Institutito Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Métodos de Análisis

Francisco Carmelo Fernández López

12/10/2020 4IM02

Nahui Ollin Morales López

“Determinación de Proteínas por el Método de Bradford”

Nahui Morales López 2

1. Objetivos

a) Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas

empleando un método fotométrico.
b) Determinará el efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pudieran
interferir en el método.
c) Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y
exactitud respecto al método del ácido bicinconínico.
d) Analizará las ventajas y desventajas de este método, con respecto a otros
métodos para la determinación cuantitativa de proteínas.

2. Fundamento de la práctica
El método de Bradford consiste en la formación de un compuesto de adsorción de
coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el
colorante azul brillante de Coomassie G-250, cambiando la lectura de absorbancia
al formarse el complejo con la proteína de 465nm a 595nm.
3. Resultados y Cálculos

Tabla1. curva de calibración para albúmina

Concentración de Proteína A 595
Tubo no. (µg/mL) Serie A Serie B
1 2 0.141 0.135
2 4 0.232 0.219
3 6 0.301 0.303
4 8 0.36 0.355
5 10 0.438 0.426

Cálculo de la Concentración de proteína para cada tubo

𝟐𝟎 µ𝒈 (𝟏𝟎𝟎)µ𝑳
= 𝟐µ𝒈/𝒎𝑳 Absorbancia vs Concentración
𝟏𝟎𝟎𝟎µ𝒈
0.5
0.4 y = 0.036x + 0.075
Absorbancia

R² = 0.9928
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración µg/mL
Nahui Morales López 3

Las variables de la ecuación obtenida de la curva de calibración pueden

interpretarse como:
y= 0.036x + 0.075; R= 0.9963 donde y= absorbancia, m= pendiente positiva,
x= concentración y b= absorbancia del blanco.
Cuando la absorción tiene un comportamiento lineal para producir resultados
proporcionales, directamente o mediante una transformación matemática, a la
concentración del analito en la muestra, se dice que se cumple con la ley de Bouger
y Beer para este método se cumple dentro de nuestros límites de cantidad de
proteína que van de 2 a 10 µg/mL.
Derivado de la recta ajustada por regresión lineal a la ecuación obtenida, se llegó a
𝑦−𝑏
la siguiente ecuación para el cálculo de concentración de proteína: 𝑥 =
𝑚
𝑦−0.075
sustituyendo con los valores de nuestra curva de calibración: 𝑥 =
0.036

II. Análisis Estadístico

Tabla 2. Replica para el análisis estadístico tubo 3

Tubo no. A 595 Concentración de proteína (µg/mL)
1 0.318 6.75
2 0.334 7.1944
3 0.322 6.8611
4 0.327 7
5 0.314 6.6388
6 0.327 7
7 0.303 6.3333
8 0.309 6.5
9 0.308 6.4722
10 0.309 6.5

Cálculo de la concentración de proteína:

𝑦 − 0.075 0.318 − 0.075
= = 6.75µ𝑔/𝑚𝐿
0.036 0.036
Nahui Morales López 4

Tabla 3. Resultados de análisis estadístico para el tubo 3

_
x Sx S2x % C. V IC de µ Precisión% Exactitud%
∑𝒏𝒊=𝟏 𝑿𝒊 ∑𝒏𝒊=𝟏(𝑿𝒊 −𝑿̅) 𝑺𝒙 ̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅
𝒕𝑺𝒙
(𝟏𝟎𝟎) 𝑿±
𝒏 𝒏−𝟏 ̅
𝑿 √𝒏
6.7249 0.2822 0.0796 4.1963 [6.523, 6.926] 95.80 87.91

%Precisión= 100 - %C.V %Exactitud = 100 – Er

Ea= Vi – Ve
Ea= 6.7249 – 6 = 0.7249
%Er = Ea/ Ve = 12.0816
Comparación estadística entre ambos métodos espectrofotométricos.
Método de Prueba: Bradford Método de Referencia: BCA
Precisión: Prueba de F
𝐺.𝐿 9
S12= 0.2132 S22 = 0.0796 =
𝐺.𝐿 9

𝑆12 0.2132
f tablas = 4.03 f calculada = = = 2.6783
𝑆22 0.0796

H0. S12 = S22; Ha. S1 2 ≠ S22

Se rechaza H0 si f calculada > f tablas.
2.6783 < 4.03 entonces f calculada < f tablas
Conclusión: No hay diferencia estadísticamente significativa entre la precisión de
ambos conjuntos de datos. El método de prueba cuenta con la precisión mínima
necesaria.
Exactitud: Prueba de t de student.

