CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
ANÁLISIS INSTRUMENTAL
FUNDAMENTO
La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada
para separar los componentes de una mezcla. Consiste
en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase
móvil. La muestra en solución es inyectada en la fase
móvil. Los componentes de la solución emigran de
acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones
químicas, determinan la separación de los contenidos en
la muestra.
ELEMENTOS DEL HPLC
RESERVORIOS
Su boca ha de ser lo más estrecha posible para evitar la evaporación del disolvente
A través del tapón discurre el tubo (generalmente de teflón) que conduce la fase móvil
al sistema de bombeo. Este tubo suele tener en su extremo un filtro de titanio de 10
µm de poro, que evita el paso hacia el equipo cromatográfico de partículas sólidas que
pueda contener la fase móvi
SISTEMA DE BOMBEO
Se denomina bomba cromatográfica al dispositivo capaz de proporcionar a la fase móvil la presión
necesaria para atravesar, al flujo seleccionado, la columna y el resto del sistema La obtención de
flujos de 0,1 a 5,0 ml/min y la capacidad de trabajar a presiones de hasta (400 bar)
ISOCRÁTICO: La composición de la fase móvil no se modifica durante el análisis
GRADIENTE La composición de la fase móvil se modifica durante el análisis para ir aumentando su
poder de elución.
Mezcla a alta presión: Una bomba para cada componente de la fase móvil. La mezcla se realiza
en una cámara de mezcla situada entre las bombas y el inyector. La mezcla tiene lugar en el
lado de alta presión de la bomba
Mezcla a baja presión: Una válvula situada antes de la bomba controla la composición abriendo
la entrada de cada eluyente durante un tiempo proporcional a la composición deseada
TUBOS DE CONEXIÓN
INYECTORES
Los tubos capilares que se utilizan
El inyector es un dispositivo hermético que se
en HPLC para conectar los distintos
encuentra situado a la salida de la
componentes del cromatógrafo
bomba y que permite, mediante el empleo de
tienen un diámetro externo de 1/16’’
válvulas, incorporar la muestra a la fase móvil antes
(1,59 mm).
de la columna, sin pérdidas de presión que alteren
Los tubos utilizados en HPLC
el flujo constante proporcionado por la bomba.
pueden estar fabricados de:
Los inyectores de válvulas, conocidos como
Teflon
inyectores de bucle (loop) son los mas usados
Metal
,Existen loops desde 5 µl hasta 5 ml.
PEEK
COLUMNAS Y FASES
ESTACIONARIAS
La columna es la parte más importante del
sistema cromatográfico, Las columnas más
habituales para HPLC analítica tienen
longitudes entre 10 y 30 cm
En función de su composición, las fases
estacionarias que se utilizan en HPLC
suelen ser de uno de estos tipos: (1) con
base de sílice, (2) poliméricas (basadas en
estireno-divinilbenceno), e (3) híbridas,
formadas por una combinación de las dos DETECTORES
anteriores
La precolumna retiene las partículas sólidas El detector cromatográfico debe
y otros contaminantes presentes en la fase caracterizarse por una gran sensibilidad,
móvil precisión y linealidad. Es preferible que el
detector no se vea afectado por cambios
en la composición de la fase móvil
(gradientes), que tenga un tiempo de
respuesta inferior a 0,3 segundos y un
volumen de celda lo más pequeño
posible, de modo que no contribuya al
ensanchamiento de los picos
Clasificación:
Detectores ópticos: de absorbancia
UV-VIS, fluorimétricos,
refractométricos, polarimétricos,
evaporativos de dispersión de luz, etc.
Detectores eléctricos: electroquímicos,
conductimétricos.
Detectores específicos: radiométricos,
viscosimétricos.
Detectores de técnicas acopladas:
espectroscopía de masas (MS), aerosol
cargado (CAD), espectroscopía
infrarroja transformadora de Fourier
(IRTF), absorción atómica (AA),
espectroscopía de emisión por plasma
(ICP), etc.
APLICACIONES
Esta técnica esta indicada para la separación de compuestos orgánicos
semivólatiles.
Hidrocarburos Poliaromáticos (PAHs), Aminoácidos: OTA, Ácido Fólico, Herbicidas,
Vitaminas, Acido tenuazonico, Formaldehído…etc.
Rango de trabajo para muestras líquidas: µg L-1
- mg L-1
Rango de trabajo para muestras sólidas: µg Kg-1 - µg g-1
