Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia.

Laboratorio de Microbiología General

Presentado por: Maria Paula Salamanca Martinez

PRACTICA 7. CRECIMIENTO MICROBIANO – CULTIVO DISCONTINUO DE
Escherichia coli

Objetivos:

 Determinar el crecimiento por medio del recuento en placa expresado como

UFC/ml en el tiempo y analizar los resultados propuestos.
 Establecer la densidad óptica en el cultivo a través del tiempo y construir su
respectiva gráfica.
 Evaluar el pH de las muestras y compararlo con el paso del tiempo
 Calcular la velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicación del microorganismo
evaluado, teniendo en cuenta las gráficas y datos analizados.
Resultados:
Tabla 1. Datos recuperados para la construcción de curvas de crecimiento de Echerichia
coli

Tiempo (h) Densidad óptica UFC UFC Factor de Promedio de UFC/mL Log 10 pH
(600 nm) cultivo cultivo B dilución UFC/ mL UFC/mL
A
0 0,026 43 38 1* 10-4 40,5 4,05*106 6,61 7
0,5 0,029 56 61 1* 10-4 58,5 5,85*106 6,77 6,95
1 0,044 87 72 1* 10-4 79,5 7,95*106 6,90 6,70
1,5 0,068 156 172 1* 10-4 164 1,64*107 7,21 6,50
2 0,133 31 36 1* 10-5 33,5 3,35*107 7,53 6,00
4 0,925 56 48 1* 10-6 52 5,20*108 8,72 5,00
6 1,35 179 163 1* 10-6 171 1,71*109 9,23 4,00

UFC/mL vs Tiempo
1.80E+09
1.60E+09
1.40E+09
1.20E+09
UFC/ml

1.00E+09
8.00E+08
6.00E+08
4.00E+08
2.00E+08
0.00E+00
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (h)

Grafica 1. Curva de crecimiento exponencial para Echerichia coli

 Fase de latencia Fase de crecimiento exponencial

Grafica 2.
Log UFC/mL vs Tiempo Curva de
9.5 crecimiento
logarítmico
9
para
8.5 Echerichia coli
Log UFC/ml

8
7.5
7
6.5 Fase de crecimiento exponencial
6
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 Fase de latencia
Tiempo (h)

Grafica 3.
Densidad óptica vs Tiempo Curva de
1.6 determinación
Densidad óptica (600 nm)

1.4 de la
1.2 densidad
1 óptica contra
0.8 el tiempo para
0.6 Echerichia
0.4 coli
0.2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
Tiempo (h)
Fase de crecimiento
Faseexponencial
de latencia
Grafica 4. Cambio de pH del cultivo de Echerichia coli al aumentar el tiempo

pH vs Tiempo
8

4
pH

0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (h)

Tabla
2. Valores determinados para la velocidad de crecimiento y tiempo de generación de
Echerichia coli

X Tiempo (min) μ (velocidad de crecimiento) G (tiempo de generación de

(UFC/min) UFC/ml) (min)
0
30 0,0123 56,5
60 0,0102 67,8
90 0,0241 28,7
120 0,0238 29,1
240 0,0229 30,3
360 0,0099 69,9
Promedio de valores cercanos Promedio de valores
cercanos
0,0236 UFC/min 29,4 min

