UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

"Año de la lucha contra la corrupción e impunidad"

CURSO: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

INFORME DE PRÁCTICA Nº2
TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

INTEGRANTES:
● 20171299 Carrillo Bronchu, Jeffrey
● 20110452 Córdova Galán, Sthefany Patricia
● 20170331 Fuentes Montesinos, Pedro Pablo
● 20161117 Sanchez Ccorahua, Joe Wilians
● 20121361 Yaranga Yaranga, Gisela

PROFESOR : Ramos Chaupin, Roberto

FECHA DE LA PRÁCTICA: 05/07/2019
MESA N°2

2019 - II
LA MOLINA - LIMA
I. INTRODUCCIÓN
 Debido a que gran parte de los microorganismos son incoloros cuando son observados
a través del microscopio, es preferible para su estudio, teñirlos de algún color. La
tinción simple, en donde se un colorante básico único, tiene como propósito destacar
la forma y estructuras celulares básicas del microorganismo. La tinción diferencial,
método que será estudiado más a fondo en este informe, es empleada para la
distinción entre bacterias, según cómo reaccionan las paredes de las mismas con los
colorantes utilizados. Las dos tinciones diferenciales más usadas actualmente son “la
tinción de Gram” y “la tinción de ácido-alcohol resistencia”. (Tortora et al., 2007)

La tinción diferencial de Gram, introducida por Hans Christian Gram en 1884,

comprende una de las características taxonómicas más importantes, pues agrupa a
las bacterias en dos grupos: Las Gram positivas y las Gram negativas. Luego del
proceso de tinción, que será explicado posteriormente, se reconoce como Gram
positiva a aquellas bacterias que retienen el complejo colorante-yodo, por tanto, el
color azul/violeta y como Gram negativas aquellas que son decoloradas por el alcohol
y podrán ser observadas mediante un contrastante. (Schlegel, 1996)

En esta práctica, se estudiará el efecto de la tinción diferencial en muestras de E. coli,

Bacillus sp. Y Staphilococcus sp.

II. OBJETIVOS
● Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de dos
grupos principales de bacterias.

III. MARCO TEÓRICO

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se

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utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria
Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.

Fue desarrollada por Hans Christian Gram en 1884 y consiste es una mezcla de
sustancias coloreadas que se aplica sobre una muestra bacteriana. Primero se aplica
una solución de cristal violeta, un colorante que tiñe todas las células bacterianas,
tanto Gram negativas como Gram positivas, y da una coloración azul – morada a las
bacterias. Posteriormente se aplica una mezcla yodo y lugol que fija el cristal violeta.
Después se lava la muestra con una mezcla de alcohol y acetona que es capaz de
disolver el cristal violeta y decolorar las bacterias. Algunas bacterias no se decoloran
y permanecen azules. Para ver mejor las bacterias que si se decoloraron se aplica otro
colorante, generalmente safranina o fucsina, que dan un color rosa a las bacterias.
Así, quedan bacterias teñidas de azul (Gram positivas) y bacterias teñidas de rosa
(Gram negativas).

Esta diferencia de coloración se debe a la existencia de 2 tipos de bacterias:

a. Bacterias Gram Positivas: Son aquellas que se tiñen de azul oscuro o violeta
por la tinción de gram. La pared celular de las bacterias Gram positivas está
formada en un 90% por peptidoglucano, siendo éste el principal componente
que permite diferenciarlas de las Gram negativas, puesto que logra mantener
la coloración del cristal violeta en el interior de la célula al teñirla con la tinción
Gram. Además del peptidoglucano, ésta se encuentra compuesta de ácidos
teicoicos, los cuales están presentes en pequeñas cantidades. Éstos se
presentan embebidos en la pared de la bacteria como polisacáridos ácidos.
b. Bacterias Gram Negativas: Son aquellas que se tiñen de rosa o rojo grosella
por la tinción de gram. La pared celular de las bacterias Gram negativas está
formada por dos membranas lipídicas, una interna (citoplasmática) y otra
externa, con un espacio entre ellas denominado espacio periplasmático en el
que se dispone una capa de peptidoglucano. La membrana externa de las
bacterias Gram negativas es una bicapa lipídica de estructura similar a la
membrana citoplasmática. En esta membrana se pueden encontrar diversas
proteínas; una de las más características son las porinas, unas proteínas que
forman canales por los que pueden pasar determinadas sustancias y que no
se encuentran en la membrana citoplasmática.

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 Tabla 1: Diferencias entre los 2 tipos de bacterias

Gram positivas Gram negativas

Pared celular simple, con una capa gruesa Doble membrana lipídica y una capa fina de
de peptidoglucano y una sola membrana peptidoglucano en el espacio periplasmático.
lipídica.