Tabla4. Comparación estadística entre el método de Bradford y BCA

BCA Bradford P-R
6.0367 6.75 0.7133
6.9458 7.1944 0.2486
6.0151 6.8611 0.8460
5.6255 7 1.3745
6.1883 6.6388 0.4505
5.77 7 1.2300
6.6645 6.3333 -0.3312
Nahui Morales López 5

5.5389 6.5 0.9611 ̅̅̅̅

𝑿𝑫 𝑺𝑫
6.5562 6.4722 -0.0840
0.5958 0.546
5.9502 6.5 0.5498

H0: Método BCA = Método Bradford; Ha: Método BCA. ≠ Método Bradford
̅̅̅̅̅̅̅̅
𝑋𝐷 √𝑛 0.5958(√10)
𝑡= = = 3.4507
𝑆𝐷 0.546

Ttablas = 2.262
Tcalculada = 3.4507
Se rechaza H0 si t calculada > t tablas.
2.262 < 3.4507 entonces t calculada > t tablas
Conclusión: Hay diferencia estadísticamente significativa. Los métodos no son
exactos entre sí.

III. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Bradford

Tabla 5. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Bradford
Concentración Tipo de
Tubo de proteína interferencia
No. Sustancia A 595 (µg/mL) generada
1 Fenol 0.2% 0.343 7.4444 positiva
2 Detergente comercial 0.2% 0.194 3.3055 negativa
3 SDS al 0.2% 0.178 2.8611 negativa
4 Mercaptoetanol al 0.002% 0.321 6.8333 no hay
5 EDTA 30 mM 0.306 6.4166 no hay

Cálculo de concentración de proteína:

𝑦 − 0.075 0.343 − 0.075
= = 7.4444µ𝑔/𝑚𝐿
0.036 0.036
Cualquier dato fuera del intervalo de confianza se considera como interferencia,
comparando con los datos bibliográficos sabemos que para el método de Bradford
hay poco o nada de interferencia de cationes como sodio o potasio ni de
carbohidratos como sacarosa. Se presenta una ligera interferencia en presencia de
agentes tamponantes fuertemente alcalinos. Los únicos componentes que se
encuentra que provocan una interferencia alta son cantidades relativamente
grandes de detergentes como dodecil sulfato de sodio (SDS), Triton X-100 y
detergentes comerciales para cristalería.
Nahui Morales López 6

Lo que coincide con nuestra interferencia negativa de SDS y detergente comercial

aunque sean cantidades pequeñas. El fenol causa interferencia a partir del 5% por
lo que al 0.2% no causa interferencias significativas aunque el valor salga del índice
de confianza mínimamente.
IV. Comparación de los métodos Utilizados para cuantificar proteínas
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS

• • NO ES MUY SENSIBLE
RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN COMPARADO CON EL MÉTODO
• MENOS DE 30 MINUTOS) POCAS DE LOWRY
SUBSTANCIAS NO • LAS CONCENTRACIONES ALTAS
PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA DE SALES DE AMONIO
• REACCIÓN DE BIURET INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
NO DETECTA N2 DE FUENTES NO • REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg
PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS DE PROTEÍNA POR PRUEBA
BIURET
• LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
TAMBIÉN ABSORBEN EN LA
REGIÓN DE 280nm
• • EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS
MÉTODO RÁPIDO Y
RELATIVAMENTE SENSIBLE AROMÁTICOS DIFIERE
(VARIAS VECES MÁS SENSIBLE CONSIDERABLEMENTE EN
QUE EL MÉTODO DE BIURET) VARIAS PROTEÍNAS
• • LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E
NO EXISTE INTERFERENCIA DEL
INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE
SULFATO DE AMONIO Y OTRAS
PRODUCIR RESULTADOS
SALES BUFFER
ERRÁTICOS
A 280 nm • MÉTODO NO DESTRUCTIVO
• EL COLOR VARÍA CON
DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS
QUE EL MÉTODO DE BIURET)
• LA SACAROSA, LÍPIDOS,
BUFFERS FOSFATO,
MONOSACÁRIDOS Y
HEXOAMINAS INTERFIEREN CON
LA REACCIÓN
MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA • LAS ALTAS CONCENTRACIONES
DE LOS OTROS MÉTODOS DE AZÚCARES REDUCTORES,
• MUY SENSIBLE SULFATO DE AMONIO Y
SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 COMPUESTOS CON
• HORAS SULFHIDRILO INTERFIEREN CON
MENOS AFECTADO POR LA LA REACCIÓN
LOWRY • TURBIDEZ DE LA MUESTRA
Nahui Morales López 7

