Universidad Autónoma
Chapingo
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
BIOQUÍMICA VEGETAL
REPORTE DE PRÁCTICA 6: “SEPARACION DE AMINOÁCIDOS
POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA”.
Profesor:
Dra. Maribel Pacheco Sánchez
Equipo: 6
De la Rosa Anaya Alejandro Eutimio
López Rosano Helí Aníbal
Miguel Pérez Jorge Alberto
Merino Merino Ángel Gabriel
Rodríguez Rojas Elizabeth Jaret
Rojas Velázquez Marisol
Grado: 4° Grupo: 5
Chapingo, Edo. de México, 08 de noviembre del 2019
Introducción
La cromatografía comprende un conjunto de técnicas que tienen como finalidad la
separación de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de
cada componente en otra sustancia. Consiste esencialmente en dos fases: la
sustancia en movimiento se llama fase móvil y la sustancia que permanece en su
sitio es la fase estacionaria. A medida que la fase móvil se mueve, se separa en
sus componentes en la fase estacionaria, así se puede hacer la identificación del
compuesto o sustancia que se encuentra. (Textos cientí[Link], 06 noviembre
2019)1
Para la particularidad de esta práctica se emplea el método de cromatografía de
capa fina, en el cual se utiliza un soporte, con cualquier sustancia que pueda
dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. El
desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se
aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un
extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a
afectar a la resolución, y depende de la concentración del compuesto o
compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas bastará una
cantidad muy pequeña para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin
llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica.
Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado
(tanque cromatográfico) y uno de los extremos se sumerge en un disolvente
apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo
de la línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por
capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de
acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el
solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, esta se
saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si
no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se
determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente,
calculándose el correspondiente valor de Rf. La identificación de tales compuestos
se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia
(patrones) de naturaleza química conocida. Es preciso reconocer que para el caso
de los aminoácidos se hace una identificación cualitativa de los aminoácidos, esto
se hará con base en la reacción de coloreados. La formación de color se toma
como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de
color es indicativo de que no está́ presente (Styrer L., Berg JM. Tymoczko JL,
2003).
Objetivos
Familiarizarse con la cromatografía en capa fina para reconocerla como una
técnica eficiente de separación.
Emplear la técnica de cromatografía en capa fina para la separación e
identificación de aminoácidos presentes en una muestra problema.
Materiales
Placa con sílica gel para Muestra problema
cromatografía Solución reveladora (Ninhidrina)
Cámara de cromatografía o Muestra A y B
Horno de secado. Eluyente (Butanol-ácido-acético-
Regla de 30 cm agua)
Lápiz Aminoácidos
o Valina o Isoleucina
o Ác. Glutámico o Leucina
o Serina o Alanina
o Glutamina o Glicina
o Metionina o Treonina
o Arginina o Histidina
o Lisina
Procedimiento
Se emplearon los aminoácidos (observar en materiales). Estas muestras se
aplicaron en la placa cromatográfica junto con las muestras A y B de
aminoácidos, estos estándares permiten conocer la composición de la
muestra problema.
Se trazo una línea con lápiz
desde la base de la placa Con el capilar se colocaron cada
Separación dejando un espacio de 2 cm,en una de las muestras, se dejo
Cromatográfica esa linea se dividio en ese secar a temperatura ambiente y
espacio se coloco la muestra se repitio la operación 4 veces.
asignada a cada equipo.
Para preparar la cámara de
elución, previamente se Transcurrido el tiempo se Se dejo secar el cromatograma
dejo unos minutos para seco el cromatograma y se en la estufa durante 20
saturar la cámara con los marco el frente del minutos, después se aplico el
disolventes y se dejar eluir disolvente. revelador.
aprox. 6 horas.
En los resultados se
muestra la determinación
de los Rf para cada uno de
los aminoácidos y la
muestra problema.
