Informe II

Tinciones Compuestas
y Especiales

Karen Tatiana Vargas Ochoa

Profesora Ángela Patricia Rojas

Departamento de farmacia
Universidad Nacional De Colombia
Viernes, 18 de septiembre de 2020
 OBJETIVOS
1. Aprender las metodologías de tinciones simples y compuestas, reconociendo la finalidad de cada una.
2. Identificar microorganismos de acuerdo con su clasificación empleando tinciones diferenciales, teniendo en
cuenta: forma (cocos, bacilos), agrupación (estreptococos, estafilococos, tetradas, sarcinas), tinción de Gram
(Gram (+) y Gram (-)), tinción de Ziehl Niehlsen (BAAR).
3. Reconocer y analizar las tinciones especiales (selectivas) como: tinción de Esporas, Sheaffer Foulton,
tinción de flagelos y tinción Negativa (capsulas).
4. Correlacionar los diferentes conceptos aprendidos en la teoría a cerca de la composición de membranas y
paredes celulares con lo observado en el Laboratorio virtual.

RESULTADOS
Para la observación de los microorganismos de manera óptima, es preciso lograr un balance entre el contraste
y la resolución. Los detalles de las células no pueden observarse al microscopio, aún con alta resolución; se
requiere el uso de colorantes a través de técnicas de tinción, que aporten contraste para la observación. (1)
Las tinciones se realizan a partir de un frotis, que son suspensiones de microorganismos extendidas en un
portaobjetos, se nombraron varios tipos de frotis: partir de cultivos líquidos, solidos, de una lámina, etc. Luego
se deja secar el frotis y este se debe fijar con el fin de que las células se adhieran al portaobjetos, para esta
práctica se estudió la fijación mediante calor. También se realizan diferentes tipos de tinciones que utilizan
colorantes los cuales pueden ser de carácter ácido o básico, dichas tinciones se basan en la afinidad que
presentan los colorantes por las estructuras bacterianas o del microorganismo a teñir.
Vimos cómo realizar la tinción negativa, donde el fondo se tiñe oscuro y se observan estructuras refringentes
como la cápsula de bacterias o levaduras, para esto primero hay que etiquetar la preparación, se emplea tinta
china o nigrosina sobre el frotis ya que este colorante tiene partículas demasiado grandes y no penetran la
célula, el frotis se puede realizar con dos laminillas, una donde está la muestra con tinta y otra con la cual se
apoya a 45 ° para arrastrar la preparación o también como la del vídeo que se puede extender con la ayuda de
un asa microbiológica, adicionalmente a esta tinción se le puede dar un contraste con Fushina, luego del fijado
con calor durante 1 min, esto con el fin de resaltar la presencia de la célula vegetativa.
También observamos tinciones compuestas (dos o más colorantes), que pueden emplear mordientes y
decolorantes, permitiendo reconocer diferentes tipos celulares, ver morfologías, tamaños, agrupaciones, etc.
Estas tinciones también permiten diferenciar el tipo de microorganismo por ejemplo, la tinción de Gram en la
cual primeramente se usa el cristal violeta que es un colorante básico (1% en Sln. De Oxalato de amonio al
0,85%) por aproximadamente un minuto en el frotis el cual debe estar secado y fijado anteriormente, se tiñe
todo lo que se tenga en la lámina de un color azul-violeta, luego sin lavar se adiciona el Lugol que actúa como
un mordiente (compuesto químico intensificador de color) aumentando la afinidad entre el colorante y la célula,
se lava la muestra, para posteriormente decolorar (30 seg) a la bacterias Gram negativas con alcohol-cetona,
puesto que no son capaces de retener el complejo cristal violeta-Yodo porque tienen una pared celular muy
delgada que es soluble en solventes orgánicos, en cambio las gram positivas sufren una deshidratación que
contrae sus poros y les permite retener el complejo, luego se lava nuevamente y, por último se utiliza un
colorante de contraste, safranina al 0.25% durante 1 min. Así la muestra está lista para lavar, secar y observar
al microscópico óptico.
 [A] [B]
Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium forman una estructura de supervivencia en condiciones
ambientales desfavorables, excepcionalmente mente resistente durante períodos largos de tiempo. Esta
estructura se denomina endospora pues se desarrolla dentro de la célula (1). Al ser células diferenciadas tan
resistentes se realiza una tinción especial, la tinción de Sheaffer Foulton utilizando verde de malaquita al 5%,
sobre el frotis previamente fijado, para permitir que penetre mejor el colorante se calienta hasta la emisión de
vapores (8 min), después se hace un lavado con agua, luego se usa Safranina al 0,5% como colorante de
contraste (2 min), por último se lava con agua y se deja secar antes de observar la preparación al microscópico.
Unas pocas especies, particularmente las del género Mycobacterium no se unen fácilmente a colorantes simples
y hay que teñirlas con un tratamiento más fuerte (1): La tinción de Ziehl Niehlsen se realiza agregando el
colorante Safranina o Fucsina sobre papel de filtro puesto sobre la muestra (frotis anteriormente fijado) y luego
se calienta el frotis por 2 métodos que pueden ser: directamente con el mechero (10min), o indirectamente sobre
una plancha de calentamiento (10 min, más recomendable), luego en la decoloración se agrega el alcohol-ácido
(Etanol-HCl) con lo cual se retira el colorante de las células no ácido alcohol resistentes y se lava
inmediatamente, en cambio las bacterias ácido alcohol resistentes quedan de color rosado-rojo; después se
aplica el colorante de contraste (azul de metileno de loeffler) que se deja actuar de 1 a 3 min y se lava,
posteriormente se deja secar y se observan al microscopio óptico. Si se sospecha de trabajar con
Mycobacterium tuberculosis y M. leprae, agentes patógenos responsables de la tuberculosis y la lepra,
respectivamente; se deben tener los cuidados de fijar la muestra en una parrilla de calentamiento para evitar
formación de aerosoles y colocar el frotis por 30 min en una campana con luz Ultra-violeta antes de teñirlo.
También vimos brevemente que el ácido tánico o la tinción de plata se emplean para teñir flagelos de bacterias.

