ENZIMAS

PRACTICA 1. DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCION

Como ya analizamos en clase las proteínas poseen pueden poseer cuatro tipos de
estructura según su función. La primera se refiere a la secuencia aminoacídica, seguido
del plegamiento que conduce a una estructura secundaria, etc. Dicha estructura se
puede perder por diversos factores químicos, físicos y fisicoquímicos. Afectando las
fuerzas de cohesión que les dan su estructura nativa. Estas fuerzas en su mayoría
involucran a los puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Walls, puentes salinos,
puentes disulfuro. Hay dos métodos de desnaturalización o el resultado de ellos: Físicos
y Químicos.

OBJETIVO

Que el alumno ponga en práctica los fundamentos teóricos sobre los diferentes tipos de
desnaturalización de proteínas mediante métodos físicos y químicos.

MATERIAL

10 vasos DP 100 ml
Una plancha
Licuadora
Centrífuga de mesa
Un trozo de carne de res fresca
2 huevos
Agua
Metanol
Cloroformo
Sulfato de amonio
Peróxido comercial H2O2 (agua oxigenada)
Leche de vaca
Ácido acético puro o diluido
Tubos falcón 25 ml con tapón
Tubos de vidrio
Agitador de vidrio
Pipetas
Pipetor

PROCEDIMIENTO

DESNATURALIZACIÓN FÍSICA

1) Poner una parte de la clara de un huevo en un vaso DP 100 ml y calentar hasta que
la clara se ponga blanca (desnaturalizada). Observar desnaturalización por calor.
2) Parte de la clara de un huevo pasarla por una batidora o con un tenedor de forma
enérgica. Observar burbujas y espuma por desnaturalización por choque.

3) Colocar un trozo de carne con buffer en la licuadora (como un licuado) y licuar

velocidad mínima y media. Observar burbujas y espuma por desnaturalización mecánica.

4) Tomar una muestra de carne licuada y calentar hasta que hierva. Observar coágulos
cocidos de la carne (albúminas, hemoglobina, etc).

DESNATURALIZACIÓN FISICO-QUÍMICA

5) a) pH: tomar una muestra de 50 ml de leche (esta contiene dos tipos de proteínas:
proteínas sensibles solo a pH (caseínas) y otra fracción solo sensible a temperatura
(lactoglobulinas) a temperatura ambiente (aprox. 25 °C) y gota a gota colocar ácido
acético puro hasta que la leche se comience a cuajar (coágulos). Observar una
desnaturalización por PI de las caseínas. Observar.
b) El cuajado se somete a centrifugación por 3 min a 3,000 RPM en una centrífuga de
mesa convencional. El sobrenadante se pasa a un eppendorf 1.5 ml y se calienta en
baño maría por 5 min donde adquirirá un color blanco (se recomienda centrifugar de
nuevo para concentrar en un paquete las proteínas). Observar coágulos de proteína
lactoglobulinas desnaturalizada (requesón). Este último es un caso de desnaturalización
física.

DESNATURALIZACIÓN QUÍMICA

6) Tomar una alícuota de clara de huevo en un vaso dp y agregar aprox. 5 ml de metanol.

Observar color blanco por desnaturalización química.

7) Tomar una muestra de carne licuada y agregar peróxido de uso comercial 3% H 2O2.
Observar espuma (acción de la catalasa), color y consistencia.

8) Tomar una alícuota de ambas muestras por separado y probar con formaldehído.
Observar color y consistencia.

RESULTADOS

Haga una tabla comparativa de los resultados

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN
CUESTIONARIO:

1.- Que sucede durante una desnaturalización física

2.- En el caso de la clara de huevo y el metanol, ¿Qué pasó?

3.- Haga un listado de las proteínas de la leche

4.- ¿En qué se basa químicamente en la desnaturalización química?

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
 PRACTICA 2. ANÁLISIS ENZIMATICO CUALITATIVO

INTRODUCCIÓN

Todos los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía muy rápidamente, debido
a la presencia de catalizadores biológicos llamadas enzimas. Al igual que los
catalizadores inorgánicos; las enzimas modifican la velocidad de una reacción química
sin afectar el equilibrio final y sólo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la
transformación de un gran número de moléculas del sustrato. Sin embargo, a diferencia
de la mayoría de los catalizadores inorgánicos las enzimas son bastante específicas ya
que catalizan un número comparativamente pequeño e reacciones; en algunos casos,
tan solo una reacción, así mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy
definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato, coenzimas, etc.
Estas condiciones se ilustran en algunos de los experimentos que se tienen
determinados en este tema.
Las enzimas se designan y se clasifican dé acuerdo con el tipo de reacción que catalizan;
los seis grupos principales de enzimas son: Oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas,
liasas, isomerasas, ligasas o sintetasas.

OBJETIVO

Al término de esta práctica, el alumno será capaz de definir el efecto fisicoquímico que
generan las enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando además, las propiedades
químicas que permiten que una enzima, catalize la modificación de un sustrato.

PRERREQUISITOS

1.- Definición de enzima, sustrato, apoenzima, holoenzima, pro-enzima, zimógeno,

coenzima, cofactor.
2.- Determine lo que significa: especificidad enzimática y alosterismo.
3.- Defina el efecto de una hidrolasa, oxidorreductasa, transferasa, liasa, ligasa e
isomerasa.

