Tesis de Posgrado

Identificación y distribución de la
hormona hipofisaria Somatolactina
en el pejerrey, Odontesthes
bonariensis (Teleostei,
Atherinidae) : Su relación con el
ciclo gonadal"
Vissio, Paula Gabriela
2000

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias

Biológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca

Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico
Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding
citation acknowledging the source.

Cita tipo APA:

Vissio, Paula Gabriela. (2000). Identificación y distribución de la hormona hipofisaria
Somatolactina en el pejerrey, Odontesthes bonariensis (Teleostei, Atherinidae) : Su relación con
el ciclo gonadal". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3283_Vissio.pdf

Cita tipo Chicago:

Vissio, Paula Gabriela. "Identificación y distribución de la hormona hipofisaria Somatolactina en
el pejerrey, Odontesthes bonariensis (Teleostei, Atherinidae) : Su relación con el ciclo gonadal"".
Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2000.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3283_Vissio.pdf

Di recci ón: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Contacto: [email protected]
Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Hay gente que con solo decir una palabra, enciende la ilusión y
los rosales
Que con solo sonreír entre los ojos, nos invita a viajar por otras
zonas, nos hace recorrer toda la magia
Hay gente que con solo dar una mano, rompe la soledad, pone
la mesa, sirve el puchero, coloca las guirnaldas
Que con solo empuñar una guitarra, hace una sinfonía de
entrecasa
Hay gente que con solo abrir la boca, llega hasta los límites del
alma, alimenta una flor, inventa sueños, hace cantar el vino en
las tinajas
Yse queda después como si nada
Y uno se va de novio con la vida, desterrando una muerte
solitaria, Pues sabe que a la vuelta de la esquina, hay gente que
es asi, tan necesaria.
H. Lima Quintana

Esta Tesis se la dedico a mis Padres, por darme

mucho mas que la vida (de alguna manera hoy están
conmigo)
Ya Fabio, Fermin y Emiliano que me hacen sentir
de novia con la vida.
Agradecimientos:

Son muchas a las personas que debe agradecer. A cada uno le debo un poquito
de esta Tesis ya que cada uno me ayudo de diferente manera. Gracias! !!:

A Cristina, mi Directora de Tesis, porque siempre confió en mí y en mi trabajo.

Porque siempre me demostró un gran respeto y me permitió trabajar en libertad. Porque
jamás se opuso a una idea o a un proyecto y sobre todo porque siempre sentí que antes
de ser una becaria era una persona. Muchas gracias!

Al Dr. Carlos Strüssman, por las muestras de hipófisis de pejerrey. Le agradezco

especialmente el apoyo que siempre me brindó y la confianza en mi trabajo.

_ A los investigadores que me enviaron los diferentes antisueros: Dr. Astola, Dr.
Kawauchi, Dr. P. Thomas, Dr. R. Peter y Dra. M. Rand-Weaver.

Al Lic. G. Berassain y la Lic. Marcela Berassain (Secretaria de Pesca y Recursos

Naturales, Ministerio de Asuntos Agrarios, Provincia de Buenos Aires) por los peces
que nos facilitaran gentilmente.

A La Dra. D. Becú-Villalobos por cedemos la buserelina utilizada en esta Tesis.

Al Dr. Jorge Florin-Cristensen por el uso del flujo laminar y las instalaciones del
laboraton'o 55.

Al Dr. Boltovskoy y la gente de su laboratorio por permitimos utilizar el

microscopio invertido.

A la Universidad de Buenos Aires, por darme la beca que me permitió realizar

mi Tesis Doctoral. Le quiero agradecer que todavía y a pesar de todo siga permitiendo
que todos tengamos el mismo derecho a estudiar.

Al departamento de Ciencias Biológicas en donde puede realizar este trabajo, y

en donde encontré tanta gente que siempre me brindó su apoyo.

A los Docentes que me dieron lo mejor de si.

A Dante, porque trabajar juntos file una de las cosas mas lindas que me pasó.
Gracias por estar siempre a mi lado ayudándome, muchas veces dejando tus propias
cosas de lado. Vos sabes cuanto te quiero, y no es chiste cuando te digo que sos como
un hermano.
 A Mario. Sin tu ayuda creo que todavia estaria escribiendo el titulo de la Tesis.
Gracias por todas las campañas que compartimos en el Ford de Clemente y por las que
fuiste a buscar muestras para mi. Gracias por las horas frente a la computadora
enseñándome a usar el Corel. Pero sobre todo gracias por ser tan pero tan buen amigo.

A Fabi, porque en este momento estaría tapada por una montaña de papeles,
tratando de buscar alguno importante. Creo que en estos años me acostumbre muy mal a
tener al lado alguien tan prolijo. Gracias por estar siempre dispuesta a darme una mano
y gracias por tantos momentos hermosos que vivimos y seguiremos viviendo.

A Andrea, mi hermanita macana. Ojalá siguiéramos trabajando juntaslll. Nunca

me voy a olvidar de los experimentos eternos, de los que salieron bien y los que salieron
mal. Porque cada uno lo hicimos con tanto entusiasmo que hasta Valentina adentro de la
panza hacia fuerza para que salieran bien. Son una persona muy especial, te quiero
mucho! .

A Gustavo, el Mono. Por enseñarme tantas cosas. Por “presentarme” al pejerrey.

Por confiar siempre en mí y en mi trabajo. Espero que podamos seguir compartiendo
muchas cosas juntos. Gracias por tu can'ño!

A Graciela, mi consejera de Tesis, por su apoyo permanente. Por preocuparte

siempre por todos nosotros.

A la gente del laboratorio 3, Gracielita y Ceci, por compartir tanto tiempo juntas,
por estar siempre dispuestas a darme una mano, gracias. A Juan, por el trabajo que
compartimos juntos. A Fernando y Natalia.

A los pichones del 80, Matías y Luz, porque el entusiasmo y la dedicación que
ponen en el trabajo es contagioso. Estoy muy contenta de que estemos trabajando
juntos.

A Fabián por darme una mano en la marcación de la buserelina y por tanta buena
onda.

Al Gabriel, el Colo y Dani Medesani , por la ayuda que siempre me supieron

dar.

A Georgina, por enseñarme los secretos del cultivo celular.

Al Bata por acompañarnos a buscar pejerreyes a Chascomúsy preocuparse que

llegaran bien.
 A toda la gente que conocí en estos años y que siempre me demostraron mucho
afecto. Especialmente a Titina, Andrea P., Pablo C. Pablo P., Carina, Juan, Anita, Rafa,
Cristian, la gente del 8] y tantos otros que me debo estar olvidando, perdónl!

A mis amigas del alma: Marilú, Andy, Daniela, Georgina, Andrea, y Mariana.
Porque ser eso, amigas. Las quiero un montónll

A Dani y Fer por tantos años de compartir tantas cosas.

A Gus y Paola, Guille, Lili y Lucas, Flavio, Loma y Mailén. Por su amistad.

A mis hermanos: Mónica, Cecilia, Loni, Juan, Dardo, Marcela y Marina y a Ale.
A cada uno de ellos y a sus familias por estar siempre cuando nos necesitamos.

A Roberto, que file quién me hizo conocer por primera vez esta facultad. por
tantos años compartidos que ya se convirtió en un hermano más.

A mis sobrinos: Roberto, Pepe, Mariana, Rodrigo Diego, Cecilia, Sebastián,

Carolina, Nicolás, Juan Cruz, Bárbara, Juancito, Sarita, Pedro, Gimena, Melina y Ailén.
Porque los quiero mucho.

A mis queridos suegros. Porque siempre están dispuestos a damos una mano.
Pero sobre todo le quiero decirles gracias por tanto amor. Son un lujo de abuelosll.

A Maia, por cuidamos y queremos como a sus propios hijos.

A mi Papá que me transmitió el amor por la Ciencia y la Docencia. A mi Mamá

por tanto amor cotidiano. A los dos, porque me enseñaron a no bajar nunca los brazos,
ni siquiera en el tramo final.

A Fabio, mi gran amor. Porque conservas intacto tus ideales, tus sueños. Porque
tu amor me da energía, me protege pero no me ahoga. porque haberte encontrado fue lo
más hermoso que me pasó en la vida. Porque tenemos los hijos más hermosos. Gracias
porque con vos me pasa esto .......me quedo sin palabras.

A mis hijos, Fermín y Emiliano. Ni juntando todas las palabras del mundo
podría escribirles lo que siento por ustedes. Les quiero decir gracias por su sonrisa, sus
palabras, sus caricias, porque todo eso me llega tan profundamente al alma, me hace tan
felizll. l-lijos, ustedes son mi vida. Los amo! !!.
El contenido de este trabajo de Tesis ha sido parcialmente publicado en:

Vissio, P.G.; Somoza, G.M.; Maggese, M.C. and Paz D.A. (1995). "Localization of
Pituítary Cells by lmmunocytochemistry in the "Argentine silver side" Odonthesles
bonariensis". En Proceedings of the 5th International Symposium on Reproductiva
Physiology qf'Fish. Edime por F.W. Goetz & P. Thomas. pp 39.

Vissio, P.G., Somoza, G.M., Maggese, M.C., Strüssmann, C.A. y Paz. D.A. (l997).
“Structure and Cell type distribution in the pituítary gland of pejerrey Odontesthes
bonariensis”. Fisheries Sciences, vol 63(1), 64-68.

Vissio, P.G., Stefano, A.V., Somoza, G.M., Maggese, M.C. and Paz, D.A. (1999).
"Close association among GnRH fibers and GtH, GH, PRL and SL expressing cells
in pejerrey, Odontesthes bonariensis". Fish Physiology and Biochemistry. 21(2):
121-127.

Stefano, A.V., Vissio, P.G., Paz, D.A., Somoza, G.M., Maggese, M.C. and Banantes,
GE. (1999). “Colocalization of GnRH bindíng sites with gonadotropins,
somatotropin, somatolactin and prolactin expressing cells of the pejerrey,
Odontesthes bonariensis. in vitro". General and Comparative Endocrinology. 116,
133-139.

Vissio, P.G., Paz, D.A., & Maggese, M.C. (1999). Estudio de la somatolactina y su
relación con el ciclo gonadal en el pejerrey, Odontesthes bonariensis. En ler Taller
integral sobre el recurso pejerrey en la Provincia de Buenos Aires. Ministerio de
Asuntos Agran'os, Provincia de Buenos Aires. p. 31-32.

Vissio, P.G., Andreone, L., Paz, D.A., Maggese, M.C., Somoza, G.M. and
Strüssmann, C. (2000). "Somatolactin cells in female of pejerrey, Odontesthes
bonariensis (Atherinidae) pituitary. Changes related with the reproductive status”.
Proceedings of the 6'" International Symposium on Reproductive Physiology
of Fish. Editado por B. Norberg, O.S. Kjesbu, G.L. Taranger, E. Andersson &
SO. Stefansson. pp 494.
 INDICE

página
RESUMEN l

ABSTRACT 3

ABREVIATURAS i

INTRODUCCIONPFNFPM 6

Hipóficie 6

Modelo biológico: el pejerrey 12

HIPOTESIS y OBJETIVOS 19

CAPITULO I: ESTRUCTURA Y DISTRIBUCION DE LOS DIFERENTES TIPOS

CELULARES EN LA HIPOFISISDE PEJERREY 20

I-I INTRODUCCION 20

I-II OBJETIVO 24

I-III MATERIALES y METODOS 24

.A—=m'=- 24

Tratamiento de las muecmq 2;

' " 25

."“""'"“'"“ 26

(‘nmmlm 28

l-lV RESULTADOS

I-V DISCUSION

CAPITULO Il: ANALISIS DE LAS VARIACIONES DE LAS CELULAS PRODUCTORAS

DE SL EN LOS DIFERENTES ESTADIOS REPRODUCTIVOS 40

II-I INTRODUCCION 40
I'J J 40
a)Somatolactina: a
 b)Expresión génica y localización ' ' ' 43

c)Posibles funciones de la QI 44

II-II OBJETIVOQ Sl

lI-III MATERIALES y METODOQ 51

a) Caracterización inmunológica de la SL de la hipóñsis de

pcjcrrey por Western hlm il

SDS-PAGF 52

T ° ' 5';

