PRACTICA No 5
DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Transaminación utilizando un extracto enzimático de hígado de paloma
INTRODUCCION
La transaminación es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo amino
desde un aminoácido hasta un cetoácido, dando como resultado conversión del primero en un
cetoácido y el segundo en un nuevo aminoácido Esta reacción es de gran importancia en el
metabolismo de los aminoácidos y es catalizada por enzimas llamadas TRANSAMINASAS o
Aminotransferasas, presentes en la mayoría de tejidos animales. El cofactor de estas enzimas es el
piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfa-cetoglutarato es el aceptor del grupo
amino, formándose por tanto ácido glutámico.
NH3 H O
-
R-CH-COO- C=O OOC-CH2-CH2-C-COO
α - ceto Glutarato
Enzima
O H NH3
R-C-COO- H - C -NH2 OOC-CH2-CH2-CH-COO-
Enzima Glutamato
L-aminoácido + alfa-cetoglutarato alfa-cetoácido + L-glutámico
El interés clínico está centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfa-
cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa glutámico Pirúvica o TGP) y L-aspartato: alfa-
cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutámico Oxalacética o TGO). Estas enzimas
tienen una acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica en condiciones
normales es baja o nula. Un aumento de actividad será evidencia de un deterioro de los tejidos en
que se encuentran de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento
de la actividad de TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima tan abundante
en el miocardio. En este caso no existirá aumento de la actividad sérica de TGP o será mínimo.
En hepatitis vírales u otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido,
habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes
de la aparición de síntomas clínicos como la ictericia. En este caso TGP será la enzima
predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático. Una elevada actividad de
transaminasas puede detectarse también en otras condiciones como: traumas accidentales o
quirúrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.
TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE PALOMA
Objetivo:
Aplicación de la técnica de cromatografía en capa fina para estudiar la transaminación en
presencia de un preparado de hígado de paloma como fuente enzimática, utilizando alanina y
aspartato como substratos.
Procedimientos:
Preparación de la fuente enzimática (Polvos acetónicos):
Los hígados recientemente extraídos de 4 pichones son homogeneizados en 10 volúmenes de
acetona fría durante un minuto, luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo obtenido es secado
a temperatura ambiente obteniéndose así polvos secos, fáciles de conservar.
El día de la práctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetónicos con 7 ml de agua
destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta el
sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada.
La acetona por su acción deshidratante facilita la extracción de enzimas de los tejidos. En esta
forma la acetona reduce la desnaturalización de las (enzimas) proteínas y concomitantemente
produce la desintegración de las estructuras celulares y la disrupción de los enlaces lipoproteicos.
Preparación del experimento de la transaminación.
En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HNO3 concentrado, medir lo
siguiente:
SISTEMAS
REACTIVOS I II III IV
Alanina 0.05 M 0,2 ml - - -
Glutamato 0.05 M - 0,2 ml - -
Aspartato 0.05 M - - 0,2 ml 0,2 ml
alfa-cetoglutarato 0.1 M 0,2 ml - 0,2 ml 0,2 ml
Piruvato 0.1 M - 0,2 ml - -
Extracto enzimático 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml -
Extracto enzimático hervido - - - 0,2 ml
Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en baño maría a 37 oC durante una hora
Identificación de los productos de la reacción por cromatografía en capa fina:
En una placa de Silica Gel, de 200 x 200 mm, marcar los puntos de origen a 15 mm del borde
inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los
cuatro tubos de experimento y tres para los tres estándares de: Alanina, Glutamato y Aspartato.
Estos sistemas estándares deberán ser preparados de la siguiente manera:
Medir 0.2 ml del Aminoácido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que previamente se encuentra
a concentración 0.05 M y agregar 0.8 ml de agua.
Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 10 μL
de cada sistema incubado y 2 μL de las soluciones estándar de aminoácidos en alícuotas de no más
de 1 μL cada vez, dejando secar cada área después de cada aplicación. Al final, colocar la placa
en la cámara cromatográfica conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenol y 25 de agua.
La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la línea marcada a 10 cm de los puntos de
origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 ºC por 3 minutos, y revelar el
cromatograma rociando una solución de ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado con agua y luego
dejarla secar. La representación esquemática de los resultados obtenidos luego de revelar el
cromatograma se muestra en la página siguiente.
