REPLICACION DEL ADN

 el apareamiento regular de bases en la estructura de doble hélice de ADN sugirió a

Watson y a Crick que se sinteticen nuevas hebras hijas complementarias a las hebras
parentales
 MECANISMO CONSERVADOR
 Las 2 hebras hijas formarían una nueva molécula de ADN de 2 hebras y el
dúplex parental permanecería intacto

 MECANISMO SEMICONSERVADOR:
 Las hebras parentales se separan en forma permanente y cada una de ellas
forma una molécula dúplex
 El copiado de una hebra molde de ADN a una hebra complementaria es una
característica de la Replicación del ADN, transcripción de ADN a ARN
 La información en el molde en forma de una secuencia específica de nucleótidos se
preserva
 En algunos virus, las moléculas de ADN de una sola hebra funcionan como moldes para
la síntesis de ARN complementario
LAS ADN POLIMERASAS REQUIEREN UN CEBADOR PARA INICIAR LA REPLICACIÓN

 El ADN se sintetiza a partir de precursores desoxinucleosidos 5’ – trifosfato (dNTP)

 La síntesis del ADN al igual que el ARN procede en dirección 5’ – 3’ porque el
crecimiento de la cadena resulta de la formación de un enlace fosfoéster entre el
oxígeno 3’ de una hebra creciente y el fosfato alfa de un dNTP
 Una ARN polimerasa puede encontrar un sitio de iniciación de transcripción de acuerdo
en un dúplex de ADN e iniciar la síntesis de un ARN complementario a la hebra molde
de ADN
 Pero, las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de una nueva cadena, en lugar
de ello, es indispensable una hebra corta preexistente de ARN o ADN a la cual se le
llama “CEBADOR” para iniciar el crecimiento de la cadena, especialmente es una
cadena de ARN
 Este cebador es dado por la ARN primasa
 Osea los que pasa es que la ADN polimerasa nunca puede iniciar de cero y para eso se
necesita extremo 3’ OH (hiroxilo) libre que es suministrado por el cebador
 Entonces cuando el extremo 3’ esta libre, ahora si la ADN polimerasa puede añadir
desoxinucleótidos al grupo hidroxilo libre
EL ADN DÚPLEX SE DESENROOLA Y LAS HEBRAS HIJAS SE FORMAN EN LA
HORQUILLA DE LA REPLICACION DEL ADN

 para que el ADN funcione como molde durante la replicación es indispensable que las 2
hebras se desenrollen para que las bases queden accesibles con la nueva cadena que
se está formando
 Para el desenrrollamiento de la cadena es necesario de la “HELICASA”, la cual
comienza en los segmentos del ADN llamados “orígenes de replicación u orígenes”
 La secuencia de nucleótidos de los orígenes varia en los diferentes organismos, aunque
por lo general, se empieza por secuencias ricas en A-T
  Una vez que la helicasas desenrollan el ADN molde, la ARN primasa forma un cebador
corto que se coloca en hebra base y a partir de él se empieza a poner nuevos
nucleótidos
 Entonces cuando las helicasas rompen los puentes H de los nucleótidos de las 2 hebras
y se va abriendo esto hace que se forme la burbuja de replicación que en sus extremos
que todavía no se abren forman una estructura de Y invertida se le conoce como
“horquilla de replicación”, osea que por cada burbuja de replicación se tiene 2 horquillas
de replicación
 Esta formación genera un problema porque los sectores que aun no se han abierto cada
vez se van tensionando, torsionando y enrollando más, pero aquí aparecen las
TOPOISOMERASAS I que rompen los enlaces fosfodiester entre nucleótidos contiguos
para de este modo girar la hebra, desenrollar y evitar que el ADN molde colapse
 El establecimiento de los orígenes de replicacion van a generar que se establezcan
direcciones de replicación
 Algo super importante saber es que la ADN polimerasa que va poniendo la nueva
secuencia de nucleótidos solo lo puede hacer en dirección 5’ – 3’
 Para ellos tenemos en las hijas se presenta unos casos:
 La hebra conductora puede proceder en forma continuada desde un cebador de
ARN en dirección 5’ – 3’, la cual es la misma dirección que el movimiento de la
horquilla de replicacion
 El problema aprece en la síntesis de la otra hebra hija, la cual se llama: HEBRA
RETARDADA, porque el crecimiento de esta va desde 3’ a 5’ entonces aquí hay
un movimiento contrario, entonces lo que pasa es el cebador se va a mover para
que el espacio que deja pueda ser sintetizado por el ADN polimerasa y asi va
hasta que llega al final, es por ello que el ADN polimerasa va avanzando de
manera contraria a la hoquilla de replicacion, pero aquí se forman segmentos
discontinuos que son los: “Fragmentos de Okasaki” que luego se unen por la
ligasa
 Entonces, una vez polimerizada la cadena va a venir la POLIMERASA 1 y
remueve los cebadores y los remplaza por fragmentos de ADN
 Finalmente, viene la LIGASA y establece uniones fosfodiester entre los
nucleótidos contiguos
VARIAS PROTEÍNAS PARTICIPAN EN LA REPLICACIÓN DE ADN

