Práctica de Gram negativas
Módulo: Prevención y control de la propagación
microbiana
Profesora: Dra. Ana Laura Esquivel Campos
Grupo: BJ51Q
Integrantes:
Castillo Gabriela
Mendoza Peralta Miguel Ángel
Vázquez Quiroz Juan Siad
Equipo: 4
INTRODUCCIÓN
Las bacterias son muy diversas y se encuentran en gran cantidad en el planeta por
lo que es necesario clasificarlas, una manera de clasificación es describiendo si son
Gram positivas o negativos y esto se debe a una técnica diferencial denominada
tinción de Gram utilizada muy ampliamente en microbiología. Dependiendo del
resultado de esta tinción las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: las
grampositivas aparecen de color morado y las gramnegativas de color rosa. Esta
diferencia en la respuesta a la tinción de Gram se debe a diferencias en la
estructura de la pared celular de las células grampositivas y gramnegativas. En las
gramnegativas la pared celular es una estructura compuesta por peptidoglicano
(compuesto muy resistente y que protege a las bacterias de una ruptura osmótica)
que representa hasta el 90% del material de la pared celular y aunque algunas
bacterias tienen sólo una capa de peptidoglicano rodeando a la célula, muchas otras
tienen varias láminas (hasta 25) apiladas unas sobre otras. En el siguiente reporte
se realizó para la identificación de 3 cepas diferentes proporcionadas por la
profesora con el objetivo de determinar de qué bacteria se trataba cada una se
utilizaron medios de cultivos diferenciales y selectivos para su identificación y se
realizaron pruebas bioquímicas para determinar su actividad metabólica, para
obtener resultados más precisos y estar seguros de que bacteria se trata.
OBJETIVO GENERAL
● Identificación de una cepa bacteriana mediante medios de cultivos y pruebas
bioquímicas.
OBJETIVOS PARTICULARES
● Aislar la cepa en diferentes medios de cultivo de uso general, diferencial y
selectivo.
● Identificar colonias representativas de cada medio de cultivo.
● Evaluar la actividad metabólica de los microorganismos.
METODOLOGÍA
El objetivo de esta práctica era la identificación de la cepa bacteriana proporcionada
por la profesora.
Preparación de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas
Para la identificación de las cepas se utilizaron los siguientes medios de cultivo y
pruebas bioquímicas de acuerdo con la tabla 1.
Cantidad Medio
3 cajas con 22 ml EMB
3 cajas con 22 ml Agar Mac Conkey
3 cajas con 22 ml Agar verde brillante
3 cajas con 22 ml Agar Hecktoen
4 tubos de 13x100 con 3 ml Agar citrato de Simmons
4 tubos de 13x100 con 3 ml Agar de hierro kligler
9 tubos de 13x100 con 3 ml RM/VP
4 tubos de 13x100 con 3 ml Agar semi-sólido SIM
4 tubos de 13x100 con 3 ml Urea
Tabla 1. Medios y pruebas bioquímicas para la identificación de cepas bacterianas
A cada equipo se le asignó un medio de cultivo o prueba bioquímica para
prepararlo. Se nos asignó la prueba bioquímica agar semisólido SIM para
prepararlo.
Se preparó de acuerdo con la etiqueta y ajustando la cantidad necesaria. Se
colocaron 3 ml del agar en tubos de 13x100 después se colocó un tapón hecho con
algodón y gasa. Todos los medios y pruebas bioquímicas fueron puestos en la
autoclave para su esterilización. Terminando el proceso de esterilización se sacaron
de la autoclave y se dejaron enfriar. Se mantuvieron en refrigeración hasta su
posterior uso.
Siembra de las cepas
Se sembró las cepas proporcionadas en los agares EMB, Mac Conkey, verde
brillante y Hecktoen por estría cruzada con ayuda de un asa para obtener colonias
aisladas. Los agares se incubaron a 37°C durante 24 horas.
Descripción morfológica macro y microscópica de los medios y siembra de
pruebas bioquímicas
Se describió la morfología macroscópica de los agares con la ayuda de la tabla 2.
Tabla 2. Características macroscópicas de colonias
Para describir la morfología microscópica de las colonias se realizó la tinción de
gram a uno de los agares (Mac Conkey) para la observación en el microscopio.
Tinción de Gram
Se realizó un frotis en un portaobjetos con un asa estéril y en una zona aséptica
colocar sobre una gota de agua estéril una pequeña cantidad de la muestra, se fijó
con calor cuidando no incinerar el microorganismo, una vez seco el frotis se cubrió
con cristal violeta durante 1 minuto se dejó escurrir el colorante y se procedió a lavar
con solución de Lugol durante 1 minuto. Se dejó escurrir el Lugol y se eliminó el
exceso con agua de la llave (se realizó un goteo suave y continuo), después se
coloca el alcohol-acetona aproximadamente 30 segundos y se lavó inmediatamente
con agua por goteo suave y continuo. Se dejó escurrir las gotas de agua y se cubrió
la preparación con safranina por 1 min y se lavó nuevamente con agua como ya se
indicó. Se dejó secar la preparación (no utilizar papel para secar la preparación). Se
procedió a observar la preparación al microscopio a un aumento de 10x (colocar una
gota de aceite de inmersión para mejor resolución).
