Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Transferencia de material genético por
conjugación en Escherichia coli
Laboratorio de genética microbiana

Grupo: 5QV01 Semestre: Enero-Julio 20

Equipo: Sección:

●
Conjugación

La conjugación es un proceso por el

cual, a través de un contacto físico, una
molécula de DNA plasmídico es
transferida de una cèlula donadora a
una receptora.

Figura 1 ; Conjugacion de Escherichia coli.

 Episoma

Elementos genéticos replicantes

extracromosómicos que se pueden
replicar de forma autónoma o que
pueden ser insertados (mediante un
proceso de recombinación) en el
cromosoma del organismo que los porta
y replicarse con el mismo.

Figura 2: Ejemplo de episoma a) extracromsomico b)

integrado al cromosoma
Figura 3: Plásmido F de E. coli.
Pili F

Es una estructura filamentosa

a nivel de la membrana
producida por bacterias F+ y
Hfr y representativa de los
apéndices de tipo sexual.
Figura 4 ; Conjugacion de de E. coli. Kitanako Med J.
(2000)
Relaxasa

Endonucleasa
específica a sitio que
realiza una ruptura en
el Ori T y permite la
movilización del
plásmido

Figura 5; reacciones realizadas por la realxasa

Figura 6: Mecanismo de transferencia
de DNA plasmidico durante
conjugacion
Tipos sexuales E. coli

Plásmido autónomo libre en el citoplasma

F+
celular.

F- Cepa que no presenta pásmido F.

Hfr Plásmido integrado al cromosoma celular.

Plásmido autónomo modificado por

F´
marcadores cromosómicos.
Cruza F+ x F-

Figura 7. Proceso de cruza entre una célula donadora F+ y una celule F-

Hfr (High-Frequency Recombination)

Plasmido integrado
Todos los Hfr aparecen por la
integración por recombinación de
un plásmido conjugativo en el
cromosoma bacteriano, esta se da or Plasmido F
la integración espontánea o inducida
por Luz UV sobre el plásmido F.

Figura 8: integración del episoma al

cromosoma bacteriano
Hrf x F-
 Facilitan la recombinación
Donadora del DNA plasmídico al
cromosoma
Rec +
Ayuda a la recombinación
Receptora génica

Genes “Rec”
Disminuye la frecuencia
Donadora de recombinación génica.

Rec -
Disminuye la frecuencia
Receptora
de recombinación génica
 Proteína RecBCD Proteína Rec A

Complejo con función de RecA envuelve al ADN de

exonucleasa, endonucleasa y cadena sencilla que ha
helicasa. Desenrolla la hélice entrado en una célula,
facilitando la recombinación en protegiéndolo de la
la que está implicada rec A. degradación por las
nucleasas.
 Cepas F’

Se forman por a ecsión

incorrecta del plásmido F
integrado al cromosoma de
una bacteria Hfr

Figura 10 : Integración del factor F que por

efecto de disociación anómala formando F’
 Mutante condicional
Mutante que expresa el fenotipo normal bajo
determinadas condiciones (permisivas) y el fenotipo
mutante bajo otras condiciones (restrictivas).

Permisivas Restrictivas

Son aquellas condiciones Son aquellas condiciones

bajo las cuales el producto ambientales bajo las cuales
del gen mutado es aún el mutante pierde la
funcional funcionalidad.
 Mutación ambar

La alteración genética caracterizada por la

terminación prematura de la síntesis de una
cadena de polipéptidos debido a que el triplete
de nucleótidos que normalmente codifica el
siguiente aminoácido de la cadena se convierte
en UAG.
 Medio mínimo de selección

Contiene los nutrientes necesarios para el

crecimiento de microorganismos en base a
su prototrofia o auxotrofia.
Bacteriófago M13

Figra 6 Estructura de un Bacteriófag M13

Western Blot

Es una técnica para identificar

proteínas, separándolas por un
proceso de electroforesis y una vez
separadas se pasan las muestras a una
membrana de poliacrilamida, a
continuación las proteínas son
sondeadas con un proceso de
immunoblotting, donde las muestras
reaccionan con anticuerpos con sitios
de unión específicos.
La transferencia de DNA ocurre durante una fase de contacto en la
superficie celular en la conjugación bacteriana mediada por el factor
sexual F.

Mitradas M Paincker y Edwin G. Minkley, JR.

