ESPECTROFOTOMETRIA

INTRODUCCION, LUZ, RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS.

La luz es de doble naturaleza, CORPUSCULAR Y ONDULATORIA. En base a su

carácter ondulatorio la luz se comporta como una onda y cumple las leyes
que rigen a los movimientos ondulatorios. Es reflejada, difractada,
transmitida, etc.

Está formada por un componente eléctrico y otro magnético, es decir, es

electromagnética. Estos componentes son vectores perpendiculares entre
sí.

Cualquier onda electromagnética (luz) se mueve en el vacío con una

velocidad (Co) de 300.000.000 metros por segundo aproximadamente, esta
depende del medio en que se mueve la radiación.

Cada radiación luminosa está caracterizada por una frecuencia (ν) que no
depende del medio en el cual se transmite; y/o una longitud de onda (λ)
que si depende de él.

Amp

Amp

λ Amp = Amplitud
λ = Longitud de onda

FIGURA 3

Estas dos variables están relacionadas por la ecuación:

 Frecuencia = Velocidad de la luz en el medio/ Longitud de onda en ese
mismo medio

v = c/ λ

La frecuencia se mide en 1/s = s-1 = Hertz = Hz.

La frecuencia sólo depende de la fuente o foco productor de las

radiaciones.
La velocidad de la luz en un determinado medio está relacionada con el
índice de refracción de ese medio (n)

Co
ni = índice de refracción =
Ci

λoν o = Co ; λiυi = Ci

λo
λi =
n

Donde i se refiere al medio y o al vacío.

Unidades de longitud de onda Equivalencias

Kilómetros (Km)
Metros (m)
Centímetros (cm)
Micras (µ) 1.0 µ= 0.0001cm
Milimicras(mµ) = nanómetros (nm) 1.0mµ= 0.001 µ = 10-9 m
Amstrongs (Å) 1.0 Å = 0.1 nm = 10-8 cm

Esta variada gama de unidades de longitudes de onda se ha escogido por

comodidad.
Co = 3.0 x 1010 cm/s

FOTONES

Con base en la naturaleza corpuscular de la luz, se considera ésta como

formada por pequeños “corpúsculos” energéticos que se mueven en el
espacio generando las ondas. Los corpúsculos de energía son paquetes
indivisibles, unitarios y característicos de cada frecuencia. La energía
unitaria de la radiación se define como la cantidad h.v y es conocida como
fotón. Cada radiación electromagnética individual tiene su unidad
energética que no puede ser igualada por adición o sustracción de otras
unidades energéticas.

La potencia de una radiación se define como el número de fotones que

chocan por unidad de área y por unidad de tiempo sobre un objeto o la
materia en general.

n.hv
P=
s.t
S= área transversal del rayo
t= Tiempo de exposición
n.hv= Número de fotones
P= potencia de la radiación

Al incidir un rayo luminoso de determinada frecuencia sobre un cuerpo se

pueden producir cambios en él, que sólo se producen por aplicación de la
energía. Ejemplos de cambios energéticos sufridos por la materia y
manifestaciones de estos cambios se anotan enseguida.

Cuando la superficie de ciertos materiales (Cesio, Rubidio) se ilumina con un

rayo de luz, se desprenden electrones de ella; como los electrones están
atraídos por el núcleo del átomo y para que se desprendan deben ser
liberados de esta fuerza de atracción, para ello se necesita hacer una fuerza
y para hacer una fuerza se necesita tener mucha energía. Muchas otras
comprobaciones de esta teoría son por ejemplo, la fotografía, la
fotodescomposición de vitaminas, etc.

La producción de corriente eléctrica a partir de la energía asociada a las

radiaciones luminosas (energía radiante) se basa en el fenómeno antes
descrito (fenómeno fotoeléctrico) y sirve para la medida de la potencia de
las radiaciones (VIS, U.V, NIR).

Un rayo de luz puede estar formado por una sola longitud de onda o por un
conjunto de ellas. El primero se denomina monocromático y el segundo
policromático.

Cuando un rayo de luz policromático incide sobre un elemento

monocromador el rayo se descompone en sus diferentes longitudes de
onda.

La luz blanca esta formada por un conjunto de radiaciones

monocromáticas, como lo ha podido observar usted cuando se forma el
arco iris en el cielo.
En estos casos los colores que usted ve son la respuesta de su cerebro a los
diferentes rangos de longitudes de onda que forman la luz blanca.

EL ESPECTRO ELECTROMAGENETICO

Se denomina espectro de rayo luminoso al conjunto de radiaciones

monocromáticas que forman ese rayo, cuando ya hayan sido separadas. El
espectro electromagnético está constituido por todas las longitudes de
onda descubiertas; y se ha dividido en varias regiones o rangos de
longitudes de onda, como se muestra en el cuadro Nº 1.

El espectro de un rayo luminoso puede obtenerse por medio de elementos

ópticos denominados monocromadores.

Como monocromador se usan rejillas y prismas de difracción. Algunos

instrumentos utilizan filtros, los cuales solo transmiten un color y de él una
longitud de onda mas intensamente. Estos filtros separan rangos más o
menos amplios de longitudes de onda, pero no monocroman la luz. Los filtros
son vidrios o plásticos coloreados.

Las rejillas son láminas de vidrio o plástico especial, a las cuales se les ha
hecho un gran número de rayas paralelas: por ejemplo 200 rayas por cada
milímetro. A mayor número de rayas/nm mayor separación de longitudes
de onda. (Mayor resolución).

SELECTORES O SEPARADORES DE RADIACIONES

Filtros, Prismas y Rejillas

Filtros de paso: Son láminas de vidrio o plástico, coloreadas según la región

en que se necesitan y separan las radiaciones en base a la absorción
selectiva de éstas.

∆λ = ancho de banda = λ2 - λ1
λf = Longitud de onda del filtro
λf
INTENSIDAD

Luz blanca Luz azul

∆λ

λ1 λ2
LONGITUD DE ONDA
 Filtro azul

(a) (b)

FIGURA 4

La región en que un accesorio de estos filtra las radiaciones, está indicada

por la longitud de onda de la radiación que transmite con mayor potencia.

La monocromaticidad de las relaciones filtradas esta determinada por el

ancho de banda de un filtro ∆λ, el cual se determina por la diferencia entre
las longitudes de onda a la mitad de la altura del pico Fig. 4b.

Filtros de interferencia: Están constituidos por dos placas semitransparentes

de metal, generalmente plata, que encierran una capa de dieléctrico (
CaF2 ò MgF2) de espesor determinado (t) y protegidos por láminas delgadas
de vidrio duro. Estos filtros producen un haz filtrado de un ancho de banda
bastante angosto, más monocromático que los otros filtros. (∆λ= 10-15nm).

Capa metálica semitransparente

2’
Luz
reflejada
2 Luz filtrada

1’
1 λ
θ
θ
t
Cos θ = t /λ

Dieléctrico

FIGURA 5
Con respecto a la figura 5b, un haz incide con un ángulo θ sobre una cara
del filtro en el punto 1, parte de la luz reflejada y otra atraviesa la capa de
dieléctrico reflejándose de nuevo hacia el punto 2.

En este punto ocurrirá una interferencia constructiva siempre y cuando m λ’

=2

Prismas de refracción: son poliedros generalmente con dos caras

triangulares (Fig 6), construidos en vidrio duro, cuarzo, fluorita, cloruro de
sodio, etc. Estos prismas separan las radiaciones que componen el haz
incidente, en una de sus caras rectangulares, en base al cambio en el índice
de refracción para cada longitud de onda.

El ángulo de desviación de un rayo es función del índice de refracción del

material del que esta hecho el prisma.

D = Angulo de desviación
α
n = sen (D + α /2)/ sen α/2 = λ0/λi
D n = índice de refracción
i

n.

PRISMA DE CORNU

FIGURA 6

Como puede ver, cada radiación con longitud de onda diferente será
desviada un ángulo distinto, puesto que a diferente longitud de onda es
diferente el índice de refracción del material del prisma.

λ1 + λ2 θ1
θ2

λ2
λ1
 FIGURA 7

DISPERSIÓN = δθ/δλ = (δθ/δn) x (δn/δλ)

δθ/δλ, depende de la forma y el ángulo de incidencia (i).

δn/δλ, depende del material en que esté hecho el prisma.

La dispersión es la separación entre dos longitudes de onda cercanas.

La dispersión de un prisma depende del material y la forma del prisma. A

mayor dispersión hay mejor separación entre dos longitudes de onda.

Rejillas de difracción: Son láminas de material óptico con un determinado

número de rayas, separadas una distancia d.
Estos elementos monocromadores permiten separar los rayos policromáticos
en base al fenómeno de interferencia.

1’
2’

1 θ

(a)

1
2’

B C
2
1’ θ i

A θ i D
 δ = AD
(b)

FIGURA 8

La trayectoria de los rayos que inciden sobre la rendija son 11’ y 22’ y la
diferencia en ellas esta dada por AB – CD (Fig. 8b).

Para que haya interferencia constructiva se debe cumplir que:

AB = d sen i
CD =-d sen θ
(
mλ = AB − CD )
AB − CD = dsen i –(-d sen θ)= dseni + dsen θ
m= orden de interferencia

Para un mismo θ existen varios λ, para m = 1,2, 3 etc, para espectros de

primero segundo y tercer orden respectivamente.