Figura 1. Procedimiento de separación cromatográfica
Resultados
Para calcular los Rf de cada aminoácido y muestra problema se empleó el uso de
la siguiente formula:
Formula
Distancia recorrida por C
R f del componente C=
Distancia recorrida por D
Figura 2. Fórmula para determinación de Rf
Rf= Retención del componente sobre la placa de cromatografía
C= Muestra de aminoácido y muestra problema
D= Frente del disolvente
Para ocupar esta fórmula a continuación, se describen los resultados obtenidos
durante la práctica, en donde observamos las distancias que recorrieron las
muestras de aminoácidos, así como su frente del disolvente.
Equipo Aminoácidos Distancia Frente del
s recorrida por disolvente
las muestras (cm)
(cm)
1 Serina 8.5 17.9
Ac. Glutámico 8.8
Valina 10.5
Muestra- B1 y B2 6 y 8.2
2 Metionina 11.4 15.5
Glutamina 8.1
Arginina 6.4
Muestra B1 y B2 8.2 y 6.1
3 Arginina 8.8 16.1
Isoleucina 11.8
Leucina 12.1
Muestra B 8.7
4 Glicina 8.2 17.9
Trionina 8.6
Histidina 5.9
Muestra A1 Y A2 5.7 y 8.7
5 Leucina 5.8 17.9
Valina 6.1
Ac. Glutámico 8.6
Muestra A1 y A2 5.5 y 8.6
6 Metionina 11.3 15.6
Serina 8.4
Glutamina 8.2
Muestra A1 y A2 8.8 y 5.8
Tabla 1. Distancias recorridas de los aminoácidos y del frente disolvente.
En el siguiente cuadro se refleja la aplicación de la formula mostrada en la figura
2.
Distancia Eluyente AA Operación Rf
Equipos Serina 8.5/17.9 0.47
Equipo 1 17.9 cm Ac. Glutamico 8.8/17.9 0.49
Valina 10.5/17.9 0.58
Muestra B1 6/17.9 0.33
Muestra B2 8.2/17.9 0.45
Equipo 2 15.5 cm Metionina 11.4/15.5 0.73
Glutamina 8.1/15.5 0.52
Arginina 6.4/15.5 0.41
Muestra B1 8.2/15.5 0.52
Muestra B2 6.1/15.5 0.39
Equipo 3 16.1 cm Arginina 8.8/16.1 0.54
Isoleucina 11.8/16.1 0.73
Leucina 12.1/16.1 0.75
Muestra B 8.7/16.1 0.54
Equipo 4 17.9 cm Glicina 8.2/17.9 0.45
Trionina 8.6/17.9 0.48
Histidina 5.9/17.9 0.32
Muestra A1 5.7/17.9 0.31
Muestra A2 8.7/17.9 0.48
Equipo 5 17.9 cm Leucina 5.8/17.9 0.32
Valina 6.1/17.9 0.34
Ac. Glutamico 8.6/17.9 0.48
Muestra A1 5.5/17.9 0.3
Muestra A2 8.6/17.9 0.48
Equipo 6 15.6 cm Metionina 11.3/15.6 0.72
Serina 8.4/15.6 0.53
Glutamina 8.2/15.6 0.52
Muestra A1 8.8/15.6 0.56
Muestra A2 5.8/15.6 0.32
Equipo 7 18 cm Isoleucina 11.6/18 0.64
Arginina 6.57/18 0.36
Leucina 11.8/18 0.66
Muestra A1 5.8/18 0.32
Muestra A2 8.8/18 0.49
Tabla 2. Cálculos realizados para la obtención de Rf en los aminoácidos y del frente disolvente.
Posterior a las mediciones y cálculos realizados, se obtienen en concreto los
siguientes resultados:
Equipos Aminoácidos R f calculado (cm)
1 Serina 0.47
Ac. Glutámico 0.49
Valina 0.58
Muestra- B1 y B2 0.33 y 0.45
2 Metionina 0.73
Glutamina 0.52
Arginina 0.41
Muestra B1 y B2 0.52 y 0.39
3 Arginina 0.54
Isoleucina 0.73
Leucina 0.75
Muestra B 0.54
4 Glicina 0.45
Trionina 0.48
Histidina 0.32
Muestra A1 Y A2 0.31 y 0.48
5 Leucina 0.32
Valina 1 y valina 2 0.34 y 0.48
Ac. Glutámico 0.48
Muestra A1 y A2 0.30 y 0.48
6 Metionina 0.72
Serina 0.53
Glutamina 0.52
Muestra A1 y A2 0.56 y 0.37
7 Isoleucina
Arginina 0.64
Leucina 0.36
Muestra A1 0.66
Muestra A2 0.32
0.49
Tabla 3. Resultados de Rf
Análisis de resultados
Los 3 aminoácidos conocidos que son metionina con Rf de 0.72cm, Serina con Rf
de 0.53cm y Glutamina con Rf de 0.52cm estas fueron nuestras muestras bases
para poder identificar la muestra “A”.