Pruebas bioquímicas
Se cultivó una porción de una colonia de uno de los agares (verde brillante) en las
siguientes pruebas bioquímicas:
● Agar citrato de Simmons y hierro kligler se sembró por picadura y estría.
● Agar RM/VP y urea se sembró por suspensión.
● Agar SIM se sembró por picadura.
Todas las pruebas bioquímicas fueron incubadas a 37°C durante 24 horas.
Lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas realizadas, esterilización,
lavado y entrega de material
Tabla 3. Interpretaciones para pruebas bioquímicas
Se determinó los resultados de las pruebas bioquímicas con la ayuda de la tabla 3,
con los resultados obtenidos se determinó de qué bacteria se trataba (ver tabla 4).
Para la finalización de la práctica todo el material contaminado (potencialmente
infeccioso) se introdujo en recipientes impermeables (bolsas de plástico especiales
para productos infecciosos) que después fueron incinerados. Los tubos de las
pruebas bioquímicas se esterilizaron antes de su entrega. El material utilizado se
lavó y se secó antes de devolverlos al laboratorio para un uso posterior. Se entregó
todo el material utilizado al laboratorista.
Finalización de la práctica.
Tabla 4. Características para la identificación de enterobacterias
DIAGRAMA DE FLUJO
Imagen 1. Metodología
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
A continuación, se presentan los resultados obtenidos de cada uno de los
integrantes del equipo para la identificación de su cepa individualmente.
Gabriela Castillo
Descripción macroscópica
Morfología macroscópica
Medio Forma Elevación Margen Superficie Color
MacConkey Puntiforme Convexa Entero Cremosa Amarillo
EMB Circular Elevada Entero Cremosa Morado
oscuro
Verde Circular Convexa Entero Cremosa Amarillo
brillante
Hecktoen Circular Convexa Entero Cremosa Amarillo
Tabla 5. Características de las colonias
Agar MacConkey Agar Verde Brillante
Agar EMB Agar Hektoen
Figura 2. Medios de cultivo Gaby
➢ Pruebas Bioquímicas
Prueba Resultado
Citrato de Simmons Positivo
Urea Negativo
SIM Movilidad: Negativo
H2S:Negativo
Indol:Negativo
RM Positivo
VP Negativo
Hierro de kligler Fermentador de glucosa
Alcalino/Ácido
Tabla 6. Resultados de las pruebas bioquímicas.
Tinción Gram
Figura 3. Observación microscópica de una de las colonias (agar mac conkey).
Al realizar la tinción Gram se observan Bacilos Gram negativos
Con los resultados obtenidos en la descripción macroscópica de las colonias hay
sospecha de tres tipos de bacterias que pudieran estar presentes en el medio:
Shigella, [Link]., Klebsiella
Para ser más precisos se realizan las pruebas bioquímicas que con ayuda de la
tabla 4. se puede observar que se inclinan más a la presencia de una cepa impura
de Shigella, que pudiera estar contaminada con cualquiera de las dos bacterias
antes mencionadas; por otro lado, la tinción gram no aportó mucha información
debido a que hablamos de microorganismos Gram - con morfologías parecidas.
Por esta razón realizaría una resiembra de alguna colonia típica en un medio
diferencial y selectivo para observar la presencia o ausencia de cada
microorganismo o bien, contar con un control positivo y negativo de cada una de las
bacterias para tener más veracidad en la técnica y procedimiento realizado, así
como en los resultados obtenidos
Miguel
Descripción Macroscópica cepa número 4
Morfología macroscópica
Medio Forma Elevación Margen Superficie Color
Mac Puntiforme Plana Entero Cremoso Blanquecino -
Conkey Transparente
EMB Puntiforme Plana Entero Cremoso Lila - Violeta
Verde Puntiforme Plana Entero Cremoso Rojo carmesí
brillante
Hecktoen Circular Convexa Entero Gelatinoso verde con
halos
transparentes
Tabla 7. Características de las colonias
Agar MacConkey Agar EMB
Agar Verde Brillante Agar Hecktoen
Figura 4. Medios de cultivo Miguel
➢ Pruebas Bioquímicas
Prueba Resultado Imágenes
Citrato de Simmons Negativo
Urea Negativo
SIM Movilidad: Negativo
Indol: Negativo
H2S: Negativo
RM Positivo
VP Negativo
Hierro de Kligler Fermentador de glucosa
y no lactosa
Anaerógeno, sin
producción gas
Tabla 8. Resultados de las pruebas bioquímicas.