Western hlm 54

b) Relación entre el volumen de las células productoras de

SL y el estado r ‘

.A¿mh- 55

. . . l , . 55

Detemu'nación de las medidas de las células

productoras de <1 56

Análisis 4' ' 57

II-IV RESULTADOQ 57

a) Caracterización inmunológica de la SL de la

hipófisís de pejerrey por Westem hlm 57

b) Relación entre el volumen de las células

productoras de SL y el estado r ’ ' 58

lI-V DISCUSION 68

CAPITULO III: RELACION ENTRE EL NEUROPEPTLDOLIBERADOR

DE GONADOTROFINAS (GnRH) Y LAS CELULAS PRODUCTORAS DE SL........................... ..72

III-I INTRODUCCION 72

III-ll OBJETIVO 76

III-III MATERIALES y METODOQ 77

 a) Asociación morfológica entre fibras GnRHérgicas y las

células GtH y QI 77

.AMmm 77

Procesamiento de las muestras 77

Doble ' 78

(‘nmmlec 79

b) Determinación de sitios de unión a GnRH en gonadotropos

y células productoras de QI 79

.‘-'—"'" 79

Cultivo primario de células hipnfisnrins 80

Radioiodinación de la ' " 81

Test de ligamiento para sitios de unión a GnRH-A

en hipófisis de mm 82

Localización de los sitios de unión a GnRH 8‘;

' 1 34

III-IV RESULTADOQ Rs

Doble ' 85

Cultivo primario de células hipnfisarinc 86

Caracterización inmunocitoquímica de lascélulas productoras de

GtH y SL cn cultivoprimario de hipófisis 87

Localimción de los sitios de unión a GnRH en las células

ir-GtH e ir-QI 87

III-V DISCUSION 93

CONCLUSIONES FINA! FG 96

BIBLIOGRAFIA 99
 Resumen

RESUMEN

La somatolactina (SL) es una hormona recientemente identificada en peces

teleósteos. Por su estructura pertenece a la familia de la hormona de crecimiento (GH)

y la prolactina (PRL). Su fiJnción es aún poco conocida, pero datos bibliográficos

recientes la relacionan entre otros con los procesos reproductivos.

Con el objeto de estudiar su participación en éstos se establecieron los

_ siguientes objetivos:

Estudiar la distribución de los diferentes tipos celulares de la adenohipófisis

(ADH) y establecer la presencia de células productoras de SL en el

pejerrey, Odontesthes bonariensis.

Determinar la relación entre las variaciones morfométricas de las células SL

y el ciclo gonadal tanto en machos como en hembras de pejerrey.

Establecer si existe una relación entre SL y el neuropéptido liberador de

gonadotrofinas (GnRH).

Los resultados mostraron que las células productoras de las diferentes

hormonas hipofisarias se localizaron en sitios específicos de la ADH. Las células

productoras de PRL y de ACTH en la pars distalis rostral (PDR), las productoras de

hormona de crecimiento (GH), de hormona tirotrófica (TSH) y de gonadotrofinas

(GtHs) en la pars distalis proximal (PDP). Estas últimas también se encontraron en el

borde externo de la pars intermedia (PI) junto con las células presuntivamente

productoras de hormona melanocitoestimulante (MSI-I). Las células secretoras de SL,

reconocidas específicamente con cuatro antisueros se ubicaron en estrecha proximidad

con la neurohipófisis (NH) también en la PI.

 Resumen

El área de las células productoras de SL mostró diferencias significativas entre

hembras activas o vitelogénicas e inactivas o no vitelogénicas. Se observó también una

correlación positiva entre el área de las células ir-SL y el Indice gonadosomático

(GSI). En machos con altos valores de GSI las células productoras de SL eran más

numerosas y de mayor tamaño en comparación con los individuos con valores menores

de GSI. Sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

En este trabajo de Tesis se demostró una clara asociación morfológica entre las

células productoras de SL y las fibras de GnRH. Por otra parte, se determinó la

' presencia de receptores a GnRH en estas células, utilizando un cultivo primario de

hipófisis de pejerrey. Los sitios de unión se revelaron por autoradiografia de un

análogo superactivo de GnRH ([1251]GnRH-A)y las células inmunoreactivas, ir-SL se

identificaron por inmunocitoquímica. Una gran cantidad de gránulos de plata

representando sitios de unión de [mI]GnRH-A se encontraron asociadas a estas

células.

Los resultados obtenidos aportan mayor información a la hipótesis sobre el

papel que jugaría la SL en los procesos reproductivos de los peces teleósteos.

Palabras claves: pejerrey, 0donresI/1es bonariensis, hormonas hipofisarias,

inmunocitoquímica, somatolactina, GnRH
 .-ll)sn'ucl

ABSTRACT

A pituitary hormone, somatolactin (SL), belonging to the growth hormone

(GH)/prolactin (PRL) family is a recently discovered polypeptide produced in the

pars intermedia (PI) of teleosts. Its fiJnction is still uncertain but several authors

propose that SL may be involved in some physiological aspects of reproduction.

ln the present work the following objectives were established:

To analyse the distribution of different cellular types in the

adenohypophysis (ADH) of pejerrey, Odontesrhes bonariensis and to

determine the presence of SL producing cells.

To study in both sexes the relationship between morphometric changes of

SL producing cells and gonadal development.

To determine the association between ir-GnRH fibers and the SL

expressing cells and analyse the presence of GnRI-I binding sites in the
same cells

Results showed that prolactin (PRL) cells were immnunostained in the

external border of the rostral pars distalis (RPD). Immunoreactive (ir-) corticotrophic

(ACTH) cells were identified in the same area and crossreactivity was observed in the

pars intermedia (PI), corresponding to presumptive melanocyte-stimulating honnones

cells. Ir-growth hormone (GH) cells were identified in close contact with the

neurohypophysis (NI-l) in the proximal pars distalis (PPD). Ir-gonadotrophic (GtH)

cells were distributed in the PPD and in the external border of the Pl. Ir-thyroid­

stimulating hormone (TSI-l) cells were revealed in the PPD. lr-somatolactin (SL) cells

were recognised specifically using four different antisera in the Pl in close contact

with the neurohypophysis.

 .-lh.vn'acl

The area of the cells ir-SL showed a significant difference between the area of

ir-SL cells of restingjreggresing and sexually active (vitellogenic) females. A

significant positive correlation between the ir-SL cellular area and the GSI was also

observed. In males with the highest GSI values the ir-SL cells appeared more

numerous and showed an increase in the immunostained area when compared to those
of individuals with lower GSI values. However, the correlation between the area of ir­

SL cells and the GSI in males was not statistically significant.

A close association of GnRH fibers and SL cells was determined. In addition,

' GnRH receptors were observed in SL cells , using a pituitary primary cell culture

system. GnRH binding sites were revealed by autoradiography of an iodinated

superactive-Gan-I agonist ([12511GnRH-A)and pituitary cells were identified by

immunocytochemistry using piscine antisera. Following autoradiography, silver

grains representing specific ['251]GnRH-A binding were associated with SL cells.

These results demonstrate the presence of GnRH binding sites in these cells.

Keywords: pejerTey, Odonlesrhes bonariensis, pituitary honnones,

immunocytochemistry, somatolactin, GnRH
Abreviaturas

adenohipófisis

neurohipófisis

PDR pars dístalis rostral

PDP pars distalís proximal

PI pars intermedia

PRL prolactina

ACTH adrenoconicotrofina

GH hormona de crecimiento

GtH gonadotrofina

TSH hormona tirotrófica

MSH hormona melanocitoestimulante

SL somatolactina

GnRH neuropéptido liberador de gonadotrofinas

 Introducción general

INTRODUCCION GENERAL

Hipófisis

La hípófisis o pituitaria, es una glándula de secreción interna que se encuentra en

todos los vertebrados. El término hipófisis proviene de su ubicación debajo del cerebro

(hypo: bajo, physis : crecimiento). El término pituitaria es antiguo y se refiere a un error

conceptual al haber sido considerada como secretora de un mucus viscoso llamado

- pimira.

En todos los vertebrados, el control neuroendócn’no de la reproducción se realiza

principalmente a través del eje cerebro-hipófisis-gónadas. La hipófisis, se compone de

dos panes distinguibles por su origen embriológico, estructura y fiJncíón: Si bien ambas

partes son de origen ectodérmico, la neurohipófisis (NH) se on'gina a partir de una

evaginación del piso del diencéfalo, y la adenohipófisis (ADH) de una evaginación del

techo del estomodeo (bolsa de Rathke). Estas partes se ponen en contacto y encierran

entre ellas mesodermo, el cual dará origen a los vasos sanguíneos (Ball & Baker, l969)

(Fig. l). Por lo tanto, la hipófisis es un órgano mixto, con diferentes fiJnciones
endócrinas.

La estructura de la hipófisis varía mucho entre los vertebrados (Fig.2). En peces

la NH consiste en un tallo hipofisario suspendido de la región ventral del diencéfalo

(hipotálamo) que contiene una extensión del tercer ventn’culo (receso infundibular). La

parte distal del tallo se engrosa y se interdigita en todas las regiones de la

adenohipófisis. La ADH posee tres lóbulos: la pars dista/is rostral (PDR), la pars
dista/is proximal o caudal (PDP) y el lóbulo neurointermedío (LN), que consiste en la

pars intermedia (PI) más las interdigitaciones e inervaciones de la NH caudal. La NH

anterior, homóloga a la eminencia media, inerva la PDR y la PDP (Peter er al., 1990).

6
 Introduccióngalera!

Las interdigitaciones en la PI son más profiJndas y elaboradas que aquellas de la PDR y

PDP (Ball & Baker, 1969). La NH es, en general, el sitio de almacenamiento de

material sintetizado en el hipotálamo y es transportado por las fibras neurosecretoras

que allí sé encuentran. Junto a estos axones se encuentran los pituicitos, pero estos no
sintetizan ni secretan hormonas.

La circulación sanguínea hacia la ADH consiste en una arteria hipofisaria (o par

de arterias) que proveen sangre a los tejidos de la NH y la ADH. Un plexo primario de

capilares se forma primero en los tejidos de la NH y a partir de aquí una serie de

. capilares (sistema centn'fugo secundario) pasa a través de la ADH para vascularizar a

las células endócrinas. La sangre del sistema secundario drena posteriormente hacia un

sistema venoso, que finaliza en una gran vena que sale de la hipófisis. Las terminales

neurosecretoras no han sido observadas sobre el plexo primario de capilares en la NH de

teleósteos. Incluso en algunas especies donde existe un vestigio de sistema portal, las

terminales neurosecretoras no se encuentran sobre este plexo (Peter et al., 1990)..

Dentro de los Craniata solo los myxinoides, lampreas y teleósteos carecen de un

sistema vascular portal (eminencia media), para transportar los neuropéptidos desde el

cerebro a la ADH. La importancia adaptativa del sistema portal es que permite una

regulación nerviosa central en procesos esenciales, que como la reproducción, están

marcados por condiciones ciclicas ambientales externas e internas (Sower, 1998). Los

teleósteos han solucionado este problema estructural con una inervación directa a la

pars dista/is, llevada a cabo por neuronas neurosecretoras apropiadas provenientes del

hipotálamo adyacente (Peter et al., 1990). Los myxines y lampreas, sin embargo, no

poseen comunicación vascular o nerviosa entre el cerebro y la neurohipófisis (Tsuneki

& Gorbman, 1975). Esto sugiere que la regulación nerviosa de la pars dista/is se realiza

por difusión de los péptidos cerebrales de la NH adyacente, a través de una fina capa de

tejido conectivo que separa el tejido neural del glandular (Sower, 1998).
 Jnlraluccián ganara!

Evolutivamente, entonces, se podría hablar de tres tipos de regulación nerviosa de la

ADH desarrollada en vertebrados: el llevado a cabo por difusión (myxines y lampreas),

por inervación directa (teleósteos) y el vascular (resto de vertebrados) (Nozaki et al.,

1994) (Fig. 3).

La ADH de los peces teleósteos es por lo tanto un modelo único en vertebrados,

ya que sus células están directamente inervadas por las fibras neurosecretoras presentes
en la NH. En este caso, la eminencia media se “movilizó” hacia la ADH.