MATERIAL

6 tubos de ensaye, 3 pipetas de 1.0 ml.,

2 pipetas de 5 ml., 2 pipetas pasteur,
2 gradillas, 6 tapones de algodón.
PROCEDIMIENTO

Experimento 1

Efecto del calor sobre la actividad de las enzimas. “Actividad de la ureasa”

Tubo 1 2 3
semilla de vegetal Pizca pizca pizca
agua(ml) ---- 5.0 5.0

Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandia y enseguida coloque un tapón de

algodón a los tubos 1 y 2 y colóquelos en baño a ebullición durante 20 minutos.(Cuidar
que no se acabe el agua del baño.)

agua(ml) 5.0 -------- -------

azul bromotimol (gotas) 2 2 2

Añadir ácido débil (gotas) en caso de que la solución tenga un color azul
.
Urea 5.0 5.0 5.0

Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire de color amarillo a azul
en cada uno de los tubos.

Experimento 2

Determinación de la actividad de renina.

Tubo 1 2 3
Leche(ml) 3.0 3.0 3.0
oxalato de amonio(ml) ------ 0.5 0.5
sol. renina(gotas) 3 3 3

Mezclar e incubar a 37°C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada
uno de los tubos.
Calentar el tubo 2 a ebullición y enfriar.

cloruro de calcio(gotas) ------ 10 10

Mezclar y compara los cambios observados en los tubos 2 y 3 con el 1.

DISCUSIONES
CONCLUSIONES

CUESTIONARIO:

1.- De acuerdo a la clasificación enzimática a que clase pertenecen las enzimas

utilizadas (renina y ureasa) y porqué?

2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa.

3.- ¿Qué grupos químicos participan en el sitio activo de las enzimas?

4.- ¿Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan? si,
no; porqué?
5.- Porqué algunas proteínas actúan como catalizadores(enzimas) de reacciones con
alta especificidad, mientras que otras proteínas que también contienen aminoácidos en
su estructura no lo hacen?

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA.
 PRACTICA 3. Actividad enzimática de SERCA (ATPasa de calcio de
retículo sarcoplásmico)

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son muy específicas, como sugirió Emil Fisher en 1894. En base a sus
resultados dedujo que ambas moléculas, enzima y sustrato, poseen complementariedad
geométrica, es decir, sus estructuras encajan exactamente una en la otra, por lo que ha
sido denominado como modelo de "llave-cerradura", refiriéndose a la enzima como a una
especie de cerradura y al sustrato como a una llave que encaja de forma perfecta en
dicha cerradura. Por lo cual se considera a las enzimas catalizadores biológicos
proteicos. Su poder catalítico es mayor que el de los catalizadores inorgánicos. La
actividad enzimática puede ser afectada por otras moléculas. Los inhibidores enzimáticos
son moléculas que disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los
activadores son moléculas que incrementan dicha actividad. Asimismo, gran cantidad de
enzimas requieren de cofactores para su actividad. Drogas o fármacos son moléculas
inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por temperatura, el pH, concentración
de la enzima y del sustrato, y otros factores físico-químicos. Algunas enzimas las
podemos encontrar en citoplasma y en membrana como es el caso de la bomba de Ca 2+
también son ATPasas unidas a membranas (Carafoli, 1991). Las células eucariotas
mantienen concentraciones de Ca2+ bajas en el citosol (~10-7 M), en comparación con
las concentraciones extracelulares de Ca2+, más elevadas (~10-3 M). Así, una entrada de
Ca2+, auque sea pequeña, a la célula, incrementa significativamente la concentración de
Ca2+ libre en el citosol. El flujo de Ca 2+ a favor del gradiente de concentración en
respuestas a señales extracelulares constituye una forma rápida de transmisión de estas
señales a través de la membrana plasmática. Por lo tanto el mantenimiento de un elevado
gradiente de Ca2+ es importante para la célula. El gradiente de Ca 2+ se mantiene en parte
por la acción de bombas de Ca 2+ que existen en membrana plasmática, las cuales
transportan Ca2+ de forma activa hacia el exterior de la célula (Alberts et al., 1994).

OBJETIVO
El alumno adquirirá la capacidad para medir la actividad enzimática. Podrá relacionar los
efectos por moléculas como: inhibidores o activadores enzimáticos, también será capaz
de diferenciar las actividades por factores físico-químicos como: temperatura, pH,
concentración de la enzima y del sustrato para poder estimar o calcular la actividad
optima de las enzimas.
MATERIAL

Tubos de vidrio
Pipetas
Sol. Fosfato de sodio 1 mM
Bufer de actividad (pH 7): Mops 20 mM (pH 7.0), KCl 80 mM, MgCl 2 5 mM, EGTA 1 mM,
CaCl2 0.967 mM (10 µM Ca2+ libre en el medio).
Vesiculas de RS
ATP 0.2 M
Reactivo de molibdato Lin y Morales (1972)
Espectrofotómetro luz visible
Cronómetro

-Disolución patrón de Pi (NaH2PO4·2H2O) 1 mM en agua bidestilada para construir

la recta de calibración.

PROCEDIMIENTO
La determinación de la actividad enzimática requiere la construcción de una recta de
calibración que se consigue con varias concentraciones de P i (ver tabla I). Una vez
añadido el fosfato se ajusta el volumen a 1 ml con agua bidestilada y a continuación se
añade 1 ml de reactivo de molibdovanadato y 4 ml más de agua bidestilada.