Departamento de ciencias biológicas, Universidad Carnegie-Mellon
Recibido 17 de septiembre de 1984 / Aceptado 4 de Febrero de 1985

Objetivo

● Definir el orden en el que ocurren los pasos

durante el proceso de conjugación.
Antecedentes
Propone modelos en los cuales el pilus F esta
Briton implicado directamente en la transferencia
conjuntiva del DNA.

Curtiss, El pili F funciona al retraerse, une las

Marvin y superficies de las células donantes y
receptoras en cuyo punto se producirá la
Hohn transferencia.

El tratamiento con SDS no causa

Achman separación de las parejas preformadas con
Hfr como donadora y el número de
recombinantes continuaba incrementando.
Figura 7: Modelo de transferencia conjugativa de plasmidos
tipo F . Willetts, N., y R. Skurray (1980)
Materiales y métodos:

Plasmidos
Cepas
JCFLO (F lac tra +) Donadoras Receptora
JCFL8 [F lac traD8 (Am)] JC3273 XK1502(F-
JCFL39 [F lac traD39 (Ts)] JC6129
JC3272 (F- lac gal his trp lys 𝛌r str) *Background JC6140

SDS

Ácido nalidíxico
Determinación de la eficiencia de
apareamiento a los 32°C y 42°

Objetivo:
Verificar que la cepa mutante se
comporta de forma similar a la
cepa silvestre.
Determinación de la eficiencia de apareamiento a los 32°C y 42°

Determinación de la eficiencia de apareamiento

0.1 mL 0.4 mL a los
0.432°C
mL y 42°C
JC6140

JC3273
JC6140 JC3273 XK1502
Se cultivaron por duplicado en 10 mL de caldo L. 2.4 mL de caldo XK1502
Incubadas a 32 y 42°C LB.
Incubar a 32 y 42°C
Tubos
por 2 h.
incubados
Determinar no.
a 32 °C
de celulas
donadoras.
Agar
MacConkey-Lactosa
con 100 µg de sulfato
de estreptomicina
Tubos
incubados
a 42°C
 Resultados
Tabla 1. Eficacia de apareamiento de los plásmidos F lac a 32 y 42°C

● JCFLO es F lac tra+ . JCFL39 es F lac traD39 (Ts).

● La receptora fue XK1502. Las colonias Lac+ Nal se contaron como transconjugantes después del
apareamiento durante 2 h a la temperatura indicada.
● La eficiencia del apareamiento se calculó como el número de transconjugantes obtenidos por cada
100 donantes
 Conclusión

La eficiencia de apareamiento es menor a

42°C que a 32°C en ambos casos, siendo
marcada notablemente en JCFL39 a 42ºC.
 Cinética de inactivación y
reactivación de traD 39

Objetivo:
Observar la velocidad de activación e
inactivación del gen traD39 en la cepa
JC6140.
 Cinética de inactivación y reactivación de traD 39
0
.4 mL 0.4 mL

Se diluyo 25 en 10 mL
JC6140 caldo LB.
32°C
Apareamiento a XK1502
32 °C por 30 32°C
minutos por
0.4 mL agitación
0.4 mL

Después se tomaron varias muestras a

diferentes intervalos y el procedimiento
de apareamiento se repitió.
Apareamiento a XK1562
JC6140 42 °C por 30 32°C
cambiado minutos con
a 42°C agitación.

Las muestras
Agar lactosa mínimo Agar MacConkey-lactosa
fueron diluidas.
con ácido nalidíxico sulfato de estreptomicina
para transconjugantes. para donadoras.
 Resultados

Figura 8. (A) La cinética de reactivación de la actividad de traD39 (Ts) en un cultivo de crecimiento exponencial de JC6140 cambió
de 42 a 32 °C (B) La cinética de inactivación de la actividad de traD39 (Ts) en un cultivo de crecimiento exponencial de donantes
JC6140 cambió de 32 a 42 ° C. Se cultivaron cultivos y se ensayaron transconjugantes como se describe en el texto. El cuadrado en
el panel B es el valor obtenido para un apareamiento de 30 minutos entre JC6140 y XK1502 cultivado continuamente y apareado a
32 ° C.
 Conclusión
traD39 se inactivo mucho más
rápido con el cambio de
temperatura de 32 a 42°C que con
su cinética de activación.
 Experimentos de cambio de
temperatura

Objetivo:
Observar en qué etapas hace su
participación el Pili F y la proteína traD
en el proceso de transferencia a
diferentes temperaturas.
 Experimentos de cambio de temperatura
0.1 mL
Se incubó
Incubadas a 42°C
durante 1 h a
42 ºC.
2.5 mL de
2.5 mL de caldo LB + 2.5 mL de caldo LB caldo LB.
cultivo de JC6140 +cultivo de XK1502
Cultivo JC6140

En ese momento, los cultivos se diluyeron 10

veces en caldo LB con SDS al 0.01%, y se Se mezcló suavemente y se
añadieron 20 μg/mL de ácido nalidíxico a incubó durante 30 minutos a
algunas de las mezclas de apareamiento. 42 ºC., sin agitación.