Si los rayos inciden perpendicularmente mλ = −dsenθ puesto que i = 0 y sen

0=0

La dispersión de una rejilla (para i = cte) se representa por

∂θ m
= m = orden de la difracción.
∂λ d cos θ

De esta última ecuación se puede observar que a menor d mayor será la

dispersión de la rejilla o lo que es lo mismo a mayor número de rayas por
unidad de área, mayor será la dispersión.
 REGIONES DEL ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

La energía asociada a una onda es E = h.v.

h = Constante de Plank = 6.62 x 10-34 J. s.
La energía asociada a las radiaciones que forman el rango visible está
comprendida entre 5.3 x 10-19 J/Fotón y 2.65 x 10-19 J/Fotón
(Un fotón es la cantidad h.v.).

Rango visible: El rango de radiaciones con longitudes de onda entre 400 y

700 nm conforma el denominado rango visible humano. Como se dijo
anteriormente, el ojo humano detecta las radiaciones (longitud de onda) y
el cerebro las registra como colores. Estas sensaciones de color son
producidas par las regiones de longitudes de onda del rango visible, como
se indica en el cuadro siguiente:

400- 440nm
440-470nm
470-565nm
565-595nm
595-625nm
625-700nm
Color, es una sensación, una respuesta del cerebro al estimulo eléctrico
producido por una radiación luminosa o un conjunto de ellas. El color es
subjetivo, depende de la persona, solo se ven las radiaciones del rango
visible que llega a nuestro ojo. La luz blanca es una mezcla de las longitudes
de onda indicadas en el cuadro anterior. Si un objeto se ilumina con luz
blanca y lo observamos coloreado es porque parte de los rangos que
producen el color han sido absorbidos y se esta transmitiendo o reflejando
el color que vemos.
Los objetos transparentes son aquellos que transmiten las radiaciones que
inciden sobre ellos, si algunas longitudes de onda se transmiten con mayor
potencia el objeto será transparente coloreado; por ejemplo una solución
de sangre.
Los objetos opacos son aquellos que se ven por la luz reflejada en ellos. Si se
reflejan todas las radiaciones de 400-700 nm se verán blancos y si solo se
reflejan unas de este rango, el objeto se vera coloreado.
Hay que considerar que se ha absorbido parcial o totalmente el otro u otros
colores y que el color que se ve es el que se transmite o refleja con mayor
intensidad. De aquí se deduce que para que un objeto sea coloreado, debe
absorber parte de las longitudes de onda del rango visible. Si la absorción
del rango visible fuera total, el objeto se vería oscuro (negro). Un objeto
transparente es aquel que transmite la luz blanca parcial (coloreada) o
totalmente (incoloro) ejemplo: sangre diluida y agua pura,
respectivamente. Se ha podido observar que al mezclar un colorante con
un determinado solvente la coloración de la solución formada por el
colorante y el solvente, se hace mas intensa a medida que se aumenta la
cantidad de colorante en la solución, esto podría conducir a una conclusión
errónea, como por ejemplo: que la solución se ve roja porque el colorante
absorbe el rojo. (Si el fuera de color rojo). Lo que en realidad esta
sucediendo es que al aumentar la concentración del colorante, el color
transmitido se va haciendo mas puro, es decir menos radiaciones blancas
están siendo transmitidas y entonces el color es menos "diluido".

Ésta propiedad que tienen las soluciones coloreadas de absorber una

determinada longitud de onda en mayor proporción, se utiliza para
determinar su concentración como se indicara mas adelante.

RANGO ULTRAVIOLET A (U.V.)

Este rango del espectro electromagnético, esta formado por todas las
radiaciones comprendidas entre las que tienen longitudes de onda desde
10 nm hasta 400 nm y se divide en dos zonas, la de vacío (10 nm 200 nm) y
la del cuarzo (100-400 nm), el rango U.V. de vacío se denomina así, ya que
los estudios con estas radiaciones deben hacerse en ausencia de aire,
puesto que el oxigeno, dióxido de carbono y agua absorben en esta región,
en el análisis poco se usan estas radiaciones U.V. de vacío.

El rango de 200 - 400 nm se denomina del cuarzo, puesto que este material
no absorbe estas longitudes de onda. En la práctica es el rango que se usa
para el análisis químico ultravioleta, cualitativo o cuantitativo.

Las radiaciones ultravioleta tienen poder bacteriostático y bactericida, el

primero para radiaciones ultravioleta larga, es decir hasta 300 nm y el
segundo para radiaciones ultravioleta cortas o sea menor de 300 nm.

En las lámparas U.V. corta generalmente se tienen longitud de onda de 257

nm y las marcadas U.V. larga tienen longitud de onda de 365 nm,
aproximadamente.

COLORIMETROS

Son instrumentos de comparación visual, en los cuales la intensidad del color

de una muestra se compara con la de un patrón por observación directa.

El Tubo de Nessler:
Es un cilindro de base plana con un aforo o marca a una determinada
distancia del fondo. Para un análisis, cada tubo se llena hasta la marca con
patrones de concentración diferente y se compara la intensidad del color
de cada tubo con el de otro en el cual se ha puesto la muestra. La
observación se hace desde arriba.

El Colorímetro de Duboscq

Consta de dos tubos, uno de profundidad variable. La altura de la columna

(l) de solución de referencia se llena hasta que coincidan las intensidades
de los colores en ambos tubos. Los cálculos se efectúan con la ecuación:

lx .Cx = lp . Cp
Donde el subíndice x se refiere al desconocido y p a la referencia, C es la
concentración.
 ABSORCION DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS U.V. Y
VIS.

Al incidir una radiación electromagnética, sobre una sustancia, la energía

asociada a esta radiación puede ser absorbida por la sustancia, parcial o
totalmente, siempre y cuando esta energía sea igual a la necesitada por la
sustancia para excitarse. Cuando esto ocurre se dice que la radiación, la
energía de ella, resuena con la sustancia.

La energía asociada a una radiación monocromática se determina por la

ecuación
Eν = hν

Donde Ev es la energía asociada a la radiación de frecuencia y h es la

constante de Planck (6.62 x 10-34 J.s.). La cantidad (hν) se denomina cuanto
y es la unidad energética de cada radiación.

El cuanto hν de cada radiación es mayor a mayor frecuencia. La energía

del cuanto se calcula a partir de la longitud de onda por:
hc
E=
λ

Al incidir una radiación sobre una sustancia el fotón puede ser absorbido y
producir una excitación en la molécula.
Las excitaciones que puede sufrir una molécula de una sustancia, son de
tres
tipos:
Electrónica 80-800 kJ. mol-1
Vibratoria 23 kJ . mol-1
Rotatoria 0.04 - 0.4 kJ. mol-1

En las excitaciones electrónicas intervienen los electrones de enlace,

principalmente; pasando los electrones de zonas energéticas bajas a zonas
energéticas mayores de la molécula. Las radiaciones que producen estas
excitaciones están comprendidas entre 150 nm a 1500 nm,
aproximadamente.
En las excitaciones vibracionales intervienen electrones, átomos y grupos de
átomos. Las radiaciones que producen estos fenómenos tienen longitudes
de onda cercanas a cinco micras (5000 nm).
Las rotaciones moleculares requieren radiaciones del fango infrarrojo lejano
y microondas (0,03 a 0,3 cm).

En el análisis químico clínico de rutina, los procesos de excitación que se

tienen en cuenta son del tipo electrónico principalmente.

Las excitaciones electrónicas ocurren al pasar electrones que ocupan

orbítales sigma o pi de una molécula a orbítales excitados de estos mismos
tipos. También ocurren con electrones n, electrones de la ultima orbita de
hetero.-átomos.
(0, S,,N, etc.).

Orbitales Sigma σ Sigma activado σ*

Orbitales pi Π pi activado Π*

EI paso de un electrón de un orbital a otro se denomina transición. Las

transiciones electrónicas permitidas se presentan en la siguiente figura:

Energía σ*

Π*

n
Π

FIGURA 10

Para que ocurra una transición se necesita absorber una cantidad de

energía igual a la diferencia de energía entre los estados normales y
excitados. Por ejemplo, para que ocurra una transición σ a σ* se necesita
absorber una energía igual a Eσ* -Eσ=Δ E=hv. Si sobre la sustancia incide una
radiación que lleve fotones con energía igual ∆ E entonces esta radiación
es absorbida:

Eν = Eσ * − Eσ = ∆E
 hc
Eν = h.ν =
λa
hc= Δ E ∴ λa =h.c / ∆E

Esta longitud de onda que lleva asociada la energía para que ocurra la
excitación se nombra como la longitud de onda que se absorbe más
intensamente.

absorción

Longitud de onda

FIGURA 11. Curva de absorción idealizada, para una sola molécula de un

compuesto, una sola transición.

absorción

Longitud de onda

Figura 12. Curva de absorción idealizada para una solución de un

compuesto ( muchas moléculas, una sola transición.

Para muchas moléculas la ∆ E no es la misma puesto que cada molécula

tiene diferente energía, algo mayor o algo menor que la E promedio, por
esto en la absorción de una solución de una sustancia, donde hay muchas
moléculas, se observa una gráfica ancha como la de la figura 12.