 La comprensión de las proteínas eucariotas que participan del proceso de la replicación

del ADN provino inicialmente de estudios con ADN virales pequeños como el ADN SV40
del genoma circular de un virus
 Replicacion en procariotas:
 El antígeno T grande da forma a una helicasa de replicación hexamérica
 Hidrolisis de ATP se necesita para desenrollar las hebras parentales en la
horquilla de replicacion
 Los cebadores para las hebras hijas conductora y retardada del ADN son
sintetizas por un complejo de una primasa que sintetiza un cebador ARN corto
 Aquí se utiliza una ADN polimerasa alfa que extiende el cebador de ARN,
formando un cebador mixto ARN - ADN
  El cebador se extiende en la hebra hija por acción de la ADN polimerasa gamma
y la ADN polimerasa, que es menos probable que se cometan errores durante el
copiada de la hebra molde
 Se dice que durante la replicacion del ADN, la polimerasa gamma sintetiza la
hebra retardada del ADN
 Pol E= sintetiza la mayor parte de la longitus de la hebra conductora
 El pol E y el pol gamma forman cada una un complejo con el factor de
replicacion C
 Un PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) desplaza al complejo
primasa pol alfa después de la síntesis del cebador
 El PCNA se conoce como una pinza deslizante que permite que el pol gamma y
la pol E se asocien de manera estable con una única hebra molde durante miles
de nucleótidos
 Después que el ADN parental se ha separado en moldes de hebra sencilla en la
horquilla de replicacion, se une con multiples copias de RPA (proteína de
replicacion A)
 La unión de la RPA mantiene al molde en una conformación uniforme, óptica
para que el ADN sea copiado por polimerasas
 Las RPA unidas se descargan de las hebras parentales por acción de las : Pol
alfa, gama y E a medida que estas sintetizan las hebras complementarias
apareadas por sus bases con las hebras parentales
 Las topoisomerasas 1 se asocian con el ADN parental mas alla de la helicasa
replicativa. Elima el estrés de torsión inducido por el desarrollamiento de las
hebras parentales
 La ribonucleasa H y la Fen I remueven los ribonucleótidos en los estremos 5’ de
los fragmentos de okazaki, los cuales son reemplazados con desoxinucleótidos
añadidos por la polimerasa delta
 La Replicacion del ADN ocurre bidireccionalmente desde cada origen
 Todas las células procariotas y eucariotas emplean un mecanismo bidireccional
de replicación de ADN
 ADN SV40: la replicacion se inicia por la unión de 2 helices hexaméricas del
antígeno T grande a un origen único del SV40 y se ensamblan las proteínas
para fromar 2 horquillas de replicacion
 Luego se alejan del origen SV40 en direcciones opuestas y la síntesis de
la hebra conductora y de la retardada ocurre en ambas horquillas
 Las moléculas de ADN eucariote contienen multiples orígenes de replicacion
separados por decenas a cientos de kb
 ORC= ORIGEN de transcripción, es una proteína de 6 subunidades que se une
a cada orifen y se asocia con otras proteínas requeridas para cargar las helicasa
 2 helicasas MSM opuestas separan las hebras parentales en un origen
 Las proteínas RPA se unen al ADN resultante de una sola hebra
 La replicacion del ADN celular y otros eventos conducen la proliferación de las
células produciendo un numero adecuado de las células que constituyen cada
tejido durante el desarrollo y vida de un organismo
 La activación de la actividad de la helicasa MCM que se requiere para inicar la
replicacion del ADN células esta regulado por proteínas cinasas dependientes
de ciclinas
 Otras cinasas dependientes de ciclinas regulan aspectos adicionales de la
proliferación celular que incluyen el complejo proceso de la mitosis por el cual
una celula eucariota se divide en 2 celulas hijas
 REPLICACION DEL ADN - KARP
 Las dos cadenas de la doble hélice se mantienen juntas por medio de puentes de
hidrógeno entre las bases, los cuales son débiles y pueden romperse con facilidad
 El Watson y Crick supusieron que la replicación ocurría por separación gradual como 2
mitades de una cremallera
 Una cadena va a servir de plantilla
REPLICACIÓN SEMICONSERVADORA

