de las paredes celulares de las bacterias y los ácidos
nucleicos de los virus. La unión de las estructuras microbianas con estos receptores de reconocimiento
de patrones activa las células centinela en el tejido, que a su vez producen mediadores de alerta
endógenos, como citocinas, quimiocinas, prostaglandinas y leucotrienos proinflamatorios. Estos
mediadores inician una respuesta inflamatoria aguda en el lugar de la infección. Durante la inflamación
local, los leucocitos que circulan en la sangre son llamados al foco de la inflamación para controlar y
eliminar los microbios. En la figura 4 se muestran los mecanismos básicos de una inflamación local aguda
incipiente. Aparecen los síntomas clínicos clásicos de la inflamación: calor, dolor, rubor y tumor. La
batalla es librada por las células del sistema inmune innato con sus armas, que en la mayoría de los
casos son suficientes para frenar el ataque. En resumen, las células dendríticas detectan el "peligro"
reconociendo los ácidos nucleicos o las moléculas superficiales prototípicos de los microbios. La decisión
es rápida y los mecanismos que se ponen en marcha son muy eficaces.

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Figura 4: Las células dendríticas son centinelas que inician una inflamación local aguda después de un ataque microbiano.

Podemos distinguir cuatro fases con respecto a la función de las células dendríticas en el inicio de la
inflamación aguda. En el estado latente, las células centinela como las células dendríticas (CD) y los
macrófagos (MΦ) residentes protegen las barreras mecánicas (en este caso, la piel). Los monocitos (M) y los
granulocitos neutrofílicos (G) se desplazan por el torrente sanguíneo. Cuando se produce una infección
bacteriana, las células centinela se activan y liberan mediadores proinflamatorios (citocinas, prostaglandinas,
leucotrienos y enzimas) que se encargan de reclutar leucocitos e infiltrarlos al lugar de la infección (fase de
alerta). Los leucocitos reclutados se activan en el foco inflamatorio y eliminan los microbios (fase de
eliminación). Las células dendríticas totalmente activadas fagocitan los microbios, procesan las proteínas
microbianas para convertirlas en péptidos, y presentan estos péptidos en moléculas CMH clase II. Además,
abandonan la periferia y se trasladan hacia al siguiente ganglio linfático de drenaje (información del sistema
inmune adaptativo).

La célula dendrítica activada alerta al sistema inmune innato sobre la necesidad de combatir microbios
peligrosos, pero tiene una segunda función más importante: informar al sistema inmune adaptativo
acerca del peligro inminente. Esto lo logra fagocitando una muestra del material peligroso, que con
frecuencia es el microbio mismo. El material fagocitado se digiere en el fagolisosoma (Fig. 5, extremo

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superior izquierdo). Los péptidos derivados de las proteínas microbianas se cargan en moléculas
especiales presentadoras de péptidos, más conocidas como moléculas CMH clase II (en seres humanos,
moléculas HLA-DR, HLA-DP o HLA-DQ) que se exportan a la superficie celular (Fig. 5, medio). Al mismo
tiempo, la célula dendrítica activada deja su lugar en la periferia y se traslada al siguiente ganglio
linfático de drenaje. Allí se establece y se convierte en una célula presentadora de antígenos profesional
(Fig. 5, extremo inferior derecho). Si está totalmente activada, la célula dendrítica no solo presentará
péptidos derivados de microbios en moléculas CMH clase II, sino que también regulará al alza las
moléculas coestimulantes en su membrana plasmática. Además, liberará mediadores del sistema
inmune: citocinas que informan a los linfocitos T vírgenes acerca del tipo de peligro que detectó la
célula dendrítica en la periferia (Fig. 5, extremo inferior derecho). Así, la célula centinela activada
suministra la información necesaria sobre la naturaleza y la gravedad del ataque microbiano para el
segundo tomador de decisiones: el linfocito T. Las células dendríticas constituyen el puente entre el
sistema inmune innato y el adaptativo. Solamente una célula dendrítica que se activa al reconocer una
sustancia "peligrosa" con receptores de reconocimiento de patrones es una célula presentadora de
antígenos eficaz que puede activar linfocitos T auxiliares vírgenes en el ganglio linfático.

Figura 5: Las células dendríticas activadas de manera óptima se convierten en células presentadoras de antígenos profesionales.

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En la periferia, las células dendríticas detectan las señales de peligro microbiano y se activan por completo,
y luego fagocitan los antígenos microbianos (extremo superior izquierdo). Los antígenos se procesan y se
convierten en péptidos que se presentan en moléculas CMH clase II, mientras que la célula dendrítica activada
deja la periferia y migra a través del vaso linfático aferente hacia el ganglio linfático que drena la zona
(medio). Cuando llega al ganglio linfático, la célula dendrítica se establece como una célula presentadora de
antígenos profesional e informa a un linfocito T auxiliar virgen acerca del peligro que detectó en la periferia.
Las moléculas coestimulantes (flecha superior) y las citocinas (flecha inferior) informan al linfocito T virgen
sobre la naturaleza y la gravedad del peligro microbiano. Comienza la respuesta inmune adaptativa.

2.1.2. La segunda decisión, propio o ajeno, por parte de los linfocitos T auxiliares
Un linfocito T auxiliar virgen reconoce el péptido presentado por CMH (antígeno) derivado del microbio
como ajeno. ("Virgen" significa que este linfocito T nunca se ha encontrado con un antígeno). Las
moléculas coestimulantes y las citocinas liberadas de la célula presentadora de antígenos contribuyen
a la activación de este linfocito T auxiliar antígeno-específico. (Los péptidos presentados en moléculas
CMH clase II siempre son reconocidos por linfocitos T auxiliares). Este linfocito comienza a multiplicarse
rápidamente en un proceso llamado expansión clonal, y en pocos días se generan miles de linfocitos T
auxiliares efectores antígeno-específicos (no se muestran aquí). Una vez generados, los linfocitos T
auxiliares efectores ayudan a las células del sistema inmune innato, como macrófagos y granulocitos
neutrofílicos, a eliminar los microbios restantes produciendo citocinas activadoras, como interferón-γ.
Además, pueden ayudar a los linfocitos B antígeno-específicos en su expansión clonal y diferenciación
en células plasmáticas B productoras de anticuerpos. En la figura 6 se muestra un esquema de los pasos
individuales desde la activación de las células dendríticas hasta la formación de anticuerpos. Los
anticuerpos pueden unirse a su antígeno y, mediante este mecanismo, rotular específicamente el
microbio del cual se originó el antígeno para su eliminación. Asimismo, junto con los linfocitos T y B de
memoria, los anticuerpos contribuyen a la memoria inmunológica que nos protege de una segunda
infección por un microbio que ya fue eliminado satisfactoriamente por el sistema inmune en una ocasión
anterior.