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Para la preparación de cualquier frotis, es importante que se trate de una capa delgada porque de lo contrario
podemos tener falsos negativos o positivos al analizar las muestras una vez teñidas.
La tinción negativa con tinta china también puede servir para observar el hinchamiento de capsulas de otros
microorganismos como por ejemplo: El protozoario Blastocystis Homimiscmat (presente en materia fecal de
humanos), algunos hongos, levaduras como la Candida Abicans, que en la clase observamos además con el
contraste con la safranina, bien interesante porque se veía la cápsula más grande a la de los otros
microorganismos, por esto prácticamente toda la micrografía se veía fucsia con círculos blancos muy grandes
y pequeños puntos negros a su alrededor.
Al realizar la observación al microscopio óptico con distintas coloraciones de los cultivos bacterianos, estas
tienen un rol importante en la identificación de las bacterias y su ubicación taxonómica. Por ejemplo, según sea
el resultado de la tinción de Gram, las bacterias se pueden dividir en dos grandes grupos: las grampositivas y
las gramnegativas (2). También la tinción de Gram se puede ampliar y emplear en levaduras que se tiñen como
Grampositivas (violeta oscuro) porque retienen el complejo cristal violeta-Yodo gracias a su pared celular
gruesa, como se observó en la presentación donde la levadura se veía bastante grande de un color violeta
respecto a los Bacilos Gram negativos pequeñitos de color rosado. Observamos también que por medio de esta
tinción no se colorean las endosporas y se ven como círculos blancos.
Las endosporas no se tiñen bien con la mayoría de los colorantes, pero una
vez teñidas, resisten intensamente la decoloración. (1) Usando la tinción de
Sheaffer Foulton para resaltar su ubicación y localización podemos luego
usar esta información y hacer una clasificación de especie de los géneros
Bacillus y Clostridium. En este caso vimos unas micrografías dónde se
observa que Clostridium tetani tiene esporas terminales y Bacillus subtilis
endosporas centrales.
[C]