 Cada uno de los dúplex hijos debía consistir en una cadena completa una hebra
heredada por el progenitor y la otra nueva sintetizada
 Se dice que es semi xq cada la dúplex descendiente tiene 1 hebra original
REPLICACION CONSERVADORA

 Las 2 cadenas originales deben permanecer juntas, después de servir como plantillas,
asi como las 2 cadenas recién sintetizadas
 Osea, como resulta 1 dúplex hija va a contener el mismo ADN parental (las 2 hebras),
mientras que la otra dúplex solo tiene ADN resintetizado
REPLICACION DISPERSIVA

 Las cadenas parentales deben recortarse en fragmentos y las nuevas cadenas

sintetizarse en segmentos cortos, entonces los fragmentos deben unirse para formar
una cadena completa
 Resultado: las cadenas hijas tendrían ADN nuevo y antíguo
 Se hizo esta teoría porque el man MAX le parecía imposible que la tarea de desenrrollar
2 cadenas de ADN para la replicacia
¿entonces cuál de las 3 se utiliza?

 Para decidir entre estas tres posibilidades fue necesario distinguir las cadenas de DNA
sintetizadas a partir de las cadenas de DNA original que sirvieron como plantillas.
 Se hizo un estudio en el cual El DNA se extrajo de la bacteria en diferentes fases del
experimento, se mezcló con una solución concentrada de cloruro de cesio (CsCl) y se
centrifugó
 En el experimento de Meselson-Stahl, la densidad de una molécula de DNA es
directamente proporcional al porcentaje de átomos que contiene de 15N o 14N.
 Entonces, Si la replicación es semiconservadora, cabría esperar que la densidad de
las moléculas del DNA disminuyera durante el cultivo en el medio que contiene
nitrógeno 14 (14N)
 Conforme la replicación continúa más allá de la primera generación, las cadenas
sintetizadas, deben contener los isótopos de los que contienen híbridos 15N-14N
y los que poseen sólo 14N (ligero).
 Las cadenas pesadas progenitoras originales deben permanecer intactas y
presentes en las moléculas de DNA híbridas que representan cada vez un
porcentaje más y más pequeño del DNA total
 ENTONCES, es asi como estos estudios llevaron a confirmar que la replicación es
semiconservativa en los procariatas como bacterias
  Luego por estudios de Herbert se dieron cuenta que las eucariotas también hacen
replicación semiconservativa, porque aquí se utilizó bromodesoxiuridina (BrdU), un
compuesto que se incorpora en el DNA en lugar de la timidina. Entonces se pudo
observar como luego de varios ciclos una cadena parental y otra de Brdu se unian

REPLICACIÓN EN CÉLULAS BACTERIANAS

 Este proceso es más sencillo en procariotas, Los primeros avances de la investigación
en bacterias fueron impulsados por técnicas genéticas y bioquímicas como las
siguientes:
 Hay bacterias mutantes que no pueden sintetizar una proteína requerida para el
proceso de replicación, sin embargo, hay mutantes “SENSIBLES A LA
TEMPERATURA (TS)”, la restricción de estas bacterias o lo que sea mutantes
no funcionen siempre y cuando estén a temperaturas elevadas llamadas
“TEMPERATURA NO PERMISIVA”, pero cuando estas están en temperaturas
bajas, la proteína mutante puede funcionar de manera adecuada y así continuar
con su crecimiento y división. Es por ella que estás mutantes son objeto de
estudia para ver cómo opera en la replicación, recombinación del ADN
 Desarrollo de sistemas in vitro, en donde la replicacion se puede estudiar
mediante componentes celulares purificados
 Estas técnicas han revelado la actividad de 30 proteínas diferentes requeridas para la
replicación del cromosoma en [Link]
HORQUILLAS DE REPLICACION Y REPLICACION BIDIRECCIONAL