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Figura 6: Resumen simplificado de los pasos individuales en las respuestas inmunes innatas y adaptativas
que tienen como resultado la formación de anticuerpos.

En la periferia, las células centinela como las células dendríticas (CD) son activadas por la unión de "señales
de peligro" microbianas con receptores de reconocimiento de patrones. Los antígenos se fagocitan y se
procesan para convertirlos en péptidos en fagolisosomas. Los péptidos se presentan en moléculas CMH clase
II en la superficie de la célula dendrítica que se convierte en una célula presentadora de antígenos
profesional. Los linfocitos T auxiliares vírgenes reconocen el péptido presentado en el contexto de CMH con
su receptor de antígenos y se activan. Los linfocitos T antígeno-específicos activados ayudan a que se activen
los linfocitos B antígeno-específicos. Así se asegura que las células plasmáticas B produzcan anticuerpos
específicos para el antígeno original.

Este modelo es muy simplificado. En la vida real, se presentan varios péptidos distintos derivados del
microbio fagocitado, y varios linfocitos T auxiliares individuales generan una respuesta policlonal.
Ayudarán a más de un linfocito B antígeno-específico a producir anticuerpos que reconozcan el microbio,
por lo cual en la mayoría de los casos se producirá una respuesta de anticuerpos policlonal. Estos
anticuerpos se unirán a distintos epítopos del antígeno, pero no necesariamente todos neutralizarán el
efecto biológico del antígeno/microbio.

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2.1.3. Consecuencias de la toma de decisiones en el sistema inmune

El sistema inmune debe tomar dos decisiones para luego poder generar anticuerpos.

La primera encargada de tomar decisiones, la célula dendrítica, debe determinar si una sustancia es
"peligrosa".

 En caso afirmativo, la información del segundo tomador de decisiones, un linfocito T virgen, es

posible mediante la presentación óptima de antígenos.

 En caso negativo, las células dendríticas no reaccionan y no se produce una respuesta inmune
adaptativa -> no se generan anticuerpos.

El segundo tomador de decisiones, el linfocito T, debe determinar si el péptido presentado en la

molécula CMH clase II es propio o ajeno = extraño.

 En caso afirmativo, el sistema inmune adaptativo se activa por completo y los linfocitos B pueden
generar anticuerpos.
 En caso negativo, no se activan los linfocitos T ni B -> no se generan anticuerpos.

Básicamente, la activación óptima de las células dendríticas por parte de las "señales de peligro" define
el resultado de la respuesta inmune total (resumido en la figura 7).

Figura 7: La activación óptima de las células dendríticas por parte de las "señales de peligro"
es fundamental para estimular una respuesta inmune.

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La fagocitosis, el procesamiento de antígenos y la presentación de péptidos dependen de la activación óptima

de las células dendríticas por parte de las "señales de peligro". Si no existe una estimulación óptima en la
periferia, las células dendríticas centinela no se convierten en células presentadoras de antígenos
profesionales en el ganglio linfático, lo que es necesario para informar a los linfocitos T auxiliares vírgenes
sobre el peligro inminente. Si la neurotoxina botulínica (NTBo) no es fagocitada por las células dendríticas,
no se generarán anticuerpos específicos contra la NTBo.

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3. Consideraciones generales sobre la neurotoxina

botulínica como antígeno

3.1. ¿Es la neurotoxina botulínica un inmunógeno?

En forma simplificada, nuestro sistema inmune formula las siguientes dos preguntas esenciales para
determinar si se requiere una respuesta inmune a la NTBo:

Primera pregunta (1): ¿Es peligrosa la NTBo?

Cuando hablamos del sistema inmune, "peligrosa" significa lo siguiente: ¿La NTBo pura y bioactiva puede
por sí sola activar las células dendríticas de manera óptima uniéndose a los receptores de
reconocimiento de patrones? ¿Se trata de una señal de peligro "microbiana"?

Segunda pregunta (2): ¿Es la NTBo ajena = extraña?

Cuando hablamos del sistema inmune, esto significa lo siguiente: ¿Pueden los linfocitos T vírgenes
detectar los péptidos derivados de la NTBo en las moléculas CMH, y se activan de manera antígeno-
específica?

Las respuestas a las dos preguntas son las siguientes:

3.1.1. ¿Es peligrosa la NTBo?

No; la NTBo pura y bioactiva no puede activar las células dendríticas por sí sola. Dentro de nuestro
conocimiento, todavía no se han identificado receptores de reconocimiento de patrones para la NTBo
en células dendríticas humanas. Estas células sencillamente no "ven" la NTBo desnuda. Tampoco es
necesario que lo hagan, porque en la naturaleza, la infección se produce por la bacteria Clostridium
botulinum entera, que las células dendríticas pueden reconocer fácilmente con receptores de
reconocimiento de patrones a través de las proteínas prototípicas de las superficies bacterianas, como
flagelina y peptidoglicano. (Se ha informado en un estudio que la NTBo-A puede estimular células
dendríticas de ratón a través de TLR2 [Kim YJ et al. PlosOne 2015]. Sin embargo, no está claro cuán
pura fue la preparación de NTBo-A utilizada en ese estudio. No se excluyó la posible contaminación, por
ejemplo con flagelina o peptidoglicanos clostridianos).