En una molécula pueden ocurrir diferentes excitaciones, dependiendo de

las radiaciones que se absorban. La representación grafica de las
absorciones de una sustancia a diferentes longitudes de onda se denomina
espectro de absorción o curva la espectral.

El grupo atómico responsable de la absorción de una molécula de una

sustancia se denomina cromóforo.

Máximos de absorción para algunos cromóforos

Tipo de cromóforo transición máximo de absorción(

nm)
aproximado

C–C σ −−−− σ∗ 150 - 160

C–H σ ------ σ∗ 150 - 160

- O: - n ------ σ* 180 - 185

C= C π −−−− π∗ 190 – 200

C = O: n ------- π* 295 - 300

El máximo de absorción de un cromóforo puede ser desplazado hacia

longitudes de ondas mayores por la sustitución de un H con un grupo de
átomos que se de nomina Auxocromo. (Efecto batocrómico).
Cuando en una sustancia existen cromóforos conjugados, el máximo de
absorción puede desplazarse tanto, que éste se encuentre en el rango
visible, lo que hace que la sustancia presente el color.

Una solución de una sustancia presenta color porque al incidir sobre ella la
luz blanca, algunas longitudes de onda son absorbidas mas intensamente
que otras y las menos absorbidas que se transmiten con mas potencia
producen la sensación de color al incidir sobre el ojo del sujeto que las
observa.
Las soluciones coloreadas absorben las radiaciones del color
complementario al de ellas; así, las soluciones que se ven rojas deben
absorber radiaciones del rango verde.
En el cuadro siguiente se da una lista de los colores de las soluciones y el de
las radiaciones que deben absorber.

Color de la solución Color absorbido λ, nm

Violeta Verde – amarillo 570 – 580

Azul Amarillo 570 - 600
Naranja Hasta 620
Naranja
 Verde Rojo 600 - 800
Violeta 380 - 450
Amarillo Azul 450 - 470
Naranja Azul – verdoso 460 - 480
rojo verde 490 - 590

Estos rangos de longitudes de onda son arbitrarios y es posible encontrar

valores diferentes, pero deben incluir los dados en la tabla anterior.

LEYES QUE RIGEN LA ABSORCION DE RADIACIONES

ELECTROMAGNETICAS

La absorción de luz por una solución depende de la potencia de la

radiación incidente (Po). A mayor Potencia incidente mayor será la Potencia
transmitida (pt).

P∞
t Po

La relación entre la potencia transmitida y la potencia incidente se

denomina transmitancia (T).

Pt P
T= ó %T = t x100
Po Po

La transmitancia se expresa con relación a 1 ó a 100. Se ha definido una

variable de mucha utilidad que se de nomina absorbancia (A).

Po
A = Logaritmo Observe que A no tiene unidades
Pt
A = − log T ;
100
multiplicando esta ecuación por
100

Pt 100 Pt 1
A = − log x = − log( x100)
Po 100 Po 100

%T 1
A = − log = − log %T − log = − log %T − log 10 −2
100 100

A = − log %T − (−2)
 A = 2 − log %T

Cuando un rayo luminoso monocromático incide sobre un medio, este es

absorbido siempre y cuando corresponda a su longitud de onda de máxima
absorción del medio .
La ley que rige esta absorción puede ser deducida matemáticamente por
el procedimiento que se muestra a continuación:

Po = Potencia del haz incidente

Pt = Potencia del haz transmitido
Pt S = Area transversal del haz luminoso
N = número de centros absorbentes
Po α= constante que depende del medio
K=α/S

b
dV = Sdb; V = S.b ; dP/P = - kdn = -α.dn/S
Integrando esta diferencial entre n=0 y P = Po
Y n = n y P = Pt se obtiene:
Ln Pt/Po = -αn/S
S -2,303Log Pt/Po = αn/S y reemplazando S por V/b y
ordenando se obtiene -2,303Log Pt/Po = αnb/V
De donde –log Pt/Po = αnb/V.2,303 = α bn/V.2,303
-Log Pt/Po = α b C/2,303 y como A = - Log Pt/Po
db Se llega a A = abC, donde a = α/2,303

Figura 13

De esta ecuación A = abC, se puede observar que la absorbancia de un

medio homogéneo, a longitud de onda de máxima absorción constante
(λm), es proporcional al paso de luz a través del medio (b) y a la
concentración de centros absorbentes de este (C).
 A = abC o A = ε bC
La constante ε; absortividad molar, también se nombra como extinción
molar.
El valor de la absortividad es dependiente de la naturaleza de la sustancia
y cambia con la longitud de onda.

C1

C2
A a a = b.C /A
C3

λm λ nm λm λ nm
(a) (b)
Figura 14. curvas espectrales a) para soluciones de una misma sustancia a
distintas concentraciones, b) la misma gráfica pero con la absortividad en la
ordenada.

En la figura 14a. se representa la absorbancia de soluciones de una

sustancia a tres diferentes concentraciones. Se puede observar que el
máximo de absorción es el mismo y que las curvas guardan "paralelidad".

En la fig. 14b.se han graficado los valores A/b.C. para las tres soluciones
obteniéndose una sola curva. En ella coinciden los valores para las tres
soluciones o sea que A/bc es el mismo para las diferentes concentraciones
a cada longitud de onda. Nótese que A/b.C es ε = a.
La colorimetría es, como su nombre lo indica, una medida de la intensidad
de color, pero se utiliza para la medida de la concentración de las
sustancias colorantes o coloreadas, en solución o demás.

La deducción de la ley de Beer Bouger Lambert se hace en una forma mas

sencilla, como se indica mas adelante.

En la solución se presenta la absorción, pero es un constituyente de la

solución el que absorbe la radiación, por ejemplo un ión, una molécula no
disociada, una sustancia compleja formada por el soluto y el solvente; esta
entidad que absorbe la llamaremos centro absorbente para simplificar !as
discusiones posteriores.

Supongamos que una solución absorbente de luz es situada en una celda

(recipiente que contiene la solución), y que se le hace incidir un rayo de luz
de la longitud de onda que mas absorbe λm

La solución tiene un determinado número de centros por unidad de

volumen, al aumentar el número de centros absorbentes mayor será la
absorbancia (A), ya que la absorbancia es proporcional al número de
centros.

A directamente proporcional al número de centros.

Si decimos que b es el trayecto atravesado por la luz en la solución podemos

observar que si aumentarnos b, mayor va a ser el número de centros
absorbentes que encuentra la luz en su paso por la solución y por lo tanto
mas va a ser la luz absorbida.

Número de centros es directamente proporcional a b

Número de centros es directamente proporcional a A.
Luego A es directamente proporcional a b.

También podemos aumentar el número de centros aumentando la

concentración, es decir el número de centros por unidad de volumen. O sea
que el número de centros absorbentes es directamente proporcional a la
concentración (C). Por lo anterior vemos que A es directamente
proporcional a C.

Finalmente A ∞ b, A ∞ C luego A ∞ b.C

La constante de proporcionalidad de esa última relación es a que se de

nomina absortividad, y es característica de cada sustancia y depende de
la longitud de onda. Convirtiendo esta última proporcionalidad en igualdad
obtenemos la ley de Beer:
A = a.b.C
Si b se expresa en cm y C en gramos por litro entonces:
A 1
a= = y se denomina Absortividad específica.
b.C cm.g / l
Si la concentración se expresa en moles por litro entonces:
litros
ε= = Absortividad molar
cm.mol

La ecuación A= a.b.C es la ley de Beer-Bouguer-Lambert y es la base de

todo análisis espectrofotomético.

La ecuación también se escribe como E = ε.l.C, donde E es la extinción.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN

1. Convertir en nm las siguientes longitudes de onda:

a. 500Ǻ
b. 0.6µ
c. 2.5 cm.

Para resolver este ejercicio se utilizan los factores de conversión:

a. 1nm =10-9m y 1Ǻ=10-10m así que:

10 −10 m 1nm
nm=500 Ǻ × x −9 = 50nm
1 10 m
b. 1µ=10 m
-6

10 −6 m 1nm
nm = 0,6µ × x −9 = 600nm
1µ 10 m
c. 1cm=10 m-2

10 −2 m 1nm
nm = 2,5cm × × −9 = 2.5 × 10 7 nm
cm 10 m

2. A qué rango pertenecen las radiaciones con longitud de onda 0,5µ,

2500Ǻ, 7000nm. Convertiremos cada una a nm.
 10 −2 m 1nm
a. nm = 0,5µ × × −9 = 500
1µ 10 m
500 nm está en el rango de 400-700 nm o sea en el rango visible.

10 −10 m 1nm
b. nm = 2.500 A × × −9 = 250nm
1A 10 m
Esta radiación tiene longitud de onda entre 200-400nm o sea está en
el rango U.V.

c. 7000nm está en el rango de longitud de onda mayor que las del

visible, se convierte esta longitud en micras.