TABLA I

Pi 1 mM Reactivo Agua
Tubo Agua
(ml) (ml) (ml)

1 1.00 0.00 1 4

2 0.95 0.05 1 4

3 0.90 0.10 1 4

4 0.85 0.15 1 4

5 0.80 0.20 1 4

6 0.75 0.25 1 4
 Los tubos se agitan con ayuda de un vortex y después se mide inmediatamente
la absorbancia a 350 nm.

0.5

0.4

As (350)
0.3

0.2

0.1

0.0

0 50 100 150 200 250

Pi (M)

FIGURA II.2. Aparición espectofotométrica de Pi respecto a su concentración molar. Regresión

lineal cuyo valor es 348 y su R2 es 0.9993. Recta de calibración que se utilizo para determinar la aparición
de Pi en los experimentos de hidrólisis de ATP, monitoreando la aparición del -Pi. El error estándar para
cada lectura se muestra en barras dentro de la grafica.

Un medio de ensayo típico para estudiar la actividad SERCA contiene: Mops 20

mM (pH 7.0), KCl 80 mM, MgCl2 5 mM, EGTA 1 mM, CaCl2 0.967 mM, vesículas de RS
a una concentración de 0.01 mg prot/ml y A23187 0.750 μM o en su lugar Oxalato-K 5
mM (para medir en min). El volumen final de la mezcla de reacción es 4 ml. La
concentración de Ca2+ libre en este caso es 10 M lo que equivale a un pCa 5 (El Ca 2+
libre se suele expresar como pCa).

Antes de dar inicio a la reacción se preparan 6 tubos de ensayo numerados (1-6)

a los que se agrega 1 ml de reactivo de Lin y Morales. Al tubo n° 1, que se utiliza como
blanco, se le añade 0.5 ml de la mezcla de reacción y después ATP (en este caso 5 l
de una disolución de ATP 200 mM).

La medida se realiza en un vaso con camisa que se mantiene termostatizado a

25 °C mediante baño de agua circulante. El vaso se sitúa a su vez sobre un agitador
magnético para mejorar la mezcla de los componentes. La reacción se inicia con la
adición de ATP 1 mM que marca el tiempo cero de reacción. A partir de ese momento
se sacan alícuotas de 1 ml cada min y se van agregando a cada tubo (del 2 al 6). Ejem
min 1 tubo 2, min 2 tubo 3. La adición a estos tubos determina el final de la reacción
debido a la presencia de un medio muy ácido con molibdato (que reacciona con P i).
Posteriormente se añade 4 ml de agua bidestilada a cada uno de los tubos y, tras
agitar con ayuda de un vortex, se mide la absorbancia a 350 nm.
DISCUSIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
 PRACTICA 4. CINÉTICA ENZIMÁTICA I
(Efecto de la concentración del sustrato y de la enzima sobre la actividad
enzimática)

INTRODUCCIÓN

La cinética química es el estudio de la velocidad de cambio que existe entre el estado

inicial de los reactantes y los productos y el estado final. La velocidad es expresada en
términos de cambios de concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo, esto
se puede seguir, determinando la desaparición de reactantes aparición de productos en
función del tiempo. Es particularmente importante hacer notar que constantemente hay
cambios en la velocidad de reacción conforme procede la reacción hasta llegar al
equilibrio, una vez alcanzado éste, los cambios de velocidad son iguales a cero.
El determinar la velocidad de una reacción no revela nada acerca de la Estequiometria
de los reactantes y productos ni del mecanismo de la reacción.
En la mayoría de las reacciones enzimáticas al seguir su comportamiento cinético se
pueden obtener generalmente varios órdenes de reacción; al examinar la curva de
velocidad responde en forma característica a los aumentos de concentración de sustrato:
1).- A muy bajas concentraciones de sustrato el comportamiento de velocidad con
respecto a la concentración de sustrato es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es
directamente proporcional a la concentración de sustrato y en esta región se presenta la
cinética de primer orden.
2).- -En la etapa final de la curva observamos que la velocidad es esencialmente
independiente de la concentración de sustrato, aquí la cinética es de orden cero.
3).- En la parte intermedia de la curva se presenta una mezcla de órdenes de reacción,
ya que se observan cambios en la velocidad de reacción pero no siguen una constante
de proporcionalidad.

Este tipo de estudio cinético fue desarrollado por primera vez por Michaelis-
Menten y formularon la siguiente ecuación:

v = Vmax (S)
Km+(S)

donde las constantes Vmáx y Km son características para cada enzima bajo ciertas
condiciones.
En forma práctica es difícil determinar el valor de Km de una curva de saturación de
sustrato, pero se puede recurrir a la gráfica de Lineweaver-Burk que utiliza los recíprocos
de velocidad y sustrato, ésta tiene la ventaja de dar valores de Km y Vmax.
estadísticamente más significativos con tan sólo 6 a 8 datos experimentales.
En los experimentos a realizar se van a observar los efectos de la concentración de
sustrato y concentración de enzima sobre la actividad enzimática en una reacción.

OBJETIVOS

El alumno observará el comportamiento de la actividad enzimática de acuerdo a los

parámetros de concentración tanto del sustrato como de la enzima determinando los
valores de:
a).- Vmax (velocidad máxima de reacción)
b).- ½ Vmax
c).- Km (constante de Michaelis).
d).- S óptima (concentración óptima de sustrato).

PRERREQUISITOS

1.- Describir el mecanismo de acción de las enzimas en las reacciones químicas.

2.- Cuál es la relación que existe entre la velocidad de una reacción catalizada y la
concentración de enzima.
3.- Definir la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción
enzimática.
4.- Interpretar la cinética de Michaelis-Menten y la Lineweaver-burk.