La ADH es el sitio de síntesis, almacenamiento y liberación a la circulación de

- diferentes hormonas peptídicas: prolactina (PRL), adrenocorticotropina (ACTH),

tirotrofina (TSI-I), gonadotrofinas (GtHs), hormona de crecimiento (GH), hormona

melanocitoestimulante (MSH) y somatolactina (SL). De todas estas hormonas, las que

mayormente están implicadas en los procesos reproductivos son las GtHs, cuya

secreción es estimulada principalmente por el neuropéptido liberador de gonadotrofinas

(GnRI-I). Este neuropéptido, fue caracterizado por primera vez en porcinos y ovinos

(mGnRH) (Matsuo et aL, 1971; Burgus et 01., 1972) y desde entonces se lograron

identificar y secuenciar doce van'antes más en vertebrados y dos en procordados (ver

capitulo 3). Todas son decapéptidos con características comunes.

Aunque las gonadotrofmas son fundamentales en los procesos reproductivos hay

otras hormonas hipofisarias como la hormona de crecimiento (GH) y la somatolactina

(SL) que parecen jugar también roles importantes (Rand Weaver et (11.,1992, Le Gac er

aL, 1993; Peter & Marchant, 1995).

De la SL, hormona recientemente caracterizada en peces teleósteos (Rand­

Weaver, l99la, 1992), poco es lo que se conoce. Hasta el momento se la ha relacionado

con diferentes procesos fisiológicos, pero su función exacta aún no ha sido determinada

y poco es lo que se sabe del control de su síntesis y secreción (ver introducción Cap. II).
 Introducción general

evogmccron NH piso . ¡nfundíbulo

diencéfolo
díencéfolo

vesícula ¿.“v
cerebral bolso
red Rathke
esiomodeo ech. oro]
notocordo
(a) (b) (c)

(d)

‘ eminencia medio

pors tubeloris tallo infundibulor

pors nervosa

pors distolis

(e) hipófisis

Figura 1: Desarrollo de la hipófisis en vertebrados: (a) sección sagital de un embrión joven,

donde se observa la formación de la bolsa de Rathke y el infundíbulo rudimentario. (b-d) los
dos divertículos hacen contacto durante el desarrollo embrionario y la bolsa de Rathke
pierde contacto con el estomodeo. (e) anatomía de la hipófisis en el adulto. Adaptado de
Kardong, 1997.
 Intraluccián general

PDR Primitive reptiles

PDP

Teleosts /7
Amphibians
Ventral Iobe '

Elasmobranches R .

i7////////
///// /
É PDRChondrichthyes
< _
LungfÍShes
l Pars nervosa
W p0p Ostelchthyes . . Neurohypophysis
Cydostomes MedIan emmence
(lamprey) M Parsintermedia
Pars distalis
Para tuberalís Adenohypophysis

Ventral lobe

Figura 2: Cambios morfológicos de la hipófisis a lo largo de 1a evolución de los

vertebrados. Las flechas negras dentro de la hipófisis muestran la conexión portal-vascular
desde la eminencia media a la pars distalis. La pars distalis muestra una región anterior y
posterior: la pars distalis rostral (PDR) y la pars distalis proximal (PDP) o pars distalis
cefálica (Cep) y pars distalis caudal (Cau). Adaptado de Kardong, 1997.

lO
 Introducción general

Agnatos: sistema

por
difusión¿aves-n,gig-AH/
Eminencia media vascular
Teleosteos: ¡nervación directa

Holocefalos y selaceos
NE _¡¡.,
Resto de vertebrados

Figura 3: Relación entre la hipófisis y el cerebro de los vertebrados: Representación de los

tres tipos de relación entre el cerebro (hipotálamo) y la adenohipófisis de los vertebrados.
En los Agnatos, una delgada NH se pone en contacto con la ADH. Entre las dos estructuras
se genera un sistema de difiJsión. En teleósteos, las proyecciones de la NH penetran en la
ADH y los axones hacen sinápsis con estas células o cerca, creandose una difusión
parácrina. En otros peces, existe un sistema intermedio , en donde unos cortos vasos
sanguíneos aparecen en una área de la NH y llegan a la ADH. La eminencia media mas
desarrollada es la de tetrápodos (anfibios, reptiles, aves y mamíferos), en donde un sistema
portal colecta sangre de la NH y la conduce a la ADH. (P: sistema portal). Adaptado de
Nozaki et al (1994).
 Imrmíucción general

Modelo biológico: el pejerrey

De todos los vertebrados, los teleósteos son los más numerosos, tanto en número

de individuos como de especies (aproximadamente 20000 teleósteos versus 4000

mamíferos). Ocupan una gran variedad de ambientes acuáticos y muestran una increíble

diversidad de estrategias reproductivas (Trudeau, 1997). Debido a esta gran

variabilidad, es importante el estudio de la biología reproductiva de especies autóctonas

presenten una importancia económica, tanto real como potencial.

De acuerdo con esto se eligió como modelo biológico para el desarrollo de esta

Tesis Doctoral el pejerrey, Odontesthes bonariensis (Valenciennes) (Figs. 4 y 5). La

clasificación sistemática es la siguiente (Nelson, 1994).

PI-IYLUM Chordata

SUBPI-IYLUM Vertebrata

SUPERCLASE Gnathostomata

GRADO Teleostomi

CLASE Actinopterygii
DIVISION Teleostei
SUB DIVISION Euteleostei

SUPERORDEN Acanthopterygii
SERIE Atherinomorpha
ORDEN Atheriniformes

SUBORDEN Atherinoidei

FAMILIA Atherinidae

SUB-FAMILIA Atherinopsinae
GENERO Odontesthes

ESPECIE Odonteslhes bonariensis

 Introduccióngeneral

Presenta un cuerpo hidrodinámico, ahusado, con boca pequeña, cabeza cónica y

alargada, ojos con párpados, línea lateral doble e irregular, aleta dorsal doble y

coloración plateada, con un peso en adultos promedio de 300 gramos, aunque algunos

ejemplares pueden superar el kilogramo. El tipo de alimentación es principalmente

planctónica (Ringuelet, 1967).

Es un pez originario de las lagunas de la Provincia de Buenos Aires que

posteriormente fiJe introducido en otras provincias y en distintos países con propósitos

de acuicultura y pesca deportiva (Bonetto & Castello, 1985).

El pejerrey, en la Provincia de Buenos Aires y en condiciones naturales, presenta

dos pen'odos de actividad reproductiva: uno en primavera, que puede comenzar en Julio

y terminar en Diciembre, con su clímax en los meses de Septiembre y Octubre y un

segundo pen'odo mas corto en otoño, en los meses de Marzo y Abril (Ringuelet, 1943).

Estos períodos se mantienen aún en condiciones de cautiverio (Strüssmann, 1989). La

amplitud de los pen'odos de desove, es variable y elástica, por eso es posible encontrar

individuos maduros todo el año (Boschi & Fuster de Plaza, 1959, Strüssmann, 1989). Se

la considera una especie promisoria para la acuicultura intensiva, aunque su tasa de

crecimiento y supervivencia todavía no son satisfactorias. En la Argentina, se llevaron a

cabo intentos de cn'a intensiva; sin embargo la falta de tradición en la acuicultura,

hábitos de alimentación en la población y la abundancia natural de esta especie,

limitaron la continuidad de esta tarea. Posteriormente la pesca incontrolada y la

ineficiencia en la técnica de cría de alevinos provocó una disminución considerable de

las poblaciones naturales.

Hace más de tres décadas el pejerrey fue introducido exitosamente en el Japón

desde la Argentina, a partir de huevos obtenidos de reproductores de la Laguna de

Chascomús, Provincia de Buenos Aires. En la actualidad, en ese país, se produce

pejerrey en forma intensiva. Aunque la producción anual y las poblaciones silvestres

 Introducción general

para la pesca deportiva son todavía escasas, esta especie ha sido aceptada

inmediatamente para consumo (Del Valle, 199]).

El interés en el cultivo del pejerrey y la poca información sobre su biología han

generado la necesidad de realizar estudios básicos para mejorar las tasas de crecimiento,

de reproducción y las condiciones de mantenimiento en cautiverio (Stn‘jssmann, l989).

Por lo tanto se consideró importante realizar estudios de la hipófisis y de aquellas

hormonas relacionadas o potencialmente relacionadas con la reproducción, ya que estos

constituirían la base para el desarrollo de técnicas que permitan una exitosa Ovulación

. y/o espermiación en cautiverio.

 Inmxhlccián ganara!

'É firma?

í r;
s "3.5 WW
a _ I thzodon
fi—om¡odontnmmaa

Poroleplrmrphn
Dlpnol
‘

Elanmoblnd‘ll

Cama
Holocapiul

VM.
(
WWE Placodorml

Subphylum Superclnu Grado Subcllu Iníraclnc Divlslon Subdlviflon Suporordor Order

Fig. 4: Arbol filogenético de los peces. Adaptado de Nelson, 1994.

 Inmxluccíón general

5€
Dlvlalan SubdMilon
W sm
' 016w

Fig. 4: continuación.

16
 Introducción general

Fig. 5: Ejemplar adulto de pejerrey, Odontesthes bonariensis.

 Introducción ganen)!

En base a lo expuesto en esta Introducción se plantearon las hipótesis de

trabajo y los siguientes objetivos:

HIPOTESIS

- La somatolactina en el pejerrey está involucrada en la fisiología

reproductiva.
- El neuropéptido liberador de gonadotrofinas (GnRH) regula su síntesis
y/o liberación.

OBJETIVOS

Determinar la estructura y distribución de los diferentes tipos celulares en

la hipófisis del pejerrey.
Caracterizar inmunologicamente a la SL de pejerrey y a los antisueros
utilizados para su reconocimiento.
Analizar las variaciones de las células productoras de SL en relación con los
diferentes estadios reproductivos.
Determinar la relación de SL con el neuropéptido GnRH.

En esta Tesis los objetivos planteados se han analizado en tres capítulos. En el

primer capítulo se determinó la estructura y distribución de los diferentes tipos celulares

en la hipófisis del pejerrey. En el segundo capítulo se caracterizó inmunologicamente a

la SL y se analizaron las variaciones de las células productoras de SL en relación con

 Introducción general

los diferentes estadios reproductivos. En el tercer capítulo se determinó la relación entre

las células productoras de SL y GnRH.

 ( 'upilulo I

CAPITULO l: ESTRUCTURA Y DISTRIBUCION DE LOS

DIFERENTES TIPOS CELULARES EN LA HIPOFISIS DE
PEJERREY.

I-I Introducción

La hipófisis de los peces teleósteos ha sido ampliamente estudiada y los

diferentes tipos celulares han sido identificados utilizando en un principio técnicas

-histoquimicas y ultraestmcturales. Si bien estos resultados permiten inferir qué tipo

celular se está poniendo en evidencia, las técnicas inmunocitoquímicas desarrolladas a

partir de los años ‘60 permitieron identificar con mayor precisión la naturaleza de los

gránulos de secreción presentes en el citoplasma de las células. Dentro de estas técnicas,

quizás algunas de las más utilizadas son las de inmunoperoxidasas que utilizan en

común el anticuerpo unido a la enzima peroxidasa o bien la reacción biotina-avidina

peroxidasa y la enzima es puesta en evidencia mediante una reacción histoquimica

indicando así el lugar donde ha actuado el anticuerpo primario.

En contraste a la distribución dispersa que presentan los diferentes tipos

celulares de la hipófisis de mamíferos, en los peces teleósteos ésta se encuentra

altamente regionalizada (Trudeau, 1997). Las células productoras de las diferentes

hormonas se ubican en regiones específicas de la adenohipófisis (PDR, PDP, PI)

(Schreibman et aL, 1973).

Si bien no se puede generalizar, ya que existen variaciones entre las especies, el

esquema básico sería el siguiente: la PDR contiene principalmente células productoras

de PRL o lactotropos. Estas células por lo general ocupan una masa compacta, que

define principalmente a esta zona. En la mayoría de las especies estudiadas, las células

productoras de PRL se extienden ventral y lateralmente hacia la PDP. Sus gránulos se

 Capilqu I

caracterizan por presentar reacción positiva a la eritrocina con la técnica tetracrómica

Aliz B y con el método tn'crómico de Cleveland Wolfe, y positivos al azocarmín y la

fucsina ácida en métodos como el Azan, Mallory y Masson, pero negativos al ácido

peyodico de Schiff (PAS), Alcian blue y aldehído fiJcsina (AF).

