ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN
MOLECULAR
ANÁLISIS INSTRUMENTAL FARMACÉUTICO
LUMINISCENCIA
• Proceso de emisión de luz por un
elemento provocada en condiciones
de temperatura ambiente, en forma
de radiación.
• Moléculas de analito se excitan para
generar una especie cuyo espectro
de emisión suministra información
para análisis cualitativo y
cuantitativo.
• Determinación cuantitativa de
especies inorgánicas y orgánicas
presentes en trazas.
Fluorescencia
Fotoluminiscencia
Fosforescencia
Luminiscencia
Quimioluminiscencia Bioluminiscencia
EMISIÓN DE FLUORESCENCIA
La absorción de la luz de excitación eleva la
molécula a un estado de excitación con un mayor
contenido de energía.
En este estado de excitación se mantienen un tiempo
determinado, en el cual la molécula sufre cambios
conformacionales e interacciona con las moléculas
de su entorno . Como consecuencia, parte de la
energía del estado se disipa, creándose un estado
de menor energía
Pasado este tiempo de excitación la molécula emite
luz de menor energía volviendo a su estado
fundamental.
FACTORES QUE INTERFIEREN EN FLUORESCENCIA
• CONCENTRACIÓN DEMASIADO ALTA, LUZ EMITIDA ABSORBIDA POR MOLÉCULAS INEXCITADAS.
• ÁTOMOS PESADOS EN SOLUCIÓN COLISIONAN CON MOLÉCULAS YA EXCITADAS.
(ENFRIAMIENTO COLISIONAL)
• FORMACIÓN DE COMPLEJOS QUÍMICOS CON OTRAS MOLÉCULAS CAMBIA
COMPORTAMIENTO DE FLUORESCENCIA. (CAFEÍNA-RIBOFLAVINA)
EFECTOS EN LA FLUORESCENCIA
• RIGIDEZ ESTRUCTURAL
• TEMPERATURA Y DEL SOLVENTE
• PH
• CONCENTRACIÓN
INSTRUMENTACIÓN
ɸ= 1
ɸ= 0
FLUORÓMETRO
ESPECTROFLUORÓMETRO
MOLÉCULAS QUE EXHIBEN FLUORESCENCIA
MOLÉCULAS QUE PUEDEN SER DERIVATIZADAS
Aluminio como complejo de 8-hydroxiquinolona
Excitación 392 nm y Emisión 518 nm
Cuantifica niveles bajos de iones metálicos
FLUORIMETRÍA DE PROTEÍNAS • SE REALIZAN CONTROLES DE CALIDAD EN LAS
PROTEÍNAS INMUNOGÉNICAS, YA QUE LOS
CONTAMINANTES AFECTAN SU ACTIVIDAD
CAMBIANDO SU ESTRUCTURA TERCIARIA.
• PUEDEN FORMAR AGREGADOS, QUE AL PRECIPITAR
ALTERAN LA EFICACIA DE LA DROGA.
• ESTE MÉTODO SIGUE LOS CAMBIOS DE LAS
PROTEÍNAS Y EL FACTOR DEL CRECIMIENTO DE
FIBROBLASTO.
• FLUORESCENCIA, PRESENCIA DE RESIDUOS DE
TIROSINA Y TRIPTÓFANO
• CAPAZ DE CUANTIFICAR CANTIDAD DE PROTEÍNA
DESNATURALIZADA EN SOLUCIÓN.
Tirosina (excitación 277 nm y emisión 305 nm)
Triptófano (excitación 290 nm y emisión 350 nm)
FORTALEZAS
• MOLÉCULAS ÚNICAMENTE DETECTADAS POR ESPECTROSCOPÍA POR FLUORESCENCIA.
• PUEDE UTILIZARSE UN MÉTODO DE DETECCIÓN SELECTIVA PARA CUANTIFICAR UN
COMPUESTO FUERTEMENTE FLUORESCENTE EN PRESENCIA DE UNA MAYOR CANTIDAD
DE MATERIAL NO FLUORESCENTE.
• SE PUEDE USAR PARA MONITOREAR CAMBIOS EN MOLÉCULAS COMPLEJAS COMO
LAS PROTEÍNAS, QUE SE USAN CADA VEZ MÁS COMO MEDICAMENTOS.
LIMITACIONES
• LA TÉCNICA APLICADA SOLO A UN NÚMERO LIMITADO DE MOLÉCULAS.