MATERIAL

8 tubos de ensaye, una gradilla

3 pipetas de 1.0 ml., 2 pipetas 5.0 ml.
un baño de agua a 37 °C, un baño de agua a ebullición.

PROCEDIMIENTO

Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.

La invertasa es una enzima hidrolítica que actúa sobre la sacarosa (un

disacárido) liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se detiene al añadir
una solución alcalina y el poder reductor de los productos se mide haciéndolos reaccionar
cn el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato.

Tubo 1 2 3 4 5 6
Enzima 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ----------
Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
sacarosa 0.02M 1.0 ----- ----- ----- ----- -----
sacarosa 0.03M ----- 1.0 ----- ----- ----- -----
sacarosa 0.05M ----- ----- 1.0 ----- ----- -----
sacarosa 0.10M ----- ----- ----- 1.0 ----- -----
sacarosa 0.30M ----- ----- ---------- ----- 1.0 -----
Agua ----- -------- ----- ----- ----- 1.0

Mezclar e incubar a 35°C durante 20 minutos.

Dinitrosalicilato 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición durante 5 minutos. Enfriar y leer a 540
nm., ajustando a cero con el tubo no. 6.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.- La velocidad inicial de una reacción enzimática es dependiente exclusivamente de la

cantidad de sustrato presente? si, no porqué?

2.- Cual es la diferencia entre los cambios de energía libre que existen entre un proceso
catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado.

3.- ¿Por qué a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la

velocidad de la reacción es independiente de la concentración de sustrato?

4.- La Km de una enzima varía con la concentración de enzima? si, no, por qué?

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA.
 PRACTICA 5. CINÉTICA ENZIMÁTICA II
(EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA)

INTRODUCCION

Es lógico pensar que el pH de una solución influye sobre la velocidad de una reacción
catalizada por enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente
están compuestos por grupos ionizables que deben presentarse con una forma iónica
apropiada o específica, de tal manera, que se pueda mantener la conformación adecuada
de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unión del sustrato y su
transformación hacia productos.
Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma
iónica específica para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realize la catálisis.
Los efectos de pH sobre la estabilidad de una enzima se debe tomar en cuenta en
cualquier estudio de efecto de pH sobre la catálisis de sustrato.
El efecto de pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima se puede observar en la
figura No. 1.

Figura No. 1.- Efecto del pH sobre la actividad y estabilidad de una enzima. Curva A: gráfica de vel vs. pH.
Curva B: gráfica de velocidad a pH 6.8 después de preincubar la enzima a los valores de pH indicado.

Se observa que el pH óptimo de la reacción enzima -sustrato es a 6.8 según la gráfica de

la curva A, sin embargo, no nos indica porque declina la velocidad por arriba y abajo de
este valor.
En la curva B se observa que la preincubación de la enzima entre pH de 5.0 - 8.0 no tiene
efecto sobre la actividad medida a pH 6.8. Por lo tanto, la interpretación de las 2 gráficas
nos indica que la caída en la actividad entre 6.8 - 8.0 y entre 6.8 - 5.0 es el resultado de la
formación de una estructura iónica impropia de la enzima y/o sustrato o los dos.
Cuando la enzima es preincubada a pH entre 5.0 - 8.0, se mantiene la actividad completa
de la enzima a 6.8. Por arriba o abajo de este valor de pH resulta en inactivación de la
enzima.
La estabilidad de la enzima depende de varios factores, por ejemplo, temperatura, fuerza
iónica, naturaleza del amortiguador, concentración de iones metálicos, concentración de
sustratos o cofactores y concentración de enzima.
El último factor es muy importante ya que existen algunas enzimas que a bajas
concentaciones se disocian en monómeros y que son menos estables.
Otro de los factores que afectan la velocidad de una reacción es la temperatura, de tal
suerte que un incremento de temperatura proporciona mayor energía cinética a las
moléculas reactantes, dando como resultado choques más productivos por unidad de
tiempo. La actividad catalítica de las enzimas resulta de una estructura altamente
ordenada. Si la molécula absorbe mucha energía, la estructura se rompe y la enzima se
desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad catalítica. Si se grafica velocidad vs
temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en el cual el pico se conoce como
temperatura óptima. La estabilidad a la temperatura, de una enzima depende del pH,
fuerza iónica del medio, así como de la presencia o ausencia de metales. La mayoría de
los sustratos ejercen un efecto de protección a la enzima contra la desnaturalización por
temperatura. Las enzimas de bajo PM compuestas de cadenas sencillas y que poseen
enlaces disulfuro son más estables al calor que las de alto PM. Las enzimas obtenidas de
un extracto crudo libre de células son más estables al calor por la alta concentración de
otras proteínas (efecto protector).

OBJETIVOS

El alumno analizará el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad

enzimática en una reacción. Basado en:
A) Discutirá el efecto sobre el comportamiento catalítico de una enzima al
variar el pH de la mezcla de reacción.
B) Discutirá los cambios que se presentan en la cinética enzimática al variar
la temperatura de reacción.
C) Determinará las condiciones óptimas de reacción en función de estos dos
factores (pH, temperatura).

