PRACTICA N°2

DESCRIPCION Y MANEJO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

INTRODUCCION

La palabra microscopio deriva de las voces griegas (micros = pequeño y skopein =

observar); es un instrumento que permite visualizar cerca y aumentado, cuerpos
pequeños y sus detalles estructurales, cuyas dimensiones son inferiores al límite
del poder de resolución del ojo humano calculado en 70 – 100 um (0.1 mm).

En el laboratorio es importante conocer la magnificación o el grado de aumento

que ha sufrido la imagen del objeto que está siendo observado. Es importante
también el poder de resolución del microscopio, es decir, el poder separar dos
puntos que se encuentran muy próximos entre sí. Por ejemplo: Si existen dos
puntos separados por una distancia de 0.2 mm a más, la vista los distingue por
separado, pero si dos puntos presentan una separación de 0.1 mm a menos, la vista
lo observará como un solo punto; en cambio el microscopio lo diferenciará por
separado.

El poder de resolución de un microscopio depende de su abertura numérica y de la

longitud de onda que usa. A menor longitud de onda, mayor poder de resolución.

OBJETIVOS

Identificar las diferentes partes que constituyen el microscopio y reconocer las

funciones de cada una de ellas.
Adquirir habilidad en el uso y manejo correcto del microscopio, siguiendo las
indicaciones de las guías de laboratorio.

III. PROCEDIMIENTO

PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO: Se pueden agrupar en cuatro

sistemas:

El sistema de soporte.

El sistema de aumento.

El sistema de iluminación.

El sistema de ajuste.

EL SISTEMA DE SOPORTE

EL PIE

Es la parte que sostiene al microscopio, asegurando perfecta estabilidad del

aparato en posición vertical, inclinada u horizontal. Presenta diferentes formas
siendo la más común la de herradura.

LA COLUMNA, BRAZO O BASTIDOR

Es la parte articulada al pie por medio de una bisagra llamada charnela (en algunos
casos), sostiene la platina, el tubo óptico, lleva los tornillos macrométrico y
micrométrico. Generalmente tiene la forma de un arco, es por donde se toma para
su traslado de un lugar a otro.

LA PLATINA

Es una plancha metálica colocada en posición horizontal, presenta un orificio en la

parte central que permite el paso de luz proveniente del sistema de iluminación. En
algunos modelos la platina lleva adherida un par de pinzas que sirven para sujetar
la lámina porta-objeto o un carro móvil (charriot) para el desplazamiento del
preparado hacia la derecha o izquierda durante la observación. Su función es
sostener las placas con los preparados biológicos que se van observar

EL REVOLVER (CAMBIADOR DE OBJETIVOS)

Es un dispositivo metálico de forma circular, atornillado en la parte inferior del

tubo óptico, gira sobre su eje central; presenta 3 o 4 orificios a los que van
atornillados los objetivos. Este dispositivo sirve para cambiar la posición de los
objetivos durante las observaciones.

EL SISTEMA DE AUMENTO.

EL OCULAR. Denominado así porque va cerca al ojo del observador, dispuesto en

un tubo cilíndrico de metal, con un diafragma intermedio, ambos lentes presentan
las caras planas hacia el ojo del observador y las caras convexas hacia el objeto.
La lente que va cerca al ojo del observador se denomina ocular propiamente dicho
y la lente inferior como lente de campo; en la parte lateral y superior del tubo
cilíndrico lleva una numeración que indica el número de aumento propio del ocular.
Aumento. El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular:

Un ocular x 4, aumenta 4 veces la imagen que produce el objetivo.

Un ocular x 6, aumenta la imagen 6 veces.

Un ocular x 10, aumenta la imagen 10 veces.

El poder de aumento de los microscopios utilizados en los laboratorios médicos

oscila entre 50 y 1000.

OBJETIVOS. Llamado así porque va cerca del objeto a observar, constituye la

parte más importante del microscopio de los cuales depende su alcance. Está
constituido por un tubo metálico cilíndrico cónico, que lleva en su interior un
sistema de lentes destinados a dar la imagen real e invertida del objeto.