 La replicación comienza en un sitio específico en el cromosoma bacteriano, que se

llama “ORIGEN o ORI”, en la [Link] la secuencia de origen se llama oriC
 Una vez comenzada la replicación, este va en ambas direcciones, es decir, bidireccional
 Aquí se forman unas regiones llamadas: “HORQUILLAS DE REPLICACIÓN”, los cuales
son el sitio de unión entre el par de segmentos replicados con los no replicados
 La horquilla de replicación corresponde a:
 Donde la hélice parental se separa
 Nucleótidos se unen a las cadenas resintetizadas
 Es importante saber que las 2 horquillas de replicación se mueven en direcciones
opuestas hasta que llegan al punto final y se acaba la replicación
DESENROLLAMIENTO DEL DÚPLEX Y SEPARACIÓON DE LAS CADENAS

 La separación de las cadenas de ADN dúplex circular tiene diferentes problemas que
debe atravesar
 A la cadena doble de ADN se la compara con un fragmento de doble cuerda
entrecruzados
 Lo que pasa es que a medida que se va abriendo la cadena, en la horquilla de
replicación se va a producir un sobre enrrollamiento, este es un super enrrollamiento
positivo en la región no replicada del ADN
 Por ejemplo: un cromosoma circular de de [Link] contiene alrededor de 400 000 vueltas
y lo duplican 2 horquillas de replicación en 40 min
 Pero para ello existen unas enzimas que tienen las células, las cuales son: las
ISOMERASAS, que son capaces de cambiar el estado de superenrrollamiento del ADN
  La ADN girasa, es una topoisomerasa de tipo II, las cuales se desplazan a lo largo del
ADN por delante de la horquilla de replicación y eliminan los superenrrollamientos
positivos
 Entonces, la ADN girasa corta 2 cadenas del ADN dúplex, o sea lo que hace es que
corta una parte del ADN y cuando este vuelve a girar los une, para esto es necesario
ATP
PROPIEDADES DE LAS ADN POLIMERASA

 Kornberg en sus estudios, purificaron una enzima de extractos bacterianos a la que

incorporaron precursores de DNA marcados con radiactividad en un polímero ácido
insoluble de DNA. La enzima se denominó DNA polimerasa
 Cuando se probaron distintos tipos de plantillas de DNA, se encontró que esta plantilla
de DNA tenía que poseer ciertas características estructurales para promover la
incorporación de precursores marcados
 En este estudio se dieron cuenta que para que la ADN polimerasa actua se necesita un
cadena doble parcial para que se puede incorporar nucleótidos nuevos,
 Es importante recordad que la ADN polimerasa es una encima que no puede iniciar la
formación de una cadena de ADN
 Esta enzima solo puede agregar nucleótidos al extremo 3’ terminal (OH libre), a este
extremo se le conoce como iniciador, primer o cebador
 Por lo tanto, los requerimientos de la ADN polimerasa, son:
 Una cadena de ADN plantilla para copiar
 Cadena iniciadora en la cual pueden agregar nucleótidos
 Por eso es necesario una cadena de ADN parcial, porque la doble hélice si bien
tiene el extremo hidroxilo 3’ no tiene una plantilla y en cambio una cadena
circular sencilla tiene un ADN plantilla pero no un iniciador
 La ADN polimerasa solo sintetiza en dirección 5’ – 3’
 En 1960 hubo indicios de que la ADN polimerasa no era la única, por ejemplo
encontraron la ADN polimerasa I que está presente en las células bacterianas
(quita el primer y rellena el espacio vacío del primer)
 La ADN polimerasa III es la principal enzima responsable de la replicación del ADN o
sea forma ADN
 Una célula bacteriana típica contiene de 300 a 400 moléculas de ADN polimerasa I y
solo 10 copias de ADN polimerasa III
 Se dice que ninguna polimerasa puede
construir cadenas en dirección 3’ – 5’
REPLICACIÓN SEMIDISCONTINUA

 NO SE PUEDE SINTETIZAR CADENAS DE

ADN EN DIRECCION 3’ - 5’
 LAS CADENAS recién sintetizadas se
ensamblan en la dirección 5’ – 3’ porque
durante la reacción de polimerización, el
grupo OH del extremo 3’ del primer o
 iniciador hace un ataque nucleofílico en el fosfato alfa 5’ del trifosfato del nucleósido que
entra