10 −9 m 1µ
µ = 7000nm × × −9 = 7,0
1nm 10 m
7µ pertenece al rango de los rayos infrarrojos.
3. De qué color se ve al iluminarse con luz blanca:

a. Un objeto que transmite intensamente las radiaciones entre 640

– 660

Rta/ De color rojo, ya que las radiaciones que se transmiten que

están entre 625 -700nm producen la sensación roja al incidir
sobre el ojo humano.

b. Un objeto opaco que absorbe fuertemente las radiaciones con

longitudes de onda entre 450 y 460nm

Rta/ De color amarillo, ya que el azul, que son las radiaciones

entre 450 – 460nm es el color complementario del amarillo. Se
absorbe el color complementario del que se ve.

c. El filtro adecuado para leer la absorbancia máxima de una

solución roja

Rta/ Es verde, ya que la solución roja absorbe verde, por ser este
su complementario, y el filtro debe ser del color que se absorbe.

4. Una solución de Ni(NO3)2 de 10.000ppm en Ni presenta una transmitancia

del 20% en una celda de 1cm al leerse a 395 nm.

a. Qué absorbancia presentará esta misma solución en una celda de

2cm?
 Se puede resolver este ejercicio de dos formas:
• Aplicando la ley de Beer como tal:
A= a.b.c., para la celda de 1 cm y calculando a y luego aplicar esta
misma ecuación para la celda de 2 cm. Así:

Si T=20% A= 2-log T =2-log 20 = 0.70

A 0.70
= 7 × 10 −5 (cm. ppm )
−1
A = abc; a= =
bc 1cm.10.000 ppm

Ahora: A=abc para b= 2cm

A=7x10-5(cm.ppm)-1.2cmx10.000ppm=1.4 y la absorbancias será 1.4

• También se puede aplicar normalmente la ley de Beer que dice que

A es directamente proporcional a b a C constante y si b se duplica A
se puede duplicar así.
A1=2-log20= 0.70

Como b2=2cm y b1=1cm, entonces A2 debe ser 1.40.

A2=2A1

b. Cuál será el % T para esta solución en una celda de 0.5 cm a 395 nm?
La ley de Beer dice que a C constante A es directamente proporcional
a b, así que primero calculamos A2 y luego la convertimos en %T así:

A1=0,70 de la parte a para b1 = 1cm como b2= 0,5 cm

 A
A2 debe ser 0.35,  A2 = 1  y como A=2-logT%
 2
Y Log T=2-A=2-0,35=1,65

Entonces T=antilog 1.65=101,65 = 44,7

O sea que T=44,7%

5. Una solución de 50mg de una sustancia M en 200ml, presenta un

transmitancia de 40% en una celda de 2cm a 300m.

a. Encuentre la absortividad específica de M a esa longitud de onda.

 b. Determine la absortividad molar de M si su peso molecular es
250g/mol.

Solución:

a. Para calcular la Absortividad específica partimos de la definición

matemática de ésta que es:

A
ae = donde C debe estar en g/L
b.c

Así que encontramos:

1g 1
C en g/L= 50mg × 3 × = 0,25 g / L
10 mg 0,2 L
Por ae:

A 2 − log 40 0,40
ae = = = (cm.g / L )−1
b.c 2cm.0,25 g / L 0,5

ae=0.8(cm g/L)-1

b. Para determinar la absortividad molar aplicamos la misma ecuación

pero con la concentración molar.

Encontramos primero CM

0.001mmol 0.001mol
CM = =
ml L

2 − log 40 0,40 L
aM = =
2cm × 0,001mol / L 0.002mol / cm

aM = 200 L / cm − mol

PROBLEMAS PROPUESTOS

1. Convertir las siguientes longitudes de onda en nanómetros: 15 µ,

0.3cm, 300Ǻ, 0.4µ, 7.000 Ǻ

2. Calcular la frecuencia de las siguientes radiaciones 400nm, 0.2µ, 7000

Ǻ.
3. Determine la energía por mol de fotones para las radiaciones de
500nm y 3x1018 Hz.

4. Calcular el ángulo de desviación mínima que sufre la radiación de

250nm en un prisma de ángulo de 60º e índice de refracción de
1,6820 a esta longitud de onda.

5. Cuál debe ser el espesor de la capa de dieléctrico en un filtro de

interferencia para obtener en el segundo orden 60nm. Índice de
refracción del dieléctrico 1,5000.

6. Qué longitud de onda tiene la radiación para el tercer orden de

interferencia que sale del filtro del problema 5.

7. Una red de difracción tiene 250 rayas por milímetro, qué radiación es
dispersada 20º con respecto a la incidencia de la perpendicular.
a. En el primer orden.
b. En el tercer orden.

8. Calcule la energía aproximada en Julios para la transición n →π *

de una mol de electrones de cetona.

9. Un objeto refleja intensamente las radiaciones entre 510 y 520nm, de

qué color se ve al iluminarse con luz blanca.

10. Un vidrio transparente absorbe las radiaciones entre 500 y 520nm de

qué color se ve al iluminarse con luz blanca.

11. De qué color es:

a. La solución que transmite fuertemente 420nm.
b. El filtro para analizar la absorción de la solución anterior.
c. La radiación de tercer orden de un filtro de interferencia que en
un segundo orden transmite 0.9 micras.
d. La solución que absorbe fuertemente las radiaciones entre 4700
y 4800 Amstrong.

12. Cuál es la transmitancia, en porcentaje de una solución que transmite

las ¾ partes de la potencia luminosa que incide sobre ella. ¿Cuál es su
absorbancia?.

13. Una solución absorbe ¼ de la potencia de la radiación de 470nm.

Calcule la transmitancia y la absorbancia de esta solución.
14. convertir en absorbancia las siguientes transmitancias:
a. 0,42
b. 50%
c. 36,8%
d. 0,8
e. 10%

15. Convertir en transmitancias las siguientes absorbancias:

a. 0,434
b. 0.76
c. 2,00
d. 0,1
e. 0,40
f. 0,00

16. una solución de un colorante tiene transmitancia de 40% en una celda

de 1,0 cm, cuál será su transmitancia en una celda de 1,5cm y cuál su
absorbancia en otra de 2cm a la misma longitud de onda.

17. Una solución de 6000ppm de ión cobalto tiene una transmitancia de

38% a 510nm en una celda de un centímetro.
a. Cuál es su absorbancia en una celda de 2cm.
b. Para que en la celda de 2 cm la absorbancia sea la misma
original. ¿Cuál debe ser la concentración?
c. Cuál es la concentración para que en la celda de 2cm se
obtenga la misma transmitancia original.

18. Calcule la absortividad específica y molar de cobalto. (utilice los

datos del problema 17).

19. Una solución de 20mg% de un compuesto orgánico de peso

molecular 150g.mol-1, presenta una transmitancia de 12% en una
celda de 0,5cm calcular:
a. La absortividad específica.
b. La absortividad molecular
c. La concentración para que en una celda 1 cm la absorbancia
sea 0,434.

20. Una solución presenta una absorbancia de 0,520, qué dilución hay
que hacerle esta solución para que la absorbancia sea 0,130 en la
misma celda.
21. Qué dilución hay que hacerle a una solución que presenta una
transmitancia de 10% para que su transmitancia cambie a 79.4%
 INSTRUMENTOS

Como se anotó anteriormente, para hacer un análisis colorimetrito es

necesario medir la potencia de la radiación incidente y de la transmitida;
para ello se han ideado instrumentos que además de medir esas potencias
tienen incorporados sistemas de monocromación de la luz, estos
instrumentos se llaman fotómetros y/o espectrofotómetros y los mas sencillos
están constituidos como se muestra en el diagrama siguiente:

Figura 15. Esquema de un fotómetro de haz simple, se muestran las partes

básicas del equipo.

F Es la fuente productora de luz policromática (por ej .lámpara para el

visible, filamento
de tungsteno o wolframio).
L Es un lente el cual enfoca la luz sobre Mc
Mc es el sistema óptico que monocroma la luz, (rejilla de difracción o un
prisma, para espectrofotómetros; y filtros, para colorímetros).
Rns es una rendija la cual deja pasar un muy angosto fango de longitudes
de onda.
C es la cubeta o celda que contiene una muestra ó el sitio donde se debe
colocar esta.
D el detector, que puede ser una celda fotoeléctrica o un fototubo.
R es el registrador

FUENTES DE EXCITACION O LAMPARAS

Su función es emitir el rayo de luz policromática que después o antes de

pasar por el monocromador va a hacerse incidir en la muestra.
Las lámparas emiten rangos de longitudes de onda dependiendo de la
naturaleza del filamento en las lámparas incandescentes, y del gas en las
lámparas de descarga.

La potencia de las radiaciones producidas por la fuente depende de la

temperatura y esta del voltaje a que se sometan las lámparas.

Una buena fuente de excitación debe ser: Potente, estable y producir un

haz continuo en el rango de longitudes de onda en el cual se utiliza.

En el cuadro siguiente se indican algunos tipos de fuentes de excitación y

sus rangos de utilización.

Fuente Tipo Rango Características

Tungsteno I 325 – 1500nm Continua
Wolframio
Hidrógeno D 150-390nm Continua
Deuterio
Mercurio D Discontinua
I = Incandescente D= Descarga

La lámpara de Mercurio puede ser de baja o alta presión y algunas

contienen Cd para producir una radiación de 643,8 en adición a las del
mercurio.

Una fuente de mercurio produce rayos potentes a las siguientes longitudes

de onda

579nm Amarilla - verdosa

546.1nm Verde
435,8nm Aul
404,7 nm Violeta
365 nm U.V. Larga
253 nm U.V. Corta

Las lámparas de tungsteno proporcionan haces de luz potentes en el rango

visible y sus radiaciones mas intensas están comprendidas entre 470 y 525
nm. Estas lámparas trabajan a potenciales de 6V y 12 V de corriente
continua.