Una muestra de 0.25 mL de

este cultivo donador se
añadió a 0.25 mL de cultivo
Los cultivos se incubaron a El número de transconjugantes se obtuvieron de XK1502.
continuación durante 2 h mediante siembra de varias diluciones en placas
adicionales a 42 o 32 ºC. de agar-lactosa mínimo adicionado de 20 μg/mL
de ácido nalidíxico.
 Resultados
Tabla 2. Transferencia de JCFL39 en pares de apareamiento estables
preformados a 32 y 42°C

● Todas las segundas incubaciones fueron durante 2 h.

● Todos los acoplamientos usados son donantes JC6140 y receptores XK1502 y se realizaron como se describe en el
texto. El número de donantes introducido fue de 1.0 x 107 por ml.
● Se añadió SDS a la mezcla de apareamiento durante la incubación inicial.
 Conclusión

Se demostró que la inhibición

provocada por el SDS tiene un efecto
notable si se aplica al inicio del
proceso.
 Microscopía electrónica

Objetivo:
Determinar la presencia o ausencia de
agregados de apareamiento entre
cepas donadoras, receptoras y la
mezcla de ambas.
 Microscopía electrónica
Cepa
Cepa JC6140
XK1502
Añadir 9 volúmenes de caldo
LB con 0.01% de SDS y 1% de
Diluir 25 veces e Mezclar donante y
glutaraldehido y agitar
incubar durante 1 receptor e incubar 20
suavemente.
hora a 42ºC. min a 42ºC.

Incubar 2.5 ml de JC6140 y XK1502

en medio LB, durante toda la noche a
42ºC.
Incubar por 20 min a
42ºC.
Se centrifugaron durante 10 min a
5 100 x g, y el sedimento celular
fue suspendido en 0.5 mL de
solución salina.

Las células se prepararon para el

análisis por microscopía electrónica Las rejillas se tiñeron con
mediante el depósito de una muestra acetato de uranilo acuoso al
en una malla de 300, y rejilla de 1%.
carbono recubiertos con Formvar
0.2%.
 Resultados

Figura 9. Histogramas del estado de agregación de la bacteria donante JC6140, la

bacteria receptora XK1502 o una mezcla de las dos, después de la incubación
durante 30 minutos a 42° C.
 Conclusión
● Se obtiene un alto número de agregados de
acoplamiento en la mezcla de las bacterias
receptoras XK1502 y bacterias donadoras
JC6140
● Se muestra una gran cantidad de células
individuales en los casos de solo donadoras o solo
receptoras.
 Western blot

Objetivo:
Demostrar la síntesis de la
proteína traD.
 Western blot Cantidades equivalentes de
muestra fueron cargadas en
gel SDS- PAGE para realizar
electroforesis

Las muestras fueron

Cuando la densidad bacteriana resuspendidas en buffer
Se realizó un overnight para OD 550 alcanzó un intervalo de SDS e incubadas en agua
obtener la cepas inmunoblot 0.6 a 0.8 se tomó una muestra hirviendo por 3 minutos
de 3 ml y centrifugadas

Se procede a western blot con

baños multiples

Las muestras fueron

transferidas a una hoja de
nitrocelulosa por aparato de
transporte de Hoffer
 Resultados

Figura 10 . Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína traD en células en crecimiento exponencial a
32 y 42°C. La IgG de conejo anti TraDp y el anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante se usaron para
visualizar la proteína traD en un gel de losa de SDS-poliacrilamida de proteína de célula completa.
 Conclusión

Se demostró que si se da la síntesis

de la proteína traD en la cepa
termosensible, pero no es
funcional.
 Conclusiones generales
● La función de Pili F en la conjugación es proporcionar el
primer contacto entre las células bacterianas, por lo tanto su
función se detecta en etapas muy tempranas.