No posee una capa externa de Posee una capa externa de

lipopolisacáridos. lipopolisacáridos.

Sin canales de porinas. Posee canales de porinas.

Retienen el cristal violeta (coloración Retienen la safranina (coloración

azul/violeta) rojo/rosado)

Si poseen flagelos, estos tienen 2 anillos de Si poseen flagelos, tienen 4 anillos de apoyo
apoyo. (2 por cada membrana).

Sensible a la penicilina. Resistente a la penicilina.

Fuente: Elaboración propia
Los tiempos de aplicación de cada solución son los siguientes:
● Cristal violeta (colorante básico) = 30”
● Lugol (mordiente) = 30’’ a 60’’
● Alcohol-cetona (agente decolorante) = 10’’ a 20’’
● Safranina (contrastante) = 30’’
La duración de cada paso no es crítica, y puede variar en unos segundos y hasta 5 minutos.
De hecho los reactivos pueden aplicarse sucesivamente con tanta rapidez como permita la
manipulación de los colorantes. La decoloración es la fase más crítica. La tendencia es
siempre decolorar excesivamente, lo cual hace que las bacterias gram positivas parezcan
gram negativas. Hay que lavar el portaobjetos con acetona-alcohol hasta que deje de
colorearse la solución de azul en las zonas menos gruesas. A continuación hay que lavar el

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portaobjetos y dejar secar el contenido al aire para posteriormente estudiarlas en el
microscopio. En caso de urgencia, puede secarse con papel absorbente. Sin embargo, a pesar
que se seque de la forma más cuidadosa posible, siempre se arrastra parte del material.

La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen pared,
como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán identificar, al igual que los virus. Existen
bacterias que dan respuestas a la tinción de Gram que no se corresponde con la estructura
real de su pared celular. Por ejemplo, existen bacterias con una estructura de pared celular
Gram positiva pero con una capa delgada de peptidoglicano que dan negativo en la tinción de
Gram. Incluso hay bacterias con una sola membrana y sin peptidoglicano (mycoplasmas) que
también dan negativo en la tinción de Gram aunque están estructuralmente más relacionadas
con las bacterias Gram positivas. Por este motivo, aunque la tinción de Gram sigue siendo
ampliamente utilizada como método de aproximación diferencial, la definición de bacteria
Gram negativa y bacteria Gram positiva en función de su respuesta a la tinción de Gram no
es del todo fiable.

La respuesta a la tinción de Gram también se utilizó como clasificación taxonómica

(Negibacterias y Posibacterias) pero con el desarrollo de la biología molecular se pudo
comprobar que esta clasificación no forma grupos filogenéticos coherentes. La línea
monofilética de las Gram negativas fue desacreditada definitivamente en 1987 con el estudio
de Carl Richard Woese sobre la evolución bacteriana.

Todos estos hechos hacen que los términos Gram negativa y Gram positiva sean actualmente
ambiguos pudiendo referirse a una clasificación taxonómica, a un tipo de estructura de pared
celular o la respuesta a la tinción de Gram. Dado que la presencia de una o dos membranas

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lipídicas rodeando a la célula son los dos principales tipos de ultraestructuras de células
procariotas, se han propuesto otros nombres para referirse de forma específica a esta
característica. El microbiólogo Gupta propuso en el año 2000 los términos monoderma y
diderma para referirse a bacterias con una o dos membranas respectivamente. También se
propuso estos términos como aplicables de forma general para referirse a las características
de cualquier célula procariota.

Entre las bacterias Gram negativas muchas son patógenos para el ser humano y la estructura
de la pared celular de estas bacterias tiene un papel destacado tanto en la patogenicidad
como en el tratamiento. Por un lado, el lípido A (la parte lipídica del lipopolisacárido) es una
endotoxina y es capaz de estimular respuestas del sistema inmunitario generando una
reacción tóxica responsable de muchos de los efectos patógenos. Entre los efectos tóxicos
más importantes del lípido A está la estimulación de la respuesta inflamatoria y fiebre. El
mecanismo de acción está relacionado con la activación de los macrófagos, los cuales liberan
Interleucina-1, factor de necrosis tumoral y óxido nítrico que desencadenan la respuesta
inflamatoria y la fiebre.

Por otro lado, la membrana externa supone una barrera de protección que impide o dificulta
la actividad de agentes antimicrobianos como pueden ser antibióticos o detergentes
antisépticos. Por ejemplo, la membrana externa de las bacterias Gram negativas es la
responsable de que sean resistentes a la lisozima y a la penicilina. No obstante, hay
disponibles antibióticos con actividad frente a las bacterias Gram negativas, por ejemplo, la
estreptomicina o la ampicilina.
IV. MATERIALES Y MÉTODOS

a. Materiales

● Cultivos jóvenes de microorganismos (18-24 hs):

Bacillus sp, Staphylococcus sp, Escherichia coli sp.