A modo de aclaración, es importante destacar que por supuesto la NTBo es una sustancia peligrosa para
los seres humanos, pero esto se debe a su efecto de inhibición de la liberación de neurotransmisores en
las terminaciones nerviosas. Desde el punto de vista inmunológico, el encargado de las decisiones del
sistema inmune no clasifica la proteína desnuda como peligrosa, porque no es una de las estructuras
prototípicas de las superficies bacterianas (por ejemplo, lipopolisacárido, flagelina o peptidoglicano)

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que actúan como las señales de peligro microbianas. Por lo tanto, la NTBo "desnuda", de manera similar
a las proteínas de los alimentos, no representa una amenaza inmunológica.

3.1.2. ¿Es la NTBo ajena = extraña para el paciente?

Sí; la NTBo es una proteína bacteriana y por supuesto es ajena a los seres humanos. Los linfocitos T
vírgenes pueden detectar los péptidos derivados de la NTBo en las moléculas CMH y se activan de manera
antígeno-específica. Se identificó una frecuencia bastante alta en un grupo de pacientes tratados con
NTBo-A por trastornos motores, lo que demuestra que los péptidos de la NTBo-A son fácilmente
identificados como ajenos por los linfocitos T humanos [Oshima M et al. Journal of Neuroimmunology
2011].

No se sabe cuántos de estos linfocitos T auxiliares específicos contra la NTBo apoyan a los linfocitos B
específicos contra la NTBo. No obstante, por lo menos algunos deben hacerlo, porque de lo contrario no
se encontrarían anticuerpos neutralizantes de la NTBo en algunos pacientes. Sin embargo, es importante
destacar que existe una gran discrepancia entre la frecuencia informada de linfocitos T específicos
contra la NTBo (~70% en el grupo de pacientes informado con trastornos motores) y la frecuencia de
anticuerpos neutralizantes informada en todas las indicaciones (~3,5%). ¿Cómo se puede explicar esta
discrepancia? No todas las respuestas de linfocitos T antígeno-específicos necesariamente dan lugar a
la formación de anticuerpos. Además, no todos los anticuerpos que se generan en los seres humanos son
neutralizantes. De hecho, se sabe a partir de muchos años de experiencia en vacunología que la
probabilidad de lograr anticuerpos protectores (es decir, neutralizantes) con inmunógenos débiles es
bastante baja. Muchos de los anticuerpos generados en una respuesta de linfocitos B policlonal pueden
unirse al antígeno, pero no neutralizan. El problema es que no hay motivo para medir los anticuerpos
no neutralizantes contra la NTBo en pacientes. Por lo tanto, no existe ningún estudio que investigue
este problema. Entonces, francamente, la frecuencia de anticuerpos no neutralizantes contra la NTBo
en pacientes es desconocida. La única justificación para extraer sangre de los pacientes y determinar
la presencia de anticuerpos neutralizantes es cuando se observa resistencia a la NTBo. En ese caso se
justifican los costos y el esfuerzo, porque estos anticuerpos tienen relevancia clínica. Entonces, resulta
tentador especular que la frecuencia de respuesta de los linfocitos B a la NTBo mediante la formación
de anticuerpos, tanto neutralizantes como no neutralizantes, puede ser mucho más alta en los pacientes
que la prevista a partir de los datos disponibles sobre los anticuerpos neutralizantes.

En resumen, la NTBo pura y bioactiva no es clasificada como "peligrosa" por las células dendríticas,
pero sí es clasificada como "ajena = extraña" por los linfocitos T auxiliares del sistema inmune
adaptativo.

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3.2. El dilema de la NTBo como inmunógeno

Como se indicó anteriormente, para que se inicie una respuesta inmune completa, ambas preguntas del
sistema inmune deben tener "sí" como respuesta. Lamentablemente, este no es el caso de la NTBo pura.
Pero, ¿cómo puede una proteína bacteriana "no peligrosa" como la NTBo, con su baja inmunogenicidad,
iniciar una respuesta inmune adaptativa y en última instancia ocasionar la formación de anticuerpos?

Este dilema se puede solucionar recordando nuestros conocimientos sobre el diseño de vacunas con
antígenos de baja inmunogenicidad. Si el antígeno no es lo suficientemente inmunogénico para provocar
una respuesta inmune por sí solo, se necesita ayuda. Los inmunólogos llaman a las sustancias que brindan
esa ayuda adyuvantes.

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4. Consideraciones generales sobre las vacunas y aspectos

específicos de la NTBo como vacuna
A esta altura, puede ser útil enfatizar que la proteína farmacológica NTBo debe inyectarse en el
paciente. La inyección de una proteína bacteriana, sobre todo cuando las inyecciones son repetidas,
recuerda a un protocolo de vacunación. ¿Entonces, el médico vacuna al paciente con NTBo sin quererlo?

Aquí surgen dos nuevas preguntas para responder. La más general es la siguiente: ¿Qué parámetros
debe satisfacer una buena vacuna para lograr la respuesta de anticuerpos neutralizantes? La segunda
tiene que ver con los productos farmacéuticos con NTBo: ¿Qué parámetros definen la inmunogenicidad
de los productos farmacéuticos con NTBo?

4.1. Parámetros que definen a una buena vacuna que induce una
respuesta de anticuerpos neutralizantes
Como se indicó anteriormente, una vacuna eficaz debe cumplir dos criterios básicos para producir una
buena respuesta de anticuerpos neutralizantes. En primer lugar, debe tener la capacidad de activar la
célula dendrítica por completo para que sea posible la presentación de antígenos profesional a los
linfocitos T vírgenes; por lo tanto, la vacuna debe contener señales de peligro. En segundo lugar, debe
contener el antígeno ajeno contra el cual se desea tener anticuerpos protectores. Al menos una parte
del antígeno debe ser una proteína que funcione como fuente para la presentación de péptidos.

Muchos años de experiencia nos enseñan que el éxito de una vacunación (formación de anticuerpos
neutralizantes) depende de lo siguiente:

 La composición del antígeno / la vacuna (desnaturalizado, en complejos).

 La dosis de la vacuna (cuanto más, mejor).
 La presencia de adyuvantes (estímulos para los receptores de reconocimiento de patrones en las
células dendríticas).

 La vía de aplicación.

 Los parámetros individuales de la persona vacunada (por ejemplo, HLA, estado inmunitario, etc.).

En pocas palabras, el éxito depende de que el nivel de inmunogenicidad de la vacuna sea alto (se resume
en la figura 8).