PRERREQUISITOS

1.- Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una

enzima.
2.- Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad
de una enzima.
3.- Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.
4.- Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de acción
sobre una enzima.
5.- Explicar los conceptos de pH y temperatura óptimos de una enzima en
una reacción catalizada.
MATERIAL

1.- 14 tubos de ensaye

2.- 1 gradilla
3.- Celdas de fotocolorímetro
4.- Fotocolorímetro
5.- Baños de agua de temperatura controlada
6.- 3 Pipetas de 1.0 ml
7.- 2 pipetas de 5.0 ml

PROCEDIMIENTO

EFECTO DEL pH

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7

Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Amortiguador EDTA
pH = 2.5 0.5 --- --- --- --- --- ---
pH = 3.5 --- 0.5 --- --- --- --- ---
pH = 4.5 ---- --- 0.5 --- --- --- ---
pH = 5.5 --- --- --- 0.5 --- --- ---
pH = 6.5 ---- --- --- --- 0.5 --- ---
pH = 7.5 --- --- --- --- --- 0.5 ---
Agua --- --- --- --- --- --- 1.0
Mezclar e incubar a 37° C durante 2 min.

Enzima 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ---

Mezclar e incubar a 25°C durante 20 min

Dinitrosalicilato 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm
ajustando a cero con el tubo No. 7

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7

Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Amortiguador
pH = 4.7 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Temperatura °C 4 26 37 45 60 100 25
Enzima 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ---
Agua --- --- --- --- --- --- 1.0
Mezclar e incubar 5 min a la temperatura indicada.

Dinitrosalicilato 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm
ajustando a cero con el tubo No. 7

RESULTADOS

1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH.

2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura.

3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura óptimos obtenidos.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.- La pepsina presenta su máxima actividad a un Ph

» 1. Mencione cuáles podrían ser los grupos funcionales presentes en el sitio activo y
sobre cuales residuos de aminoácidos rompe los enlaces peptídicos.

2.- Si la concentración de sustrato en una reacción enzimática es igual a un 1/3 de Km.

Cuál será la velocidad inicial de la reacción.

3.- Deacuerdo a la clasificación de las enzimas a que clase pertenece una enzima que
participa en la conversión de un azúcar de tipo aldosa a un azúcar de tipo cetosa.

4.- En esta práctica se ha observado como influye el pH en la actividad de invertasa, a una

concentración de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacárido y es un sustrato para
esta enzima y se ha observado que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la
sacarosa, bajo las mismas condiciones de concentración y pH. Cómo explicaría esta
velocidad máxima tan baja en relación al pH de la reacción (a-Gal-a-Gal-a-Glu-ß-Fru ).

5.- Cuando las soluciones enzimáticas son calentadas, hay una pérdida progresiva de la
actividad catalítica con el tiempo. Así, una solución de hexocinasa incubada a 45°C
durante 12 minutos pierde el 50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a
45°C, en presencia de altas concentraciones de glucosa durante el mismo tiempo,
solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porque de la variación
desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y presencia
del sustrato.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
 PRACTICA 6. ACTIVIDAD CATALASA

INTRODUCCION

Los catalizadores ― según la definición clásica, son agentes que afectan a la velocidad
de una reacción química, y no son alterados durante el proceso de la reacción ya que se
encuentran presentes al final de la reacción en idéntica cantidad y en las mismas
condiciones físicas y químicas en las que se encontraban al comienzo de la misma. Las
enzimas no son alteradas por la reacción, pero por ser proteínas, resultan termolábiles y
sensibles a los cambios y variaciones del medio ambiente físico en que se hallen.

El desgaste de las enzimas es mucho mayor que otros catalizadores. Donde un

catalizador actúa sobre un acelerador de una reacción química, o sea., que exagera una
tendencia ya presente. En el caso de compuestos orgánicos, que pueden participar en
muy diversas reacciones, el incremento de velocidad dado por la enzima a uno de los
sentidos de la reacción canaliza selectivamente a esta en tal dirección.

Durante el metabolismo aerobio se generan pequeñas cantidades de especies reactivas

de oxígeno (ROS), incluyendo radicales hidroxilos (OH), aniones superóxido (O2.-), y
peróxido de hidrógeno (H2O2), como respuesta a estímulos externos e internos. Estas
mínimas concentraciones de ROS pueden ser indispensables en muchos procesos,
como el sistema de señales intracelulares (que está relacionado con otros procesos
como la proliferación celular y la apoptosis), la inmunidad, y la defensa contra
microorganismos.

Catalasa (CAT)

Es una enzima tetramérica, con cuatro subunidades idénticas de 60 kDa dispuestas

tetraédricamente y contiene cuatro grupos de ferro-protoporfirina por molécula. Es una
de las enzimas conocidas más eficientes, tanto que no puede ser saturada por H 2O2 a
ninguna concentración, catalizando su conversión en H 2O y O2, para proteger a las
células del H2O2 que se genera en su interior. Con dadores de H (metanol, etanol, ácido
fórmico, fenoles...) presenta actividad peroxidasa.
2H2O2 -> 2H2O + O2
ROOH + AH2 -> H2O + ROH + A
Por lo tanto, el H2O2 es catabolizado enzimáticamente en organismos aerobios por la
catalasa y otras peroxidasas. En animales, el peróxido de hidrógeno sé destoxifica
mediante las actividades de la catalasa y la glutatión peroxidasa. Aunque la catalasa no
es esencial para algunos tipos de células en condiciones normales, tiene un importante
papel en la adquisición de tolerancia al estrés oxidativo en la respuesta adaptativa de las
células. La catalasa captura el H2O2 antes de que pueda escapar de la célula y lo
convierte en oxígeno molecular.
MATERIAL

50-100 g de carne de res molida

Tubos de ensaye
Termoplato
Termometro
Agua oxigenada comercial (3%).
NaOH 10%
HCl conc.
Baño de agua

PROCEDIMIENTO

1) Colocar un pequeño fragmento de carne en un tubo a T ambiente, un poco de buffer

0.9% sal de mesa. Obresrevar
2) Repetir el mismo tubo, pero en hielo
3) repetir 1 pero antes hervir
4) Repetir 1 a 36 °C
5) Repetir 1 con una gota de HCl conc.
6) Repetir 1 con una gota de NaOH 10%.