La muestra “A” presento dos puntos cada uno con distinta distancia recorrida esto
debido a que en esta muestra hay dos tipos de aminoácidos. Tomando en cuenta
la distancia recorrida de los aminoácidos, la coloración y los resultados de Rf
podemos determinar que la muestra “A” es la Serina con un Rf de 0.53 y la
muestra “A” con un Rf de 0.56 cm estos no varían por mucho, también tomamos
en cuenta que los puntos en la capa de sílice se encontraron aproximadamente a
la misma distancia y presenta una coloración parecida a (naranja pálido). El
segundo con una coloración naranja fuerte con un Rf de 0.37 cm que al
compararlo con los demás aminoácidos el Rf mas parecido a este fue la la Valina
con un Rf de 0.34 cm.
Las propiedades ópticas de los aminoácidos se ven influidas por la polaridad de su
entorno esto al absorber la luz esto a
través de las longitudes de ondas en las
que se localizan los máximos de
absorción y emisión de
fluorescencia.
La glutamina (abreviada Gln o Q, y
con frecuencia nombrada como L-
glutamina). Es una cadena lateral
de una amida del ácido glutámico,
formada mediante el reemplazo del
hidroxilo del ácido glutámico con un
grupo funcional amina. Es una
aminoácido asimétrico que tiene los
4 tipos de grupos funcionales
adheridos al carbono esto provoca
que exhiba una actividad óptica.
El aminoácido Glutamina recorrió una
Figura (1)- Estructura de la glutamina
distancia de 8.2 cm debido a su cadena
que tiene una Carga negativo. Es un aminoácido polar (hidrófilo) muy soluble en
agua
La posición de los aminoácidos se revela con anhidrina formando aductos
coloreados según la reacción. Las manchas redondas amarillas a las que se
denomina prolina su coloración se debe a que estas no presentan reacción ya que
no tienen el grupo amino libre.
Metionina El nombre de “metionina” es una abreviatura del nombre químico de
este aminoácido: el ácido γ-metiltiol-α-aminobutírico.
Tiene un carbono α unido a un grupo amino
(—NH2), a un grupo carboxilo (—COOH), a
Figura (2)- fórmula estructural de metionina
un átomo de hidrógeno y a una cadena lateral (—R) que contiene azufre y que
está constituida de la siguiente forma: —CH2—CH2—S—CH3.
El aminoácido Metionina recorrió la distancia de 11.3 con debido a que presenta
una carga positiva volviéndolo un aminoácido no polar insoluble en agua. La 3 de
un grupo amino libre le proporciona su respectiva coloración amarilla a este
aminoácido
Serina
La serina contiene tres átomos de carbono: un carbono central unido, por un lado,
a un grupo carboxilo (COOH) y por otro, a un grupo amino (NH3+). Los otros dos
enlaces del carbono central están ocupados por un átomo de hidrógeno y por un
grupo CH2OH (grupo R), característico de la serina.
IFigura (3)- Formula estructural de la
serina
Cuestionario
Conclusión
El que los aminoácidos recorrieron parte de la placa se logró gracias a que cada
uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los
componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente mientras que
los más afines a la fase móvil se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, la
placa cromatografía funciona como un controlador de la velocidad de cada
sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación.
Fuentes consultadas
1
. [Link]. (2007). CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. 06 noviembre, 2019, de
[Link] Sitio web: [Link]
fina?fbclid=IwAR3W7hftD_FJs6R3FRwPi8WJp5YD7_QWP5MNAviOLvf8DaKcXZiINNvh21M