● El producto del gen traD es necesario durante la etapa de

transferencia del DNA desde una bacteria donadora hacia
una bacteria receptora.

● La transferencia de material genético entre una célula

donadora y una célula receptora se lleva a cabo mientras
están en contacto mediante sus superficies posterior a la
función del pili.
 PRÁCTICA:

TRANSFERENCIA DE MATERIAL
GENÉTICO POR CONJUGACIÓN
EN Escherichia coli
 Objetivos

● Cuantificar el material genético por medio de

la conjugación de bacterias Gram negativas.

● Establecer las diferencias entre las

transconjugantes que se obtienen a partir de
células donadoras Hfr y F´ y con receptoras
Rec + y Rec -.
 Medios de cultivo y cepas
Medios de cultivo Cepas donadoras de Escherichia coli
Agar blando JC4046 (F´ Sms, His-/F, His+)
Medio Luria (L)
Medios mínimos de CSH62 (Hfr Sms , B1-)
selección: G8, G9 y G10

Cepas receptoras de Escherichia coli

Bacteriofago M13
- - - - - R +
RC 712 (F Pro , Trp , His , Lac , Sm , RecA )

KL 323 (F- Pro-, Trp-, His-, Met-, SmR, RecA-)

 Medios mínimos de selección
Agar, Sales, Glucosa, Estreptomicina

G8 G9 G8

Prolina Prolina Histidina

Triptofano Histidina Triptofano

Prototrofos de Prototrofos de
Prototrofos de
Histidina Triptófano
Prolina
 Protocolo

Primer día

Incubar a 37°C, sin

agitación durante
toda la noche.

8 mL de caldo L
Segundo día

Incubar a 37°C
10 mL de caldo L con agitación
Cuenta viable

Tomar 0.2 mL de cada

dilución y depositarlo en
tubos de hemólisis

Sembrar por
Agitar y verter el
duplicado e incubar a contenido del tubo en
37° C por 24 h. una caja con medio L.
Selección de revertantes

Sembrar
por
duplicado
.
Colocar 0.1 ml de los cultivos (obtenidos el día Agitar y verter el contenido de los tubos
2) en tubos 13x100mm con 3 ml de agar blando sobre cajas conteniendo cada uno los
fundido. medios mínimos de selección.

Incubar a 37°C por 48

h.
Conjugación

4.5 mL del cultivo de Mezclar e incubar

cepa donadora + 0.5 mL a 37°C por 1 h.
de la cepa receptora Tomar 1 mL de la mezcla

Realizar Desechar sobrenadante

diluciones, y resuspender en
usando solucion solución salina estéril.
salina esteril
 Tomar 0.1 mL
de cada una de Incubar a 37°C
las diluciones. durante 48
horas.

Colocarlo en un tubo de Agitar y vaciar en cada uno de los

hemólisis con 3 mL de medios de selección.
agar fundido blando (45°
C)

Tercer día

Calcular los títulos

bacterianos.

Contar las colonias crecidas en el agar

L procedentes de la cuenta viable.
 Cuarto día Contar las transconjugantes
crecidas en cada uno de los
Contar las colonias desarrolladas en
medios procedentes de
medios de selección de revertantes y
conjugación.
calcular la frecuencia de
reversión.

La siembra puede
hacerse también Resuspender en tubos
Hacer una estría de c/u de
por vaciado en con 0.2 mL de caldo Tomar una asada de cada una de las
las suspensiones con un
placa con agar L. transconjugantes His+ de la cruza JC4046 X
hisopo estéril.
blando. RC712, y una Trp+ His+ o Pro+ de la cruza CSH62 X
RC712, así como de la donadora y receptora.
 Incubar las cajas a 37°C
durante 24 horas.

Dejar secar y colocar sobre la

estría o superficie del agar dos
gotas del bateriofago M13.

Quinto día
Interpreta los resultados
obtenidos tomando en
cuenta los objetivos del
experimento.

Observar presencia de Calcular la frecuencia de

zonas de inhibición por el recombinación (F rec).
Bacteriófago.
 ● https://www.jstage.jst.go.jp/article/kmj1997/50/2/50_2_175/_pdf (09-02-20)
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● Gunther S.S, Calendar R;(1971) Molecular Genetics an introductory narrative. W.H. Freeman and companyUSA, New York;
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● https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/ (15-02-20)
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Bibliografia
Gracias Por su atención