UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI PROGRAMA DE QUÍMICA
Asignatura: LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA I 1 credito 3 h /s
Título: SEPARACIÓN DE COLORANTES POR CROMATOGRAFIA
1. INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método físico de separación de mezclas complejas, en la cual la sustancia a
separar interacciona con la mezcla de dos fases: una móvil y una estacionaria (o inmovil). El
sistema opera por repetidos procesos de desorción y sorción, la fase móvil (eluyente) ayuda en el
movimiento de los componentes de la mezcla que a su vez son retenidos por la fase estacionaria. La
selección de las fases se hace dependiendo del tipo de compuesto. La mezcla debe ser soluble en la
fase móvil pero inmiscible en la estacionaria, que por lo general es sólida. Los solutos se separan en
base a la distinta velocidad de desplazamiento en el sistema que se emplee.
Hoy en día, hay diferentes técnicas cromatográficas, que involucran el mismo principio de
separación con distinta fase móvil: Cromatografía líquida (CL), Cromatografía de fluidos
supercríticos, Cromatografía de gases (CG), Cromatografía de capa fina (CCF) y Cromatografía de
columna (CC).
La movilidad relativa o constante de Rf de un compuesto es:
Rf= distancia recorrida por la compuesto / distancia recorrida por el disolvente.
Cromatografia de columna
La cromatografía en columna consta de dos fases: una fase móvil y una fase estacionaria contigua.
La fase de estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida. La mezcla de compuestos se mueve
junto con la fase móvil a través de la fase estacionaria y se separa dependiendo del grado diferente
de adhesión (a la sílice) de cada componente en la muestra o la mezcla de compuestos. Para esta
cromatografía se utiliza una columna que consta de un tubo de vidrio con una entrada grande
circular y una pequeña salida con un tapón. La columna se coloca verticalmente con un soporte
donde la salida es hacia abajo. Una pieza de algodón se introduce en la salida y se coloca sobre el
tapón para detener la fase estacionaria, esta ultima puede ser silice o alumina.
Método de empaquetado: la columna se llena con sílice en polvo seca. Luego, la fase móvil, el cual
es un solvente adecuado se hace pasar a traves de la silice hasta que toda la fase queda humeda y se
asienta. Desde este punto hasta el final, siempre la columna debe mantenerse húmeda con
disolvente.
Paso 1: La fase móvil o eluyente es disolvente o mezcla de disolventes. El nivel superior de la fase
móvil debe ser el mismo que la fase estacionaria. Eso significa que la fase estacionaria debe estar
húmeda con el solvente. En esta etapa, la mezcla de compuestos que es necesario separar, se agrega
desde la parte superior de la columna de tal manera que el nivel superior no se vea afectado. Al
abrir el grifo de abajo, se permite su adsorción en la superficie de la sílice.
Paso 2: Luego, se agrega el solvente o una mezcla de solventes adecuada al tocar por primera vez el
lado de la columna de vidrio lentamente y con cuidado para que el nivel superior de la fase de
papelería no se vea afectado. El solvente se agrega repetidamente tantas veces como sea necesario
durante el proceso.
Paso 3: cuando el grifo está en los compuestos de la mezcla de compuestos, mueva junto con el
eluyente dependiendo de la polaridad de la molécula de muestra. Los componentes no polares
viajan más rápido que el componente polar. Ejemplo: Una mezcla de compuestos contiene tres
compuestos azul, rojo y verde. Según la polaridad, el orden de estos compuestos es azul> rojo>
verde. Eso significa que el azul es el compuesto más polar y, por lo tanto, tendrá menos tendencia a
moverse junto con la fase móvil.
Paso 4: El compuesto de color verde viajará primero, ya que es menos polar que los otros dos.
Cuando está cerca del final de la columna, se toma un tubo de ensayo limpio para recoger la
muestra verde. Después de esto, el rojo y por último el compuesto azul más polar se recolecta, todos
en tubos de ensayo separados.
Así, una mezcla de compuestos se separa o se purifica mediante cromatografía en columna.
Figura 1. Representación de CC.
Tabla 1. Eluyentes comunes en orden creciente de
polaridad usados en cromatografía.
Eter de petroleo
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tolueno
Cloroformo
Diclorometano
Dieltil eter
Acetato de etilo
Acetona
Piridina
Etanol
Metanol
Agua
Ácido acetico
Cromatografía de capa fina
La cromatografía de capa fina consta de dos fases: una fase móvil y una fase de papelería contigua.
La fase estacionaria es una capa delgada de sílice o alúmina recubierta de vidrio, plástico o metal. Y
el gas móvil es un solvente adecuado. La mezcla de compuestos se mueve junto con la fase móvil a
través de la fase estacionaria y se separa dependiendo del grado diferente de adhesión (a la sílice) de
cada componente en la muestra o la mezcla de compuestos.
La placa de cromatografía de capa fina o la placa de TLC está disponible comercialmente. El
nombre químico de gel de sílice es dióxido de silicio (sílice) donde el silicio se une con oxígeno
mediante un enlace covalente. También se puede usar alúmina (óxido de aluminio) en lugar de
sílice.