Discusión de resultados:
En muchos ámbitos es necesario realizar controles de crecimiento microbiológico ya sea
por ejemplo en alimentos o como tal, productos en los cuales podamos encontrar una
cantidad especifica permitida de microorganismos; para hacer este seguimiento al
crecimiento microbiológico hacemos uso de las curvas de crecimiento microbiano como lo
veremos a continuación.
Para este informe se tomaron los datos que se encuentran en la tabla 1, en donde los
correspondientes a densidad óptica y unidades formadoras de colonia fueron adaptados
del estudio realizado por (Rafael Bosch Zaragoza, 2020, 03:15–05:21). En este caso los
datos fueron tomados a partir de una muestra de 1ml del cultivo de Echerichia coli
inoculados en 100 mL de agar LB realizando así una dilución 1/100 de la cual se partió
para llevar a cabo las respectivas diluciones que se llevaron a cabo por duplicado y que
se muestran en la tabla; cabe resaltar que en el estudio de donde fueron sacados estos
datos se evalúan aun más intervalos de tiempo que los que se encuentran en la tabla 1,
pero por conveniencia solo se tomaron los que se especifican en ella. Para poder obtener
el numero de células o el numero de unidades formadoras de colonia por mL (UFC/mL) se
realizó el método de recuento en placa para el cual se obtuvieron 2 valores por dilución
realizada (UFC A y UFC B) que fueron promediados con el fin de tener un recuento mas
certero, y se hizo uso de la siguiente fórmula para poder obtener las UFC/mL con
respecto a los datos proporcionados:
Fórmula 1: Promedio de UFC∗10∗inverso de factor de dilución
De esa forma se obtuvieron los datos de UFC/ mL para cada tiempo evaluado y con estos
se construyeron las gráficas 1 y 2 que se pueden observar en la sección de resultados.
La grafica 1 corresponde a los valores de UFC/mL contra el tiempo evaluado, en esta
gráfica podemos evidenciar básicamente una curva exponencial en la cual vemos como
se pasa de una fase de latencia que es en la cual las células no demuestran un
crecimiento o un aumento celular significativo, sino que se encuentran adaptándose al
medio, a una fase de crecimiento exponencial en donde las células ya se empiezan a
duplicar, donde la actividad metabólica empieza a incrementar y se alcanza la velocidad
máxima de crecimiento; en esta gráfica se encuentra señalado con una línea en verde el
tiempo aproximado en el cual se pasa de una fase de latencia a una exponencial que
corresponde a 2 horas. Al comparar esta grafica con la gráfica 2 en la cual también
vemos señalado el tiempo de cambio entre las fases mencionadas en verde, notamos que
el tiempo disminuye a 1 hora, sin embargo en esta grafica podemos ver una curva más
clara en donde se puede ver tal vez de manera más certera el tiempo en el que
cambiamos de fase de latencia a exponencial; de igual forma señalado en rojo podemos
ver el tiempo en donde aproximadamente terminaría nuestra fase de crecimiento
exponencial y entraríamos en una fase estacionaria el cual corresponde a 5,5 horas, aquí
se llega a cierto punto en el cual no aumenta más el crecimiento bacteriano y el número
de microorganismos se estabiliza hasta llegar a la fase de muerte en donde el número de
células empieza a disminuir considerablemente debido a la acumulación de metabolitos
tóxicos que pueden producir el gran numero de microorganismos presentes en el medio y
a la falta de nutrientes, esta fase no es observable en nuestras graficas pero que se
podría ver si se continua haciendo seguimiento por un periodo más largo de tiempo.
(Negroni, 1999b, pp. 47–48).
El crecimiento exponencial se encuentra relacionado directamente con el tiempo de
generación (G) del microorganismo evaluado, este se define como el tiempo que tarda
una población en duplicarse y es diferente para cada organismo pues algunos crecen
rápidamente con tiempos de generación cortos mientras que otros tienen tiempos de
generación desde varias horas e inclusive días. Para calcular el tiempo de generación del
cultivo de Echerichia coli estudiado partimos de la siguiente fórmula:
 ln( 2)
Fórmula 2: G=
μ
En donde μ corresponde a la tasa o velocidad de crecimiento que se encontró de la
siguiente manera para los distintos intervalos de tiempo:

ln ( N 2) −ln ( N 1)
Fórmula 3: μ=
T 2−T 1
En donde N corresponde a las UFC/mL de los respectivos intervalos de tiempo (T) que
fueron usados en unidades de minutos como se evidencia en la tabla 2 en donde se
tomaron los valores cercanos entre los tiempos evaluados (resaltados en verde y amarillo)
y se promediaron de modo que obtuvimos una tasa de crecimiento de 0,0236 UFC
generadas en 1 minuto, y por ende obtuvimos un tiempo de generación de
aproximadamente 29,4 min, un valor lógico teniendo en cuenta lo reportado por la
literatura en donde nos mencionan que Echerichia coli posee tiempos de generación de
entre 20-30 min. (Pumarola, 1992, p.65).
Otro de los métodos usados para la evaluación de crecimiento bacteriano es el método de
la evaluación de la turbidez, pues en un medio aparece turbidez cuando se encuentran
organismos en él, la medición de la turbidez por medio de un espectrofotómetro puede
otorgarnos buenas estimaciones acerca de el crecimiento de los microorganismos
presentes, pues el objetivo es obtener un valor de absorbancia o densidad óptica de las
partículas presentes en cada una de las diluciones; los datos evaluados en el tiempo bajo
este método se ven en la tabla 1 y con estos se construyó la gráfica 3 en la cual
podemos ver una curva parecida a la construida en la gráfica 2, en donde evidenciamos
de igual forma una fase de latencia, una fase de crecimiento exponencial y el comienzo de
una fase estacionaria. En este caso como es señalado en verde, el tiempo de cambio
entre la fase de latencia y la exponencial se encuentra aproximadamente en 1, 55 horas
de modo que si promediamos los valores obtenidos en las distintas gráficas obtendremos
que el tiempo aproximado en el cual se da un cambio de fase latente a fase exponencial
en el cultivo de Echerichia coli es de 2,28 horas (136,5 min); por el lado del tiempo de
cambio entre fase exponencial y estacionaria los valores entre las dos gráficas coinciden
por lo cual el tiempo aproximado de cambio entre fase exponencial y estacionaria para
Echerichia coli es de 5,5 horas. Este método de turbidez es útil para poder evaluar la tasa
de crecimiento sin perturbar a los microorganismos del medio de cultivo; sin embargo, las
muestras que posean densidades celulares muy altas deben diluirse para garantizar
lecturas. El error asociado a la toma de densidades ópticas se da cuando los cultivos
contienen menos de 1 millón de células por mililitro, pues en estos puede verse muy poca
o incluso ninguna turbidez incluso cuando se está produciendo un crecimiento. (Black &
Black, 2012, p.155).
Otro de los métodos para evaluar el crecimiento de bacterias es basándose en los
productos del metabolismo específicos para los diferentes organismos como es el caso de
gases o ácidos orgánicos, en este caso sabemos que Echerichia coli es fermentador de
azucares de modo que produce ácidos orgánicos a medida que se encuentra creciendo,
por lo que la medición de pH puede servirnos para ver como está evolucionando el cultivo,
pues este parte como se ve en la tabla 1 y la gráfica 4 de un pH neutro que por acción de
fermentación de los metabolitos en el medio baja debido a la producción de ácidos; el pH
baja lentamente hasta llegar a el tiempo de aproximadamente 2 horas donde como ya
dijimos anteriormente se da el comienzo de la fase de crecimiento exponencial, aquí la
actividad metabólica empieza a incrementar y por consiguiente la producción de ácido lo
que notamos en los datos pues a partir de ese tiempo el valor de pH baja más
drásticamente hasta 4. De esta forma podemos establecer una relación entre el pH y el
crecimiento de E. coli, pues a menor pH tendremos más UFC/mL fermentando azucares y
generando ácidos. (Black & Black, 2012, p.155).
Conclusiones:

 El método de recuento en placa para las diferentes diluciones de cultivo de

Echerichia coli evaluado nos permite determinar el numero de UFC/mL en un
tiempo específico de modo que por medio de una evaluación gráfica y de los
respectivos datos podemos saber cuales son los tiempos de generación de un
organismo especifico y la tasa de crecimiento, para usarlos a nuestra conveniencia
en diferentes ámbitos.
 El método de la evaluación de la turbidez es un método útil para determinar de
igual manera los tiempos de generación, tasa de crecimiento y tiempos de cambio
entre fases por medio de sus gráficas, cuenta con la ventaja de ser más rápido
que el método de recuento en placa, pero también presenta sus desventajas que
deben ser consideradas por el investigador.
 La evaluación del pH o en general de la generación de productos del metabolismo
en un medio de cultivo puede sernos de utilidad si requerimos evidenciar el
crecimiento microbiano, sin embargo, es poco efectivo para determinar tiempos de
generación, tasa de crecimiento y tiempos de cambios de fase.
 La velocidad de crecimiento y el tiempo de generación son valores útiles de
determinar, pues son valores específicos para los microorganismos y pueden
indicarnos si la presencia de un microorganismo en un medio de interés debe ser
controlada o no.
Datos de las tablas 1 y 2 adaptados de:

 Rafael Bosch Zaragoza. (2020, 2 abril). Curva de crecimiento en Excel [Archivo de

vídeo]. Recuperado de [Link]
Referencias:

 Negroni, M. (1999). Microbiología Estomatológica. Madrid, España: Editorial

Médica Panamericana.
 Pumarola, A. (1992). Microbiología y parasitología médica. Madrid, España:
Ediciones Científicas y Técnicas.
 Black, J. G., & Black, L. J. (2012). Microbiology: Principles and Explorations (8.a
ed.). Arizona, USA: John Wiley & Sons Inc.
 REPRODUCCIÓN Y CRECIMIENTO MICROBIANO. (s. f.). Recuperado 16 de
noviembre de 2020, de
[Link]
_6_crecimiento
  Caracterización Microbiológica. (s. f.). Recuperado 16 de noviembre de 2020, de
[Link]
%C3%B3n_microbiol%C3%[Link]?sequence=10&isAllowed=y
 Departamento de química- UNAM. (2019). Crecimiento microbiano [Diapositivas].
Recuperado de
[Link]

PREGUNTAS
1. Describa las fases del crecimiento microbiano y explique qué ocurre en cada una
de ellas
Rta:

 Fase de latencia: En la fase de latencia, los microorganismos no aumentan

significativamente en número, pero son metabólicamente activos: crecen de
tamaño, sintetizando enzimas e incorporando varias moléculas del medio. La
duración de la fase está determinada en parte por las características de la especie
bacteriana y en parte por las condiciones de los medios (tanto del cual los
organismos se toman como al que se transfieren). Algunas especies se adaptan al
nuevo medio en una o dos horas; otros tardan varios días.

 Fase de crecimiento exponencial: Una vez que los organismos se han adaptado
a un medio, el crecimiento de la población ocurre en una tasa exponencial o
logarítmica. Durante la fase exponencial, los organismos se dividen en su máxima
velocidad y la población de organismos se duplica en cada tiempo de generación.
Los organismos en un tubo de medio de cultivo pueden mantener crecimiento
exponencial durante un tiempo limitado. Como el número de organismos aumenta,
los nutrientes se agotan, los desechos del metabolismo se acumulan, el espacio
habitable puede volverse limitado y los organismos aerobios sufren de
agotamiento de oxígeno. Generalmente el factor limitante de crecimiento
exponencial parece ser la tasa correspondiente a qué energía se puede producir
en forma de ATP. Como la disponibilidad de nutrientes disminuye, las células se
vuelven menos capaz de generar ATP, y su tasa de crecimiento disminuye.

 Fase estacionaria: Cuando la división celular disminuye hasta el punto de que se

producen nuevas células al mismo ritmo que mueren las células viejas, el número
de células vivas permanece constante. El cultivo se encuentra entonces en la fase
estacionaria, representada por una recta horizontal evidenciada en las curvas de
crecimiento. El medio contiene una cantidad limitada de nutrientes y puede
contener cantidades tóxicas de desechos. Además, el suministro de oxígeno
puede volverse inadecuado para organismos aeróbicos y cambios dañinos de pH
pueden ocurrir.