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Figura 8: El éxito de una vacunación depende de varios parámetros.

4.1.1. Los inmunógenos fuertes unen "señales de peligro" y "proteínas extrañas"

Una bacteria entera es un inmunógeno fuerte porque contiene estructuras de superficies microbianas
prototípicas y señales de peligro, y al mismo tiempo brinda muchas proteínas microbianas (antígenos)
que se pueden digerir para producir varios péptidos diferentes. Los péptidos bacterianos digeridos son
presentados y reconocidos como "ajenos" por los linfocitos T auxiliares vírgenes. Puede producirse la
expansión clonal de los linfocitos T auxiliares antígeno-específicos (se muestra en la figura 9).

Figura 9: Los inmunógenos fuertes unen "señales de peligro" y "proteínas extrañas".

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Las "señales de peligro" incluidas en un inmunógeno fuerte, como una bacteria, activan la célula dendrítica
por completo para que se convierta en una célula presentadora de antígenos profesional que presente un
péptido derivado de proteínas "extrañas" (de la bacteria) a un linfocito T auxiliar virgen (Th0). Si este linfocito
reconoce el péptido como "ajeno = extraño" con su receptor de antígenos y, además, interactúa con las
moléculas coestimulantes reguladas al alza en la superficie de la célula presentadora de antígenos (flecha
doble) y es estimulado por las citocinas liberadas por esta célula, entonces produce el factor de crecimiento
autocrino interleucina-2 (IL-2) que es necesario para la expansión clonal a los linfocitos T auxiliares efectores
antígeno-específicos (Th1).

4.1.2. Los inmunógenos débiles carecen de "señales de peligro"

Una proteína bacteriana pura para la cual no existen receptores de reconocimiento de patrones funciona
como fuente de péptidos antigénicos, pero dado que no hay "señales de peligro", nunca se activarán las
células dendríticas para que fagociten la proteína. En consecuencia, no se generarán ni presentarán
péptidos (se muestra en la figura 10).

Figura 10: Los inmunógenos débiles carecen de "señales de peligro".

Los antígenos que carecen de "señales de peligro" no pueden activar las células dendríticas del todo, por lo
que no se produce la fagocitosis. Dado que no se generan péptidos para presentar, es imposible informar al
sistema inmune adaptativo. No pueden generarse anticuerpos contra el inmunógeno débil.

Si el antígeno es un inmunógeno débil, el resultado de la vacunación puede mejorarse drásticamente

agregando adyuvantes.

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4.1.3. Los adyuvantes brindan señales de peligro a los inmunógenos débiles

"Adjuvare" es la palabra en latín que significa "ayudar". Y sin duda, los adyuvantes son ayudantes
inmunológicos. Se agregan a los antígenos de baja inmunogenicidad con el objetivo de lograr la
activación óptima de las células dendríticas que se requiere para estimular la fagocitosis, el
prerrequisito absoluto para que se produzca una respuesta inmune. Esto se produce de un modo
independiente del antígeno (también llamado "inespecífico") mediante la activación de receptores de
reconocimiento de patrones en las células dendríticas. En consecuencia, los mejores adyuvantes son
señales de peligro microbianas. Anteriormente se utilizaban bacterias inactivadas por calor enteras para
estimular las células dendríticas, sobre todo en animales. El "adyuvante completo de Freund" es un
potente adyuvante muy conocido que produjo excelentes respuestas de anticuerpos en animales. Sin
embargo, dejó de usarse por sus efectos secundarios graves. El lipopolisacárido de bacterias Gram-
negativas y los peptidoglicanos de bacterias Gram-positivas son dos de los estímulos más potentes para
las células dendríticas humanas. Otras estructuras microbianas, como flagelina o ADN bacteriano,
también activan las células dendríticas de manera potente.

Además de los adyuvantes, la unión cruzada de antígenos más pequeños con complejos más grandes (por
ejemplo, con formaldehído o por desnaturalización) y el agregado de sustancias que forman depósitos
(como escualeno) pueden aumentar todavía más la inmunogenicidad de las vacunas. Estos aspectos de
las vacunas no se desarrollarán en mayor profundidad en este contexto.

Entonces, el adyuvante y el antígeno tienen dos funciones separadas. El adyuvante suministra la "señal
de peligro" requerida para activar el primer encargado de tomar decisiones de manera óptima, mientras
que el antígeno es la fuente del péptido ajeno que debe presentarse al segundo tomador de decisiones.
Combinados, el adyuvante y el inmunógeno débil como antígeno hacen posible que el sistema inmune
responda "sí" a las dos preguntas. En estas circunstancias, puede comenzar la inmunidad adaptativa a
un inmunógeno débil y pueden generarse anticuerpos.

El adyuvante puede ser una proteína. La flagelina es un adyuvante muy potente [véase Mizel y Bates JI
2005] con una inmunogenicidad propia fuerte porque estimula un receptor de reconocimiento de
patrones (el receptor tipo Toll 5). Al mismo tiempo, es una fuente de péptidos antigénicos para
presentar. En este caso, el adyuvante también es un antígeno. Sin embargo, el adyuvante no debe ser
necesariamente una proteína: también puede ser un componente no proteináceo de las paredes
celulares de las bacterias, como lipopolisacárido, o un ácido nucleico.