• NO EXISTE INTERFERENCIA DEL

SULFATO DE AMONIO
• NO EXISTE INTERFERENCIA DE
LOS POLIFENOLES NI
CARBOHIDRATOS COMO LA
SACAROSA
• MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS
MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE CON UNA MASA MOLECULAR
• PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS) APROXIMADAMENTE IGUAL O
NO EXISTE INTERFERENCIA DE MAYOR DE 4 000 DALTONS
BRADFORD • CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+
• EL COLOR NO ES ESTABLE CON
EL TIEMPO. SE NECESITA
SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE
• DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA
10mg) LECTURA EN ABSORBANCIA.
LAS SALES DE BUFFER Y • LOS AZÚCARES REDUCTORES
• DETERGENTE NO IÓNICO NO
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
ALTAS CONCENTRACIONES DE
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
• SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN
LAS CONCENTRACIONES DEL
CON LA REACCIÓN.
MEDIO DE REACTIVOS
DESNATURALIZANTES NO
INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl
BCA O UREA 3M)

4. Discusión
Observando la gráfica de la curva de calibración, la pendiente obtenida en el
método de Bradford es menor que la obtenida en BCA. Lo que se puede
interpretar como que el método del BCA es más sensible que Bradford, sin
embargo los datos experimentales pueden estar sujetos a errores ya sean de
tipo instrumental, del método o del analista.
En el análisis estadístico se observa una diferencia visible entre el método del
BCA y Bradford para los valores de la media y los valores de dispersión y
concordancia, esto puede deberse a que en Bradford el valor de fondo para el
reactivo disminuye continuamente a medida que se une más tinte a la proteína
lo que hace que sea un método de reacción rápida pero ocasiona una estabilidad
de corta duración.
Se realizaron las pruebas estadísticas de t de student y f de Fisher para medir la
exactitud y precisión respectivamente tomando como método de prueba
Bradford y método de referencia BCA, se obtuvo como resultado que el método
de Bradford cuenta con la precisión mínima necesaria con respecto al BCA pero
los métodos no son exactos entre si ya que la hipótesis nula se rechaza y se
presentan diferencias estadísticamente significativas.
Nahui Morales López 8

Finalmente, con respecto a las interferencias en los métodos por efecto de

sustancias no proteínicas se observan valores negativos fuera del índice de
confianza para los componentes en los que se observa un color excesivo en el
ensayo tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) y detergentes comerciales.
Cuando se encuentran en pequeñas cantidades, los efectos debidos a Tris,
ácido acético, 2-mercaptoetanol, sacarosa, glicerol, EDTA, trazas cantidades de
detergentes, Triton X-100 y SDS se puede eliminar la interferencia fácilmente
ejecutando el control de tampón adecuado con el ensayo. Sin embargo, la
presencia de grandes cantidades de detergentes presenta anomalías
demasiado grandes para corregirlas. Comparando ambos métodos se puede
concluir que en cuanto a interferencias se encuentra en ventaja el método de
Bradford.

5. Conclusiones
• Se cumple la ley de Bouger y Beer.
• Se obtuvieron interferencias para SDS y detergente comercial.
• No hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión respecto
al método del BCA.
• Hay diferencia estadísticamente significativa en la exactitud respecto al
método del BCA.
• Se recomienda el método de Bradford para cuantificación de proteínas
por reducción en el tiempo de reacción, sensibilidad del método y
disminución de interferencias por efecto sustancias no proteínicas.

6. Referencia Bibliográfica
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248–254.
Davies, E. M.; (1988) (Review, Protein Assays) Amer. Biotech Lab. 28–37
Christian, G. 2009. Capítulo 16. Métodos Espectroquímicos En: Quimica
Analitica. 6ta ediciòn. Editorial Mc Graw-Hill. pp 196-213
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/acym/27_METODOS_PARA_LA_CUA
NTIFICACION_DE_PROTEINAS.pdf
Nahui Morales López 9