 Aquí hay un problema porque 1 cadena va en dirección 5’ – 3’ y va directo hacia el dinal

sin ninguna interrupción, sin embargo, otra cadena va en dirección 3’ 5’ pero alreves de
la hebra madre, es por ello que esta cadena se sintetiza de manera discontinua, con
unos fragmentos
 Entonces, tenemos 2 tipos de cadenas hijas:
 Cadena adelantada
 Esta cadena se sintetiza conforme avanza la horquilla de replicacion
 Cadena retrasada
 Se forma de manera discontinua
 Porque esta debe esperar que se abran la cadena para ir poniendo
fragmentos y asi ir sintetizando una cadena hija
 Aquí algo curioso esque ambas cadenas se sintetizan casi de manera
simultanea pero como una cadena se sintetiza de manera continua y otra de
manera discontinua se llama una replicacion semidiscontinua
 Los frgamentos que dejaba para sintetizar la nueva cadena se los conoce como
“FRAGMENTOS de OKASAKI”, la enzima que une estos fragmentos se llama ADN
ligasa (une los segmentos de ADN)
 Entonces este man del okasaki descubrió que la cadena retrasada se sintetiza en
piezas
 Entonces, aquí se dice que la ADN polimerasa no da inicio a ninguna cadena, si no la
responsable es la ADN PRIMASA que pone el cebador, primer o iniciador (que son
secuencias cortas de ARN)
 El fragmento corto de RNA lo sintetiza una primasa en el extremo 5' de la cadena
adelantada y el extremo 5' de cada fragmento de Okazaki que sirve como el iniciador
para la replicacion del ADN
 Luego estos fragmentos se quitan y la ligasa los une
MAQUINARIA QUE OPERA EN LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN

 La replicación es más que la incorporación de nucleótidos

 Para el desenrrollamiento de la cadena dúplex, es necesario la HELICASA y las
proteínas que se unen al ADN que se llaman SSB
 La helicasa desenrrolla la cadena con ATP para poder separar los puentes de H
 Las cadenas de ADN de [Link] tiene 12 helicasas diferentes que se usan en distintos
aspectos del metabolismo del ADN
 DnaB= maquina principal de desenrrollamiento durante la replicación
 Tiene 6 subunidades estructuradas que forman una proteína igual a un
anillo
 La helicasa Dnab junto con la proteína DnaC se colocan en el origen de
la replicaicon que se desplaza en dirección 5’ – 3’, es decir a lo largo de
la plantilla de ADN de la cadena retrasada
 Lo que permite que la helicasa siga abriendo la cadena y esta no se cierre, se debe a la
unión de las proteínas SSB a las cadenas separadas de ADN, esto evita que se vuelva
a enrrollar y o mantiene en un estado extendido
  En las bacterias, la primasa y la helicasa se relacionan de manera transitoria para
formar los “PRIMOSOMAS”
 Conforme la helicasa se mueve sobre la plantilla de la cadena retrasada y abre
las cadenas dúplex, la primasa se une de manera periódica a la helicasa y
sintetizan a los iniciadores cortos de ARN o primer, los cuales empiezan a
formar los fragmentos de okazaki y la ADN polimera III empieza a sintetizar la
nueva cadena, para esto la polimerasa III se recicla del sitio donde termino un
fragmento de okazaki y pasa al próximo sitio y empieza nuevamente a poner
desoxinucleótidos
 A todo esto se lo denomina el modelo de trombón porque el asa del ADN crece
de manera rápida, lo que asemeja el movimiento del asa de un trombon
ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LAS ADN POLIMERASAS