4.1.4. Secuencia detallada de una vacunación con un inmunógeno débil más adyuvante
Durante la vacunación, el antígeno se inyecta junto con el adyuvante. El adyuvante se une a los
receptores de reconocimiento de patrones en la superficie de la célula dendrítica. Esto estimula la
célula de manera óptima. En consecuencia, la célula dendrítica comienza a fagocitar la sustancia que
causó la estimulación (suponiendo que sea un microbio ineficaz). El antígeno de baja inmunogenicidad
propiamente dicho, coinyectado con el adyuvante en el mismo lugar, también es fagocitado por la célula
dendrítica de manera más o menos accidental. Cualquier proteína que ingresa en fagolisosomas es

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degradada, incluso el antígeno, y se generan péptidos. Si el adyuvante es proteináceo (por ejemplo,

flagelina), también se procesará y se convertirá en péptidos. Luego se produce la presentación de los
péptidos generados, tanto del adyuvante como del antígeno, en moléculas CMH clase II. Al mismo
tiempo, la célula dendrítica activada deja la periferia y se traslada al siguiente ganglio linfático de
drenaje, donde se establece como una célula presentadora de antígenos profesional. Linfocitos T
vírgenes individuales detectan el péptido correcto en las moléculas CMH con su receptor de antígenos.
Un linfocito T virgen con su receptor puede reconocer un péptido derivado de la proteína adyuvante,
mientras que otro con una especificidad distinta puede reconocer un péptido derivado del antígeno
propiamente dicho. En esta situación, surgirán dos linfocitos T auxiliares diferentes con especificidades
de antígeno discretas (se muestra en la Figura 11). Esto abre la posibilidad de ayudar a dos linfocitos B
vírgenes a producir sus anticuerpos: uno se une a la proteína adyuvante, y el otro se une al antígeno. El
anticuerpo contra la proteína adyuvante es clínicamente irrelevante. Si el anticuerpo contra el antígeno
es neutralizante, brindará protección contra la enfermedad causada por el microbio del cual se derivó
el antígeno.

Figura 11: Los inmunógenos débiles requieren adyuvantes para lograr la presentación de antígenos.

La combinación de adyuvante (como fuente de "señales de peligro") e inmunógeno débil (como antígeno y
fuente de péptidos "ajenos") da como resultado la activación óptima de la célula dendrítica para que se
convierta en una célula presentadora de antígenos. Pueden producirse respuestas inmunes adaptativas
individuales tanto al adyuvante (linfocito T superior) como al inmunógeno débil (linfocito T inferior).

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4.2. Parámetros que definen la inmunogenicidad de los productos

farmacéuticos con NTBo
En principio, la situación que se describió anteriormente también es válida para el inmunógeno débil
NTBo. La NTBo pura y bioactiva carece de la "señal de peligro" microbiana para la activación. No es
capaz de estimular las células dendríticas por sí sola, y la inyección no produce ninguna respuesta
inmune (véase la figura 10).

4.2.1. "Vacunación" con NTBo: generación de anticuerpos contra la NTBo

Si la NTBo se coinyecta con un adyuvante, este último activa por completo la célula dendrítica. Una vez
activada, la célula dendrítica fagocita el adyuvante y cofagocita la NTBo. Ambas sustancias se derivan
a fagolisosomas, donde todas las proteínas, incluida la NTBo, se procesan para formar péptidos. Los
péptidos se presentan en moléculas CMH clase II (véase la figura 11). Al mismo tiempo, también pueden
presentarse péptidos derivados de una proteína adyuvante. Una vez activada, la célula dendrítica deja
la periferia y migra al siguiente ganglio linfático de drenaje, donde se establece, ahora como una célula
presentadora de antígenos profesional. Los linfocitos T vírgenes analizan la superficie de esta célula
presentadora de antígenos profesional. Si un linfocito T virgen tiene un receptor de antígenos que encaja
con un péptido derivado de la NTBo en la CMH, este linfocito antígeno-específico se activa y se expande
clonalmente para formar linfocitos T auxiliares específicos contra la NTBo. Estos posteriormente
contribuyen a la activación de los linfocitos B específicos contra la NTBo. En última instancia, esto
ocasiona la formación y liberación de anticuerpos específicos contra la NTBo. Al mismo tiempo, pueden
generarse anticuerpos contra el adyuvante sin consecuencia clínica alguna.

4.2.2. ¿El médico realmente vacuna al paciente con NTBo?

La respuesta a esta pregunta provocadora es, por supuesto, "no". Nadie estaría satisfecho con una vacuna
que protege apenas al 3,5% de las personas vacunadas.

Sin embargo, en una pequeña proporción de pacientes se detectan anticuerpos específicos contra la
NTBo. Y esto tiene consecuencias clínicas. Si vuelve a inyectarse NTBo más adelante para continuar el
tratamiento, los anticuerpos neutralizantes se unirán a la toxina de manera tal que se bloqueará su
bioactividad. Entonces, por lo menos desde el punto de vista formal, la respuesta debe ser "sí": el médico
vacuna a algunos de los pacientes con los productos farmacéuticos con NTBo sin quererlo, aunque con
un resultado bastante pobre si lo consideramos un "vacunador".

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5. ¿Los productos con NTBo disponibles comercialmente

son vacunas?
Para poder responder esta pregunta central, debemos considerar los componentes de los distintos
productos farmacéuticos con NTBo que se ofrecen en el mercado europeo y determinar si algunos de
ellos pueden funcionar como adyuvantes y así incrementar la baja inmunogenicidad del principio activo,
la NTBo.

5.1. Diferencias entre los productos con NTBo del mercado europeo
Actualmente hay tres formulaciones de NTBo-A y un medicamento con NTBo-B disponibles en el mercado
europeo. En este trabajo, nos referiremos únicamente a las tres formulaciones de NTBo-A (resumidas
en la Tabla 1). La NTBo-B es un principio activo distinto, una proteína distinta con una inmunogenicidad
más alta que la NTBo-A. Esto se debe, al menos en parte, a que también suelen emplearse dosis más
altas en comparación con la NTBo-A. Se ha informado que las tres formulaciones de NTBo-A difieren en
cuanto a su contenido de proteínas clostridianas además de la molécula de la toxina pura [Frevert Drugs
RD 2010, Frevert & Dressler Biologics 2010]. En algunos estudios se informa que las formulaciones
también difieren en cuanto a su inmunogenicidad, es decir la frecuencia con la cual ocasionan la
formación de anticuerpos neutralizantes en los pacientes [Naumann et al. J Neural Transm 2013, Fabbri
M et al. 2016] (véase también la figura 2).

Tabla 1: Resumen de las formulaciones de NTBo-A1 disponibles en el mercado europeo en 2017.

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Los datos utilizados para esta tabla fueron tomados y adaptados de [Frevert J Drugs R D (2015) 15:1-9 y
Jankoviv, J et al. (editores) Botulinum Toxin, 2009, páginas 390-395, tablas 32-1 – 32-4].