Tinción de Gram
Figura 5. Observación microscópica de una de las colonias (agar MacConkey).
De acuerdo con los resultados obtenidos en la descripción macroscópica de las
colonias hay sospecha de varios tipos de bacterias que pudieran estar presentes en
el medio. Ya que se puede tratar de 2 cepas en el cultivo entre las cuales se
encuentra Salmonella o shigella.
Con la ayuda de los resultados de las pruebas bioquímicas se asegura que es
Shigella ya que todos los resultados coinciden con esa bacteria, por que presenta
resultados negativos en producción de gas, movimiento, producción de sulfuro de
hidrógeno, indol, Vogues-Proskauer, y citrato de Simmons. Donde se encontró un
resultado positivo fue en la prueba de rojo de metilo. De esta manera reafirmando
de que se trata de una cepa de shigella
Said
Morfología macroscópica
En la tabla x se muestran los resultados de la descripción macroscópica de las
colonias de cada uno de los agares.
Morfología macroscópica
Medio Forma Elevación Margen Superficie Color
Mac Puntiforme Convexa Engero Cremosa Rosado
Conkey
EMB Puntiforme Elevada Entero Cremosa Negro
azulado
brillo verde
metálico
Verde Puntiforme Convexa Entero Cremosa Amarillo-
brillante verdosas
Hecktoen Circular Convexa Entera Cremosa Amarillo
Tabla 9. Características de las colonias
Figura 6. Esquina superior izquierda agar MacConkey, esquina superior derecha agar EMB,
esquina inferior izquierda agar verde brillante y esquina inferior derecha agar hecktoen.
Morfología microscópica
De acuerdo con la tinción de Gram realizada y la observación al microscopio se
determinó la morfología microscópica de una de las colonias como bacilos Gram
negativos (ver figura 7).
Figura 7. Observación microscópica de una de las colonias (agar MacConkey).
Pruebas bioquímicas
En la tabla 10 se muestran los resultados de las pruebas bioquímicas.
Prueba Resultado
Citrato de Simmons Positivo
Urea Negativo
SIM Movilidad: Positivo
Indol: Negativo
H2S: Positivo
RM Positivo
VP Negativo
Hierro de kligler Fermentador de glucosa y lactosa
(A/A). Aerogeno
Tabla 10. Resultados de las pruebas bioquímica
Figura 8. Resultados de las pruebas bioquímicas.
Con base a todos los resultados obtenidos de la descripción macro y microscópica y
de las pruebas bioquímicas se determinó que la bacteria de la cepa proporcionada
por la profesora fue citrobacter freundii. Los datos obtenidos de la tabla x no son de
gran ayuda puesto que ninguno de estos agares presenta la descripción
macroscópica de la bacteria Citrobacter, por lo que se recomiendo un medio
selectivo (como ejemplo agar CIN) para aislar esta bacteria y tener un mayor
porcentaje de aseguramiento que sí lo es. La figura x nos determina que es un
bacilo gran negativo, informacion importante ya que esto es correcto. Pero para
tener mayor porcentaje de seguridad de que bacteria se trataba están los resultados
de las pruebas bioquímicas y con ayuda de la tabla x se asegura que es [Link]
ya que todos los resultados coinciden con esa bacteria, solo para estar más seguro
se recomienda realizar la prueba de ureasa nuevamente ya que muestra +/- lo que
determina que es una seguridad del 50%-50% ya si se realiza de nuevo la prueba
tendremos más seguridad de que se trata de esa bacteria.
CONCLUSIÓN
La identificación de las cepas fue una manera complicada a la hora de la
interpretación de los resultados ya que algunas presentaban contaminación o
también en los resultados de las pruebas bioquímicas daban interpretaciones como
falsos/positivos por lo que se sugiere que para obtener un mejor aislamiento de las
cepas sembrarlas en medios de cultivo selectivos para cada cepa y también que se
realicen nuevamente pruebas bioquímicas con falsos/positivos para tener una mejor
respuesta de la prueba y estar más seguros del resultado de dicha prueba.
REFERENCIAS
-Bou, G., Fernández-Olmos, A., García, C., Sáez-Nieto, J. A., & Valdezate, S.
(2011). Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología.
Enfermedades infecciosas y microbiología clínica, 29(8), 601-608.
-Mora, X. (2012). Diferenciando bacterias Gram+ y Gram-.
-Olmos, A. F., de la Fuente, C. G., Nieto, J. A. S., & Ramos, S. V. (2010). Métodos
de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Procedimientos en
Microbiología Clínica, 5-9.
-Gobernado, M., & López-Hontangas, J. L. (2003). Identificación bacteriana. Enferm
Infecc Microbiol Clin, 21(Supl 2), 54-60.