La sílice en la superficie de TLC contiene un enlace Si-O-H en lugar de un enlace Si-O-Si. La
superficie de TLC se vuelve muy polar debido a la presencia de este grupo -OH. Así que los
compuestos pueden formar enlaces de hidrógeno o pueden interactuar por las fuerzas de dispersión
de van der waals y las fuerzas de dipolo-dipolo.
La cromatografía en capa fina funciona en pocos pasos:
Paso 1: se dibuja una línea horizontal cerca de un extremo (aproximadamente a 1.5 cm del borde
inferior) de la placa de TLC (ver figura 2).
Paso 2: La muestra a separar se coloca como una pequeña gota o línea en la placa de TLC
utilizando un tubo capilar. Etiquetando la caída con un lápiz con un alfabeto o ayuda numérica para
identificar el compuesto más adelante. Las gotas se empapan luego en el plato y se secan.
Paso 3: La placa de TLC se coloca luego en un recipiente sellado con una capa de solvente
adecuado. El nivel de disolvente debe ser más bajo que la línea del lápiz o caer sobre él. El
recipiente debe estar cubierto para detener el disolvente para evaporarse.
Paso 4: El solvente eleva la cromatografía llevando a cada componente de la muestra. Los
componentes que viajan con el solvente dependen de tres cosas:
• La polaridad de la molécula de muestra. Los componentes no polares viajan más rápido que
el componente polar.
• La atracción entre la molécula de muestra y el disolvente o mezcla de disolventes.
• La atracción entre la muestra y la sílice.
Ejemplo: en una mezcla de compuestos, uno de ellos puede formar un enlace de hidrógeno con
sílice tendrá tendencia a adherirse a la superficie de la placa de TLC más que otro compuesto que
no lo pueda hacer.
Paso 5: Cuando el solvente llega cerca del final de la placa de TLC, la placa debe sacarse del
recipiente sellado y secarse al aire. La placa con bandas separadas de componentes se observa luego
bajo luz UV o luz visible.
Figura 2. Representación de CCF.
2. OBJETIVOS
• Reconocer la importancia de dos diferentes técnicas cromatográficas usadas para la separación,
purificación de compuestos y monitoreo de reacciones.
• Realizar la separación, monitoreo y toma de coeficiente de reparto diferentes colorantes.
3. CONSULTAS PRELIMINARES
• Cuáles son las diferencias de absorción y adsorción en cromatografía?
• Explique las diferencias de un colorante, pigmento y tinte.
• Investigue la importancia y usos de los colorantes, los pigmentos y los tintes
• En qué casos se usa la cromatografía de capa fina y cromatografía de columna?
• Qué criterios se tiene en cuenta para seleccionar el disolvente o la mezcla de disolventes para
separar dos compuestos?.
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales Cantidad de cortar y repartir)
Probeta de 25 mL 1 Algodón
Erlenmeyer de 50 mL 2 Extracto de espinaca
Beakers de 100 mL 2 Acetona 30 mL
Beakers de 50 mL 5 Agua
Tubos de ensayo con 6 Colorante zafranina
tapones de caucho Colorante fluoreceina
Varilla de vidrio 1 Colorante cristal
Frasco lavador 1 violeta
Vidrio reloj 1 Etanol 96%
Espátula 1 Cloruro de sodio
Embudo caña corta 1 Sulfato de sodio
Bureta 1 anhidro
Gotero 4 Sílica gel 4g
Capilares para 2 Lampara de luz UV 1 por Grupo de 24
cromatografía estudiantes
Pinza con nuez 1 Plancha de 1
Placas de 2 placas enteras de calentamiento
cromatografía TLC 20 x 20 cm (el
silica profesor se encarga
5. PROCEDIMIENTO
Empacado de columna para CC
Lave y seque la columna (si es necesario) con una toalla de papel o con 20 mL de acetona, no
olvide recuperar el disolvente y hacer un buen tratamiento de desechos y/o recuperacion del
disolvente. Coloque un trozo de algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla de
vidrio (no se debe introducir dentro del estrechamiento de la columna y menos en el orificio de la
llave) asegurándose de que no quede muy apretada. Sujete la columna con una pinza al soporte
universal y coloque un erlenmeyer de 50 mL debajo de la columna. En un beaker de 50 mL rotulado
como 1, adicione 20 mL de hexano, el cual será utilizado para todo el experimento. Cierre la llave
de la columna y adicione 1 mL de hexano por las paredes de la columna. Pese 2 g de sílice en un
erlenmeyer de 25 mL y añada 4 mL de hexano. Agite y deje reposar por 1 minuto esta mezcla
(slurry). Empleando un embudo de caña corta, transfiera el “slurry” con mucho cuidado a la
columna y lave el contenido del erlenmeyer con pequeñas porciones del eluyente (hexano). Abra la
llave para que salga lentamente el exceso del eluyente y asegurar un empaquetamiento suave del
adsorbente (sílice). A medida que desciende el hexano por la columna adicione pequeñas cantidades
de solvente para remover la sílice que queda adherida en las paredes de la columna. Deje que el
hexano pase por la sílice hasta que llegue justo encima de ella ( 1 cm) y colecte el hexano
sobrante en el erlenmeyer de 50 mL. No deje que la sílice se seque para evitar canales y burbujas de
aire. Siempre debe estar húmeda. Cierre la llave de la columna y proceda a realizar el siguiente
paso.