¿Pueden los componentes de las distintas formulaciones de NTBo-A aumentar la inmunogenicidad del
principio bioactivo NTBo-A puro (cadena pesada y ligera)? ¿Hay posibles adyuvantes presentes en los
medicamentos comerciales con NTBo-A?

5.2. Información de base sobre los productos farmacéuticos con NTBo-A

La NTBo-A se produce fermentando una determinada cepa de Clostridium botulinum (Hall) y luego
purificando el principio activo NTBo-A a partir de estos cultivos bacterianos. En la naturaleza y en los
cultivos, las bacterias liberan la neurotoxina en un complejo con otras proteínas bacterianas, que
cumplen por lo menos dos funciones distintas. Protegen la toxina de la degradación rápida y posibilitan
la captación a través del epitelio gastrointestinal (¡recordemos que la NTBo-A es un tóxico alimentario!).
La proteína no hemaglutinina no tóxica protege la cadena pesada y ligera de la NTBo-A formando un
complejo íntimo con la cadena pesada y ligera. Las distintas hemaglutininas se requieren para estabilizar
el complejo y facilitar su captación a través del epitelio gastrointestinal (pueden consultarse detalles
por ejemplo en Rossetto O et al. Nat Rev Microbiol. 2014). En la figura 12 se muestra un modelo
simplificado de todo el complejo.

Figura 12: Modelo simplificado del holocomplejo de NTBo-A.

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La neurotoxina botulínica A1 (NTBo-A1) central consiste en una cadena pesada (P) unida por un puente
disulfuro (línea amarilla) a una cadena ligera (L). Este complejo central es necesario y suficiente para causar
neurotoxicidad cuando se inyecte al paciente (A). Las bacterias Clostridium botulinum producen y liberan un
holocomplejo en el cual la neurotoxina central está protegida por la cadena no hemaglutinina no tóxica
(NTNHA) de la degradación, así como varias hemaglutininas (HA) de un tamaño de 17, 33 y 70 KDa que
participan en la captación del complejo de toxina progenitora del intestino al torrente sanguíneo. La
estructura es similar a un trípode, con la toxina central arriba (B). La estequiometría del complejo se resume
en (C). Los datos resumidos aquí fueron tomados y adaptados de [Rosetto O et al. Nat Rev Microbiol (2014)
12: 535-549 Fig. 2].

Por supuesto, las tres formulaciones de NTBo-A disponibles comercialmente contienen la molécula de
NTBo-A central. La cantidad total de cadena pesada y cadena ligera de NTBo-A que contiene cada
producto es distinta, posiblemente debido a una proporción de neurotoxina biológicamente inactiva.
Puede existir neurotoxina inactiva por un procesamiento no cuantitativo de la proteína precursora por
parte de las bacterias, el plegado incorrecto de la proteína y la descomposición del puente disulfuro.
Aunque esto puede contribuir a las distintas cargas totales de proteína bacteriana presentes en los
productos farmacéuticos, y por lo tanto afectar la cantidad total de antígeno, no desarrollaremos el
tema en mayor profundidad en este trabajo. El énfasis aquí se pone en las proteínas bacterianas
adicionales que se encuentran en dos de las tres formulaciones y pueden influir en la inmunogenicidad
de los medicamentos. Estas proteínas adicionales suelen denominarse proteínas accesorias no tóxicas.

Xeomin / Bocouture (incobotulinumtoxina A) contiene únicamente la neurotoxina botulínica A pura, es

decir, cadena pesada y ligera en un complejo de 150 KDa. No hay otras proteínas bacterianas presentes.
Se informa que la NTBo-A tiene una alta bioactividad específica, lo que significa que la toxina pura está
correctamente plegada y, por lo tanto, es bioactiva [Frevert J Drugs RD 2010, Frevert J Drugs RD 2015].

Botox / Vistabel (onabotulinumtoxina A) también contiene la cadena pesada y ligera de la NTBo-A, en

una calidad comparable a la de la incobotulinumtoxina A (según los numerosos informes que demuestran
una bioactividad comparable en el uso clínico). Además, esta formulación contiene más proteínas
clostridianas del holocomplejo, como hemaglutininas y la cadena protectora no hemaglutinina no tóxica
[Frevert J Drugs RD 2015].

Dysport / Azzalure (abobotulinumtoxina A) contiene la cadena pesada y ligera de la NTBo-A en una

concentración de proteínas más alta que las otras dos formulaciones. El motivo detrás de esta mayor
cantidad de neurotoxina no está del todo claro, pero puede deberse a una mayor cantidad de NTBo-A
no bioactiva. Al igual que la onabotulinumtoxina A, la abobotulinumtoxina A también contiene proteínas
accesorias no tóxicas del holocomplejo. Asimismo, también contiene flagelina clostridiana [Frevert J
Drugs RD 2015, FDA Medical Report Clinical Review on Dysport].

Cabe destacar que, para que se produzca la acción biológica de la neurotoxina en la terminación
nerviosa (neurotoxicidad), se requiere solamente la NTBo-A central, que consiste en la cadena pesada
y la cadena ligera unidas por un puente disulfuro. No se requieren proteínas bacterianas adicionales si
se inyecta NTBo-A.

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En los tres medicamentos, el principio activo se complementa con otros aditivos para estabilizar la
proteína y asegurar una recuperación cuantitativa de NTBo-A después de la reconstitución de la
formulación liofilizada o secada al vacío. Si bien esto también puede influir en la inmunogenicidad de
los productos farmacéuticos (por ejemplo, formación de agregados de proteínas), estos aspectos no se
desarrollarán en el presente trabajo.

5.3. ¿Los productos farmacéuticos con NTBo-A son vacunas?

Debemos analizar tres situaciones distintas con respecto a las tres formulaciones: inyección de NTBo-A
pura (Xeomin / Bocouture), inyección de NTBo-A más proteínas accesorias no tóxicas (Botox / Vistabel),
e inyección de NTBo-A con proteínas accesorias no tóxicas más flagelina (Dysport / Azzalure).