RESULTADOS

HAGA UNA TABLA Y DISCUTA RESULTADOS

DISCUSION

CONCLUSION

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
 PRACTICA 7. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS PEROXISOMAS

INTRODUCCIÓN
Los perixosomas se denominan así porque generalmente contienen una o más
enzimas que utilizan oxígeno molecular para eliminar átomos de hidrógeno a partir de
substratos orgánicos específicos a través de una reacción oxidativa que produce
peróxido de hidrógeno.

OBJETIVO
El alumno demostrará in vitro la actividad enzimática de los Peroxisomas en
diferentes células.

Materiales de laboratorio por equipo Material del alumno por equipo

12 tubos de ensayo Hígado de pollo
1 gradilla Corazón de pollo
1 estuche de disección Riñón de pollo
2 cajas de petri Rama de apio
5 vasos precipitados de 100ml Papa
1 vaso precipitado de 400ml
Materiales de laboratorio por equipo
1 pipeta de 10 ml HCl
1 Mechero Alcohol
1 Mortero con pistilo Hidróxido de sodio
Peróxido de hidrógeno

PROCEDIMIENTO
1. Corta 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de apio, colócalo en hielo.
2. Corta 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de papa, colócalo en hielo.
3. Corta 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de carne (hígado, riñón y corazón),
colócalo en hielo.
4. Enumera los tubos del 1 al 6 y adiciona 2 ml de peróxido de hidrógeno
(PRECAUCIÓN)
5. A cada tubo adiciona el tejido tal como se anota en la tabla
6. En cada uno de los tubos se debe determinar la presencia o ausencia de 02,
inmediatamente después de adicionar el tejido tapa el tubo con el dedo pulgar y
coloca en la boca del mismo tubo, un palillo en punto de ignición (no acerques los
tubos a tu cara o a la de tus compañeros)
7. Repite los pasos 4 a 6 para los otros tejidos.
RESULTADOS
TUBO Papa AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)
1 Machacado
2 Cocido
3 Con HCl
4 Con Etanol
5 Con NaOH
6 Sin ninguna alteración
TUBO Apio AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)
1 Machacado
2 Cocido
3 Con HCl
4 Con Etanol
5 Con NaOH
6 Sin ninguna alteración
TUBO Hígado AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)
1 Machacado
2 Cocido
3 Con HCl
4 Con Etanol
5 Con NaOH
6 Sin ninguna alteración
TUBO Corazón AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)
1 Machacado
2 Cocido
3 Con HCl
4 Con Etanol
5 Con NaOH
6 Sin ninguna alteración
TUBO Riñón AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)
1 Machacado
2 Cocido
3 Con HCl
4 Con Etanol
5 Con NaOH
6 Sin ninguna alteración

DISCUSION
CONCLUSION

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la estructura y función de los peroxisomas?
2. ¿Qué es la enzima y como se relaciona con las peroxisomas?
3. ¿Cuál es la función de los glioxisomas en la germinación de las semillas de aceite
de ricino?
4. ¿Cuál son los efectos del etanol y ácido clorhídrico sobre las enzimas?
5. Al cocinar los alimentos demasiado ¿ Cómo influye en la actividad de las enzimas?
6. en lista las enzimas presentes en el peroxisoma
Anota las enzimas características de los glioxisomas, que no están presentes en los
peroxisomas?

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
 PRACTICA 8. EFECTO DE LAS COENZIMAS SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

La mayoría de las manifestaciones metabólicas de un organismo, se relacionan con

cambios de energía, la cual se obtiene por la oxidación sistemática de los nutrientes y
esto es debido a que en los procesos de oxidorreducción hay transferencias de energía
generadas por diferencias n el potencial electroquímico. Un sistema de potencial
elevado, oxida al de más bajo potencial con la consiguiente liberación de energía para
las necesidades vitales.
En todas las reacciones de oxidorreducción, existe transferencia de electrones. La
oxidación se define como: la pérdida de electrones por parte de un compuesto, mientras
que la reducción es la ganancia de dichos electrones por otro compuesto. Por lo tanto,
la oxidación y la reducción son fenómenos que se realizan en forma simultánea.
La oxidación biológica implica transferencia de hidrógenos y electrones a través de una
serie de sistemas enzimáticos que actúan como intermediarios, para llegar al aceptor
final que es el oxígeno. El proceso oxidativo se inicia por la oxidación de una
deshidrogenasa específica que no reacciona directamente con el oxígeno, sino que
requiere intermediarios como el NAD, las flavoproteínas y los citocrómos.
En el presente experimento, se pretende realizar un estudio cualitativo, donde se utilizará
la deshidrogenasa láctica de músculo de rata; que sólo es activa en estado de
anaerobiosis y requiere NAD como intermediario para completar su actividad, la cual se
manifiesta en la siguiente reacción.