Los corticotropos o células productoras de ACTH se encuentran localizados a lo

largo del borde entre la PDR y la PDP o PDR y NH anterior. Reaccionan positivamente

con la eritrocina y con el azul de alizarina. También se colorean con hematoxilina

plúmbica (PbH) y muestran reacción negativa al PAS y al Alcian blue.

La PDP contiene principalmente a los somatotropos o células productoras de

hormona de crecimiento (GH) y los gonadotropos o células productoras de

gonadotrofinas (GtH). Las células productoras de GH se caracterizan por ser acidófilas,

positivas al Orange G en varias técnicas tricrómicas y tetracrómicas.

Las células productoras de tirotrofinas (TSH) o tirotropos, en varias especies de

teleósteos se encuentran distribuidos en la PDR, pero también se los puede encontrar a

lo largo de la PDR y el borde de la PDP, en ambas zonas o solamente en la PDP. Son

basófilas al igual que los gonadotropos.

Las células productoras de GtH, se ubican en la PDP, a menudo en la parte

ventral. En peces maduros se las puede encontrar también en la PDR (Ball & Baker,

1969). Sus gránulos reaccionan positivamente al PAS y a AF, Alcian blue y azul de

anilina en las técnicas tricrómicas y tetracrómicas.

Como se mencionara anteriormente las GtHs: GtH I y GtH II se destacan como

hormonas claves en la reproducción. Estas hormonas son glicoproteínas heterodime'ricas

compuestas por una subunidad a común a las dos gonadotroflnas y a TSH y otra B que

le confiere especificidad biológica. El análisis de la secuencia de las subunidades

sugiere que GtH I sería homóloga a la honnona foliculoestimulante (FSH) de tetrápodos

mientras que GtH II seria homóloga a la hormona luteinizante (LH) de tetrápodos

21
 ( 'apilulu I

(Swanson, 1991; Quérat, 1994, 1995). Actúan a nivel gonadal mediante receptores

específicos siendo su efecto primario la activación de la sintesis de varios tipos de

esteroides sexuales en testículo y ovario (Van der Kraak e! a1., 1992; Yan et a1., 1992).

Los niveles en plasma e hipófisis de estas dos GtHs varian marcadamente durante el

ciclo reproductivo (Suzuki et al, l988a), siendo la GtH I la hormona predominante

durante la vitelogénesis o espermatogénesis y la GtH II durante la ovulación o

espermiación (Suzuki et a1., 1987,1988a).

Las células productoras de GtH son las más estudiadas de la hipófisis de los

-teleósteos. Se encontraron dos gonadotrofmas diferentes en la hipófisis de diferentes

especies incluyendo representantes de los ordenes Salmoniformes, Oncorhynchus keta y

Oncorhynchus kisutch (Swanson et a1., 1987; Suzuki et a1., l988b y c), Perciformes,

Micropogonias undulatus (Copeland & Thomas, 1993), Pag'rus major (Tanaka et a1.,

1993), KÜÍSUWOHIIS
plelamis (Koide et a1., 1993), Morone saxatilis (I-Iassin et a1., 1995),

Thunnus obesus (Okada et a1., 1994), Spams aurata (Elizur et a1., 1996) y Seriola

dumerilii (García-Hernandez et al._ 1997), en Cyprinodontiformes, Funda/us

heteroclitus (Lin et a1., 1992), Cypriniformes, Cyprinus carpio (Van der Kraak et a1.,

1992) y Pleuronectiformes, Trichogaster trichopterus (Jackson et a1., 2000). No se han

aislado formas tipo GtH-I de Anguilla anguilla (Schulz et a1., 1995) de varias otras

especies de Cypriniformes (Lo et a1., 1991) y del Siluriforme, Clarins gariepinus

(Koide, 1992).

Por otra parte existe una controversia acerca de la existencia de uno o dos tipos

celulares productores de gonadotrofmas, es decir algunas células producen GtH I y otras

GtH II (Olivereau, 1976; Ueda & Hirashima, 1979) o si es una única célula en

diferentes estadios de actividad sintética (Ekengren el a1., 1978; Peute et a1., 1978).

En la PI se encuentran en general las células productoras de MSH junto con las

productoras de SL o somatolactínicas (Batten, 1986; Cambré et a1.,1986; Peter el a1.,

 ( ‘apilulo I

1990; Yan & Thomas, |99|; García-Hernández, 1996). Los primeros estudios

histológicos revelaban que la PI de la mayoría de los teleósteos contenía dos tipos

celulares diferentes, uno bordeando la NH, positivo a PbH y negativo a la coloración

PAS, mientras que el otro tipo celular que bordeaba a la NH era PbH negativo y

usualmente PAS positivo, llamado PIPAS, células PAS positivas de la PI. Con el

desarrollo de las técnicas inmunocitoquimicas y la purificación de la SL se pudo

determinar que estas células PlPAS eran las células productoras de SL distinguibles de

las células MSH las cuales son PAS negativas. Sin embargo, en salmónidos las células

-productoras de SL son PAS negativas. Por lo tanto la SL puede existir en forma

glicosilada o no glicosilada, dependiendo de la especie. Rand-Weaver et aL, (l99la)

aislaron por primera vez esta hormona de la hipófisis del bacalao, Gadus morhua y

desarrollaron antisueros específicos. Esto permitió demostrar la localización exacta de

estas células (Rand-Weaver et aL, l99lb). Hasta el momento las células productoras de

SL han sido identificadas en pocas especies de peces teleósteos: en Gadiformes, Gadus

morhua; Siluriformes, Heteropneustes fossilis, Anguilíformes, Anguilla anguilla,

Cyprinidontiformes, Fundulus heteroclitus y Poecilia Iatipinna (Rand-Weaver et a1._

l99lb), en Pleuronectiformes, Pleuronectes flesus (Rand-Weaver et aL, l99lb) y

Pleuronectes vetulus (Johnson et al, 1997), Salmoniformes, Oncorhynchus ner/ca y

Oncorhynchus keta (Olivereau & Rand-Weaver, l994a), Oncorhynchus mykiss (Rand­

Weaver et a1., l99lb, Kaneko et aL, l993a); Oncorhynchus tshawytscha (Olivereau &

Rand-Weaver, l994b), Perciformes, Sciaenops ocellatus (Zhu & Thomas, 1995);

Seriola dumerilii (García-Hemández et al, 1996), Oreochromis mossambicus (Dores el

al, 1996) y Oreochromis niloticus (Mousa & Mousa, l999a).y en el orden

Synbranchiformes, Synbranchus marmomtus (Vissio et al, 1996).

La hipófisis de pejerrey fiJe previamente descripta por Calvo & Morriconi

(1974), quienes identificaron seis tipos celulares utilizando técnicas histoquímicas

 ( 'apilulo I

clásicas. Si bien este estudio permite una buena aproximación a la morfología de esta

glándula, no discrimina fehacientemente la naturaleza de los gránulos de secreción. Por

lo tanto, con el frn de analizar con mayor precisión la distribución de los diferentes tipos

celulares, se planteó el estudio de la hipófrsis del pejerrey utilizando técnicas

inmunocitoquímicas

r-rr Objetivo

- Determinar la estructura y distribución de los diferentes tipos celulares en

la hipófisis del pejerrey.

I-III Materiales y métodos

Animales

Aproximadamente 20 ejemplares de pejerrey, juveniles y adultos, provenientes

de la laguna de Chascomús (Provincia de Buenos Aires, Argentina) fueron capturados

con red de enmalle y procesados inmediatamente. Otro grupo de peces fue colectado

durante la estación de cría en la laguna Salada Grande (Provincia de Buenos Aires) y

un tercer grupo, criado en estanques externos de la Saitama Prefecture Fisheries

Experimental Station (Saitama Prefecture, Japon), fue provisto por el Dr. C.

Strüssmann.
 Capitulo l

Tratamiento de las muestras

Los ejemplares fueron anestesiados con benzocaína disuelta en agua (0.l g/l) y

decapitados.

Los cerebrosjunto con las hipófisis se extrajeron a través de una incisión dorso­

longitudinal de la cabeza. El cerebro junto con la hipófisis fueron disecados en el

fijador, y permanecieron aproximadamente 20 horas en la solución fijadora hasta que

ésta se reemplazo por alcohol 70%

Los fijadores utilizados fueron Bouin (solución ácido picrico 70%, formol 25%,

ácido acético 5%) y Bouin Hollande. No se observaron diferencias en la

inmunomarcación ni entre los dos fijadores ni entre las muestras marcadas

inmediatamente (muestras provenientes de Chascomús o de Salada Grande) y las

muestras mantenidas en cortes de parafina sin marcar por aproximadamente diez años

(Saitama). Luego de deshidratadas, las muestras se embebieron en parafina. Los cortes

parasagitales de aproximadamente 5-7 um se montaron en portaobjetos previamente

gelatinizados.

Immunocitoquimica

Los cortes fueron inmunomarcados utilizando la técnica Avidina-Biotina

Peroxidasa (ABC). (Sigma, St. Louis, MO), desparafinados, utilizando xileno e

hidratados en una serie decreciente de alcoholes ( 100%, 96%, 90%, 70%) hasta llegar a

buffer fosfato salino, pI-l: 7.6 (PBS). Luego se procedió a bloquear las peroxidasas

endógenas con una solución al 3% de H202 por 5 min. Al cabo de este tiempo los cortes

fiJeron lavados nuevamente en PBS y se realizó un bloqueo con suero normal de caballo

(Vectastain, Vector Lab.) por 45 min, con el objeto de eliminar las marcaciones
 Capitulo I

inespecificas. Al cabo de este tiempo y luego de un lavado en PBS se incubaron con el

antisuero específico a la dilución adecuada (Tabla l) durante toda la noche a 4°C. La

dilución utilizada para cada antisuero se determinó experimentalmente, probando un

amplio rango de diluciones y seleccionando la más diluida en la cual se detectaba una

buena marca con un mínimo de coloración inespecifica de fondo (background). Luego

de la incubación con el antisuero adecuado, los cortes fiJeron lavados en PBS, y se les

realizó un segundo bloqueo con suero normal de caballo, se los lavó y se los trató con el

antisuero secundario biotinado por una hora a temperatura ambiente. Luego de

- transcurrido este tiempo, se volvieron a lavar en PBS, y se trataron con el complejo

Avidina-estreptoavidina (ABC). La actividad peroxidasa fue demostrada por incubación

de los cortes en una solución 0.03% de 3,3’ diaminobencidina en bufi‘er Tris, pH: 7.6 y

0.02% de H202, Algunas muestras fueron contracoloreadas con hematoxilina, antes de

ser montadas en DPX (Fluka).

Antisueros

Se utilizaron los siguientes antígenos y antisueros: Chum salmon Oncorhynchus

keta PRL (chumPRL) y su respectivo antisuero anti-chum PRL, chum salmon GH

(chumGH) y anti-chum GH, chum salmon SL (chumSL) y anti-chum SL, chum salmon

GtH IB y GtH IIB (chum GtH IB y GtH IIB) y anti-chum GtH IB y GtH IIB, todos estos

donados generosamente por el Dr. Kawauchi (School of Fisheries Sciences, Kitasato

University, Iwate, Japon). Anti-carpa Cyprinus carpio GH (cGH) y anti-carpa prolactina

(cPRL) fueron donados por el Dr. R.E. Peter (University of Alberta, Edmonton,

Canada). Anti-croaker en estadio maduro Micropagonias undulatus GtH (chtH) y anti­

red drum Sciaenops ace/[ams SL (rdSL) generosamente donados por el Dr. Peter

Thomas (Marine Science Institute, The University of Texas at Austin, Texas, USA).
 Capitulo I

Anti-TSH humana (hTSH), anti-PRL humana (hPRL) y anti- ACTH humana sintética,

1-24 (hACTl-l) fueron adquiridas a Dako (DAKO, Dinamarca). Anti-coho salmon,

Oncorhynchus kisutch SL donado por la Dra. M. Rand-Weaver (anel University,

Uxbridge, Middlesex, Inglaterra) y anti-SL recombinante de Spams aurata (saSL)

donado por el Dr. A. Astola, (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

Facultad de Ciencias, Universidad de Cádiz, Cádiz, España). En todos los casos los

antisueros fiieron diluidos en PBS pH 7.6.(Tabla l)

- Antisuero Dilución Elevado en: Elevado contra: Procedencia

anti-chum salmon PRL 1:1000 Conejo PRL de 0. ¡cera Dr. H.