1. Cuando se inyecta la NTBo-A pura y bioactiva, el heterodímero de cadena pesada y ligera unido por
disulfuro se deposita intacto en el tejido cerca de la unión neuromuscular a la que apunta el médico, y
también cerca de las células dendríticas. No obstante, la NTBo-A pura tiene baja inmunogenicidad y no
es capaz de activar la célula dendrítica, por lo cual no pasará nada (Fig. 13).

Figura 13: Las consecuencias inmunológicas de inyectar NTBo-A1 pura.

La NTBo-A1 pura intacta no activa las células dendríticas humanas. Debido a la falta de "señales de peligro",
no es capaz de activar los receptores de reconocimiento de patrones en las células dendríticas. Por lo tanto,
no se produce ninguna consecuencia inmunológica.

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2. Cuando se inyecta en el tejido un complejo de NTBo-A y proteínas accesorias no tóxicas, lo más

probable es que el complejo se desintegre y los componentes se separen muy rápido [Eisele KH et al.
Toxicon 2011]. Si bien en este caso la NTBo-A tampoco es capaz de activar la célula dendrítica, las
hemaglutininas pueden interactuar con las moléculas en la superficie de la célula gracias a sus
propiedades similares a las de la lectina. Los carbohidratos se han identificado como socios de
interacción de las hemaglutininas clostridianas en las células huésped [Yao G et al. Toxins 2014]. La
unión cruzada de los receptores de la superficie puede dar lugar a la activación de la célula dendrítica.
En la actualidad, no está claro si las hemaglutininas clostridianas son señales de peligro para las células
dendríticas humanas. Se ha informado que las hemaglutininas de Clostridium botulinum tipo B aumentan
la producción de anticuerpos contra la neurotoxina en ratones [Lee JC et al. Microbiology 2005]. En otro
estudio, se demostró que HA33 de la NTBo-A tiene una alta inmunogenicidad en ratones y se sugirió su
uso como adyuvante [Kukreja R et al. Toxicon 2009]. Estos datos sugieren que las hemaglutininas
clostridianas podrían funcionar como adyuvantes. Sin embargo, es necesario realizar más estudios, sobre
todo con hemaglutininas altamente purificadas sin ningún otro contaminante clostridiano que pueda
proporcionar las señales de peligro, para que finalmente se puedan determinar las propiedades
adyuvantes de las hemaglutininas clostridianas.

3. Inyección del holocomplejo de NTBo-A con flagelina. Si hay presencia de flagelina, el caso es más
claro. Las flagelinas son muy buenos activadores de las células dendríticas y se utilizan como adyuvantes
en vacunología (véase un análisis en [Mizel y Bates JI 2010]). No existe por el momento ningún informe
sobre las propiedades estimulantes de la flagelina derivada de Clostridium botulinum. Sin embargo, los
flagelos derivados de Clostridium difficile estimulan las células a través de TLR5 [Yoshino Y et al. Life
Sciences 2013, Batah J et al. Anaerobe 2016]. Por lo tanto, es altamente probable (aunque todavía no
se ha comprobado formalmente) que la flagelina contenida en esta formulación de NTBo-A disponible
comercialmente sea un ligando de TLR5 capaz de activar las células dendríticas humanas. La secuencia
de acontecimientos posibles después de inyectar este tipo de medicamento se resume en la figura 14.
Mientras que la flagelina brinda la señal de peligro microbiana necesaria a través de TLR5, la NTBo-A
cofagocitada funciona como la fuente de los péptidos ajenos para presentar a los linfocitos T vírgenes.
El procesamiento y la presentación de péptidos permiten activar la respuesta inmune adaptativa de
manera específica a la NTBo-A. En última instancia, la formación de anticuerpos específicos contra la
NTBo-A es posible. Este escenario podría explicar en parte por qué se informa una frecuencia de
anticuerpos neutralizantes de la NTBo-A más alta con Dysport / Azzalure que con los otros dos productos
farmacéuticos, que no contienen flagelina.

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Módulo 2 de 9. Sobre la inmunogenicidad de la neurotoxina botulínica (Dr. Michael U. Martin)

Figura 14: Las consecuencias inmunológicas de inyectar productos farmacéuticos con NTBo-A1 que contienen adyuvantes.

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Cuando se inyectan productos farmacéuticos que contienen el holocomplejo de NTBo-A y flagelina (1), el
holocomplejo se desintegra rápido y se separa en la neurotoxina central (NTBo-A1), las hemaglutininas y la
flagelina (2). La "señal de peligro" flagelina puede unirse al receptor tipo Toll 5, y las hemaglutininas pueden
unirse de manera cruzada a las moléculas en la superficie de la célula dendrítica, y así activar esta célula
por completo (3). Esto fagocitará el material inyectado en los alrededores. El procesamiento de las
hemaglutininas y la flagelina resulta en péptidos ajenos (se muestran en verde) que son presentados por la
célula dendrítica, ahora como célula presentadora de antígenos profesional, a un linfocito T auxiliar virgen
(Th0, se muestra con un receptor de antígenos de linfocito T verde, 4). Al mismo tiempo, la célula dendrítica
activada cofagocita la NTBo-A1 y la procesa (5). Por último, la célula presentadora de antígenos también
presenta los péptidos derivados de la NTBo-A1 (se muestran en rojo) a un linfocito T auxiliar virgen distinto
con un receptor de antígenos específico para el péptido de la NTBo-A1 (6). Una respuesta inmune adaptativa
a ambos antígenos es posible porque las proteínas bacterianas adicionales brindaron la "señal de peligro" a la
célula dendrítica para permitir la cofagocitosis del inmunógeno débil NTBo-A1.

En resumen, algunos de los componentes presentes en las formulaciones de NTBo-A, como

hemaglutininas y flagelina, pueden funcionar como adyuvantes al activar los receptores de
reconocimiento de patrones en las células dendríticas humanas. Es posible que otros componentes
también ayuden (se resumen en la Tabla 2). Por supuesto que los productos farmacéuticos altamente
purificados no deberían contener componentes de las paredes celulares, como peptidoglicanos. Sin
embargo, si están presentes aunque sea a concentraciones muy bajas, podrían contribuir parcialmente
(ver más adelante).

Tabla 2: Ingredientes de las formulaciones de NTBo-A que pueden aumentar la inmunogenicidad de la NTBo-A1 pura.