En la tinción de Ziehl Niehlsen el calentamiento es necesario para que la cera de la bacteria acido alcohol
resistente se reblandezca y permita el paso de la Fushina que posteriormente quedara unida a los ácidos
micólicos que poseen este tipo de bacterias en sus paredes celulares así estas quedan de un color entre fucsia
y rojizo, en cambio todo lo demás queda azulado gracias al colorante de contraste (azul de metileno).

[D]

CONCLUSIÓNES
Con las tinciones Compuestas podemos observar primeramente morfologías (cocos,bacilos), agrupaciones,
tamaños, colores, diferencias entre microorganismos e incluso estructuras de estos.
En las tinciones selectivas, los mordientes son necesarios para la tinción de ciertas estructuras especiales como
cápsulas, flagelos y esporas que tienen poca afinidad con ciertos tintes.
Para realizar tinciones de esporas (muy resistentes) y de bacterias acido-alcohol resistentes (contienen en su
pared celular ácidos micólicos y otros lípidos), se requiere el uso del calentamiento con el fin de que penetre
mejor el colorante.
Las tinciones diferenciales (que son las que clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus
propiedades de tinción) se valen del peptidoglicano de los microorganismos, de sus componentes y grosor de
la pared celular, adicionalmente muchas tinciones diferenciales, como la tinción de Gram se pueden usar para
diferenciar otro tipo de microorganismos no solamente las bacterias, siempre y cuando estos difieran en su
pared celular y tengan la capacidad de retener el complejo.
 PREGUNTAS SEGUNDA GUÍA
1. ¿Establezca las diferencias en cuanto a composición bioquímica de las paredes bacterianas de
Gram (+) y Gram (–)?
Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de mureina o peptidoglicano (de 20 a 80 nm de
espesor), cuyas mureínas a menudo están entrelazadas por puentes peptídicos. Sin embargo, estas
células contienen también una gran cantidad de ácidos teicoicos, polímeros de glicerol y ribitol unidos
por grupos fosfato. Aminoácidos como D-alanina o azúcares como glucosa están unidos a los grupos
glicerol y ribitol. Los ácidos teicoicos no están presentes en las bacterias Gram negativas, las cuales
tienen una capa de peptidoglicano (2 nm) más fina y una membrana externa que está situada por fuera
de la capa fina de peptidoglicano, formada de lipopolisacáridos, lipoproteínas y lípidos .Sus
lipopolisacáridos (LPS) son moléculas grandes y complejas que contienen tanto lípidos como hidratos de
carbono, y están formadas por tres partes: 1) lípido A, 2) polisacárido central o core, y 3) cadena lateral O.
(1)

[E]
Gram + Gram -
2. ¿Según el fundamento de la coloración de Gram, cómo podemos clasificar taxonómicamente a
las bacterias?
Nos permite dividir a las bacterias según la composición de su pared celular, se clasifican en dos grandes
grupos taxonómicos: Gram positivas y Gram negativas, según sea su comportamiento frente a la tinción.
Las bacterias Gram positivas se tiñen de color violeta intenso, mientras que las Gram negativas adquieren
un color rosa a rojo. (1)
3. ¿De qué depende que las bacterias Gram (+) tomen el cristal violeta y lo retengan en su
citoplasma comparado con las Gram (–)?
Las bacterias grampositivas tienen una pared muy gruesa formada
fundamentalmente por peptidoglicano. Durante la tinción de Gram, la
pared celular grampositiva es deshidratada por el alcohol, que hace
que los poros de las paredes se cierren e impide así que se escape el
complejo insoluble de cristal violeta y yodo. En las bacterias
gramnegativas, por el contrario, el alcohol penetra rápidamente a
través de la membrana externa rica en lípidos y extrae el complejo
cristal violeta-yodo de la célula. Después del tratamiento con alcohol,
las células gramnegativas son prácticamente invisibles a menos que
se vuelvan a teñir con un segundo colorante. (2)
[F]
4. ¿Cuál es la importancia de la utilización de cultivos jóvenes (12-24 horas) para la realización de
tinciones?
Aunque las bacterias Gramnegativas son constantes en su reacción, los microoranismos grampositivos
no, por lo cual podemos dar con falsos negativos, debido a que las bacterias viejas pueden perder capas
de peptidoglicano y así mismo la propiedad de retener el cristal violeta, en consecuencia puede pasar que
después estas se tiñan con la safranina apareciendo como gram negativas. (3)