Kawauchi

anti-c PRL l: 1000 Conejo PRL de C.carpio Dr. RE. Peter

anti-h PRL 12100 Conejo PRL humana DAKO.

Denmark

anti-chum salmon GH l: 1000 Conejo GH de 0. kela Dr. H.

Kawauchi

anti-carpa GH l: 1000 Conejo GH de C.carpio Dr. RE. Peter

anti-hTSH 12500 Conejo Subunidad [3 TSH DAKO.

humana Denmark

anti-hACTH 1:2000 ' Conejo aa. 1-24 de la ACTH DAKO.

humana Denmark

anti-chm 1:500 Conejo th-l de .\I undulatus Dr. P. Thomas

 Capitulo I

anti-chum salmon GtH l 1:2000 Conejo GLHl de 0. kela Dr. H.

Kawauchi

anti-chum salmon GtH II 112000 Conejo GtH ll de 0. keta Dr. H.

Kawauchi

anti-chum salmon SL 121000 Conejo SL de 0. kem Dr. H.

Kawauchí

ami-rdSL 1:1000 Conejo SL de S. ace/[ams Dr. P. Thomas

’ anti-coho salmon SL 1:2000 Conejo SL de 0.k¡sulch Dr.M. Rand,­

Weaver

anti-sa SL 1:2000 Conejo SL de Spams aurala Dr. Astola

Tabla l: Características y dilución de los antisueros utilizados:

Controles

La especificidad de los antisueros utilizados fue validada por preadsorción con

exceso de antígeno (24 h a 4°C), en los casos en los cuales se disponía del antígeno

correspondiente (GtH I, GtH II, GH y SL), o por el uso de más de un antisuero (PRL,

GH y SL). En todos los casos, cortes controles se incluyeron en el mismo portaobjeto,

en los cuales el antisuero pn'marío fiJe reemplazado por PBS.

La ubicación de los diferentes tipos celulares fiie similar a la encontrada por

otros autores en otras especies. Esto también validaría la especificidad de los antísueros
utilizados.
 ( 'npr'mlo I

I-IV Resultados

La hipófisis de Odonteslhes borrariensis se encuentra suspendida del diencéfalo

por detrás del quiasma óptico. Está conectada al tercer ventrículo por un tallo que se

ramifica en la ADH formando la NH. El tamaño es variable. Básicamente, se reconocen

tres áreas en la ADH: la PDR, la PDP y la PI. La NH se interdigita en todas las regiones

pero mucho más marcadamente en la PI.

La PDR se caracterizó por la presencia de células inmunoreactivas a PRL

-(células ir-PRL) y células inmunoreactivas a ACTH (ir-ACTH). Las células ir-PRL se

identificaron con anti-chum PRL y anti-carpaPRL, pero no se obtuvo inmunomarca

cuando se utilizó anti h-PRL. La mayoria de las células ir-PRL se localizaron en un

grupo compacto en la periferia de la PDR (Fig. 6a), pero algunas células aisladas se

encontraron en la PDP, y en la PI. Las células ir-ACTH, reveladas con anti-hACTH se

distribuyeron en el lado interno de la PDR bordeando a la NH (Fig.6b). Una intensa

inmunomarcación también se detectó en la PI .

La PDP se caracterizó por la presencia de células ir-GH, ir-GtH e ir-TSH. Las

células ir-GH se reconocieron utilizando dos antisueros, anti-chum GH y anti-carpaGH.

Ambos antisueros reconocen el mismo grupo de células rodeando las interdigitaciones

de la NH (Fig.6c). Las células ir-GtH se localizaron en la PDP y en el borde externo de

la PI (Fig. 7a) con los diferentes antisueros utilizados (anti-chtH, anti-chum GtH IB o

GtH IIB).

Se realizaron dos estrategias diferentes para determinar si ambas gonadotrofmas

se expresan o no en la misma célula: l) Se inmunomarcaron dos cortes adyacentes, uno

con anti-chum GtH IB y el otro con anti-chum GtH lIl3, y luego se los comparó a alta

magnificación, 2) Otros cortes se inmunomarcaron con anti-chum GtH IB preadsorbido

con chum GtH IIÍ3y anti-chum GtH [IB preadsorbido con chum GtH IB. Sin embargo
 (Ïapimlo I

fue dificil distinguir claramente si ambas gonadotrofinas se expresan en una o dos

células diferentes, ya que aunque secciones adyacentes inmunomarcadas con anti-chum

GtH IB o anti-chum GtH IIB mostraron un patrón diferente (Fig. 7b y 7c) también

aparecieron otras células inmunomarcadas con ambos antisueros. Por otra parte, no se

obtuvo inmunomarca cuando se utilizó anti-chum GtH IB preadsorbido con chum GtH

IIB y anti-chum GtH IIB preadsorbido con chum GtH IB.

Las células ir-TSH se pusieron en evidencia utilizando anti-hTSI-I. Aparecen

pocas y dispersas en la PDP (Fig. 8c). Cuando la concentración de anti-hTSH se

-incrementó, se observaron células inmunomarcadas en otras regiones, probablemente

células productoras de GtH.

Las células ir-SL fueron identificadas utilizando cuatro antisueros diferentes:

anti-chum salmon SL, anti-rdSL, anti-saSL y anti-coho salmon SL. En todos los casos

las células inmunomarcadas fueron las mismas y aparecieron en la PI (Fig. 8a). Estas

células se caracterizaron por presentar forma elongada, con núcleo pen'férico. Algunos

antisueros revelaron las células productoras de SL con un background mínimo, sin

embargo otros antisueros produjeron un background suave en las células vecinas (Fig.

8b). La preadsorción con chumSL suprimió completamente la inmunomarca de anti­

chum salmon SL y anti-rd SL.

Los resultados obtenidos se resumen en la Fig. 9.

 Capítulo I

Fig. 6: Cortes parasagitales de hipófisis de pejerrey. La PDR se encuentra a la izquierda,

x64, a) Inmunomarcación de células productoras de PRL, con anti-chum salmon PRL.
Observese la inmunomarcación en la PDP y en la PI (flecha), b) Inmunomarcación de
células productoras de ACTH con anti-hACTH. En la PI se observa una gran área
inmunomarcada, probablemente poniendose en evidencia las células productoras de MSH,
c) Células productoras de GH, inmumarcadas con anti-chum salmon GH en la PDP.

31
 Capítulo I

Fig. 7: Cortes parasagitales de hipófisis de pejerrey. a) Inmunomarcación de células

gonadotroficas con anti-chtH, x64, b) y c) Secciones adyacentes (correspondientes a la
zona indicada en el corte a) inmunomarcadas con anti-chum salmon GtH I y anti-chum
salmon GtH II respectivamente, x200.

32
 Capítulo I

Fig. 8: Cortes parasagitales de hipófisis de pejerrey. a) Resultado de la inmunomarcación

con anti-rd SL, donde se ven la células ir-SL en la PI (x64), b) Detalle de las células
productoras de SL inmunomarcadas con anti-chum salmon SL. Notese la difusa
inmunomarcación de las células vecinas (xlOOO),c) Detalle de las células ir-TSH en la
PDP inmunomarcadas con anti-hTSH (x400).

33
 Capítulo I

Hipo’rólomo

Fig. 9: Diagrama de una sección sagital de hipófisis de pejerrey, mostrando la distribución

de los diferentes tipos celulares. Células ir-PRL (©), células ir-ACTH (en PDR) o MSH ( ),
células ir-GH (ÉÉ),células ir-TSH (©), células ir-GtH (+) y células ir-SL ( 43).

34
 (.‘apr’lulo l

l-V Discusión

Aunque la hipófisis de peces ha sido estudiada desde hace mucho tiempo, la

anatomía y distribución celular de la misma se conoce en un grupo reducido de

especies. Por ejemplo, la identificación y distribución de los tipos celulares en la

hipófisis de los peces Atheriniformes fiie solamente estudiada en una sola especie

marina, Austromenidia [aria/avia, y en este caso solo se utilizaron antisueros

desarrollados a partir de hormonas de mamíferos (Siegmund et aL, 1987). En nuestro

-caso, con la excepción de los antisueros, anti-hTSH y anti-l-24hACTH, la

identificación se llevó a cabo con antisueros contra hormonas de peces.

Las ubicación de las células ir-PRL y las ir-ACTH en la PDR fiJe coincidente

con las descripciones realizadas en otros teleósteos (Batten y Schreibman, 1986; Yan &

Thomas, 1991; Vissio et al., 1996). Las células ir-PRL se identificaron con dos

antisueros diferentes desarrollados a partir de PRL de peces y al igual que lo que

sucedió en Austromenidia [aria/avia (Siegmund el aL, 1987), anti-hPRL fiJe incapaz de

reconocer a los lactotropos. Las células ir-PRL aparecieron como un grupo compacto en

la periferia de la PDR. Ambos antisueros reconocieron también un pequeño grupo de

células en la Pl. Esto podría deberse a la similitud estructural existente entre la PRL y la

SL (Rand-Weaver et aL, l991a; Takayama et al., l99la y b). No se pudo determinar si

esta inmunoreactividad en células de la PI se debió a la presencia de células productoras

de PRL o a alguna clase de reacción cruzada con las células productoras de SL.
Las células ir-ACTH en la PDR se inmunomarcaron con un antisuero comercial

desarrollado en conejo a partir de los aminoácidos 1-24 de la ACTH humana. Se

determinó también una gran reacción positiva con las células presumiblemente MSH de

la PI. Esto ha sido informado también para otras especies (Munro, 1985; Cambre et aL,

1986; Siegmund et aL, 1987; Yan & Thomas, 1991). Esta reacción cruzada podría
 Capítulo I

deberse a que MSH comparte epitopes con ACTH (Follénius & Dubois, 1980) ya que

ambas moléculas derivan de un precursor común, la proopiomelanocortina (POMC).

La distribución de las células productoras de Gl-L identificadas con dos

antisueros desarrollados a partir de GH de peces, siguió el mismo patrón descripto en

otras especies de teleósteos. A pesar de la relación entre GH y SL (Rand-Weaver et al.,

l99la; Takayama et al., l99la y b), no se han observado células inmunomarcadas en la

PI.

En cuanto a las células ir-GtH, se distribuyeron en el centro y el borde ventral de

-la PDP y en el borde externo de la PI en el pejerrey. Calvo & Morn'coni, (1974) ya

habían descripto por técnicas histoquímicas la presencia de estas células supuestamente

productoras de gonadadotrofinas en la PI del pejerrey. Aunque se sugirió como inusual

la presencia de GtH en la PI (Yan & Thomas, 1991), se encontró en otras especies de

teleósteos (Cambré et al., 1986; Yan & Thomas, 1991, García Hernández et al., 1996),

incluyendo a Austromenidia Iaticlavia (Siegmund et al., 1987). En el caso de Lepomis y

de Dicentrarchus Iabrax (orden Perciformes) se comprobó que estas células no son

parte de la PI sino que la PI se encuentra rodeada por pequeñas porciones de la pars

dista/is (Simon & Reinboth, 1974; Cambré et al., 1986). En el caso del pejerrey no se

puede descartar la posibilidad de que estas células en realidad se encuentren en

extensiones de la pars distalis, sin embargo seria necesario analizarlo con microscopía

electrónica para confirmarlo.

Dos formas de GtH (GtH I y GtH II homólogas a FSH y LH) fileron

identificadas utilizando anti-chum GtH IB, anti-chum GtH IIB y anti-chtH. Los cortes

adyacentes inmunomarcados con anti-chum GtH IB y con anti-chum GtH [IB

generalmente mostraron diferentes patrones, aunque algunas áreas fueron reconocidas

por ambos antisueros. Esto sugeriría que existen células que expresan GtH l y células

que expresan GtH II, como se describió en salmónidos (Nozaki et al., 1990) y células
 (.‘apílulo I

que expresarían ambas gonadotrofinas como en el platifish (Cyprinodontiformes)

(Schreibman et aL, 1990). Se intentó resolver esta cuestión realizando los experimentos

de preadsorción descriptos previamente. Sin embargo, cuando se preadsorbieron anti­

chum GtH IB con chum GtH IIB y anti-chum GtH IIB con chum GtH IB se abolió
totalmente la marcación. Resultados similares han sido obtenidos con anti-coho salmon

GtH I y GtH II preadsorbidos con coho GtH II y GtH I respectivamente (Nozaki et aL,

1990). La razón exacta por la que esto ocurre no se conoce. Una posibilidad sería que la

estructura tridimensional de la subunidad B de ambas gonadotrofinas sea muy similar

- (Nozaki et a1., 1990). Por otro lado ninguno de los dos antisueros reconoce a las células

presumiblemente productoras de TSH a pesar de que estas hormonas están

estructuralmente relacionadas.