Objetivos Secos. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a
observar, no existe sustancia alguna, excepto el aire. Se utiliza generalmente para
observaciones de preparados en fresco.

Por el número de aumentos son de tres clases:

Pequeño aumento o panorámico: mayor de 0 y menor de 10X.

Mediano aumento: mayor de 10 y menor de 30X.

Gran aumento: mayor de 30 y menor de 80X.

Objetivos de Inmersión. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el

preparado a observar, se interpone una sustancia líquida, comúnmente el aceite de
cedro, cuyo índice de refracción es de 1.5; se utilizan generalmente para
observaciones de preparados en seco.
Características del Objetivo de Inmersión:

Es el de mayor aumento: 80X, 100X, 120X, 150X.

El lente frontal es más pequeño.

Lleva inscrito una fracción: 1/12; o un decimal: 1.20; 1.30.

De acuerdo a la procedencia lleva una franja o una raya negra para facilitar su
identificación.

La Abertura Numérica (AN)

La AN también se halla grabada en la manga de la lente, junto a la indicación del

poder de aumento;

0.30 en el objetivo de 10.

0.65 en el objetivo de 40

1.30 en el objetivo de 100

Distancia Focal:

Es la distancia que media entre la parte inferior del lente frontal y del objeto a
observar, cuando se tiene un enfoque perfecto.

Estas distancias focales para los diferentes objetivos son:

Pequeño aumento: entre 0.5 y 3 cm

Mediano aumento: entre 3 mm y 0.5 cm

Gran aumento: 1 mm y 3 mm entre 0.8 mm y 1.20 mm

SISTEMA DE ILUMINACION

Se encuentra ubicado en la parte inferior de la platina y comprende:

El diafragma. Es un dispositivo constituido por un sistema de laminillas metálicas

dispuestas concéntricamente, de tal forma que permita cerrar y abrir, regulando
de esta manera la entrada de luz emitida por el espejo.

El condensador. Es un dispositivo constituido, por un sistema de dos o más lentes

montadas dentro de un cilindro cónico truncado de metal, está situado por debajo
de la platina. Este sistema óptico sirve para concentrar o condensar los rayos
luminosos emitidos por el espejo; funciona accionando un tornillo.

Porta filtro. Es un dispositivo que permite colocar filtros de diferentes colores,

los cuales facilitan la observación.

LA LUZ:

La luz es una forma de energía transportada continuamente por el espacio a

velocidades muy elevadas (330.000 Km/s en el vacío). La luz está formada por
pequeños corpúsculos que salen de un foco luminoso en forma de ondas. El brillo de
la luz es proporcional a la altura o amplitud de la onda y su color depende de la
longitud de ésta. La luz blanca está constituida por una gama de colores del
espectro visible, estos colores son: rojo, anaranjado, amarillo, verde, azul y
violeta.

Cada color corresponde a una longitud de onda determinada, por consiguiente, la

luz blanca se compone de muchos rayos de luz, todos vibrando con diferentes
longitudes de onda. (Figuras 1.3 y 1.4). La luz de una sola longitud de onda se llama
monocromática. Si bien se utilizan casi solo microscopios de luz blanca, la mayoría
de las lentes modernas están diseñadas para el uso de luz monocromática verde.
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EL SISTEMA DE AJUSTE

El sistema comprende:

TORNILLO MACROMETRICO. Se utiliza primero para lograr la

aproximación del enfoque. Se encuentra situado en la parte superior o
inferior de la columna, permite desplazamiento del tubo óptico y de la
platina.

TORNILLO MICROMETRICO. Hace que el objetivo se desplace más

lentamente. Se encuentra situado en la parte superior o inferior de la
columna por debajo del macrométrico. En los microscopios modernos, el
micrométrico y el macrométrico se encuentran accionados por un solo
tornillo.

TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR. Se utiliza para elevar el

condensador y aumentar la iluminación o descenderlo y reducir la
iluminación.

TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR. Puede haber tres

tornillos colocados alrededor del condensador: uno al frente, uno en la
izquierda y otro a la derecha. Se usan para centrar el condensador
exactamente en relación con el objetivo.

ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS. Este es un pequeño elevador que se

encuentra fijo al condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el
diafragma, reduciendo o aumentando así el ángulo y la intensidad de la luz.

REGULADORES DE LA PLATINA METALICA. Se utilizan para desplazar

el portaobjeto sobre la platina (presente en los microscopios mejorados).

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ILUMINACION Y ENFOQUE:

La iluminación y enfoque son dos condiciones principales para realizar una

observación microscópica. La iluminación se consigue utilizando fuentes
luminosas adecuadas, que pueden ser: natural o artificial. Los rayos de luz
son reflejados por el espejo o por la lámpara de iluminación hacia el objeto o
preparado.

Cuando se examina con grandes aumentos, la luz debe ser intensa, en cambio
cuando se hacen con menores aumentos, la luz debe ser menos intensa, lo
que se consigue desplazando en forma vertical (arriba o abajo) al
condensador, y graduando la abertura del diafragma.

Obtenida la iluminación conveniente, se efectuará el enfoque del preparado,

utilizando primero el macrométrico hasta encontrar la imagen (enfoque
aproximado), y por último accionando el tornillo micrométrico que permite el
enfoque perfecto (visualización de la imagen).

CONDICIONES NECESARIAS PARA LA ILUMINACIÓN Y ENFOQUE.

Son las siguientes:

Objetivo a menor aumento (panorámico).

Diafragma abierto.

Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de

la preparación que se encuentra en el porta objetos.

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Utilizando el tornillo macrométrico eleve el objetivo hasta que observe una

imagen clara a través del ocular.

Nota: Al realizar el enfoque perfecto se debe tener en cuenta las

distancias focales a las que trabajan los diferentes objetivos, a fin de
evitar las rupturas de los lentes frontales y destrucción del preparado a
observar.

AMPLIFICACION

Cuando se trabaja en el laboratorio con el microscopio, es de gran

importancia conocer los poderes o grados de aumento de magnificación de
los objetos observados. Así tenemos que, el grado de aumento es la
amplificación que ha sufrido la imagen del objeto que está siendo observado.
Para obtener la amplificación se multiplica el número de aumento del ocular
por el número de aumento del objetivo.

Ejemplo:

La lente ocular presenta el número 10X y el número de la lente del objetivo

es 4X, el poder de amplificación del microscopio cuando se trabaja
simultáneamente con estas dos lentes será de:

Amplificación: 10X x 4X = 40 diámetros.

CUIDADO DEL MICROSCOPIO.

El microscopio compuesto (MC) es un instrumento muy delicado y de costo

muy alto, de allí que se deben seguirse los siguientes cuidados para su uso:

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Limpiar los lentes con papel especial, papel de silicona para no rayarlos.

Al transportarlo de un sitio a otro se tomará con la mano derecha la columna

del MC y con la mano izquierda el pie del MC. El instrumento debe ir
ligeramente inclinado hacia atrás para evitar la caída de los lentes o
espejos.

El microscopio se utiliza en posición vertical.

Al realizar la observación de preparados en fresco, evite que el agua fluya

sobre la platina.

No colocar los dedos sobre los lentes o el espejo, pues la grasa ocasiona que
estos elementos se empañen dificultando la buena visión. Por otro lado, la
grasa facilita el desarrollo de microorganismos que deterioran el MC.

Cuando se use el objetivo de inmersión, procure usar poca cantidad de

aceite de cedro. Luego de finalizar la observación, limpie el objetivo con
xilol.

Cuando termine de utilizar los microscopios de luz incorporada, desconecte

cuidadosamente los enchufes del tomacorriente. No tire del enchufe para
evitar su maltrato.

PREPARADOS Y COLORACIONES

La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico

es hacer una PREPARACIÓN EN FRESCO. Una preparación en fresco
consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un
portaobjetos (lámina) y a continuación cubrirla con un cubreobjetos

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(laminilla). Esta clase de preparados se observa comúnmente con objetivos a

seco.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos

vivos.