 Fase de muerte celular: A medida que las condiciones en el medio se vuelven

cada vez menos favorables para la división celular, muchas células pierden su
capacidad de dividirse y, por tanto, mueren. En esta fase de declive o de muerte,
 el número de células vivas disminuye en una tasa logarítmica. Durante la fase de
declive, muchas las células experimentan la involución, es decir, adoptan una
variedad de formas inusuales, lo que las hace difíciles de identificar. En cultivos de
organismos formadores de esporas, sobreviven más esporas que células
vegetativas (metabólicamente activas). La duración de esta fase es tan variable
como la duración de la fase de crecimiento exponencial. Ambos dependen
principalmente sobre las características genéticas del organismo. Los cultivos de
algunas bacterias atraviesan todas las fases de crecimiento y mueren en unos
días mientras que otros contienen algunos organismos vivos después meses o
incluso años. (Black & Black, 2012, pp.148-150).

2. ¿Qué factores afectan el crecimiento microbiano?

Rta:

 Temperatura: La mayoría de los microorganismos capaces de producir

enfermedades en el hombre crecen mejor a temperaturas cercanas a los 37 ºC, por lo
que las bajas temperaturas tienden a retrasar e incluso paralizar el crecimiento de
microorganismos mientras que las altas temperaturas eliminan en mayor o menor
grado dependiendo de la intensidad del tratamiento térmico el crecimiento de estos.
 Humedad: El agua es un elemento indispensable para la vida incluida la de los
microorganismos cuanto mayor sea el contenido en agua de un medio más fácil será
que este crezca en él, mientras que los bajos contenidos de agua impiden este
crecimiento.
 Acidez (pH): Un medio neutro La mayoría de los microorganismos crecen mejor en
medios que tengan un pH próximo a la neutralidad, algunos pueden crecer en
condiciones medianamente básicas o en condiciones medianamente acidas, pero
condiciones extremas de cambio de pH son factores que impiden el desarrollo de más
microorganismos.
 Nutrientes: Los microorganismos para multiplicarse necesitan nutrientes que obtienen
del medio, estos hacen fácil el crecimiento bacteriano; distintos tipos de
microorganismos requieren distintos tipos de nutrientes, por ejemplo, las bacterias
necesitan más proteínas, y aunque también necesitan azucares las concentraciones
muy altas de estas pueden impedir el crecimiento al igual que la ausencia de estos
compuestos afectará su el crecimiento.
 Tiempo: como fue expuesto en la discusión del informe entre más tiempo se tenga un
cultivo bacteriano y la población sea más grande se agotarán los nutrientes, el
espacio, y se acumularan desechos metabólicos que inducirán la muerte celular y
frenaran el crecimiento de nuevos microorganismos.
 Oxigeno: Dependiendo del tipo de microorganismo que quiera crecer la ausencia o
presencia de oxigeno es un factor importante, pues algunos microorganismos lo
necesitan para poder realizar sus metabolismos (aerobios) mientras que otros pueden
realizarlos sin el (anaerobios)
(«2.3.- Factores que influyen en el crecimiento bacteriano. | SHMA03.- Manipulación de
alimentos.», s. f.)