 La ADN polimerasa II es parte de una maquinaria de replicacion que se llama

“holoenzima adn polimerasa III”
 La pinza B (abrazadera) es uno de los componentes no catalíticos de la holoenzima que
mantiene a la polimerasa relacionada a la plantilla de ADN
 Las ADN polimerasas poseen propiedades:
 Tienen que permanecer vinculadas con la plantilla de ADN sobre largos tramos
para sintetizar una cadena complementaria continua
 No se pueden fijar con tanta fuerza para que no les impida desplazarse de un
nucleótido al siguiente.
 Estas propiedades se deben a la forma de dona de la pinza B que rodea al ADN
y se desplaza por ella
 A medida que la ADN polimerasa se une a una “pinza deslizante Beta”, se pueden
mover progresivamente de un nucleótido al próximo sin pasarse más allá de la plantilla
 La polimerasa en la cadena adelantada permanece unida a una sola pinza B durante
toda la replicación
 La polimerasa en la cadena retrasada completa la síntesis de un fragmento de Okasaki,
la cual se desengancha de la pinza B y luego otra vez, se une a otra pinza B, que se
ubica en el iniciador de ARN y el ADN plantilla
 Esta pinza esta unida mediante ATP, entonces cuando ya acaba un fragmento y se
tiene que ir al otro, el ATP unido al cargador de la pinza se hidroliza, por lo tanto, se
libera la pinza y se cierra alrededor del ADN, entonces la pinza B esta lista para unirse a
la polimerasa III y sintetizar nuevos desoxirribonucleosidos
 La AND polimerasa I, solo tiene 1 subunidad, la cual interviene en la reparación del
ADN (se corrige secciones dañadas de ADN), esta también elimina los fragmentos de
okasaki en el extremo 5’
ACTIVIDADES DE LA EXONUCLEASA DE LAS ADN POLIMERASAS

 Las preparaciones de la ADN polimerasa I siempre contiene actividades de

exonucleasa, es decir, que son capaces de degradar polímeros de ADN al eliminar uno
o más nucleótidos del extremo de la molécula
 Todas las polimerasas bacterianas poseen la actividad de exonucleasa
 Las exonucleasas pueden dividirse en actividades de exonucleasa 5' → 3' y 3' → 5',
según sea la dirección en la cual se degrada la cadena
 La DNA polimerasa I tiene ambas actividades de exonucleasa, 3' → 5' y 5' → 3',
además de su actividad de polimerización
 Es decir, la ADN polimerasa I posee 3 enzimas en
 PROCESO DE COMO LA ADN POLIMERASA 1 QUITA LOS FRAGMENTOS DE OKASAKU Y
UNE EL ADN
 Casi todas las nucleasas son específicas para DNA o RNA, pero la exonucleasa 5' → 3' de la DNA
polimerasa I puede degradar los dos tipos de ácido nucleico.
 El inicio de los fragmentos de Okazaki por medio de la primasa deja un
segmento de RNA en el extremo 5' el cual se remueve por la actividad de
exonucleasa 5' → 3' de la DNA polimerasa I
 A medida que elimina el gragmento la polimerasa rellena de manera simultanea
el espcio resultante con desoxirribonucleótidos
 El ultimo desoxirribonucleotido se une de manera covalente en el extremo 5’
 Un error durante la replicación del DNA crea una mutación permanente y la posible
eliminación de la progenie celular.
 En E. coli (procariotas) la probabilidad de que un nucleótido incorrecto se incorpore en
el DNA durante la replicación y permanezca allí es menor de 10−9 o tan baja como una
en mil millones de nucleótidos. Esto se debe a que la E. coli tiene alrededor de 4x106
pares de nucleótidos
 La incorporación de un nucleótido en el extremo de una nueva cadena sintetizada
depende de que el trifosfato de nucleósido entrante pueda formar una complementación
correcta con el nucleótido de la cadena de ADN plantilla
 Osea que para que entre un nucleótido a la cadena este no debe alterar la geometría de
las uniones A-T G-C, es decir, que entre los cuatro posibles trifosfatos de nucleósido
que pueden entrar, sólo uno con una geometría apropiada puede encajar perfectamente
con el DNA plantilla y ello produce un apareamiento de bases A-T o G-C correcto
 Si la enzima “percibe” el nucleótido entrante como correcto se observa un cambio
conformacional en el cual el “dedo” de la polimerasa gira hacia la “palma” y así evita la
unión
 Si el nucleótido entrante es correcto se une de manera covalente y se hace una
geometría adecuada
 Se estima que un apareamiento incorrecto ocurre de manera aleatoria una vez por cada
105 a 106 nucleótidos incorporados, una frecuencia que es mas grande al de las
mutaciones
 Cuando la DNA polimerasa incorpora un nucleótido incorrecto, la enzima se detiene y el
extremo de la cadena sintetizado nuevamente tiene una tendencia aumentada para
separarse de la plantilla y formar una cadena sencilla 3' terminal.
 Para ello, sitio de exonucleasa 3' → 5' remueve al nucleótido erróneo. Este trabajo de
“lectura y corrección” es uno de los más importantesde todas las actividades
enzimáticas
 La actividad de exonucleasa 3' → 5' remueve alrededor de 99 de cada 100 bases mal
pareadas
 Además la bacteria tiene un sistema que se llama: “REPARACION DEL
APAREAMIENTO ERRONEO” que opera después de la replicación y corrige todas las
uniones erróneas que escapan del paso de lectura y corrección
 Entonces, la replicación de los nucleótidos bien hecho se debe a:
  Selección precisa de nucleótidos
 Lectura y corrección inmediata
 Reparación del apareamiento erróneo después de la replicación
 La replicacion en las bacterias dura 40 min
REPLICACION EN LAS CELULAS EUCARIOTAS