Las células ir-TSH fiJeron identificadas en la PDP utilizando anti-hTSH B, ya

utilizado previamente para la identificación de estas células en otras especies de

teleósteos (Ueda et a1., 1983, Batten & Schreibman et a1., 1986, Yan & Thomas et aL,

1991, Vissio et aL, 1996)

Las células ir-SL fiieron identificadas con cuatro antisueros diferentes, en la PI.

Los estudios inmunohístoquimicos realizados hasta el momento, tanto en teleósteos de

agua dulce como en marinos, muestran que las células productoras de SL se encuentran

alli. Aunque la SL esta estructuralmente relacionada con GH y PRL, la distribución de

las células productoras de SL es claramente diferente. Estudios previos en otras especies

demuestran que estas células pueden ser detectadas con antisueros contra GtH de peces

(Margolis-Kazan & Schreibman, 1981; Batten, 1986), antisuero contra PRL de peces, y

antisueros contra lactógeno placentario (PL). Esta inmunoreactividad cruzada se debe a

Ia similitud en la estructura de estas moléculas. En el pejerrey ningún tipo de reacción

cruzada se observó entre SL y moléculas estructuralmente relacionadas.

Resulta interesante destacar que recientemente Mousa & Mousa (l999a) han
 Capímlo I

descripto la presencia de células ir-SL ampliamente distribuidas en el cerebro de

Oreochromis niloticus (Cichlidae). Según los autores, estas células se extienden a todo

lo largo del cerebro, desde el bulbo olfatorio hasta la médula oblongata, pero no se

describen fibras inmunoreactivas, por lo que no es posible inferir que células inervarían

y que fiJnción cumpliría la SL cerebral. En nuestro laboraton'o y trabajando con el

mismo antisuero (anti-chum salmon SL) usado por Mousa & Mousa en l999a y con

otros tres antisueros (ver tabla l) no se ha podido detectar inmunomarca a nivel

cerebral. Además en trabajos recientes llevados a cabo en nuestro laboratorio en

-Cichlasoma dimems, una especie de la misma familia que O. niloticus, usando los

cuatro antisueros disponibles contra SL tampoco fue posible identificar células

inmunoreactivas a nivel cerebral. Por lo expuesto se deduce que son necesarios nuevos

estudios con el objeto de confirmar la presencia de SL a nivel cerebral.

Los resultados de este estudio permiten concluir que el patrón de distn'bución de

los diferentes tipos celulares en la hipófisis del pejerrey es bastante similar a lo

observado en otros grupos de teleósteos, aunque algunos autores han informado sobre la

presencia de TSH (Fn'dberg et aL, 1981; Nozaki et aL, 1990) y GtH (Olivereau &

Nagahama, 1983) en la PDR de algunas especies. Asimismo estos resultados sirvieron

de base para los estudios planteados posteriormente.

En salmónidos, Olivereau & Rand-Weaver (1994a) observaron un aumento de

las células ir-SL en número y tamaño cuando comparaban animales sexualmente

maduros e inmaduros, sugiriendo que la SL de alguna manera estan'a involucrada en la

reproducción. Observaciones preliminares realizadas en el pejerrey, nos llevaron a

plantear la hipótesis de que en esta especie también habría un cambio en el tamaño de

las células ir-SL relacionado con el estadio reproductivo.

Por otra parte, la proximidad entre las células productoras de SL y la NH

podrían indicar un posible control de estas células por neuropéptidos presentes en las
 (Ïapílulo l

fibras nerviosas (Rand-Weaver et al., l99lb). En base a las observaciones preliminares

que indican variaciones de las células SL a lo largo del ciclo reproductivo, se plantea el

posible control de GnRH en la regulación de la síntesis y/o liberación de SL.

 Capi/uh) 2

Capítulo II: ANALISIS DE LAS VARIACIONES DE LAS CELULAS

PRODUCTORAS DE SL EN LOS DIFERENTES ESTADIOS
REPRODUCTIVOS.

II-I Introducción

a) Somatolactina: generalidades

La SL, es una proteína hipofisaria, que fue aislada y caracterizada por primera

vez en un pez del orden Gadiformes, el bacalao del Atlántico, Gadus morhua (Rand­

Weaver et al., l99la, Takayama et al., l99la). La SL es una proteína estmcturalmente

relacionada con GH y PRL, por lo que se la llamó somatolactina, un hibrido entre

somatotropina (GH) y prolactina (PRL). Esta glicoproteína en esta especie posee un

peso molecular de 26 Kda y 209 aminoácidos, incluyendo ocho residuos de cisteinas

(Cys). Posee tres puentes disulfuro entre los residuos Cyss-Cys”, Cysó5-Cys'8'y Cysm­

Cyszoó.Los residuos de Cys en posición 42 y 180 no están involucrados en la formación

de puentes disulfuro. La posición de estos puentes disulfuro es homóloga a la que

poseen GH y PRL.

Desde su descubrimiento, la SL ha sido aislada también en representantes de los

siguientes ordenes: Salmoniformes: Onchorhynchus kiwtsch (Rand-Weaver et al.,

1992) y O. Kela (Takayama et al., l99lb), Perciformes: Micropogonias Imdularus

(Safl'ord, 1992), Sciaenops ace/latas (Safford, 1992; Zhu & Thomas, 1995), Spams

aurata (Cavari et al., 1995) y Siganus gurtarus. (Ayson et al., 1999), Pleuronectiformes:

Paralichthys olivaceus (Ono et al., 1990), Hippoglossus hippoglossus (lraqui et al.,

[993) y Solea senegalensis (Pendon et al., 1994), Scorpaeniformes: Cycloprerus lumpus

(Iraqui el al., 1993), Cypriniformes: Carassius auratus (Cheng e! al., 1997).

40
 Capimlo 2

Recientemente ha sido clonado el DNA copia (cDNA) de un representante de la

subclase Chrondostei, orden Acipenseriformes, el esturión blanco, Acipenser

transmontanus y de un representante de la clase Sarcopterygii, orden

Lepidosireniformes, Protoplerus annectens (Amemiya er al., 1999). Esto estaría

indicando que el gen de SL está presente en dos líneas divergentes, los Actinopterígii

(Chondrostei y todos los teleósteos estudiados) y Sarcopterygii.

La SL proviene de una molécula precursora que incluye una secuencia

correspondiente al péptido señal. La presencia de un péptido señal es esencial para la

-secreción y el hecho de que SL se encuentre en la hipófisis, y se libere a la circulación,

estan'a indicando que es una hormona, de acuerdo a la definición clásica. Del análisis de

la secuencia de aminoácidos se desprende que la SL madura y sus precursores consisten

en 205-209 aminoácidos y 229-235 respectivamente, dependiendo de las especies

consideradas (Kaneko, 1996) (Fig. 10). La SL madura posee un peso molecular que
varia entre 24.5 Kda (O. kisutch) a 28 Kda (P. olivaceus y S. aurata). En el curso de su

purificación se han identificado variantes mas pequeñas en muchas de las especies

estudiadas (Rand-Weaver et aL, l99la, Zhu & Thomas, 1995, Cavari et aL, 1995), éstas

aparentemente serían formas no glicosiladas de la molécula.

La secuencia de SL presenta un 20-30% de homología en su secuencia con GHs,

PRLs y lactógeno placentário (PLs) (Rand-Weaver et al., l993a). Todas estas proteínas

podrian derivar de un ancestro común mediante duplicación génica (Cavari el al, 1995).

Esta proteína está altamente conservada, con una homología entre el 75-80 % en

géneros poco relacionados filogenéticamente. Entre los más relacionados, como los

pleuronéctidos, la homología es mucho mayor. Por ejemplo el cDNA aislado de H.

hippoglossus , presenta una homología del 95 % con el cDNA de P. olivaceus (Ono e!

al.. [990).

A pesar de la similitud estructural de la SL con GH y PRL, la glicosilación

41
 ( 'apilulo 2

presente en la SL es una característica única (Kaneko, 1996). Para cada SL el número de

sitios potencialmente glicosilables varia entre las diferentes especies. Por ejemplo en P.

olivaceus , existe un solo sitio de glicosilación (Ono et aL, 1990), mientras que en G.

morhua (Rand-Weaver e! al., 19913, Takayama et al, l99la) existen dos sitios. Sin

embargo, la glicosilación no es una propiedad general de la molécula de SL. Por

ejemplo estos sitios están ausentes en la molécula de SL de salmónidos (Rand-Weaver

et al., l99la). Por lo tanto, la SL puede existir en forma glicosilada o no glicosilada. La

glicosilación de la SL se refleja en la presencia o ausencia de células reactivas al PAS

-en la PI. El hecho de que existan dos somatolactinas en una misma especie, una

glicosilada y la otra no, plantea interrogantes sobre posibles diferencias funcionales

entre los dos tipos de SL (Kaneko, 1996).

Si bien se sabe que la SL es una hormona hipofisaria, existen algunos pocos

trabajos que se refieren a la expresión de esta hormona en tejidos extrahipofisarios.

Estudios llevados a cabo utilizando la técnica de RT-PCR (reverse transcription­

polymerase chain reaction) en diferentes tejidos de trucha arco iris, demostraron que si

bien la expresión de SL es predominante en hipóflsis, también se expresa en otros

tejidos (Yang, et al., 1997). Estudios previos utilizando inmunoblotting de ARN

demostraron que la expresión de SL está restringida a la hipófisis en P. olivaceus (Ono

et aL, 1990). Esta discrepancia entre los resultados de los dos autores puede deberse a la

metodología utilizada ya que la sensibilidad del método de RT-PCR es mucho mayor

que la del inmunoblotting de ARN. Sin embargo es posible que existan diferencias entre

especies ya que utilizando técnicas inmunocitoquímicas, Mousa & Mousa (l999a),

demostraron la presencia de células ir-SL en el cerebro de Oreochromis niloticus.

El hecho de que una hormona hipofisaria se exprese en otros tejidos también fue

observado en mamíferos. Por ejemplo GH también se expresa en el sistema inmune

(Lytras et al., 1993) o PRL en placenta (Tadokoro et a/., 1995), glándulas mamarias
 Capilu/o 2

(LeProvost et al., [994), hipotálamo (Schachter et al., [984), cerebro (Wilson et al.,
1992), y células del sistema inmune (O’Neal et aL, 1992).

1 19 20 30 40 50 60 10 ¡0 90 [00
l l 9 9 O O 4’ Q + O

Atlantic cod . _ _ . . - .- j
tlamdzr _ , . _ - mmm'
ch]. su“ VIII; ' I - - n ¡(u-lll"
lwfish . _ _ .. .
lulihut _ _ . - - .. .
gilthesd ,
n_ _ _
namammmmr n. a. ,naa
- . ú .
nannmmmemmm
llo 120 110 un 150 160 170 180 190 200 210
o o o + O o o t O 6 l

l .uIn-uimn I ' _
- [Wii-31"! . - \
(csl . - - . l“ .
llfl _ . . .
(N?! . '“".""" . . - .

m}mm" rm n mon mk mom l. ' "o n m a 'nm't e m‘út

Fig. lO: Comparación dela secuencia de aminoácidos de SL en diferentes peces. Gadus morhua

(Ac), Para/ichrlrvs olivaceus (fl). Oncorhynchus ¡teta (cs). CVC/oprerus Iumpus (lt). Hippoglossus

hippoglossus (hb) y Sparus aurala (gh). Nótese que los residuos de cisteína se conservan cn todas las

secuencias. Con (*) se indican otros aminoácidos conservados y con (-) las deleciones. (Kancko. 1996).

b) Expresión génica y localización intracelular

Utilizando técnicas de hibridización in situ con sondas de cDNA que hibridizan para

la SL de chum salmon, Kaneko el al. (l993a), demostraron la expresión génica de la

molécula de SL en las células ir-SL que bordean la NH en la trucha arco iris. Cuando se

realizó ¡nmunocitoquímica para microscopía electrónica, que utiliza partículas de oro

unidas a proteína A se demostró la inmunoreactividad a SL en los gránulos de secreción

del citoplasma. Estas características en pane, definen a las células SL como
 Capitulo 2

células endócrinas.