MONOCROMADORES: Esta unidad permite que, en un espectrofotómetro, los

rayos policromáticos puedan ser separados en rayos monocromáticos.
Los monocromadores están constituidos principalmente por: lentes, espejos,
rejillas de difracción y/o prismas y rendijas; algunos tienen filtros para eliminar
los espectros de órdenes diferentes al que se este utilizando, cuando se usan
rejillas de difracción.

L Filtr
Rn Rn
Rd

R L

Espej

Figura 16. a) diagrama de un mon0ocramador de red de difracción(Rd).

b)diagrama de un monocromador de prisma (P).

La separación que se pueda obtener de dos longitudes de onda, está

relacionada con el poder de resolución del monocromador y se expresa
como:
 λ
R=
∆λ

Donde ∆λ es la diferencia entre las dos longitudes de onda y λ es la longitud

de onda media entre las dos.

El poder de resolución (R) de un monocromador no sólo esta determinado

por la dispersión del elemento monocromador, sino también par las
características de las rendijas, principalmente la de la salida.

Una rendija como su nombre lo indica, es un pequeño espacio entre dos

objetos.
Las rendijas pueden ser fijas o variables. Las rendijas fijas permiten el paso de
un ancho de banda constante, sólo se usan con monocromadores que usan
rejillas de difracción. Las rendijas variables, cambian su anchura, permiten el
paso de rayos luminosos de ancho de banda variable; en un
monocromador de prisma es necesario el uso de rendijas variables ya que
la dispersión es diferente para las distintas longitudes de ondas de un rango.

Para obtener una mejor resolución se construyen las rendijas como quijadas
adelgazadas, así se pueden ajustar las aberturas con bastante precisión.
Hay un óptimo de apertura de una rendija y será aquella que permita el
paso de un rayo intenso y de ancho de banda angosto. En todo caso la
resolución de un monocromador estará limitada por el elemento dispersor.

δn
Para un prisma R = t
δλ

δn
En donde t es el espesor de la base del prisma y es la variación del
δλ
índice de refracción con la longitud de onda.

Para una rejilla R = m. N.

Donde m es el orden de interferencia u orden espectral y N es el número de

líneas o rayas de la rejilla. (para complementar ver: Strobel H;
Instrumentación Química, capitulo V, Edil Limusa Wiley, México 1968).

COMPARTIMIENTO DE MUESTRAS
Es el lugar donde se coloca la celda, recipiente que contiene la muestra.
Las celdas se construyen en material transparente a las radiaciones que
pasan por la muestra.

En el ultravioleta se utilizan celdas de cuarzo; en el visible, celdas de vidrio,

cuarzo o plástico incoloro; en el infrarrojo se usan celdas de cloruro de sodio
y otro haluro alcalino.

La forma de las celdas es muy variada, pueden ser cilíndricas, hexagonales

o rectangulares, siendo estas últimas las más utilizadas. Las celdas deben
estar construidas de tal manera que sus caras opuestas sean perfectamente
paralelas, esto con el fin de que el haz de luz incida perpendicularmente a
la muestra y no pierda potencia radiante por reflexión.

Los instrumentos modernos traen celdas de flujo, es decir celdas a las cuales
esta acoplada una unidad de succión que aspira la muestra desde un
recipiente cualquiera.

Las celdas también pueden ser termostatadas, o sea que se pueden

mantener a una determinada temperatura.
 Figura 17. diagrama de distinto tipos de celdas.

DETECTORES

Detector o receptor es el dispositivo que recibe la radiación y produce una

señal.
Para que una radiación sea detectada se necesita que sea absorbida por
el material fotosensible del detector.

Un buen detector debe tener las siguientes características, como mínimo:

1. Ser sensible
2. Producir una respuesta lineal.
3. Tener tiempo de respuesta corta (ser rápido)
4. Ser estable.

En cuanto a la linearidad, la respuesta (G) del detector debe ser

directamente proporcional a la potencia de la radiación que incide sobre
el:
P α G ó P= kG

donde k es una constante que depende del tipo de detector.

Del detector depende, en alta proporción, la sensibilidad del instrumento.

Los detectores para el rango visible y ultravioleta se basan en el fenómeno
fotoeléctrico. Se usan fototubos, celdas fotovoltaícas y celdas
fotoconductoras.

Detector Material Sensible Rango de Utilización

Fototubo Oxido de metal 200 – 1000 nm –U.V, VIS, NIR

Alcalino
Celda fotovoltaica Semiconductor 400 -800 nm VIS
Sobre metal
Celda fotoconductora PbS, PbSe 700 -3300nm. VIS –NIR
Principalmente
Termo par Unión de metales diferentes 0,8 -40µ I.R.

Foto Multiplicador

La sensibilidad de un foto tubo puede ser incrementada multiplicando

electrónicamente la señal original. Los electrones producidos en la placa
fotosensible son atraídos hacia otra placa de la cual salen mayor numero
de electrones y estos son luego enviados a otra placa donde se vuelve a
repetir el fenómeno y así sucesivamente. Este tipo de detector se denomina
fotomultiplicador y se usa en el rango ultravioleta, visible y cercano infrarrojo.

Figura 18. Diagrama de un foto tubo y un Fotomultiplicador, se muestran la

luz incidente y el flujo de electrones producidos por el fenómeno
fotoeléctrico
 REGISTRADORES

La corriente eléctrica u otro tipo de señal que sale del detector es

amplificada y convertida en otra señal más fácilmente observable, como
desviación de una aguja en una escala (análoga) o la presentación de
números en una pantalla (digital).

Los registradores de desviación son galvanómetros, voltímetros,

amperímetros, etc., no son complicados y tienen respuesta rápida. El
registrador de este tipo se denomina medidor o "meter". En los instrumentos
modernos la señal es presentada digitalmente. Esta señal es procesada para
presentarla en diferentes formas, como transmitancia, absorbancia en varios
fangos (0-1, 0-2, 1-2) y concentración. Algunos instrumentos traen impresores
los cuales escriben los resultados del análisis y permiten diferenciar o
catalogar cada muestra. En esta época de los computadores los
espectrofotómetros no podrían ser dejados aparte, así que los modelos mas
evolucionados de estos equipos traen incorporados micro-computadores
que almacenan los parámetros de las técnicas, corrigen errores de
operación o no permiten errores en el manejo, etc.

Los espectrofotómetros de doble haz vienen con registradores gráficos que

permiten obtener el espectro de absorción automáticamente.

FOTOCOLORIMETROS

Están provistos de detectores eléctricos (fotoceldas) y filtros que seleccionan

haces de luz de un determinado color. Las fotoceldas generalmente
producen corrientes altas que mueven al registrador (galvanómetro)
directamente a través de una resistencia. Pueden tener sistemas de
detección y registro mas complicados, sobre todo los fotocolorímetros
modernos.
 ESPECTROFOTOMETROS

Tienen sistemas ópticos mas sofisticados y de mayor resolución que la de un

filtro, sus sistemas de detección y registro son más evolucionados y presentan
mejor sensibilidad.

Se diferencian de los colorímetros en que el espectrofotómetro tiene

monocromador (rejilla o prisma) y el fotocolorímetro tiene solo filtros. Los
espectrofotómetros son de un solo haz o de doble haz.

Los espectrofotómetros de doble haz pueden ser estáticos que no tienen

sistema automático para cambio de la longitud de onda o dinámicos que
si lo tienen. Con estos últimos se obtienen los espectros de absorción.

FUNCIONAMIENTO: La mayoría de los fotómetros funcionan así: al encender

el instrumento, se prende la lámpara F. la cual produce la luz que es
enfocada por el lente L sobre el elemento monocromador Mc aquí la luz es
descompuesta en sus diferentes longitudes de onda; de ella solo una o un
angosto rango coincide con la rendija, (para variar la longitud de onda que
debe coincidir con la rendija se acciona la palanca (S) y pasa por el
compartimiento de muestra antes de llegar al detector D, donde en
proporción a la intensidad de la radiación se desprenden electrones que
generan una pequeña corriente eléctrica que llega al registrador, aquí la
corriente eléctrica, produce el desplazamiento de una aguja sobre una
escala graduada.
El desplazamiento producido es proporcional a la intensidad de la corriente
que llega. Generalmente, la intensidad incidente de la radiación se lee
primero para la celda y el solvente: y el valor obtenido se lleva a 100 por
media de un potenciómetro, así todas las otras lecturas estarán
relacionadas a la inicial de 100, o sea que la transmitida se puede leer en %.
 ESPECTROFOTOMETRIA

PROCEDIMIENTO SEGUIDO PARA LA ESTANDARIZACION

DE UN METODO ESPECTROFOTOMETRICO
Anteriormente se dijo que cualquier solución coloreada presenta una
absorción en el rango visible, pero ello no indica que cumpla con la ley de
Beer.