• LA FLUORESCENCIA ESTÁ SUJETA A LA INTERFERENCIA DE LAS ESPECIES QUE
ABSORBEN LOS RAYOS UV, LOS IONES PESADOS EN SOLUCIÓN Y ADEMÁS SE
PUEDE VER AFECTADA POR LA TEMPERATURA.
APLICACIONES
• DETERMINACIÓN DE FÁRMACOS FLUORESCENTES EN FORMULACIONES DE DOSIS BAJAS EN
PRESENCIA DE EXCIPIENTES NO FLUORESCENTES.
• EN LA REALIZACIÓN DE PRUEBAS DE LÍMITE DONDE LA IMPUREZA ES FLUORESCENTE O
SIMPLEMENTE SE PUEDE HACER FLUORESCENTE.
• ÚTIL PARA ESTUDIAR LA UNIÓN DE FÁRMACOS A COMPONENTES EN FORMULACIONES
COMPLEJAS.
• AMPLIAMENTE UTILIZADO EN BIOANÁLISIS PARA MEDIR PEQUEÑAS CANTIDADES DE FÁRMACO
Y PARA ESTUDIAR LA UNIÓN A LAS DROGAS.
EMISIÓN DE FOSFORESCENCIA
• TIPO DE LUMINISCENCIA (FOTOLUMINISCENCIA)
• MÉTODO QUE CONSISTE EN LA EMISIÓN DE LUZ TRAS ABSORBER ENERGÍA DE
UNA RADIACIÓN.
• ELECTRONES ABSORBEN ENERGÍA DE FOTONES Y PASAN DE UN ESTADO BASAL
A UNO DE MAYOR ENERGÍA.
• CUANDO VUELVE A SU ESTADO BASAL, SE EMITE LA ENERGÍA.
• NO NECESITA GRANDES TEMPERATURAS.
INSTRUMENTACIÓN
(FOSFORÍMETRO)
APLICACIONES
• DETERMINA COMPUESTOS ORGÁNICOS, BIOQUÍMICOS QUE INCLUYEN SUSTANCIAS COMO
ÁCIDOS NUCLEICOS, AMINOÁCIDOS, ENZIMAS, HIDROCARBUROS Y PESTICIDAS.
• AMPLIAMENTE UTILIZADO EN BIOANÁLISIS PARA MEDIR PEQUEÑAS CANTIDADES DE FÁRMACO Y
PARA ESTUDIAR LA UNIÓN A LAS DROGAS
QUIMIOLUMINISCENCIA
• EMISIÓN DE LUZ CAUSADA POR UNA
REACCIÓN QUÍMICA ESPECÍFICA.
• BIOLUMINISCENCIA
• EMPLEADAS PARA DETECTAR EXISTENCIA DE
SUSTANCIAS QUÍMICAS EN BIOPSIAS DE
TEJIDOS.
• PROTEÍNA CARACTERIZADA A ALGUNA
ENFERMEDAD, UN ANTICUERPO CONTIENE
SUSTANCIA QUIMIOLUMINISCENTE.
A+B C*+D
C* C+hv
ANÁLISIS DE GASES
Originados para determinar
contaminantes atmosféricos, como ozono,
óxidos de nitrógeno o compuestos
azufrados.
Determinar compuestos azufrados en
la atmosfera en cromatografía.
ANÁLISIS ESPECIES INORGÁNICAS EN FASE LIQUIDA
Reacciona con el oxigeno,
peróxido de hidrogeno, ion
hipoclorito, permanganato.y
otros agentes oxidantes
fuertes.
Quimioluminiscencia es proporcional
a la concentración de oxidante,
catalizador o luminol.
ANÁLISIS DE ESPECIES ORGÁNICAS
Reacciones enzimáticas
Etapas enzimáticas sucesivas
BIOLUMINISCENCIA:
LUMINOMETRÍA
• EFECTO BIOLUMINISCENTE GENERADO POR
REACCIÓN DE ATP Y UN COMPLEJO ENZIMÁTICO.
(LUCIFERIN-LUCIFERASA)
• PRODUCE ONDA LUMÍNICA HASTA 562 NM
PROPORCIONAL AL ATP.
• SE APLICA PARA EVALUAR CONDICIONES DE
INOCUIDAD EN ALGÚN PROCESO.
FORTALEZAS
• POSEE ALTA SELECTIVIDAD, ES SENCILLO Y POSEE UNA EXTREMA SENSIBILIDAD.