Aunque el mecanismo intracelular de la síntesis de SL es poco conocido, se sugiere

al factor de transcripción Pit-l, como involucrado en la expresión génica de SL (Ono er

al., 1994). Pit-l es también responsable de la expresión de los genes que codifican para

GH, PRL de mamífero y para el desarrollo de las células productoras de PRL y GH.

Utilizando un antisuero contra Pit-l de chum salmon se demostró la presencia de una

proteína Pit-l de 40 kDa en la PI y en la PD de la hipófisis de la trucha arco iris (Ono &

Takayama, ¡992). Por inmunocitoquímica se demostró la localización de esta proteína

t en el núcleo de la células productoras de SL en la PI. Por lo tanto es probable que Pit-l

también esté involucrado en la expresión y el desarrollo de las células productoras de

SL.

c) Posibles funciones de la SL

El hecho de que la SL presente una estructura tan conservada y esté tan

ampliamente presente en teleósteos, sugiere que esta hormona jugaría un rol

significativo en la regulación de procesos fisiológicos en este grupo de vertebrados

(Johnson et aL. 1997).

Se han llevado a cabo numerosos estudios para elucidar la fiJnción de esta

hormona. Sin embargo, ninguno ha demostrado cuál es su fimción definitiva. Los

resultados obtenidos hasta el momento por los diferentes investigadores son los

siguientes:

44
 (.‘apilulo 2

- Papel (le la SL en la regulacion del Calcio

Estudios histológicos realizados en varios peces teleósteos (Olivereau et al.,

1980, l98la y b, Olivereau & Olivereau, 1982 a y b, Ball et aL, 1982) demostraron que

las células PIPAS (células PAS positivas de la Pl, presumiblemente células SL) se

activaban por exposición de los peces a un medio con baja concentración de calcio.

Más tarde, Kakizawa et aL, (1993) trabajando con trucha arco iris demostraron

que el área nuclear de las células SL se incrementaba cuando los peces eran transferidos

-de un medio rico en calcio a uno con baja concentración y esta área volvía a decrecer

cuando los peces eran transferidos nuevamente a un medio rico en calcio. Es importante

observar que un aumento en al área nuclear estaría indicando una elevada actividad

celular (Olivereau et al., 198lb). Los niveles de ARNm de esta hormona determinados

por hibridización in situ, también disminuyen al transferir los peces a un medio rico en

calcio y aumentan cuando nuevamente se los traslada al agua dulce, lo mismo que el

área nuclear y los niveles plasmáticos de dicha hormona. La activación de las células

productoras de SL en un medio pobre en calcio sugiere una acción hipercalcemiante de

SL.

- Papel (le la SL en respuesta al stress

Se demostró que diversos factores estresantes del medio ambiente no específicos

provocan un aumento en los niveles plasmáticos de SL en salmónidos (Rand-Weaver et

al., l993b, Kakizawa et aL, l995a) y en Pleuronectes vetulus, Johnson et aL, 1997). Sin

embargo, en Sciaénidos no se encontró una relación directa entre el aumento plasmático

de SL y el stress (Zhu & Thomas, 1995).

4. 'JI
 ('apilulo .7

- Papel (le la SL en la regulación ácido-base

Una manera de provocar stress es someter a los animales a la realización de

ejercicios exhaustivos (Kakizawa et aL, 1997). Considerando que la acidósis

(disminución del pH sanguíneo), usualmente se da cuando se realizan ejercicios

profundos (Heisler, 1993) y posiblemente cuando se dan situaciones de stress, se podria

presumir que en realidad el incremento en las concentraciones plasmáticas de SL

durante los ejercicios y el stress se produzca por la acidosis asociada. Kakizawa et al.

-(l996), trabajando con trucha arco iris, fiJeron los primeros en demostrar la relación

existente entre el pH sanguíneo y los niveles plasmáticos de SL. Cuando el pH del agua

fue disminuido de 7.5 a 4.5 por adición de HZSO4, se produjo una acidosis considerable.

El pH sanguíneo decreció de 7.6 a 7.1, 4 dias después de la exposición de los peces al

medio ácido, mientras que los niveles plasmáticos de SL se incrementaron un día

después de la acidificación del agua. Por otro lado, cuando se induce a los peces a la

realización de ejercicios exhaustivos por 8 minutos, y luego se los transfiere a peceras

de descanso, se observa un aumento en los niveles plasmáticos de SL inmediatamente

después del ejercicio, justamente cuando la acidosis es mayor. Los niveles de SL en

plasma tienden a disminuir conjuntamente con la disminución de la acidosis.

- Papel dela SL en el metabolismo de las grasas

Es prácticamente imposible realizar la remoción de las células somatolactínicas

sin afectar otros tipos celulares. Por lo tanto, las técnicas de estudio que incluyen la

extirpación de cierto tejido endócrino y el posterior análisis de los efectos causados no

es posible en este caso. Sin embargo, existe una variedad de trucha arco iris de

coloración azulada, llamadas “cobalto” en la cual se ha demostrado que carece de la Pl

46
 ( ‘upilulo 2

de la hipófisis (Kaneko et aL, l993b). Como mencionáramos anteriormente, ya que las

células productoras de SL se encuentran en la PI, esta variedad de trucha podn'a servir

como modelo para el estudio de la SL. Esta patología se caracteriza no sólo por carecer

de PI, sino también porque la hipófisis malformada esta completamente separada del

hipotálamo. Los estudios histológicos han demostrado que las células productoras de

GH y PRL son las predominantes, mientras que existen unas pocas células SL y MSH.

Por otra parte los niveles plasmáticos de SL son extremadamente bajos, y si bien los

niveles de GI-I son bajos están dentro de un rango fisiológico. Los niveles de PRL son

- iguales que en peces normales.

La diferencia fundamental entre la truchas arco iris normal y la variedad

“cobalto” es la deposición de la grasa en la cavidad abdominal (1.6 % en peces

normales versus 12 % en el “cobalto”). Ya que la anormalidad en el color se le podn'a

atribuir a la poca cantidad de células MSH (Oguri, 1983), la anormalidad en el

metabolismo de las grasas podría deberse a la casi ausencia de SL.

- Papel de Ia SL en Ia adaptación a su medio ambiente (background)

Los pn'meros estudios indicaban que las células PIPAS se activaban durante la

adaptación a un background (entorno) oscuro en Saratherodon mossambicus (Van Eys,

1980) y en Poecilia latipinna (Ball & Batten, 1981). Sin embargo, como mencionamos

anteriormente, en salmónidos las células productoras de SL son cromofóbicas, y en este

caso no son activadas por adaptación a un background oscuro.

Estudios recientes indican que en Sciaenops ocellatus y en Micropogonias

undulatus los niveles de SL en plasma eran mucho mayores en los animales mantenidos

con un background oscuro que aquellos con un background claro (Zhu & Thomas,

1995, 1996). En la trucha arco iris no se observan cambios en los niveles plasmáticos de

47
 ('apiIu/o 2

SL cuando se los adapta a los diferentes background (Kakizawa et al., l995a). Estos

datos sugerirían que la SL cumpliría un rol en la adaptación a un background oscuro en

no salmónidos, pero no en salmónidos.

-PapeI dela somatolactina en la reabsorción defósforo en el túbulo proximal renal.

Lu et aL, (l995) demostraron que la SL de salmón estimula la reabsorción de

fósforo inorgánico (Pi) de manera dosis dependiente a los niveles fisiológicos de la

-hormona, en cultivos primarios de células del túbulo proximal renal de Pleuronectes

americamls. El transporte de Pi fiJe significativamente alterado cuando los cultivos eran

expuestos a la presencia de SL de salmon, sin embargo, las fluctuaciones de Ca2+no

sufrieron variaciones. El tratamiento de estas células con SL de salmón produce un

aumento de AMPc y además la reabsorción de Pi es inhibida por el agregado de H89 un

inhibidor de la Protein Kinasa A. Estos resultados indicarían que la acción de SL estaría

mediada por el sistema de transducción de señales via Proteina Kinasa A (PKA) en

Pleuronectes americanas.

-Papel dela somatolactina en Ia reproducción.

Los pn'meros trabajos que sugieren una función para la SL en la reproducción

fueron los realizados por Rand-Weaver et al., (1992), quienes desarrollaron un

radioinmunoensayo (RIA) específico para la SL del coho salmon, y midieron los niveles

plasmáticos en este pez, durante el último año reproductivo (la mayoría de los coho

salmon desovan a los 3 años de edad, luego de lo cual mueren). Durante el período de

crecimiento gonadal, los niveles plasmáticos de SL se incrementaron. Este aumento se

correlaciona con el aumento de los niveles de estradiol en hembras y ll­

43
 (.‘apimlo 2

cetotestosterona en machos. Los niveles plasmáticos más altos se observaron durante la

maduración final y el desove/espermiación en ambos sexos.

Por otro lado, los niveles en plasma de SL también en este mismo pez se

elevaron durante la maduración sexual y la “smoltificación”. En condiciones naturales

el coho salmon es anádromo, es decir migra en primavera como juvenil (l año de vida)

del agua dulce al mar, donde permanece por lo menos un año. Previo a las migración

sufi'e importantes cambios morfológicos, fisiológicos y comportamentales que le

permiten sobrevivir en ese nuevo ambiente. Este proceso se denomina “smoltificación”.

- Durante el otoño del segundo año en el agua de mar, vuelve a migrar al agua dulce.

Durante la “smoltificación”, los niveles de SL variaron casi en paralelo con los niveles

plasmáticos de tiroxina. Cuando la smoltificación esta finalizando los niveles de ambas

hormonas comienzan a decrecer. Los niveles plasmáticos de SL permanecen bajos luego

de este pen'odo y comienzan a incrementarse durante la maduración gonadal,

alcanzando un pico durante el desove, mayor que el registrado durante la

“smoltificación” (Rand-Weaver & Swanson, l993). Por otra parte, también en coho

salmon, SL estimula la producción de ll-cetotestosterona y testosterona in vitro en

fragmentos de testículo, y la producción de estradiol de folículos ováricos de manera

dosis dependiente (Planas et aL, 1992). Sin embargo, la actividad esteroidogénica es

menor a la producida por GtH I.

En contraste con estos resultados, Kakizawa et aL, (l995b), no observaron una

clara correlación entre los niveles plasmáticos de SL y la maduración gonadal final en el

chum salmon. Se capturaron peces del mar, de la bahía y del río durante la migración

corriente arriba. Se observó un incremento en los niveles de SL en los peces capturados

en el rio, pero esto no parecía estar correlacionado con el desarrollo gonadal. Por otra

parte, en Micropogonias undulatus tampoco se observó un incremento en los niveles de

SL durante el desarrollo gonadal (Zhu & Thomas, 1997).

49
 Capi/uh) .7

Experimentos de castración en Salmo salar, maduros, mostraron una reducción

en los niveles plasmáticos e hipofisarios de SL comparados con animales controles

(Mayer et (11., 1998)., sugiriendo que los testículos maduros tendrian un efecto

estimulatorio en la síntesis y liberación de SL. Sin embargo, tratamientos a los animales

castrados con testosterona, l l-cetotestosterona o 17a, 20 B-hihidroxi-4-pregneno-3-ona

(20-P) no lograron abolir los efectos de la castración.

Por otro lado, los estudios histológicos proveen evidencias que apoyarían el rol

de la SL en la reproducción. En dos especies de, Oncorhynchus nerka y O. keta,

-utilizando técnicas inmunocitoquímicas, se demostró un incremento tanto en número

como en tamaño, de las células productoras de SL en animales inmaduros con respecto

a los maduros. Las células ir-SL en peces inmaduros, aparecían menores y menos

inmunoreactivas que las células ir-SL de los peces maduros. En peces próximos a

desovar, estas células eran mucho grandes y presentaban fi'ecuentemente mayor

cantidad de gránulos. Células grandes con mayor o menor degranulación , indicarían

una activa liberación de gránulos de SL (Olivereau & Rand-Weaver, l994a). En

Oncorhynchus tshawytscha, los mismos autores, también observaron cambios

morfológicos en las células somatolactínicas en relación con el desarrollo gonadal

(Olivereau & Rand-Weaver, 1994b). Recientemente, Mousa & Mousa (l999a)
observaron variaciones estacionales en número, tamaño e intensidad de la marcación en

las células productoras de SL, en concordancia con el desarrollo gonadal y el desove en

Oreochromis niloticus.