Para poder determinar si la solución cumple con esta ley, lo primero que se
debe hacer es averiguar la longitud de onda de máxima absorción. Para
esto se lee la transmitancia o la absorbancia que presenta la solución a
diferentes longitudes de onda. Esto se hace a concentración constante. La
longitud de onda a la cual se presenta la máxima absorbancia o la mínima
transmitancia, se puede determinar por observación de los datos o por una
curva de A vs λ (longitud de onda), la cual se denomina curva espectral.

Esta curva también puede ser construida con T, como se muestra en la figura
siguiente:

A T

λm

Habiendo conseguido esta longitud de máxima absorción, se determina la

absorbancia que presentan la soluciones de diferentes concentraciones a
esta longitud de onda y se hace una grafica de A vs. Concentración.

Si la grafica resulta una línea recta, se dice que el sistema (la solución)
cumple la ley de Beer-Bouguer-Lambert, en ese rango de concentraciones.

Teniendo esta curva, a cualquier solución de esta sustancia Ie puede ser

determinada su concentración par interpolación.
 Curva de Calibración

A
Ax

Cx
Concentración

Como se puede ver en la figura anterior, la pendiente (m) de la recta es:

A2 − A1
m=
C 2 − C1

Y la ecuación de la línea será: A = m.C

Para cualquier solución de absorbancia conocida (Ax), de la misma

sustancia en el mismo solvente, se Ie puede determinar su concentración a
partir de la ecuación:

1
C= , A ; Cx = f.Ax (método del factor)
m
1
En donde f = es el factor de conversión de absorbancia a
m
concentración para la solución estudiada.
Otro método usado para calcular la concentración de una muestra se basa
en esta relación lineal. Se utilizan una o dos soluciones patrones y se aplica
la relación:

Ax
Cx = Cp.
Ap

Lo anterior puede ser deducido a partir de la ley de Beer - Bougner - Lambert

así

Ax = abC x A p = abC p
Ap abC
p
= abC
Eliminando ab se obtiene
Ax x
Ap C x
=
Ax C p

Cp
C x = Ax
Ap

O si las celdas son diferentes para la muestra y el patrón:

Ax
Cx = .Cp.bp / bx
Ap

DETERMINACION DEL RANGO ÓPTIMO DE CONCENTRACION

Un sistema cumple la ley de B.B.L. sólo en un determinado rango de

concentraciones. Este rango se puede calcular o determinar, haciendo una
curva de T vs log C, que se denomina la curva de Ringbom.
 Curva de Ringbom

m = T2-T1 / log C2-logC1

%T
2

Cmin Cmax
Logaritmo de Concentración

Esta curva tiene una parte recta la cual esta delimitada por las Cmin y Cmáx
del rango óptimo. Además se puede calcular el porcentaje de error relativo
∆C
el método ( % ) utilizando la ecuación:
C
∆C 230,3Ei
% =
C m

Donde Ei = error instrumental, se obtiene de las especificaciones del equipo.

m = valor absoluto de la pendiente de la parte recta de la curva de
Ringbom; m= %T2 - %T1 / logC2 - logC1

SISTEMAS COLORIMETRICOS
La determinación de la concentración de una sustancia par colorimetría
(espectrofotometría visible), hace necesario que esta sustancia sea
coloreada o pueda ser convertida en una nueva sustancia coloreada, cuya
concentración es proporcional a la de la sustancia incolora.

Sistema + Reactivo Compuesto coloreado

Este proceso se denomina revelado.

Otras veces, el efecto puede ser el de disminuir el color de un reactivo

coloreado y esta disminución es proporcional a la concentración de la
sustancia a determinar.

Reactivo
Reactivo Producto menos
Sustancia
Coloreado incoloro coloreado
incolora
(Exceso)

Los métodos colorimétricos se fundamentan en las propiedades físicas y/o

químicas de las sustancias y no dependen del espectrofotómetro utilizado
en el análisis .

ERROR FOTOMETRICO

Un sistema cumple la ley de Beer solo en un determinado Rango de

concentraciones, ya que el instrumento esta limitado para detectar la
potencia transmitida par una solución.

El instrumento produce un error que se denomina fotométrico (Ei), que incide

en el error relativo de concentraciones que se comete al analizar una
muestra desconocida. El error fotométrico no es igual para todas las lecturas
que da el instrumento sino que es función de estas, como se puede observar
en la siguiente gráfica.

Para la mayoría de los instrumentos comerciales el error fotométrico se

puede considerar constante en el rango de valores de transmitancia de 12%
a 85% con instrumentos de muy "alta calidad" se puede obtener un rango
de 10 a 90%.
El valor teórico de transmitancia que produce el menor error relativo es de
36.8%, teóricamente.

Para muchas técnicas de análisis espectrofotométrico, las concentraciones

limites del Rango Optimo de concentración, para su mejor utilización
producen lecturas muy cercanas a los limites del rango de lecturas de error
fotométrico constante.

AJUSTE DE CURVAS DE CALIBRACION

Los datos de absorbancia que se obtienen de los patrones que se preparan

para una curva de calibración, llevan asociados errores del analista los
cuales hacen que estos datos no produzcan una línea recta, con el fin de
ajustar estos datos a una línea recta se ha ideado el siguiente
procedimiento:
Los datos de absorbancia obtenidos para los respectivos patrones se
multiplican por la concentración de estos (AxC); la concentración de cada
patrón se eleva al cuadrado (C2), se obtienen las sumatorias y se dividen
ΣA.C por ΣC2 para obtener un factor de corrección (W) el cual luego se
multiplica por cada concentración para obtener la absorbancia corregida.
(A *), así:

Ci Ai Ai.Ci Ci2 Ai* = w.Ci

W = Σ Ai.Ci / Σ C2

Se deben tener en cuenta los valores limites del rango óptimo, para eliminar
datos muy dispersos.
Este factor W se usa para calcular la concentración de una muestra a partir
de su absorbancia.

1
C= .Ax
W
C x = fAx

1
Donde f =
W

Con este factor se pueden elaborar tablas de absorbancia concentración,

que facilitan la determinación de la concentración de una muestra, por
localización de la absorbancia de la muestra en la tabla y la lectura de la
concentración correspondiente.
 EJERCICIOS DE APLICACIÓN

1. Una solución de una sal de cobalto presenta una transmitancia de

45% en una celda de un cm a 505 nm. ¿Cuál es su concentración en
mg/L Co2+ si a esta longitud de onda la absortividad molar del ión Co2+
es 4.50.

DESARROLLO

Para determinar la concentración de la solución aplicamos la ley de

Beer. A = a.b C; encontramos primero la concentración molar y luego la
convertimos en mg/L

A = 2 -log T = 2 -log 45 = 0,346; a = 4,5 (cm M)-l por ser molar

A 0.346
C= = −1
= 7.7 × 10 −2 M
ba 1cm 4,5cmM

Para convertir esta concentración en mg/ L utilizamos el peso del Co

que es 58,9 g/mol

mol 58,9 g 103 mg

mg / L = 7.7 × 10 −2 × × = 4535, mg / L
L 1mol 1g

R/. Concentración de Co en mg/L es 4535,3

2. Una solución coloreada se diluye 1:4 con agua y se lee la transmitancia al

lambda máxima del colorante en una celda de 1 cm., obteniéndose un
valor de 30%. Una solución patrón del colorante de 200 mg/L presenta una
transmitancia de 25% a la misma longitud de onda y en la misma celda.
Determine la concentración del colorante en la solución original.

DESARROLLO
Para poder determinar la concentración de la solución problema partimos
de los datos del patrón y la solución diluida del colorante.
 M ___1 : 4____ M diluida

Patrón

Aplicamos la ecuación del patrón para celdas iguales:

Ax
Cx = Cp
Ap
Ax=2- log 30=0.523;Ap=2-log25=0.60

0.523
C x = 200mg / L × = 174.2mg / L
0.60

Esta concentración Cx es la del colorante en la solución diluida 1:4 o 1/5 así

que la solución original que es la concentrada será:

Cd = fdCc

Cd 174.2mg / L
Cc = = = 871mg / L
fd 1/ 5

R/. La concentración en la solución original es 871 mg/L

EJEMPLO:

De un suero se mezclan 0.1 ml con 2.5 del reactivo Biuret para proteinas y se
lee al
lambda 7máxima una absorbancia de 0.545 en una celda de un cm. Un
patrón de
proteínas de 7.5 g/ dl se diluye 1:2 y se lee en igual forma que el suero
obteniéndose una absorbancia de 0.486. Calcule los g/ dl de proteínas en
el suero.

DESARROLLO:
Tenemos un suero muestra y un patrón que se ha diluido, para resolver el
problema aplicamos la ecuación del patrón, hallando antes la
concentración del patrón diluido.

Ax
Cs = C pd ×
Ap
C pd = fd × C pc
C pd = 7.5 g / dl × 1 / 3 = 2.5 g / dl
0.545
Cs = 2.g / dl × = 2.8 g / dl
0.486
Cs = 2,8 g / dl

La concentración de proteínas en el suero es de 2.8 g/ dl

EJEMPLO:

Se prepara un stock de 70 mg/ dl de una sustancia M y se le determina la

curva de absorción a una dilución de ella, obteniéndose los datos que se
muestran en la tabla -1.
Se prepara una serie de patrones y se lee su transmitancia al lamda de
máxima
absorción, encontrándose los datos que se indican en la tabla -2, para cada
dilución.