• MUY SENSIBLES PORQUE EN AUSENCIA DE RUIDO SE PUEDEN REALIZAR CON
BAJOS NIVELES DE LUZ.
• NO TIENE LA NECESIDAD DE DESTRUIR LA MUESTRAS YA QUE NO NECESITA ALTAS
TEMPERATURAS.
ESPECTROSCOPÍA RAMAN
ØANÁLOGO A LA FLUORESCENCIA.
ØNO DEPENDE DE LA LONGITUD DE
ONDA.
ØNO NECESITA QUE LA MOLÉCULA
TENGA CROMÓFORO.
ØBANDAS MEDIDAS EN LA MOLÉCULA
CORRESPONDEN AL IR MEDIO.
INSTRUMENTACIÓN
SISTEMA DE ILUMINACIÓN DE LA MUESTRA:
Muestras gaseosas Muestras líquidas
vRecipientes de vidrio. Se introduce el v Contenidos en ampollas, tubos de
gas en capilares pequeños y luego se vidrios o capilares sellados.
sellan.
v Rayo láser se enfoca en zona
vCon dispersores débiles se utiliza un cercana a pared, reduciendo
aparato externo. mínimo de absorción del rayo
incidente.
vRaman es perpendicular al tubo de
muestra y el haz de laser se enfoca v El agua no interfiere en la lectura
mediante un lente potente hacia la de la muestra.
rendija.
SISTEMA DE ILUMINACIÓN DE LA MUESTRA:
MUESTRAS SÓLIDAS
• CAPILAR CON MUESTRA PULVERIZADA.
• LECTURA SIN TRATAMIENTO PREVIO.
• EN ALGUNOS CASOS SE UTILIZA PASTILLA DE
KBR SIMILARES A IR.
• RAMAN CON SONDA DE FIBRA ÓPTICA.
• OBJETIVO DE MICROSCOPIO ENFOCA
RADIACIÓN LASER QUE TRANSPORTAN EL RAYO
HASTA LA MUESTRA.
• TRANSDUCTOR TRANSFORMA LA INTENSIDAD
DE LUZ DIFUNDIDA EN CORRIENTE
PROPORCIONAL.
FORTALEZAS
• PORTA MUESTRAS DE DIFUSIONES RAMAN NO POSEEN ATAQUES DE HUMEDAD Y LA
• CANTIDAD DE AGUA PRESENTE NO INTERFIERE.
• COMPLEMENTARIO A LA ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO MEDIO.
• REQUIERE MUY POCA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA YA QUE SE PUEDE USAR RADIACIÓN
DE INFRARROJO CERCANO (N-IR) CON SUS PROPIEDADES PARA EL ANÁLISIS.
• CADA VEZ MÁS, UNA OPCIÓN DISPONIBLE EN LOS INSTRUMENTOS FT-IR DE IR MEDIO.
LIMITACIONES
• AÚN NO ESTABLECIDO PLENAMENTE COMO TÉCNICA CUANTITATIVA.
• EL DISOLVENTE PUEDE INTERFERIR SI LAS MUESTRAS SE PROCESAN EN SOLUCIÓN.
APLICACIONES
• TIENE POTENCIAL PARA IDENTIFICAR MUESTRAS COMPLEJAS, POR EJEMPLO, MEDICAMENTOS EN
FORMULACIONES.
• LAS MUESTRAS COMO PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PEPTÍDICOS PUEDEN ANALIZARSE PARA DETECTAR
CAMBIOS EN SU ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL.
• PROPORCIONA INFORMACIÓN ADICIONAL DE IDENTIDAD DE HUELLAS DACTILARES COMPLEMENTARIA AL
IR MEDIO ESPECTROSCOPIA
• RÁPIDO FINGERPRINTING DE FÁRMACOS, ANÁLISIS DE FÁRMACOS EN SUS FORMULACIONES Y
APLICACIÓN CUANTITATIVA, CONTROL DE MEDIDAS POLIMÓRFICAS DE FÁRMACOS EN COMPRIMIDOS.
FINGERPRINTING EN FÁRMACOS
ANÁLISIS DE FÁRMACOS EN SUS FORMULACIONES
APLICACIÓN CUANTITATIVA
CONTROL DE MEDIDAS
POLIMÓRFICAS DE
FÁRMACOS EN
COMPRIMIDOS
(Meprobamato)