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● Colorantes básicos:
○ Cristal violeta y Safranina
○ Mordiente: Lugol
○ Decolorante: Alcohol-cetona

● Papel secante
● Asa de Kölle
● Lámina porta objetos
● Mechero de alcohol
● Piseta de agua
● Aceite de cedro
● Soporte para tinción

b. Procedimiento

Se usarán cultivos de bacterias jóvenes que difieran en el tipo de su pared celular y

morfología.

Preparar un frotis bacteriano con cada uno de los microorganismos proporcionados :

Staphylococcus sp., Bacillus sp. y Escherichia coli sp.

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 1. Agregar el colorante básico ( cristal violeta) y dejar actuar por 30 segundos.
2. Lavar con abundante agua destilada el exceso de colorante.
3. Cubrir la película teñida con lugol y dejar actuar por 30 segundos.
4. Lavar con agua destilada el exceso de lugol.
5. Decolorar con alcohol-acetona hasta que la preparación deje de perder color (2-3
lavadas).
6. Lavar con abundante agua destilada para eliminar el resto de disolvente.
7. Teñir la muestra con safranina por 30 segundos.
8. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
9. Retirar con papel secante rastros de humedad que queda en la muestra.
10. Aplicar una gota de aceite de cedro.
11. Examinar las preparaciones teñidas bajo el objetivo de inmersión (1000x) de un
microscopio compuesto.

TECNICA DE TINCION DE GRAM

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V. OBSERVACIÓN / RESULTADOS

● Se pudo observar que el Staphylococcus sp y el Bacillus sp retuvieron el colorante

primario (cristal violeta) por lo tanto son bacterias Gram (+).
● En la observación de la Escherichia coli se pudo observar algunos pequeños rastros
del colorante cristal violeta esto a causa de que la muestra no estaba tan pura.
VI. DISCUSIÓN

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 ● Los fundamentos de la técnica de Tinción de Gram se basan en la capacidad
de diferenciar entre las paredes celulares de la bacterias Gram positivas y
Gram negativas.
● La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una pared celular
gruesa con hasta 40 capas de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos
teicoicos: el ácido lipoteicoico se encuentra anclado en la cara interna de la
pared celular y unido a la membrana plasmática,y en la superficie, el ácido
teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (conocido como
mureína).
● Mientras que la capa de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida
a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la
interna) por medio de lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de
proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias
se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared.
● La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que
la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol-acetona. La capa de peptidoglucano
que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se
escapa, perdiéndose la coloración azul-violeta.
● Caso contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente
y con mayor proporción de peptidoglucano, no son susceptibles a la acción del
solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo
que impide que pueda escaparse el complejo formado cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloración azul-violeta. Como se pudo observar en las
bacterias Staphylococcus sp y Bacillus sp.
● Según Stearn (1923), los microorganismos Gram(+) pueden hacerse Gram (-)
al aumentar la acidez . Los microorganismos Gram(-) pueden hacerse Gram
(+) al aumentar la alcalinidad .

VII. CONCLUSIÓN

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 ● La capa gruesa de peptidoglucano en las Gram positivas, es la responsable de fijar la
coloración primaria en el espacio periplasmático, impidiendo que el complejo yodo-
colorante se pierda.
● Debido a la avanzada edad de algunas bacterias, como se vio en el caso de la muestra
de Bacillus sp., pueden llegar a no retener el colorante primario, por lo que pueden ser
confundidas como bacterias Gram negativas.

VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Bajo qué circunstancias la tinción diferencial de Gram podría resultar errática?

La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo,
cuando más antigua sea la muestra, más riesgo de que la pared bacteriana se
encuentre dañada. El pH del medio también influye en la tinción pues se requiere que
las células mantengan su carga negativa para la interacción correcta con los
colorantes, esto sucede a pH neutro o cercano al neutro.

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos
viejos de bacterias Gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse
como Gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy
prolongado se puede correr el riesgo que bacterias Gram positivas se tiñen como Gram
negativas). Es por esta situación deben teñirse controles con bacterias Gram positivas
(ej. S. aureus) y Gram negativas (E. coli)

2. ¿Qué efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante?

Ninguna ya que cumpliría la misma función de incrementar la afinidad del colorante

primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal
violeta- yodo sirve para intensificar el color del teñido, así que no se produciría un
efecto si el lugol es reemplazado por otro agente oxidante.

3. ¿Podría Ud. variar el colorante primario y contrastante obteniendo los mismos

resultados?

Se puede variar el colorante primario mientras sea básico para que tiñe las células, en
cuanto al colorante de contraste sirve para poner de manifiesto las células Gram
negativas.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina; sin
embargo, no es crucial para la técnica. Entonces, sí se lograría reconocer el grupo al
que pertenecen las bacterias, aunque se cambien los colorantes.