PIRUVATO---------------- LDH-------------LACTATO
NADH+ H+ NAD +
Con este experimento se pretende demostrar que: Si la LDH es una enzima que funciona
normalmente, basándose en la concentración de NAD y anaerobiosis promoviendo la
reducción del piruvato en presencia de NADH+ H+; entonces, aumentando la
concentración de NAD+ podemos revertir la reacción para oxidar al lactato y generar
NADH+ H+ el cual reaccionará con el azul de metileno y provocará su decoloración. Si
esta premisa se cumple se habrá demostrado que la concentración de la coenzima puede
regular la dirección de la actividad de una enzima reversible.

OBJETIVO

Determinar cualitativamente, mediante la observación de los grados de decoloración; las

relaciones existentes entre la actividad de la deshidrogenasa láctica (LDH) y la presencia
de nicotinamida adenin dnucleótido (NAD), en función de los siguientes aspectos:
Determinar si la actividad de LDH depende de la presencia de NAD.
Especificar la actividad de indicador redox del azul de metileno
Aportar pruebas experimentales que demuestren la coenzima no se modifica
estructuralmente durante la actividad de enzima.
PRERREQUISITOS

1.- Definir los términos: cofactor, coenzima y metaloenzima.

2.- Mencionar las coenzimas que actúan en oxidorreducciones.
3.- Explicar cómo afectan las coenzimas a la cinética enzimática.

MATERIAL

1.- Una rata adulta de 250g de peso(o un conejo)

2.- Cuatro tubos de ensayo de 20 x 150 mm.
3.- Tres pipetas de 5.0 ml.
4.- Una pipeta de 2.0 ml.
5.- Una pipeta de 1.0 ml.
6.- Dos vasos de precipitado de 150 ml.
7.- Un matraz erlenmeyer de 125 ml.
8.- Un mortero con pistilo.
9.- Un estuche de disección
10.- Un baño maría ajustado a 37 °C
11.- Eter(anestésico para la rata)
12.- Arena lavada(agente triturante)
13.- NaCl al 0.9%(solución isotónica para resuspenden células).
14.- KCN al 0.5% (inhibidor de las deshidrogenasas mitocondriales).
15.- Lactado de sodio al 1%(substrato de la LDH)
16.- Azul de metileno 0.002M(indicador redox que reacciona con NAD).
17.-Aceite mineral (compuesto que al sellar los tubos promueve la anaerobiosis).

Efecto de la Nicotinamida adenin dinucleótido (NAD) en la actividad de la enzima

Lactato Deshidrogenasa.

a).- Preparación de la enzima LDH:

1.- Matar una rata con éter, disecarla y obtener de 2 a 3 gramos fragmentos de
músculo de las patas.
2.- Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y añadir NaCl al
0.9%(10 ml por gramo de tejido) y agregar un poco de arena. Triturar perfectamente.
3.- Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos.
4.- Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y recuperar el sobrenadante etiquetándolo
como LDH.

b).- Preparación de la coenzima NAD:

1.- Obtener otos 3 g de tejido muscular de las patas traseras de la rata.

2.- Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlo en agua a ebullición por 5
minutos en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. en una proporción de 8ml de agua por
gramo de músculo.
3.- Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena y triturar perfectamente.
4.- Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como
NAD.

c).- Detección de la actividad enzimática de LDH:

Preparar una serie de cuatro tubos de ensaye como se indica a continuación:

NOTA: se debe tener precaución al utilizar el KCN ya que es altamente tóxico.

UTILICE BURETA.
Tubo 1 2 3 4
KCN al 0.5%(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0
Lactato de sodio al 1% (ml) 1.0 1.0 ----- 1.0
Azul de metileno 0.002 M (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3
Agua destilada (ml) 1.0 ----- 1.0 1.0
Coenzima (NAD) (ml) ----- 1.0 1.0 1.0
Enzima (LDH) (ml) 1.0 1.0 1.0 -----

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1.0 ml. de aceite mineral.
Incubar en baño de agua a 37°C los tubos MANTENIÉNDOLOS INMOVILES y observar
los grados de decoloración de cada solución. Hacer estas observaciones en intervalos
de 15 minutos durante 45 minutos.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.- Relacione el efecto de cada reactivo con los resultados obtenidos.

2.- Determine si los resultados que obtiene son acordes con los esperados.
3.- Explique el fundamento químico de la reacción entre el azul de metileno y el
NAD.
4.- Mencione los errores, si es el caso, en el planteamiento o en el manejo del
experimento que pudieran modificar los resultados.
5.- Mencione las diferencias entre una enzima y un cofactor.
6.- Explique cuál es el efecto del oxígeno en la actividad de las oxidasas.
7.- Mencione cinco coenzimas que actúen con transferasas.
8.- Explique la relación que existe entre algunas coenzimas y las vitaminas del
Complejo B-
9.- Describa la función del fosfato de piridoxal en la reacción que cataliza la
Enzima transaminasa glutámico oxaloacética (TGO).

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
PRACTICA 9. Efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática.
(Ensayo sobre la inhibición competitiva y no competitiva de las
enzimas lactato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa)

INTRODUCCIÓN

Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad catalítica.