5. ¿Qué implicaciones tiene fijar la muestra con calor antes de realizar la tinción y qué
precauciones se toman el respecto?
Con la fijación del frotis (seco) se pretende obtener la muerte de los
microorganismos, la adhesión a la lámina y la conservación de su morfología,
aunque no de las estructuras internas. Se obtiene una coagulación rápida de
las proteínas y disolución de lípidos, por tanto su estabilización. Esta técnica
no es recomendable cuando se trata de tejidos vegetales, puesto que produce
alteraciones importantes y muy desiguales en las paredes celulares. Se hace
pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar
la parte inferior del portaobjetos, no el lado donde este la muestra). Esto
impedirá el arrastre de los microorganismos por las soluciones de colorantes y
lavados durante la coloración. (4)
[G]
6. ¿Qué papel juega el Lugol en la tinción de Gram?
El Lugol, sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal
violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. (5)
7. ¿Qué papel juega la Fushina en la tinción de Gram?
La Safranina o Fucsina funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las
bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo, aporta un color rojo o rosado. (5)
8. ¿Cómo es la preparación óptima de un frotis y cómo influye en la tinción de la preparación?
En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas
en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La forma más común de preparar un frotis es extender una
pequeña cantidad de muestra sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, con un ansa en anillo,
previamente esterilizada a la llama del mechero y enfriada. Luego, se seca el extendido al aire aunque
puede acelerarse por calentamiento suave en la cercanía de la llama del mechero. Una vez seco, el
preparado debe fijarse; una forma sencilla y rápida consiste en fijar por calor, pasando el frotis
suavemente sobre la llama del mechero evitando un recalentamiento excesivo del vidrio. El frotis debe ser
delgado porque de lo contrario pueden ocurrir falsos negativos o falsos positivos, ya que las bacterias de
arriba se pueden teñir pero las de abajo no. (4)

[H]
 PREGUNTAS TERCERA GUÍA
1. ¿Cuál es la composición de la pared de bacterias ácido alcohol resistentes?
Las micobacterias producen ácidos micólicos de gran tamaño que distinguen sus paredes celulares del
resto de las bacterias. Sus paredes celulares son muy ricas en contenido lipídico (ocupa el 60 % respecto
a los demás componentes), como por ejemplo, el lipoarabinomanano (LAM) y contienen ceras con ácidos
micólicos de 60 a 90 átomos de carbono. Éstos son ácidos grasos complejos con un grupo hidroxilo en el
carbono P y una cadena alifática ligada al carbono
a. El LAM es análogo en sentido estructural y
funcional al lipopolisacárido de las bacterias
gramnegativas. (1) Y (6) [I]
2. ¿Cómo se explica el concepto de ácido-
alcohol resistente?
En las micobacterias, la presencia de ácidos
micólicos y de otros lípidos como el
lipoarabinomanano (LAM), un complejo lípido-
polisacárido que se extiende de la membrana
plasmática a la superficie, por fuera de la capa de
peptidoglicano podría considerarse como una capa
de cera que las hace más invulnerables, impenetrables e hidrofóbicas. Es decir, hace que las
micobacterias sean ácido-alcohol resistentes (la fucsina básica no puede ser eliminada de la célula por un
tratamiento con alcohol y ácido). La extracción del lípido de la membrana con etanol alcalino destruye la
ácido-alcohol resistencia. (1) Y (6)
3. ¿Cuál es la composición de la pared de las endosporas?
La endospora está a menudo rodeada por una capa delicada y delgada, denominada exosporio. La
cubierta de la endospora se encuentra debajo del exosporio, es responsable de la birrefringencia
característica en observaciones microscópicas, ya que
está compuesta por varias capas de proteínas
hidrófobas, pudiendo ser bastante gruesa. El córtex
(compuesto en gran parte por un único péptido glucano
que contiene tres subunidades repetitivas), puede
ocupar tanto como la mitad del volumen celular,
descansa debajo de la cubierta de la endospora. Está
constituida por un peptidoglicano modificado, con
menos enlaces que en las células vegetativas. La pared
celular de la endospora que posee ácidos específicos,
se encuentra dentro del córtex y rodea al protoplasto. El
protoplasto contiene las estructuras celulares normales
como ribosomas y un nucleoide, pero es
metabólicamente inerte. La célula que está esporulando
presenta una elevada cantidad de ión Ca++. (1)