PREPARADOS EN SECO: Son aquellos en donde la sustancia examen se

encuentra fija a la lámina portaobjeto. La observación de estos preparados,
se hace generalmente con el objetivo de inmersión, aunque inicialmente se
utilizan objetivos de menor aumento.

Los preparados en seco se hacen por extensión o por frotis.

Extensión

Consiste en extender la sustancia examen en la lámina portaobjeto,

tratando de hacerlo en el centro, uniformemente y lo más finamente
posible, utilizando para ello una asa de k 011, mondadientes, etc.

Frotis

Consiste en extender la sustancia examen en el portaobjeto, utilizando para

ello dos láminas portaobjetos. En el tercio externo de una de ellas se coloca
la sustancia examen, sobre la cual. Se coloca el borde de la otra lámina, de
tal manera que forme un ángulo de 45 grados aproximadamente. Después de
observar que la sustancia examen se extiende en todo el borde de la lámina
superior, deslizar ésta hasta el otro extremo, mediante un movimiento
rápido, tratando de obtener un frotis fino y uniforme.

Fijación

Consiste en matar la célula, tratando de conservar su estructura

morfológica manteniéndola adherida a la lámina portaobjeto

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COLORACIÓN Y COLORANTES:

La coloración es el proceso mediante el cual, un cuerpo toma color bajo la

acción de otro cuerpo o sustancia llamada colorante y que no se decolora con
lavados de agua o cualquier otra sustancia empleada como disolvente.

Un colorante es una sustancia que es capaz de teñir las fibras vegetales y

animales. Los colorantes se han usado desde los tiempos más remotos,
empleándose para ello diversas materias procedentes de vegetales y de
animales así como distintos minerales.

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

SEGÚN SU ORIGEN:

NATURALES: como la hematoxilina, el carmín y la orceína.

SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina,

azul de anilina, el naranja G, entre otros.

SEGUN SUS PROPIEDADES QUÍMICAS

Colorantes ácidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma

negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos
componentes cargados positivamente se denominan acidófilos, porque tienen
afinidad por los colorantes ácidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a
grupos aminos de las proteínas. Estas proteínas pueden pertenecer al
citoesqueleto de la célula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al
elevado contenido de proteínas del citoplasma la eosina es un excelente
colorante citoplasmático. La eosina se une también a las membranas
plasmáticas. Las células que presentan un gran desarrollo de membranas

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(muchas mitocondrias, mucho retículo endoplasmático liso, entre otras) son

sumamente acidófilas, o sea, se tiñen intensamente con la eosina. También
encontramos a la fucsina ácida, ácido pícrico, entre otros.

Colorantes básicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante

cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados
negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan
basófilos, porque tienen afinidad por los colorantes básicos. Por ejemplo,
estos colorantes se unen al núcleo y ciertas regiones del citoplasma.
También encontramos a la hematoxilina, fucsina básica, violeta de genciana,
thionina, entre otros.

Colorantes neutros: son colorantes en los que la porción ácida y la básica

colorean. Tiñen las partes básicas de una célula de un color y las partes
ácidas de otro. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. El
eosinato de azul de metileno, Giemsa, Wrigth, May Grunwall, entre otros.

Colorantes indiferentes: tiñen aquellas estructuras o sustancias que los

disuelven más fácilmente que el líquido en que están preparados. Un ejemplo
es el colorante sudan, un colorante de lípidos.

II. MATERIALES DE LABORATORIO

Microscopio, gradillas, pipetas, mecheros, azul de metileno, wrigth, eosina,

leishman.

III. MATERIALES QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

Agua estancada, alcohol, algodón, gotero, láminas y laminillas, lanceta,

bajalenguas

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IV. REALIZA LOS SIGUIENTES PROCEDIMIENTOS

PREPARADOS EN FRESCO:

1.- Limpiar bien la lámina portaobjetos (laminilla) con un pedazo de tela o

material de lino.

2.- Con un gotero, colocar una gota de agua estancada en el centro de la

lámina portaobjetos y sobre la muestra el cubreobjeto.

3.- Efectuar la iluminación del microscopio

4.- Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio, fijarla con las

pinzas. La parte que contiene el cubreobjeto y la preparación, deberá estar
sobre el orificio de la platina.