4. ¿Cuál es la influencia del pH en la reacción de Gram?

El pH tiene un papel muy importante en la tinción de Gram, hay que tomar en cuenta
que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de pH 7 – 7.8 ya que las

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 bacterias Gram positivas pueden parecer Gram negativas si la acidez aumenta y las
Gram negativas pueden parecer Gram positivas si la alcalinidad aumenta.

5. Liste cinco ejemplos de bacterias Gram positivas y cinco de Gram negativas,

señalando su importancia.

a. Bacterias Gram positivas:

● Staphylococcus aureus: Bacteria ampliamente distribuida en la población

humana, presente en la epidermis y que puede desencadenar patologías de
amplio espectro, desde conjuntivitis hasta neumonía.
● Enterococcus faecalis: Bacteria comensal que habita en el tracto intestinal de
algunos mamíferos y que tiene particular importancia biomédica por haber
adquirido inmunidad respecto a casi todos los antibióticos en uso. Mayormente
causa enfermedades intrahospitalarias.
● Streptococcus pyogenes: Con gran relevancia médica por ser uno de los
patógenos más comunes en humanos, son causantes de enfermedades
supurativas y no supurativas.
● Bacillus anthracis: Bacterias causantes de la enfermedad de “ántrax” o el
síndrome de la piel negra, patógena en el ganado y en humanos.
● Bacillus thuringiensis: Bacterias benéficas para el control de plagas en la
agricultura, poseen en su interior cristales con efecto insecticida.

b. Bacterias Gram negativas:

● Pseudomonas aeruginosa: Patógeno oportunista en animales y plantas

inmunocomprometidos.
● Neisseria gonorrhoeae: Diplococo de importancia médica que causa la
gonococia, enfermedad de transmisión sexual en humanos.
● Chlamydia trachomatis: Bacteria intracelular obligada y patógena sólo en
humanos que causan traucomas, ceguera, infecciones óculo genitales y
neumonías.
● Yersinia pestis: Bacilo patógeno primario con importancia epidemiológica,
causante de las pestes pulmonar y bubónica.
● Rhizobium leguminosarum: Bacteria benéfica para la agricultura, fijadora de
nitrógeno atmosférico en simbiosis con las plantas.

6. ¿Cuál es el principio de la tinción Gram?

a. El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por
sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.
por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.

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 b. Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre
una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la
pared celular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el
lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se
disuelva y se pierda el colorante durante el [Link] sabemos que la pared de
los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran
afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son
agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez
de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico
cristal violeta.

c. La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared

bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta
a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, pero las dos
más aceptadas son:

● Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano

de los microorganismos Gram positivos lo cual cierra los poros de la pared,
propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-
lugol. En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco péptidoglicano y
una gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona,
lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.

● Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de
peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos
los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de
barrera en la pared bacteriana que no permite la salida del complejo cristal
violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso
de decoloración.

d. La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas
tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram
negativas se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se
tiñen debido a que su pared celular está saturada del colorante cristal violeta y esto
no permite la entrada de la safranina.

e. Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de

colorante y quitar el alcohol-acetona.

IX. BIBLIOGRAFÍA
● Schlegel, H. G. (1996). Microbiología general. Barcelona, España: Ed. Omega.
● Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introducción a la microbiología (9ª
ed.). Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica Panamericana Sa de.
● Paul D. Hoeprich, M. D. (1982) Tratado de enfermedades infecciosas. Tomo I. Pág.
77. Edición Revolucionaria. La Habana, Cuba.

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● Woese, Carl Richard (Junio 1987). "Bacterial evolution". Microbiol. Rev. 51 (2): 221–
71. PMID 2439888.
● Rojas Campos, Norman. "El lipopolisacárido bacteriano: una potente endotoxina con
múltiples actividades biológicas". Recuperado de:
[Link]
● Gupta RS (2000). "The natural evolutionary relationships among prokaryotes". Crit.
Rev. Microbiol. 26 (2): 111–31. doi:10.1080/10408410091154219.
● Wilhelm, M. J., Sheffield, . B., Sharifian, M., Wu, Y., Spahr, C., Gonella, G., Xu, B., y
Dai, H.. (2015). Gram’s Stain Does Not Cross the Bacterial Cytoplasmic Membrane.
ACS Chemical Biology. DOI: 10.1021/acschembio.5b00042
● [Link] (31 julio, 2018). "¿Qué es una bacteria Gram negativa?".
[Link]
● Guia de Laboratorio de Microbiología General.
● Guedea Fernández G. Tinción de Gram. URL disponible en:
[Link] Accedido
en fecha 07 de septiembre de 2019.

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