Expresión de Resultados:
Frente del solvente
Interpretación de los resultados
Obtenidos.
Sistema1
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___________________________
___________________________
___________________________
2 4
Sistema 2
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
Sistema 3
1 3 6
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___________________________
___________________________
___________________________
5 7
Sistema 4
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___________________________
___________________________
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I II III IV
Figura Nº 6.1.- Cromatograma de la transaminación
Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completar la siguiente tabla e interpretar el cromatograma
con los resultados obtenidos. Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados:
Rf Rf
Mancha Nº 1 ................ Mancha Nº 5 ................
Mancha Nº 2 ................ Mancha Nº 6 ................
Mancha Nº 3 ................ Mancha Nº 7 ................
Mancha Nº 4 ................
Haga la identificación de cada una de las manchas señalando a qué aminoácido corresponde en
base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta que los valores de Rf para los estándares de Alanina, ac.
glutámico y ac. Aspártico encontrados en el experimento, para el solvente usado en la presente
cromatografía.
Aminoácido Aminoácido
Mancha Nº 1 ................ Mancha Nº 5 ................
Mancha Nº 2 ................ Mancha Nº 6 ................
Mancha Nº 3 ................ Mancha Nº 7 ................
Mancha Nº 4 ................
INTERROGANTES BIOQUIMICAS
1. ¿Qué es Rf?
2. ¿Cuáles son las reacciones catalizadas por TGO y TGP?
3. ¿Cuál es el objeto del sistema 2?
4. Explique el mecanismo que permite la separación de sustancias por cromatografía en capa fina
5. ¿Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reacción de transaminación?
Fundamente su respuesta
6. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradación de los
aminoácidos. ¿La degradación de los 20 aminoácidos sería afectada?
7. ¿Cuál será la distribución celular de la TGO y TGP?
8. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se incorporarán en una
proteína. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este fenómeno.
9. Si se utilizara leucina y α-ceto glutarato para estudiar la transaminación; ¿qué productos se
podría identificar? ¿Qué nombre propondría para la enzima involucrada?
10. ¿Es factible la identificación de cetoácidos mediante cromatografía? ¿De qué manera?
EXPERIMENTO 2
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA (TGP)
EN SUERO SANGUINEO
Objetivos
• Estudio de la transaminación en sueros normales y patológicos
• Aplicación del método colorimétrico de Reitman y Frankel para la determinación de la
actividad de la TGP sérica.
Métodos
Determinar la cantidad de piruvato formado luego de reaccionar Alanina y α-ceto Glutarato en
presencia de la TGP del suero utilizando la reacción con la 2,4 dinitro fenilhidrazina en medio
alcalino.
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo rotulados como B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:
REACTIVOS B D
Sustrato TGP (Alanina y α−ceto glutarato en Tampon Fosfato pH 7.4) 0.25 ml 0.25 ml
Colocar en Baño maría a 37 ºC por 2 minutos y luego agregar:
Suero sanguíneo ------ 50 µl
Agua destilada 50 µl ------
Mezclar por agitación suave. Incubar exactamente por 30 minutos y luego agregar:
Reactivo 2.4 DNFH (2,4 Dinito fenilhidrazina) 0.25 ml 0.25 ml
Mezclar. Dejar durante 10 minutos a 37 ºC. Luego agregar:
NaOH 0.4 M 2.5 ml 2.5 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos leer en el fotocolorímetro con filtro
verde (500-550 nm), llevando previamente el aparato a cero D.O. con agua destilada.
Expresión de Resultados:
1.- Complete la siguiente Tabla:
Muestra normal Muestra patológica
Actividad de TGP (U/L)
2.- Haga un breve comentario del experimento realizado y del valor de actividad transaminásica
obtenida.
Interrogantes Bioquímicas.
1. ¿Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación? ¿Cuál es el
grupo funcional del cofactor? Explique su mecanismo
2. ¿Participan las reacciones transaminación en la biosíntesis de aminoácidos? Cite algunos
ejemplos.
3. ¿Qué otro método, además del que se usó en esta práctica, podría emplear para detectar los
productos de la reacción de transaminación?
4. ¿Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero se mezclará con
aspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa? ¿Qué idearía para
determinar la actividad de TGP por un método similar?