Preparación de la muestra a separar
En un beaker de 25 mL pese 0,05 g de cada uno de los colorantes zafranina, fluoresceina y cristal
violeta, y adicione 1 mL de acetona y 5 gotas de etanol. Tápelo con un vidrio reloj y guárdelo.
Rotule 2 beakers de 100 mL y coloque en cada uno de ellos los siguientes solventes:
Beaker 2: 8.5% acetona: 1.5% etanol (v/v) (30 mL).
Beaker 3: etanol (15 mL)
Con la llave cerrada de la columna y una pipeta Pasteur, añada la disolución de los colorantes,
teniendo cuidado de no perturbar la sílice. Una vez, depositada la mezcla abra la llave para que la
muestra penetre en la fase estacionaria sin dejarla secar. Cierre la llave y limpie el recipiente donde
estaba la mezcla de colorantes con 1 mL más de acetona y repita la operación anterior dos veces
más.
Separación de los colorantes
Rotule 10 tubos de ensayo pequeños limpios y secos.
Una vez adsorbida la mezcla de compuestos que se desean separar, ajuste la altura de la columna
con mucho cuidado para que debajo quepa el tubo de ensayo 1. Adicione la solución acetona:agua
(8.5:1.5) contenida en el beaker 2. Abra la llave de tal manera que controle el flujo del disolvente
(ni muy lento ni muy rápido) y empiece a colectar el disolvente en los tubos. Cuando visualice un
color que se acerca al fondo de la columna retire el tubo y ponga uno nuevo. Al terminar de salir la
mezcla 8.5:1.5 de la columna y sin dejarla secar adicione el contenido del beaker 3 (15 mL de
etanol). Después de que todo el disolvente salga sin color detenga el procedimiento.
Cromatografíaa de capa fina
El profesor pasará por cada grupo para seleccionar los tubos de ensayo en los cuales debe evaporar
el disolvente en beakers de 50 mL (puede utilizar los que contenían las disoluciones) hasta un
volumen mínimo en la plancha de calentamiento (aproximadamente 90°C) dentro de la campana de
extracción. Las muestras obtenidas serán analizadas posteriormente por CCF.
Cromatografía en capa fina
Preparación de la placa cromatográfica usada en CCF
En una placa cromatográfica trace suavemente una línea recta y horizontal con lápiz a 1.0 cm de
uno de los borde de la placa y otra a 0.5 cm del otro borde. Señale 4 puntos a intervalos de 1 cm.
Empleando capilares diferentes para cromatografía, aplique por separado una pequeña cantidad de
disolución de las muestras (tubos a los cuales evaporó el solvente) de un diámetro inferior a 0.5
mm. Repita el proceso tres veces pero dejando evaporar el disolvente cada vez que realiza una
aplicación, de esta forma aumenta la concentración de la muestra en el punto.
Preparación de la cubeta cromatográfica
En un Beaker de 50 mL adicione 5 mL de una disolución al 8.5% acetona:etanol. Introduzca un
papel filtro (siga recomendación del profesor) y tape el beaker. Deje que todo el papel filtro se
humedezca con la mezcla de disolventes. Utilizando pinzas deposite la placa cromatográfica y
asegúrese de que el disolvente no cubra la línea donde se depositó las muestras. Tape el beaker y
deje ascender el disolvente hasta la línea del borde superior de la placa el cual será el punto máximo
alcanzado por el frente de disolvente. Saque la placa y deje que se evapore el eluyente al aire.
Señale con lápiz la altura alcanzada por los compuestos. Si los colores son muy claros, examine la
placa utilizando un revelador de luz ultravioleta. Calcule los valores Rf de los compuestos
coloreados con las cifras significativas adecuadas.
6. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
• Cuales son los compuestos que se aislaron y purificaron?
• Explique cómo afecta la polaridad de los compuestos purificados por cromatografía de capa
fina y de columna, también su velocidad y los Rf’s calculados.
• Consulte sobre la polaridad de los solventes utilizados en la práctica en la separación por
cromatografía de columna y sugiera otros que se podrían utilizar.
7. TENGA EN CUENTA PARA EL ANALISIS
• Realice un dibujo de la separación que obtuvo con la CCF e identifique el tipo de
compuesto correspondiente a cada mancha.
• Explique el orden de separación de los colorantes por CC, dependiendo de su estructura e
interaccion con el eluyente.
• Que otra mezcla de disolventes puede usar para obtener una mejor separación?
• Para que calculo los Rf de las manchas obtenidas por CCF de la mezcla de colorantes.
REFERENCIAS
• Cisneros, Carlos. Guias de laboratorio de Química Organicá I. Universidad Santiago de
Cali.
• [Link]
• [Link]
• Guias de laboratorio de Química Orgánica. Universidad Icesi.