A partir de estos datos:

a. Elabore la curva espectral de M y determine su lambda de máxima

absorción.
b. Compruebe el cumplimiento de la ley de Beer.
c. Determine el rango óptimo de concentraciones donde puede ser
utilizada esta técnica de análisis y su error analítico si Ei es 0.15.
d. Encuentre la absortividad específica de M si la celda usada fue de 1
cm.
e. Encuentre el valor del factor para convertir A en C en mg/ dl para una
solución de M leída directamente en el fotómetro por esta técnica.
f. Determine la concentración de una solución de M, si una dilución 1:4
de ella presenta una transmitancia de 37%.
 Λ (nm) A
400 0.00
420 0.01
440 0.02
450 0.08
455 0.20
460 0.45
465 0.50
470 0.48
475 0.20
480 0.05
500 0.01
540 0.01
Tabla 1

Dilución T% A
1/400 89.1 0.05
1/200 83.2 0.08
1/100 72.4 0.14
3/200 61.6 0.21
1/50 52.5 0.28
1/40 44.6 0.35
3/100 38.1 0.43
1/25 26.9 0.57
1/20 20.0 0.70
3/50 14.8 0.86
7/100 10.0 1.00
2/25 9.1 1.04
1/10 6.0 1.22
Tabla 2

Desarrollo

a. Para determinar la longitud de onda de máxima absorción, podemos

observar los datos y aquella longitud de onda a la que se presente la
mayor A, se escogerá como tal. De la curva espectral A vs λ, se
determina la longitud de onda del pico resultante, proyectando ésta
al eje de λ.
 Gráfica 1. Curva espectral para la sustancia M. Longitud de
onda de máxima absorción 465 nm.

0.8

Δλ
A 0.6
B
S
O
R
B 0.4
A
N
C
I 0.2
A
λ
42 440 46 48 50
0 0 0 0
LONGITUD DE ONDA λ, (nm)

Con los datos de la tabla 1 se elabora una gráfica A vs λ, la cual se puede

ver en la gráfica 1, de esta se obtiene un lambda de máxima absorción de
465 nm. Para esta técnica se podrían utilizar longitudes de onda de 460-470
como λ m, como se puede deducir la anchura del pico, en la curva
espectral.

b. Para comprobar el cumplimiento de la ley de Beer es necesario hacer

la gráfica A vs C y si ésta resulta una línea recta se concluye que el
sistema cumple dicha ley.
Para graficar A vs C, determinamos primero la concentración de cada
una de las diluciones indicadas en la tabla 2. Para esto usamos:

Cd = f .Cc

Así, para determinar C1 usamos el factor de dilución 1/400 y la

concentración del stock 70mg/dl
 1
C1 = × 70mg / dl = 0.35mg / dl
400

Para C2 usamos la misma ecuación, con los datos correspondientes

1
C2 = × 70mg / dl = 0.35mg / dl
200

Y así para todos los demás; obteniéndose la tabla 3.

C mg/dl A
0.175 0.05
0.35 0.08
0.70 0.14
1.05 0.28
1.75 0.35
2.10 0.43
2.80 0.57
3.50 0.70
4.20 0.86
4.90 1.00
5.60 1.04
7.0 1.22
Tabla 3
 Gráfica 2. Curva de calibración para la
A
1.2 suntancia M.
A
B 1.0
S
O
0.8
R
B
A 0.6 (0.57,2.8)
N
2.8)
C 0.4
I (0.35,
A 1.75)
0.2

1 2 3 4 5 6 7
CONCENTRACIÓN
(mg/dl)

Como se puede ver en la gráfica 2. A vs C es una línea recta, por lo tanto

cumple la ley de Beer.

c. el rango óptimo se encuentra a partir de la curva de Ringbom, este

está dado por las concentraciones que limitan la parte recta de dicha
curva.

Para elaborar la curva de Ringbom se grafica T vs log C, y para ello es

necesario encontrar los logaritmos de las concentraciones indicadas
en la tabla 3 y obtener la tabla 4.

Log C T%
-0.757 89.1
-0.456 83.2
-0.155 72.4
0.021 61.6
0.146 52.5
0.243 44.6
0.322 38.1
0.477 26.9
0.544 20.0
0.623 13.8
0.690 10.0
 0.748 9.1
0.845 6.0
Tabla 4

Log C T%

-0.757 89.1
Gráfica 3. Curva de Ringbom
-0.456 83.2
% T 120
-0.155 72.4

0.021 61.6

0.146 52.5
100
0.243 44.6

0.322 38.1

80 0.477 26.9

0.544 20.0

0.623 13.8
60 (50, 0.15) 0.690 10.0

0.748 9.1

0.845 6.0
40
(35, 0.35)

20

-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

LogC
C

El rango óptimo corresponde a las concentraciones cuyos logaritmos son 0.0

y 0.65 que son los puntos que limitan la parte recta de esta curva de
Ringbom. Estas concentraciones se hallan obteniéndose el antilogaritmo de
0.0 y 0.65 que son respectivamente 1.0 y 4.47.

El rango óptimo para esta técnica es de 1.0mg/dl a 4.47 mg/dl.

Para encontrar el error analítico de la técnica determinaremos la pendiente

(m) de la parte recta de la curva de Ringbom. Usamos los puntos (50, 0.15)
y (35, 0.35).

35 − 50 − 15
m= = = −75
0.35 − 0.15 0.2
 230,3Ei
y luego aplicamos %error =
m

230,3 × 0.15
%error = = 0.46
75

Así que el rango óptimo de esta técnica es 1.0 a 4.47 mg/dl y su error
analítico es de 0.46%.

d. La Absortividad específica es la absorbancia que presentaría una

solución de 1g/L en una celda de un cm. De la gráfica 2 podemos
hallar la pendiente K que sería igual a ab ya que esta línea cumple la
ecuación A=KC y como la ley de Beer es A=abC entonces K=ab.

A2 − A1 0.57 − 0.35 0.22

K= = = = 0.209(mg / dl ) −1
C2 − C1 2.8 − 1,75 1.05

K = ab → a = K / b = 0,209dl /(cm.mg )

L
Debemos pasar a las unidades correspondientes
cm.g

dl 1000mg 1L L
a esp = 0.209 × = 20.9
cm.mg 1g 10dl cm.g

La absortividad específica de M es 20.9

e. El factor para convertir A en C sería: f=1/k ya que:

A = abC
1 1
C = .A = .A
ab K

1
Como ya conocemos K del punto anterior, encontramos f =
k

1
f = = 4.78mg / dl
0.209
 f. Para determinar la concentración de la solución M, si una dilución 1:4
de ella presenta una T de 37%, encontramos primero la concentración
de esta solución diluida por la curva de calibración o por el factor y
luego obtenemos la concentración de la solución original teniendo en
cuenta el factor de dilución.

A=2-Log T = 2-log 37= 0.432

Por interpolación en la curva de calibración (gráfica 2) encontramos

que para A=0.432 C=2.1mg/dl

Como esta concentración es de la solución diluida encontramos Cc

por:

Cd 2.1mg / dl
Cc = = = 10.5mg / dl
fd 1/ 5

Si utilizamos el método del factor, entonces

C=f.A=4.78 mg/dl x 0.432=2.06 mg/dl

2.06
Cc = = 10.3mg / dl
1/ 5

La concentración de la solución origina de M es 10.3 mgl dl, es mas exacto

el dato obtenido par el factor, ya que en este caso la fijación de la
absorbancia en el eje de la curva de calibración es muy aproximado.

TEXTOS PARA CONSULTAR

• KENNER, C.T., Instrumental and separation Analysis. Charles E. Merril

Publ.
Co., Columbus, Ohio (1973).

Metodos Instrumentales de Anilisis Quimico

• EWING. G.W., Edit. Mc. Graw Hill, Trad. Espai'lol. E. Estrada Mexico.
(1978)

Análisis Instrumental
 • SKOOG A.D. y WEST DM., Ed. Interarnericana, Trad. Espanol, V. Agut.,
Mexi.
co, 1975.

Instrumentación Quimica
• STROBEL H., Edic. Limusa Wiley, Trad. al español, H.Corona, Mexico,
1968.

PROBLEMAS

1. Determine el rango de concentraciones de una sustancia M con

absortividad molar 3500, para que las absorbancias estén entre 0.1000 y
1,0000 al leerlas en una celda de un cm.

2. Una solución de un colorante 0.5 m M, presenta una transmitancia de 40%

en una celda de 1.0 cm. Que diluciones hay que hacer de un patron 2 m M
para obtener absorbancias de 0.1 y 0.9 en la misma celda y a la misma
longitud de onda.

3. A partir de un stock de 1000 ppm de x se preparan diluciones

1:24,2:23,3:22,4:21, 5:20. 2 ml de cada una se tratan con 3 ml de un reactivo
especifico para x y se obtienen soluciones coloreadas que al leerlas λ
producen las transmitancias en porcentajes 82.2; 67,6; 56,1; 45,7; 37,6,
respectivamente. Determine:
a) Absortividad especifica de x a partir de la curva de calibración.
b) El factor para convertir absorbancia a concentración en mg%. (Las
lecturas se hicieron en una celda de un cm.).

4. Se prepara un stock de M pesando 200 mg de M y disolviendo a 550 ml a

partir de esta se elaboran por dilución los patrones indicados en la tabla.
Igual volumen de cada patrón se mezcla con igual volumen de reactivo
para M y se leen a su -λm, reactivo de o-toluidina.