[J]
4. ¿Qué papel juega el calor en la realización de tinciones de Sheaffer Foulton y Ziehl Niehlsen?
Con el método de Schaeffer-Fulton, la suspensión
de microorganismos se tiñe en caliente con el
colorante verde de malaquita, el calor modifica la
permeabilidad de la endospora y permite la entrada
del colorante a través de las capas externas de la
endospora. A continuación, el lavado con abundante
agua produce la decoloración de las formas
vegetativas así como de los extremos de las
bacterias esporuladas, que se tiñen por último con
un colorante de contraste, la safranina. [K]
Para bacterias ácido alcohol resistentes que contienen una gran cantidad de ceras asociadas a la mureina
de la pared celular, es necesario usar una alta concentración del colorante primario (fucsina de Ziehl o
carbol fucsina) y aplicar calor suave sobre la preparación, ya que el calentamiento derrite la cera y
aumenta la penetración y la retención del colorante. A continuación el extendido se trata con ácido-alcohol,
un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes. Los BAAR
retienen el color rojo porque las ceras vuelven a solidificarse al enfriarse y por lo tanto, no actúa el
decolorante. Las células que no son ácido-alcohol resistentes permanecerán incoloras hasta que se
coloree el extendido con azul de metileno, que actúa como colorante de contraste. (4)

[L]
5. ¿Qué estructuras tiñe la Fushina en microorganismos esporulados?
Las formas vegetativas así como de los extremos de las bacterias esporuladas, se tiñen por último con un
colorante de contraste, la safranina. (4)
6. ¿Cuál es el fundamento de las tinciones que se realizan para la identificación de estructuras
flagelares?
Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción en forma de hilo, tan delgados (10 a 30 nm de
diámetro, aproximadamente) que sólo se pueden observar directamente con el microscopio electrónico.
Para observarlos con el óptico, se aumenta su grosor cubriéndolos con mordientes, como ácido tánico y
alumbre de potasio, y tiñéndolos con pararosanilina (método de Leifson) o fucsina básica (método de
Gray). Los métodos de tinción de flagelos ofrecen una información taxonómica importante acerca de su
presencia y el modelo de su distribución. (1)
7. ¿Cuál es el fundamento del empleo de la Tinta China para observación de microorganismos
encapsulados?
Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden en una capa fina sobre un
portaobjetos. Después de secarlo al aire, las bacterias aparecen como cuerpos más claros en medio de un
fondo azul oscuro, porque la tinta y las partículas de colorante no pueden penetrar ni la célula bacteriana
ni su cápsula. La extensión de la región de luz está determinada por el tamaño de la cápsula y por la
propia célula. Apenas se produce modificación de la forma bacteriana y la célula se puede teñir
posteriormente para conseguir incluso una mejor visibilidad. (1)
 [M]
8. ¿Estructuras como esporas y cápsula son evidenciables en todos los microorganismos?
¿Porque?
La espora es una estructura de resistencia que presentan algunos géneros bacterianos y la capsula es
una estructura externa que envuelve a algunos microorganismos, como por ejemplo las bacterias
Klebsiella, Streptococcus pneumoniae y Clostridium perfringens. (7) Por lo tanto estas estructuras no son
evidenciables en todos los organismos ya que no son de vital importancia para todos.