5.4. Las células dendríticas pueden integrar "señales de peligro"

En este punto, es importante destacar que la activación de una célula centinela no necesariamente se
debe a un solo tipo de estímulo. Las células dendríticas pueden integrar señales individuales hasta que
se alcanza una determinada intensidad de "señales de peligro". Una vez alcanzado el umbral crítico, las
células dendríticas se activan por completo. También se sabe que las señales que activan distintos
receptores de reconocimiento de patrones pueden actuar en conjunto para estimular las células
dendríticas humanas de manera sinergística [Napolitani G et al. Nat Immunol 2005]. Por lo tanto, es
concebible que incluso las concentraciones bajas de un solo estímulo, que por sí solo no activaría una
célula dendrítica, si se aplicaran junto con otros estímulos, que también podrían estar por debajo de
sus propias concentraciones críticas, puedan ocasionar la activación completa de las células.

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5.5. Aportes adicionales para la activación de las células dendríticas

En este sentido, debemos mencionar otras contribuciones. Un aspecto es el modo de aplicación. La
proteína farmacológica NTBo-A debe inyectarse en el tejido. La inyección siempre significa que la aguja
destruye células mecánicamente. La muerte celular por lesión ocasiona la liberación de contenidos
celulares hacia el tejido circundante. Las proteínas intracelulares, como las proteínas de choque
térmico, son señales de alerta "endógenas" que pueden activar los receptores de reconocimiento de
patrones (por ejemplo, TLR4) en las células dendríticas humanas. Si la lesión es lo suficientemente
grave, las células dendríticas pueden activarse. Esto puede manifestarse como una inflamación aguda
en el lugar de la inyección. No se espera que la inyección por sí sola produzca "señales de peligro" lo
suficientemente potentes como para causar la formación de anticuerpos; de lo contrario, la frecuencia
de anticuerpos neutralizantes contra la NTBo-A sería mucho más alta. Sin embargo, puede ser uno de
los factores que ayudan a alcanzar el umbral.

En ese contexto, los anticuerpos no neutralizantes o incluso de reacción cruzada que se unen a la NTBo-
A también podrían cumplir una función. Estos complejos de anticuerpos contra la NTBo-A podrían unirse
a los receptores Fc en las células dendríticas y contribuir a su activación.

Una advertencia: Para inducir una respuesta inmune adaptativa a la NTBo-A, debe producirse la
secuencia de acontecimientos que se describe aquí. Sin embargo, es imposible predecir en qué momento
durante el tratamiento se producirá eventualmente la inmunización. Puede ser después de la segunda
o tercera aplicación, o incluso después de varios años. Asimismo, hoy por hoy es imposible predecir
quién desarrollará anticuerpos. Es concebible que algunos seres humanos tengan una mayor probabilidad
de responder con la formación de anticuerpos que otros, posiblemente debido a su haploptipo de CMH,
que define qué péptidos se pueden presentar. Y, al igual que en la vacunología, las inyecciones repetidas
preferentemente de altas dosis de antígeno (refuerzo) ocasionarán una mejor respuesta de anticuerpos.
Lamentablemente, estos interesantes aspectos de cómo mejorar la memoria inmunológica están fuera
del alcance de este capítulo.

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6. Resumen final
6.1. Cumplimiento del objetivo de este aporte
El objetivo de este aporte fue brindarle al médico información básica sobre inmunología para responder
dos preguntas sobre la inmunogenicidad de la NTBo-A.

 ¿Cuáles son los requisitos para la NTBo-A como vacuna, a fin de lograr una respuesta inmune/de
anticuerpos que sea protectora y duradera?
 ¿Cuáles son los requisitos para la NTBo-A como fármaco terapéutico, a fin de posibilitar la
administración repetida en pacientes durante un tiempo prolongado sin el riesgo de provocar una
respuesta de anticuerpos?

Ahora debería ser fácil responder estas preguntas.

Si se desea vacunar a una persona, se deberá:

 Aplicar NTBo-A como un agregado grande (desnaturalizado como un toxoide en alumbre).

 Si es posible, agregar varios activadores de receptores de reconocimiento de patrones como
adyuvantes.
 Inyectar una gran cantidad del antígeno bacteriano repetidas veces (inyecciones de refuerzo).

Sin embargo, si se desea aplicar NTBo-A repetidamente durante un tiempo prolongado y evitar la
formación de anticuerpos, se deberá:

 Usar NTBo-A pura con una actividad específica lo más alta posible (-> bajo contenido de
antígenos).
 Evitar los complejos con proteínas bacterianas innecesarios (-> baja carga total de proteínas
bacterianas).

 Evitar especialmente la flagelina (-> sin adyuvantes).

 Elegir intervalos entre inyecciones lo más largos que sea aceptable desde el punto de vista
terapéutico (-> riesgo de refuerzo reducido).

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6.2. Consideraciones finales sobre la inmunogenicidad de la NTBo-A

Muchos parámetros que no pueden ser fácilmente modificados por el médico pueden influir en la
inmunogenicidad de una formulación de neurotoxina botulínica.

Algunos de esos parámetros son los siguientes:

 La dosis (cantidad de proteína farmacológica bioactiva necesaria para lograr la neurotoxicidad).

 La vía de aplicación (por inyección).

 Los parámetros individuales del paciente (por ejemplo, HLA, estado inmunitario, infecciones).

Sin embargo, es importante destacar que la inmunogenicidad de una formulación de neurotoxina

botulínica individual se define fundamentalmente por:

 el estado del antígeno

 y la presencia de componentes adyuvantes.

Sabiendo esto, el médico puede minimizar la inmunogenicidad y el riesgo de formación de anticuerpos

eligiendo la formación de NTBo-A adecuada.

La conclusión es:

La composición de la formulación de NTBo-A define la reacción del sistema inmune a la proteína

farmacológica.

La NTBo-A pura y altamente activa presenta el riesgo más bajo de formación de anticuerpos.

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Abreviaturas

 NTBo = neurotoxina botulínica

 NTBo-A = neurotoxina botulínica A1

 NTBo-B = neurotoxina botulínica B

 CD = célula dendrítica

 CPA = célula presentadora de antígenos

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