Dilució 1/2 2/2 3/2 4/2 5/2 6/2 8/2 10/2 14/2 16/2 18/2
n 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
%T 96 80 73 54. 45 38 30 25 12 9 8
5
a) Compruebe si el sistema M reactivo, cumple la ley de B.B.L
b) En que rango de concentraciones
c) Cuál es el error relativo de concentraciones para esta técnica si Ei=0.12
d) Determine k para la ecuación A=k.C

5. Que patrón de un compuesto con absortividad 200 L/ cm g debe

prepararse para obtener la lectura de transmitancia que contiene el mínimo
error fotométrico, en celda de 1 cm y a su longitud de onda de máxima
absorción

6. Un patrón de glucosa de 80 mg % presenta una transmitancia de 42% al

leerse a 630nm después de tratarse con reactivo de O-toluidina. El suero de
una muestra de sangre tratado en igual forma, presenta una transmitancia
de 32% a la misma λ y en la misma celda. Calcule los mg% de glucosa en el
suero.

7. Qué dilución hay que hacerle a un suero de un paciente que al leer su

glucosa por O-toluidina presenta 6% de transmitancia, si el valor de T debe
estar cerca a 30%. Use los datos del problema 6.

8. Dos ml de un patrón de proteína de 35% p/v se mezclaron con 2ml de

reactivo biuret y después de 30 minutos se leyó su transmitancia a 540 nm,
obteniéndose una lectura de 34%. Un ml de un suero mezclado con 1 ml de
solución salina y 2ml de biuret, producen una transmitancia de 42% a 540 nm
y en la misma celda del patrón. Calcule 18 concentración de proteínas
totales en eI suero.

9. La determinación de la concentración de salicilatos en sueros se lleva a

cabo por espectrofotometría U.V. ya que el máximo de absorción de este
anión se encuentra 300nm.

Un patrón de salicilato de 100 mg% se diluyó 1/10 y se leyó a 300 nm con

buffer pH 10. Obteniéndose una absorbancia de 0.425. Una muestra de
suero luego de un tratamiento especial que indicaba una dilución 1/5
presentó una absorbancia de 0.320; si el blanco no absorbe, cual es el
contenido de salicilatos en el suero?

10. Desarrolle el problema 9, teniendo en cuenta que el blanco presenta

una absorbancia de 0.020.

11. Para el análisis del contenido de una sustancia X en una muestra, el

folleto del
reactivo comercial dice C = 3.25x102. Donde C es la concentración en mg
% y A es la absorbancia de la muestra; un ml de solución que contiene X se
diluye con 4 ml de solvente, se tratan con el reactivo de coloración según el
folleto y se lee su transmitancia a 420 nm, resultando 30%. Calcule los mg %
de X en la solución.

12. Para determinar fotométricamente M en una muestra una técnica

recomienda un factor de 2400 mg% p/v. La absorbancia de una muestra de
M es 0,542 y la del blanco es 0.062 a la longitud de onda que indica la
técnica de análisis. Cual es la concentración de M en la muestra en g por
100 ml ?

13. Para la determinación de colesterol en suero se puede usar la técnica

de Liebermann-Buchard; un suero estándar de 200 mg/l presenta una
transmitancia de 450/0 después de tratarse con el reactivo de Liebermann
y leerse a 610 nm en una celda de un cm. Una muestra de suero se diluyo 1:
1 y se trató con el reactivo, en las mismas condiciones que el suero estándar;
obteniéndose una lectura de 15%. Calcule los mg/L de colesterol en la
muestra de suero?

14. Para estandarizar una técnica espectrofotométrica se prepararon 10

patrones e igual volumen de ellos se mezcla con igual volumen de reactivos,
se calentó a 80ºC y después de enfriarse se leyeron a la longitud de onda
de máxima absorción, obteniéndose los datos que se muestran en tabla:

C mg/l 0 15 20 30 60 90 120 180 200 240 260

%T 100 95.0 88.0 79.5 63.0 50.0 39.5 25.0 15.0 10.0 8.0

a) Encuentre el rango óptimo de concentraciones para esta técnica.

b) El factor de conversión de A a C. para cualquier muestra de la misma
sustancia en idénticas condiciones.

15. Para estandarizar una técnica espectrofotométrica de X se procedió de

la siguiente forma: se pesaron 250 mg de AX y se diluyeron a 200 ml se
tomaron volúmenes de stock y se le trato según los datos de la tabla; luego
a iguales cantidades de los patrones se le adiciono un reactivo y la solución
coloreada leída a su máximo de absorción en celdas de 1 cm.

ml de 0.5 1.0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
stock
ml de H2O 49.5 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40
%T 90 80 48 41 36 25 16 12 10 8 7
Determine la Absortividad, el error del método (Ei=0.15%) el rango óptimo y
el factor de conversión de A a C.

Peso molecular de AX= 250g mol-1 Peso mol A= 100g mol-1

16. Se pesan 0,025 g de glucosa pura y se disuelven con agua basta 10 ml,
esta solución
se diluye 2: 3 y 100 mcl se mezclan con 4 ml de reactivo de ortotoluidina, se
lleva a ebullición la mezcla por 15 minutos y luego se lee a 630 nm
obteniéndose una transmitancia de 0.30. Para analizar el contenido de
glucosa en un suero se tomaron 100 mcl de suero y se trataron y leyeron en
igual forma que la dilución de glucosa obteniéndose una transmitancia de
0.36. Determine los mg de glucosa por dl en el suero.

17. Una Sustancia X presenta una absortividad molar de 21700 a 220 nm. Qué
dilución
debe hacerse de un patrón de X de 20 mg/l para obtener una transmitancia
de 36,896 al leerse la dilución a 220nm en una celda de 1 cm. El peso mol-g
de X es 100.

18. Una técnica fotométrica para Y tiene un rango óptimo de 5 a 20 mg 96

de Y cuando se mezclan 0,2 ml de muestra; y 3.8 ml de reactivo. Si la
absortividad del complejo coloreado de Y es 3 x 10-3 cm-1 (mg%) -1
a) Cuánto se debe tomar de suero y de reactivo para llevarlo al rango
óptimo, si se espera que el tenga una concentración de 400 mg%.
b) Cómo se procedería a tratar el suero si se desea que al mezclarse con el
reactivo la lectura de T sea de 3896 en una celda de 1 cm al lambda de
máxima absorción del complejo coloreado de Y.

19. Se espera que en un suero se obtengan concentraciones de un

determinado metabolito entre 60 y 120 mg%, si la absortividad del complejo
del metabolito es de 0.2
cm-1 (mg/ dl)-1 cuánto de suero se debe tomar para obtener absorbancias
entre 0.3 y 0.6 y un volumen final de 4 ml de mezcla. (Suero más reactivo).

20. Con el fin de determinar la concentración de ácido salicílico en una

muestra por el método del patrón se leyó la muestra y varios patrones
obteniéndose los datos que se dan en la tabla a 298 nm y en una celda de
1 cm.

Cppm 0 2 10 20 30 60 100 X
T 100 90 85 56 42 20 12 38
X se refiere a la muestra diluida 1:4
Encuentre la concentración del ácido salicílico en la muestra

21. Para una técnica fotométrica se determino un factor de 550 mg/dl,

cuando se mezclan 0,05 ml de muestra y 2,95 ml de reactivo especifico para
el metabolito a determinar. Cuando se debe diluir una muestra de 2.200 mg
de metabolito/ dl para obtener en el fotómetro una T de 40% para esta
técnica.

22. Para analizar el contenido de M en una solución se tomaron 0,5 ml de

esta y se diluyeron hasta 10 mI. Se prepararon patrones los cuales se leyeron
en la misma celda de la solución diluida de la muestra obteniéndose los
siguientes datos:

T% 96 60 40 2 45
C ppm 0.5 10 20 100 X

Calcule los mg/l de M en la solución.

23. Para analizar el contenido de Colesterol de suero de un paciente se

tomaron 0.2 ml de suero y se trataron con el reactivo de Lieberman-Buchard.
obteniéndose una lectura de T de 40% a 640 nm, en una celda de un
centímetro. Un patrón de colesterol de 300 mg% diluido 1:1 y tratado en
forma idéntica que el suero, dió una T de 50% para la dilución. Los mg% de
colesterol en el suero son:

24. Para determinar el contenido de glucosa en una solución (X) muy diluida
se siguieron los siguientes pasos:

a) Se pesaron 0,050 g de glucosa anhidra y se disolvieron con agua en un

matraz aforado de 25 ml.
b) Cuatro ml del stock anterior, se diluyeron con 6 ml de agua y 0.1 ml de
esta dilución se mezclo con 3.9 ml de reactivo de ortotoluidina; se calentó
por 15 minutos en baño maría y se leyó su transmitancia a 630 nm en una
celda de un cm, obteniéndose un valor de 28%.
c) Se tomaron 0.2 ml de solución (X) y se mezclaron con 3.8 ml de reactivo
de orto-toluidina y después del calentamiento se leyó a 630 nm en una celda
de 2.5 cm obteniéndose una transmitancia de 54%.

Encuentre los mg de glucosa por litro en la solución (X) problema.