3. Explique el concepto de tiempo de generación

Rta: El tiempo de generación corresponde a el tiempo en el cual se duplican las
células. Este tiempo no alcanza la misma velocidad para todas las especies de
microorganismos, ya que es característico para cada una, aunque haya factores que
puedan influir en este tiempo ya sea ralentizándolo o acelerándolo.
Los microorganismos que posean un tiempo de generación corto son capaces de
dividirse en alrededor de 20 minutos como en el caso de la Echerichia coli, mientras
que otros pueden necesitar de hasta 24 horas. (Negroni, 1999b, p.47).
4. Explique las formas de medir el crecimiento microbiano
Rta: Los métodos usados para el seguimiento del crecimiento microbiano puede
clasificarse en métodos directos y métodos indirectos.
Métodos directos: Se basan en la medida de evolución de las células vivas (técnicas
de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de
partículas). Entre los métodos directos encontramos los siguientes:

 Determinación del peso húmedo

 Determinación del peso seco
 Determinación del nitrógeno total
 Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN,
proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.
 Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial
con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas.
 Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter)
Métodos indirectos: Se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos
permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos.
Dentro de estos métodos encontramos:

 Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por

unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de
carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción
de ácidos.
 Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del
laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la
cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.
 Recuento de viables en placa
 Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se
hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las
bacterias, pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se
deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se
forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se
cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del
volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.
(«Ciclo celular y crecimiento», s. f.)
 5. Teniendo en cuenta la USP-37, en el capítulo 85 “PRUEBA DE ENDOTOXINAS
BACTERIANAS”, ¿cuáles son los métodos que se utilizan para la detección de
endotoxinas?, y de ellos, explique uno.
Rta: La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o
cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos
del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Hay tres
técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada
en la formación de gel; la técnica turbidimétrica, basada en la producción de
turbidez después de la ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica
cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la ruptura de un
complejo sintético péptido-cromógeno.
Técnica cromogénica: Esta técnica es una valoración para medir el cromóforo
liberado de un péptido cromogénico adecuado por la reacción de las endotoxinas con
el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica se puede
clasificar como valoración cromogénica de punto final o valoración cromogénica
cinética. La valoración cromogénica de punto final se basa en la relación cuantitativa
entre la concentración de endotoxinas y la liberación del cromóforo al término de un
período de incubación. La valoración cromogénica cinética es un método para medir el
tiempo (tiempo de iniciación) necesario para alcanzar una absorbancia
predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad de desarrollo de color. La
prueba se efectúa a la temperatura de incubación recomendada por el fabricante del
lisado (por lo general 37 ± 1 º). (USP-37, 2014)
6. Realice un cuadro comparativo indicando el límite de microorganismos permitidos
para tres productos estériles y tres productos no estériles, teniendo en cuenta la
USP-37.
Rta:
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, interpretar de la
siguiente manera:
- 101 ufc: recuento máximo aceptable = 20;
- 102 ufc: recuento máximo aceptable = 200;
- 103 ufc: recuento máximo aceptable = 2000; etc. (USP-37, 2014)

Límite de microorganismos permitidos en productos no estériles Límite de microorganismos

permitidos en productos no estériles
Recuento Total de Recuento Total
Productos no Microorganismos combinado de hongos Productos Límite de
estériles Aerobios (ufc/g o filamentosos y levaduras estériles endotoxinas
ufc/ml) Aerobios (ufc/g o ufc/ml) permitidas
Uso vaginal 102 101 Suero fetal 10 unidades de
bovino (vacunas) endotoxinas/mL
Uso gingival 102 101 Oxitetraciclina 0,20 unidades de
endotoxinas/mL
 Parches 102 101 Dispositivos para 2,15 unidades de
transdérmicos la extracción de endotoxinas/mL
LCQ

Referencias:

 Black, J. G., & Black, L. J. (2012). Microbiology: Principles and Explorations (8.a
ed.). Arizona, USA: John Wiley & Sons Inc.
 2.3.- Factores que influyen en el crecimiento bacteriano. | SHMA03.- Manipulacion
de alimentos. (s. f.). Recuperado 16 de noviembre de 2020, de
[Link]
idos/website_23_factores_que_influyen_en_el_crecimiento_bacteriano.html
 Negroni, M. (1999). Microbiología Estomatológica. Madrid, España: Editorial
Médica Panamericana.
 Ciclo celular y crecimiento. (s. f.). Recuperado 17 de noviembre de 2020, de
[Link]