REFERENCIAS
1. Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiología. 5Th Ed. McGraw-Hill
2. Michael T. Madigan, John M. Martinko, Kelly S. Bender, Daniel H. Buckley, David A. Stahl. Brock
Biología de los Microorganismos. 14Th Ed. Pearson
3. Maria J. Rodriguez. (2017). Laboratorio: Realizacion de Frotis y Coloracion de Gram. Recuperado de:
https://es.slideshare.net/MajoRodriguez29/laboratorio-realizacion-de-frotis-y-coloracion-de-gram

4. María M. Reynoso, Carina E. Magnoli, Germán G. Barros y Mirta S. Demo. (2015). Universidad
Nacional de Río Cuarto. Manual de microbiología general. Recuperado de:
https://www.unrc.edu.ar/unrc/comunicacion/editorial/repositorio/978-987-688-124-1.pdf

5. Luis Esaú López J., Melissa Hernández D., Claudia Adriana Colín C., Silvestre Ortega P., Guillermo
Cerón G., Rafael Franco C. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Recuperado de: https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

6. Kenneth J. Ryan, C.George Ray, Nafees Ahmad, W. Lawrence Drew, James J. Plorde. Microbiología
Médica. 5Th Ed. McGraw-Hill

7. Alberto Rojas Triviño. Universidad Nacional de Colombia. Sede Palmira. (2011). Conceptos y Práctica
de Microbiología General. Recuperado de: bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf

IMÁGENES
[A] Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiología. 7Th Ed. McGraw-Hill: (b) Results of a Gram stain.
The Gram-positive cells (purple) are Staphylococcus aureus; the Gram-negative cells (reddish-pink)
are Escherichia coli.
[B] Indira Soto. (2017). Diferencia entre Bacterias Gram Positivas y Gram Negativas. Recuperado de:
diferencias.info/diferencia-entre-bacterias-gram-positivas-y-negativas/
[C] Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiología. 7Th Ed. McGraw-Hill:
[D] Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiología. 7Th Ed. McGraw-Hill
[E] Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiología. 7Th Ed. McGraw-Hill
[F] Michael T. Madigan, John M. Martinko, Kelly S. Bender, Daniel H. Buckley, David A. Stahl. Brock Biología
de los Microorganismos. 14Th Ed. Pearson
[G] Michael T. Madigan, John M. Martinko, Kelly S. Bender, Daniel H. Buckley, David A. Stahl. Brock Biología
de los Microorganismos. 14Th Ed. Pearson
[H] Michael T. Madigan, John M. Martinko, Kelly S. Bender, Daniel H. Buckley, David A. Stahl. Brock Biología
de los Microorganismos. 14Th Ed. Pearson
[I] Kenneth J. Ryan, C.George Ray, Nafees Ahmad, W. Lawrence Drew, James J. Plorde. Microbiología
Médica. 5Th Ed. McGraw-Hill
[J] Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiología. 7Th Ed. McGraw-Hill
[K] Lizette Serrano. (2008). Tinción de endosporas paso a paso https://www.sutori.com/story/tincion-de-
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[L] María M. Reynoso, Carina E. Magnoli, Germán G. Barros y Mirta S. Demo. (2015). Universidad Nacional
de Río Cuarto. Manual de microbiología general.Imagen Visualización de Mycobacterium tuberculosis usando
la tinción de Ziehl-Neelsen. Recuperado de:
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[M] Luis Esaú López J., Melissa Hernández D., Claudia Adriana Colín C., Silvestre Ortega P., Guillermo Cerón
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