5.- Enfocar, mientras observa por el ocular, eleve ligeramente el tubo con el
tomillo macrométrico hasta que se visualice el preparado, haga la imagen
más nítida con el tomillo micrométrico.

6.- El ajuste de la intensidad de la luz se hará con el diafragma.

7.- Enfoque girando el tomillo micrométrico, lentamente, hacia atrás o hacia

adelante para obtener detalles en varios niveles.

8.- Las observaciones se inician con el objetivo de pequeño aumento hasta el

objetivo de mayor aumento, procurando enfocarlo bien.

9.- Esquematice sus observaciones. Campo Microscópico:

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Resolución:

NOTA:

Para cambiar el objetivo de menor aumento a objetivo de mayor aumento

simplemente gire el revólver para colocarlo en su lugar. Aclare la imagen
utilizando el tornillo micrométrico.

Otra forma de observar protozoarios:

Tres o cuatro días antes de la práctica, prepara el cultivo de protozoarios

hirviendo un poco de paja en un litro de agua. Deja enfriar la infusión y
viértela en un frasco de vidrio de boca ancha. Agrega unas gotas de agua de

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charco y déjalo destapado fuera de la casa donde no le dé la luz solar

directa.

Elabora una preparación temporal de protozoarios: agrega una gota de la

infusión en un portaobjetos, coloca un cubreobjetos sobre ella y observa la
preparación en el microscopio con los objetivos 10X hasta 40X.

PREPARADOS EN SECO (Los cantidades de los materiales se duplican por

existir 02 secciones).

Extensión: Preparación de mucosa bucal:

a) Tomar una muestra de la mucosa bucal de la boca con ayuda de un

bajalenguas. Para ello basta pasarlo por el interior de la mejilla.

b) Extender la muestra sobre el portaobjetos con el palillo. Realizar una

extensión.

c) Fijar la muestra pasándola sobre la llama del mechero, con cuidado de que
no se queme. Es una fijación con calor.

d) Cubrir la muestra con azul de metileno (6ml por los seis grupos
formados). Dejar actuar durante tres minutos.

e) Lavar la muestra con agua dejándola caer con cuidado con ayuda de una
pipeta hasta eliminar los restos de colorante.

f) Cubrir con un cubreobjetos o colocar una gota de aceite de cedro (6ml

por los seis grupos formados).

g) Observar al microscopio, primero con los mínimos aumentos, luego pasar a

aumentos mayores.

h) Dibujar, indicando los aumentos.

Campo Microscópico:

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Resolución:

Frotis: Observación de células sanguíneas.

Con la lanceta estéril realizar una punción en un pulgar.

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2. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos.

3. Colocar un portaobjetos formando un ángulo de 45° y deslizarlo sobre

toda la superficie del portaobjeto de manera que se pueda obtener una fina
película de sangre.

4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tinción y añadir unas gotas

de alcohol absoluto (6ml por los seis grupos formados) y dejar que el alcohol
se evapore para fijar la preparación.

5. Cubrir con unas gotas de hematoxilina (18 ml por los seis grupos
formados) y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecación del
colorante agregando más líquido.

6. Lavar la preparación y añadir unas gotas de eosina (6ml por los seis
grupos formados) dejándola actuar 1 minuto.

7. Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante.

8. Dejar secar aireando el portaobjeto o bien al calor muy lento de la llama

del mechero.

9. Colocar una laminilla cubreobjeto o una gota de aceite de cedro (6ml por
los seis grupos formados).

10.- Observar al microscopio.

Campos Microscópicos:

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Resolución:

V. DISCUSIÓN

VI. CONCLUSIÓN

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

VIII. INVESTIGACION ADICIONAL

Escribir los nombres de las partes que corresponden al microscopio:

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¿Cuáles son las características y diferencias entre un microscopio óptico y

un electrónico?

¿Con qué aumentos pueden ser observados una bacteria, una célula vegetal y
una célula animal?

Por qué se utiliza el aceite de cedro en las observaciones con los objetivos
de inmersión?

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