 Se ha decidido estudiar esto porque:

 En las especies de arqueas, la duplicación requiere de proteínas homologas a
las células eucariotas, pero menos complejas
 Desarrollo del sistema invitro en los que la replicación puede llevarse a cabo en
extractos celulares o mezclas de proteínas purificadas
 El aislamiento de mutantes de levaduras incapaces de crear productos de genes
específicos requeridos para la replicación
 La primera diferencia con las procariotas es que estas tenían un solo sitio de origen, en
cambio en las aucariotas por tener mas de mil veces el ADN que las procariotas
contienen, las células eucariotas replican su genoma en pequeñas porciones llamadas
“REPLICONES”, cada replicon tiene su propio sitio de origen de replicacion, desde el
cual avanza la horquilla de replicacion en ambas direcciones
 La replicación puede comenzar en 10 000 a 100 000 diferentes orígenes de replicación,
ojo esta replicacion es simultánea en cada replicón.
 Alrededor de 10 a 15% de los replicones se dedican activamente a la duplicación en
cualquier momento dado durante la fase S del ciclo de vida
 La presencia de histonas acetiladas, están muy relacionadas con la transcripción de
genes, es un factor común en la determinación de la replicación temprana de loci
genéticos activos
 Las regiones mas compactadas del cromosoma, que son las no acetiladas, están
empaquetadas en la heterocromatina y son las últimas en replicarse
 Esto es en levaduras: El elemento central de una ARS (secuencias de replicación
autónoma) consiste en una secuencia de 11 pares de bases, que funcionan como un
sitio de unión específico para el complejo de reconocimiento de inicio
 Si la ARS muta de modo que sea incapaz de unirse al ORC, no se inicia la replicación
 En los mamíferos, se piensa que una molécula de ADN contiene muchos sitios de
duplicación del ADN, pero solo un subconjunto de estos sitios se usa
 Se considera que los sitios de origen se rige por factores epigenéticos reales, como la
posición de los nucleosomas, modificaciones de histonas, estado de metilación del
ADN, etc
LA REPLICACIÓN SE RESTRINGE A UNA POR CICLO CELULAR

 En cada porción del genoma, solo se debe replicar 1 vez durante el ciclo celular
 Deben hacer mecanismo que eviten el reinicio de la replicacion en el sitio que ya se ha
duplicado
 Paso 1: al origen de replicacion lo une un complejo proteíco llamado ORC, que se
relaciona con el origen a través del ciclo celular
 PASO 2: las proteinas llamadas “FACTORES PERMISIVOS” se unen al ORC para
ensamblar un complejo proteínico llamado “COMPLEJO DE PRERREPLICACIÓN” que
es permisivo para iniciar la replicación
  Las proteinas Mcm se encargan en el origen de duplicación en una fase tardía
de la mitosis
 Las Mcm2 y 7 se relacionan con un complejo anular que tiene actividad helicasa,
por lo que son: la HELICASA REPLICADORA EUCARIOTA
 PASO 3: justo antes de iniciar la fase S del ciclo celular, la activación de proteínas
cinasas clave (Ej: cinasa dependiente de ciclina Cdk) conduce la activación de la
helicasa Mcm 2 y 7 y así inicia la replicación
 La Cdk es importante porque suprime la formación de nuevos complejos
prerreplicacionales
 PASO 4: una vez que la replicación comienza (en la parte inicial de la fase S) las
proteínas Msm se mueven con la horquilla de replicación y son esenciales para
completar la replicación de un replicón
 El destino de las Mcm, depende, ponte en las levaduras se desalojan de la
cromatina y se movilizan desde el núcleo. En los mamíferos, se desplaza del
ADN pero permanece en el núcleo
HORQUILLA DE REPLICACIÓN EUCARIOTA:

 Todos los sistemas de replicacion requieres: HELICASAS, PROTEÍNAS DE UNIÓN

CON ADN MONOCATENARIO,TOPOISOMERASAS, PRIMASAS, ADN POLIMERAS,
PINZA DESLIZANTE, CARGADOR DE LA PINZA Y LA ADN LIGASA
 En la replicación in vitro, se combina, proteinas de replicacion con una helicasa vírica
que se llama “antígeno T grande”, codificada por el virus SV40
 El antígeno T grande induce la separación de las cadenas del origen de replicacion de
SV40 y desenrolla el ADN para que avance la horquilla de replicación
 Aquí igual se sintetiza la cadena de una manera discontinua, aquí los fragmentos de
okasaki son mas pequeños de la cadena retrasada (150 nucleótidos de longitud)
 La ADN polimerasa III replica el ADN eucariota, tanto la cadena retrasada como la
adelantada se sintetizan de manera coordinada
 ADN polimerasas en Eucariotas:
 Alfa: replican el ADN mitocondrial
 Beta: Reparacion del ADN
 Gamma:
 Delta:
Tienen funciones de
 Epsilón:
replicación
 La polimerasa alfa esta relacionada con la primasa y juntas forman los fragmentos de
okasaki. La primasa comienza la síntesis por el ensamble de un iniciador corto de RNA,
el cual se amplía por la adición de unos 20 desoxirribonucleótidos por medio de la
polimerasa α.
 Se cree que la delta es la principal sintetizadora de ADN en la cadena rezagada
 El épsilon es la principal sintetizadora de ADN en la cadena líder
 Estas 2 polimerasas requieren de la pinza deslizante, que mantiene unida la enzima al
ADN lo que le hace posible que se muevan a lo largo de la plantilla
 En las eucariotas la pinza deslizante se conoce como PCNA, el cargador que coloca la
PCNA sobre el ADN se llama RFC (análogo al complejo cebador de pinza de la
polimerasa III)
 Después de sintetizar un iniciador de RNA-DNA, la polimerasa α se sustituye en la
unión de plantilla e iniciador por el complejo PCNA-polimerasa δ, que completa la
síntesis del fragmento de Okazaki
 Una endonucleasa (FEN-1) corta el ADN recién sintetizado y la ligasa lo une
 Se cree que FEN-1 y la DNA ligasa se atraen a la horquilla de replicación mediante la
interacción con la pinza deslizante PCNA
 Las polimerasas γ, δ y ε poseen una exonucleasa 3' → 5', cuya actividad de lectura y
corrección garantiza que esta replicación ocurra con una gran eficiencia
REPLICACIÓN Y ESTRUCTURA NUCLEAR

 el aparato de replicación consiste en un complejo de proteínas que opera dentro de los

confines de un núcleo estructurado.
 Se dice que la maquinaria de replicación está presente en estrecha conexión con la
lámina nuclear (pág. 477) y con la matriz nuclear
 el DNA en replicación se mueve como un convoy a través de un aparato de replicación
inmóvil
 la horquilla de replicación activa en un momento particular no se distribuye de forma
aleatoria a través del núcleo celular; en realidad, se localiza en 50 a 250 sitios,
conocidos como lugares de replicación
ESTRUCTURA Y REPLICACiON DE LA CROMATINA

 Los cromosomas de las células eucariotas consisten en DNA unido en complejos con
conjuntos regulares de proteínas histonas que se presentan en forma de nucleosomas
 Se cree que el movimiento de la maquinaria de replicación a lo largo del DNA desplaza
a los nucleosomas que se encuentran en su trayecto.
 los nucleosomas que se forman durante el proceso de replicación y están formados por
una mezcla más o menos equivalente de moléculas de histona heredadas de los
cromosomas de los progenitores y moléculas de histona recién sintetizadas
 el octámero central de histona de un nucleosoma consiste en un tetrámero (H3H4)2
junto con un par de dímeros H2A/H2B.
 los tetrámeros (H3H4)2 presentes antes de la replicación permanecen intactos y se
distribuyen en forma aleatoria entre las dos parejas hijas. Como resultado, parece que
los tetrámeros (H3H4)2 antiguos y nuevos se mezclan en la molécula de DNA de cada
hija
 los dos dímeros H2A/H2B de cada nucleosoma parental no permanecen juntos cuando
la horquilla de replicación se mueve por la cromatina, sino que los dímeros H2A-H2B de
un nucleosoma se separan y se unen al azar con los tetrámeros nuevos y antiguos