Este efecto se utiliza para preparar drogas o insecticidas que inhiben selectivamente
ciertas enzimas en la bacteria o insecto infectante y que no afecte al hospedero.
La inhibición es una de las formas más útiles para regular la actividad de una enzima.
Los estudios logrados en base a inhibidores han contribuido a la información actual sobre
cinética enzimática y mecanismos tanto metabólicos como clínicos.
Los dos tipos principales de inhibición son: La inhibición competitiva: donde el compuesto
inhibidor interacciona con el sitio catalítico, compitiendo con el sustrato por la unión con
dicho sitio. En este caso el grado de inhibición depende directamente de la concentración
del inhibidor, con respecto al sustrato específico, por lo tanto, si la concentración de
sustrato es mayor que la del inhibidor, no se presentará el efecto inhibitorio. Más aún, si
a una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo se le adiciona mayor cantidad de
sustrato, casi siempre desaparecerá el efecto inhibitorio.
La mayoría de los inhibidores competitivos tienen una estructura química semejante a la
del sustrato natural por lo tanto son muy específicos. Como el inhibidor competitivo se
une al sitio catalítico, la enzima pierde afinidad con el sustrato original y esto modifica la
constante de Michaelis (Km).
La inhibición no competitiva es aquella, donde el inhibidor se combina con la enzima,
pero no con el sitio catalítico de manera que la enzima puede unirse al sustrato y al
inhibidor simultáneamente. La inhibición ocurre porque al unirse el inhibidor provoca
cambios moleculares en la enzima que disminuye su actividad catalítica. El aumento de
la concentración de sustrato no tiene efecto sobre el inhibidor.
Los inhibidores no competitivos son inespecíficos o sea que un mismo inhibidor puede
afectar a varias enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos como el
pentacloruro de mercurio, el benzoato de sodio o muy simples como los iones metálicos
plata, cobre, plomo y cianuro. La inhibición no competitiva no afecta la afinidad de la
enzima por el sustrato por los que la Km se mantiene intacta.
En este caso, el complejo enzima-sustrato-inhibidor no se puede disociarse y ocurre una
disminución en la cantidad de enzima activa disponible.

OBJETVO
Analizar el efecto inhibitorio de los compuestos químicos malonato de sodio, sobre la
actividad enzimática de lactato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa, en base al
tipo de inhibición que generan.

PRERREQUISITOS

1.- Explicar el término actividad enzimática.

 2.- Describir el fenómeno de inhibición competitiva.
3.- Describir el fenómeno de inhibición no competitiva.
4.- Enumerar al menos cinco inhibidores que actúen en cada tipo de inhibición.
5.- Explicar el comportamiento cinético de una enzima cuando está bajo el efecto
de ambos tipos de inhibición.

MATERIAL
1.- Catorce tubos de ensayo de 20 x 150 mm.
2.- Cuatro pipetas de 1.0 ml.
3.- Dos pipetas de 2.0 ml.
4.- Dos pipetas Pasteur.
5.- Una gradilla.
6.- Solución de succinato de sodio 0.1M.
7.- Solución de malonato de sodio 0.1 M.
8.- Solución de azul de metileno 0.002M.
9.- Aceite mineral.
10.- Preparación de la enzima deshidrogenasa succinica (DSC).
11.- Solución de cloruro de sodio al 0.9%.

PROCEDIMIENTO

En este experimento se probará el efecto inhibitorio del malonato de sodio

mediante un diseño en donde, se aumenta gradualmente la concentración de inhibidor
con respecto al sustrato, manteniendo constante la concentración de la enzima. La
verificación de la actividad se determinará, en referencia a la actividad de un redox
biológico(azul de metileno) ya que las enzimas que utiliza el diseño son
Oxidorreductasas.

Preparación de DSC a partir de músculo cardiaco de rata.

1.- Tomar de 2 a 3 gramos de músculo de corazón de una rata recién disecada y cortarlo
en fragmentos pequeños.
2.- -Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y añadir NaCl al
0.9% en una proporción de 10 ml. por gramo de músculo, agregar un poco de arena
lavada y triturar perfectamente.
3.- Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos.
4.- Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante
y etiquetado como DSC.

EXPERIMENTO 1

Efecto del malonato de sodio sobre la actividad de DSC:

Preparar una serie de tubos de acuerdo con el siguiente cuadro:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Succinato de sodio 0.1M 0.5 ---- 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0
Azul de metileno 0.002 M 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Malonato de sodio 0.1 M ---- ----- ----- 1.5 0.5 0.25 0.25
Agua destilada 1.0 1.5 .3.0 ----- 0.5 0.75 0.25
Enzima DSC 2.0 2.0 ---- 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos los tubos 1.0 ml de aceite
mineral.
Incubar en baño de agua a 37°C y observar los grados de decoloración que genera cada
tubo a los 15, 30, 45 y 60 min. de incubación.

RESULTADOS

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es el tipo de inhibición que genera el malonato de sodio?

2.- Determine si el diseño experimental que se plantea en esta práctica es el adecuado
para la diferenciación de una inhibición competitiva y no competitiva.
3.- Explique los cambios moleculares que genera el inhibidor no competitivo sobre la
estructura de la enzima.
4.- Describa el comportamiento cinético de una enzima bajo el efecto de un inhibidor
competitivo.
5.- Hago la misma descripción para una inhibición no competitiva.
6.- Analice las diferencias entre un inhibidor y un efecto alostérico negativo.
7.-Qué tipo de reacciones específicas inhiben los siguientes compuestos?
Yodoacetato, Cianuro, Alopurinol,Tioguanina, Floruros, 2,4-dinitrifenol y metotrexato.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
(CAPITULOS DIFERFENTES DE LIBROS)

Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, D. 1994. Biología molecular
de la célula. Tercera edición. Capítulo 2 Pequeñas moléculas, energía y
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Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. 1994. Biología Molecular
de la célula. Capítulo 11. Transporte de moléculas pequeñas a través de la
membrana y base iónica de la excitabilidad de la membrana. 3a edición. Editorial
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