Todos estos resultados estarían involucrando de algún modo a la SL en la

reproducción, pero ninguno de ellos provee una evidencia directa. Como se sabe la

reproducción incluye no sólo el desarrollo gonadal y el desove, sino también varios

eventos biológicos asociados, tales como la energía metabólica, la alimentación y la

ionoregulación (Kakizawa e! al., l995b).

 (Ïapílulo 2

En base a lo planteado en esta introducción, se ha propuesto analizar las

variaciones de las celulas productoras de SL en pejerreyes en diferentes estados de

maduración gonadal, recalcando que el pejerrey, a diferencia de los Salmónidos

transcurre todo su ciclo de vida en el mismo ambiente.

Se plantean como objetivo de este segundo capitulo lo siguiente:

II-II Objetivos

—Caracterizar inmunológicamente a la SL de pejerrey, y determinar la

especificidad de los antisueros utilizados.

- Analizar las variaciones de las células productoras de SL en relación con

los diferentes estadios reproductivos.

II-III Materiales y métodos

a) Caracten' cío’ninmunolo' ica (le la somatolactina de la hi ó ¡sis (le e'err

Western blot

El hecho de estar trabajando con un sistema de antisueros heterólogos, obliga a

determinar la especificidad de los mismos. Si bien en el capítulo I se determinó que

cualquiera de los antisueros contra SL reconocían las mismas células, los controles se

reforzaron realizando una caracterización inmunológica de la SL utilizando la técnica de

Western blot.

'JI .­
 ( 'apilulo 2

SDS-PA GE

La determinación del peso molecular (PM) de la SL y la especificidad de los antisueros

contra SL utilizados en las técnicas de inmunocitoquímica se realizó por Western blot.

Se utilizaron 20 hipófisis (45 mg) provenientes de pejerreyes adultos de la laguna de

Chascomús, las cuales fueron homogeneizadas con un homogeinizador vidrio-teflón en

2 ml. de buffer Tris-HCL 50 mM, pH 7.4. El homogenato fiJe luego centrifugado a

6000g por 30 min. Una alícuota del sobrenadante se utilizó para determinar la

_concentración de proteínas (Lowry et al., 1951) y el resto se guardó a -20°C hasta el

momento de la electroforesis SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

patterns). Se tomaron 5 ul del homogenato (37 ug de proteínas) junto con 5 ul de buffer

de siembra [120 mM TRIS-HCL pH 6.8, 3% dodecil sulfato de sodio (SDS), 10%

glicerol y 0.2% azul de bromofenol] en condiciones reductoras (1% B-mercapto etanol)

y no reductoras. Cuando los homogenatos se com'eron en una solución sin B mercapto

etanol, no se logró obtener bandas bien definidas, sin embargo las muestras con B

mercapto etanol definieron bien las bandas. Se calentaron a 95°C por 5 min luego del

cual se centrifugaron a lOOOOgpor l min. Las muestras se sembraron en un gel

acrilamida-bis acrilamida (15%-0.4%) en buffer Tris HCL 350 mM, pH 8.8. En una de

las calles se sembró SL recombinante de Spams aurata en las mismas condiciones que

el homogenato. Para determinar el PM relativo (Mr) se sembró además una mezcla

compuesta por: fosforilasa b, (97.4 kD), sero albúmina (66.2 kD), ovoalbúmina (45 kD),

anhidrasa carbónica (31 kD), inhibidor de tn'psina (21.5) y lisosima (14.4 kD). El

procedimiento fue llevado a cabo mediante un sistema de electroforesis vertical (Mini­

PROTEAN II, BIO-RAD), utilizando geles de 1.75 mm de espesor, preparados entre

placas de vidrio (8 x 7.3 cm), empleando un gel separador (4 ml) y un gel stacking,

acrilamida-bis acrilamida (2.5%-0.06%) en buffer Tris HCL 124 mM, pH 8.8. Cada gel
 Capilqu 2

constaba de lO calles. En 4 de las calles se sembraron lO cada calle se sembraron

La separación de las proteínas se realizó a un voltaje de 100V hasta que las

muestras llegaron al gel stacking luego de la cual el voltaje se cambió a 150 V (tiempo

aproximado 2 hs).

Transferencia

Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE fiJeron posteriormente

- transferidas en buffer de transferencia (Tn's 0.025M, glicina 0.187 M, 20% metanol) a

membranas de nitrocelulosa (BRL Hybri-dot Manifold, Life Technologies, Inc.) por

aplicación de un amperaje constante de 300 mA durante una hora.

Una vez concluida la transferencia, el gel y la membrana de nitrocelulosa fueron

separadas. El gel fue coloreado con una solución de Coomassie blue (0.1% Coomassie

Brillant Blue, 50 % de metanol, lO % de ácido acético) por 2 hs y luego lavado con

solución decolorante (5% ácido acético, 7.5% de metanol) con el objeto de verificar la

eficiencia de la corrida electroforética y la distribución de los estándares de PM. Por

otra parte, con el objeto de ven'ficar la eficiencia de la transferencia e identificar las

distintas calles, la membrana de nitrocelulosa fue tratada durante 2 min, a temperatura

ambiente y con agitación constante, con una solución Ponceau S (ácido 3-hidroxi-4-[2­

sulfo-4-(4-sulfofenilazo)fenilazo]-2,7-nafialenodisulfónico). Esta solución se preparó a

partir de l parte de una solución stock (2% Ponceau S en 30% ácido tn'cloroacético) en

9 partes de una solución 1% de ácido acético. Posteriormente se decoloró totalmente la

membrana mediante un excesivo lavado con agua bidestilada.

Las condiciones reductoras fiieron eficientes para la determinación del PM de la

SL, con lo cual se utilizó este tratamiento para los análisis posteriores. Para la

determinación del PM de esta hormona se comparó la distancia relativa de la banda

 Capitulo 2

correspondiente con las distancias relativas de una mezcla de proteínas de PM bajo. Se

caracterizó cada banda por su valor de relación de frentes (Rr) correspondiente, siendo:

Rr= Distancia (cm) recorn'da por la proteína considerada! Distancia (cm)

recorrida por el azul de bromofenol.

Conociendo el valor de Mr de cada proteína patrón se construyó el gráfico (Ri­

vs. log Mr correspondiente).

- Western blot

Las membranas de nitrocelulosa fueron mantenidas en una solución de TTBS

(100 mM Tris, 0.9 % ClNa, Tween 20 0.1%, pH: 7.5) hasta que se realizó el bloqueo

(150 ul de suero de caballo en 10 ml de TTBS). Esta incubación fue realizada con el

propósito de evitar la adsorción inespecifica. Luego de dos lavados en TTBS, las

membranas fueron incubadas por una hora a temperatura ambiente en el antisuero

primario preparado en conejo (anti-saSL, anti-coho salmon SL, anti-chum salmon SL y

anti-rdSL, ver Tabla l, cap. I, 1:2500) en TTBS. Una vez transcurrido este tiempo las

membranas se lavaron nuevamente en TTBS dos veces 10 min cada vez. Luego se

sometió a las membranas por 30 min al anticuerpo secundario unido a biotina (Vector

Lab., Burlingame, CA), se lavaron nuevamente en TTBS y se pusieron en contacto con

el complejo avidina-biotina peroxidasa (Vector Lab., Burlingame, CA) por 30 min. Una

vez transcurrido este tiempo, las membranas fueron reveladas en una solución 0.03%

3,3’ diaminobencidina en Tris bufl'er (pH: 7.6) y 0.02% de HzOz y otras con un kit

comercial quimioluminiscente (Western blot Chemiluminescence Reagent, Nen Life

Science Products, Boston, MA).
 Capitulo 2

b) Relación entre el volumen de las células productoras (le SL 2 el estado

reproductivo

Animales

Hembras (n:29) y machos (n:lS) fueron coleccionados a lo largo de un año de

estanques externos en la Estación experimental de la Saitama Prefecture Fisheries

(Japón). Esta parte del trabajo se realizó en colaboración con el Dr. Carlos Strusmann,

- quien determinó el estadio reproductivo de cada animal (por análisis histológico de las

gónadas) y el índice gonadosomático (GSI%) (peso de las gónadas/peso corporal). Las

gónadas y los cerebros junto con las hipófisis fueron removidos y fijados en Bouin.

Luego de la inclusión en parafina, las gónadas fueron cortadas y se realizó un análisis

histológico de las mismas. El estadio reproductivo en hembras fue determinado

midiendo el GSI% y realizando un análisis de los ovarios. De acuerdo a esto fueron

clasificadas en activas (vitelogénicas o predesove) o inactivas (en reposo o regresadas).

Los machos fiieron clasificados de acuerdo al GSI%. Los cerebros junto con las

hipófisis también f'ueron incluidos en parafina y de cada uno se realizaron cortes

seriados parasagitales de 7 um, los cuales fiieron montados en portaobjetos previamente

gelatinizados.

Inmunohistoquímica

Cada corte file inmunomarcado, utilizando el método ABC, descripto

previamente en el capítulo l. Las secciones fueron desparafinadas en xileno, hidratadas

en una serie decreciente de alcoholes y llevados a PBS. Las secciones se incubaron por

30 min en 0.3% de agua oxigenada para bloquear las peroxidasas endógenas y fueron
 (‘apimlo 2

lavadas luego en PBS. Para reducir las marcaciones no específicas los cortes fiJeron

tratados con suero normal de caballo por 30 min y lavados luego en PBS. El antisuero

primario, anti-chum salmon SL (l :1000) fire aplicado a los cortes y estos se incubaron

toda la noche a 4°C. El antisuero secundario biotinilado, anti-conejo IgG y el complejo

ABC fue aplicado durante una hora cada uno. El producto final se visualizó con 0.3%

3,3'-diaminobenzidina en buffer Tris HCL, pH 7.6 y 0.02% 1-1202.Las secciones fueron

montadas en DPX.

En alguno de los cortes se realizó la reacción de PAS (Acido peryódico de

-Schifi) para determinar si las células productoras de SL eran PAS positivas.

Determinación delas medidas delas célulasproductoras (leSL

De los cortes inmunomarcados, fileron seleccionadas 64 células ir-SL de

diferentes zonas de la hipófisis para ser medidas con el analizador de imágenes

(Quantimet 520 Leica). Se seleccionaron sólo aquellas células en la que se notaba

claramente la forma elongada típica de las células productoras de SL, es decir las que en

el corte aparecen claramente sagitales. Se descartaron todas las células que presentaron

una forma redondeada, para evitar medir las cortadas en un plano transversal.

A cada célula se le midió el área celular y el área nuclear. También se

determinaron otros parámetros como el perímetro, largo mayor y ancho mayor tanto de
la célula como del núcleo.

Los datos fueron analizados utilizando ANOVA de un factor, y análisis de

correlación.
 Capitulo 2

Análisis estadístico

Los valores se expresan como la media i la media de los desvíos estándar

(SEM). Los datos fueron analizados utilizando un programa para el análisis de datos

estadístico (GraphPad Instat). Para comprobar si el área celular y el GSI% o el área

celular y el área nuclear varian juntas se realizó una correlación de Pearson. Las

diferencias entre la media del área celular de las células ir-SL en peces con diferentes

status reproductivo, se realizó un Test de Student (Estadístico de “t” para dos muestras

- independientes). Las diferencias fueron consideradas significativas a P<0.05 o P<0.0l.

Il-IV Resultados

a) Caracterización inmunológica de la somatolactína de la hipoflsis de pejerrey por

Western blot

Por medio de la técnica de Western blot se reveló una banda principal de

aproximadamente 33 ch con todos los antisueros utilizados (Fig. ll y 12). Sin

embargo, otras bandas de menor peso molecular también se revelaron aunque con

menor intensidad. Las bandas de PM mayor que 33 kD corresponderian a dímeros de

SL.

Por otra parte, cuando se utilizó la técnica de PAS en cortes seriados de hipófisis

se demostró que las células productoras de SL son PAS positivas indicando que esta

proteína se encuentra glicosilada (Fig. 13).

 Capitulo 2

b) Relación entre las células productoras de SL y el estadio reproductivo

En todos los individuos estudiados, las células ir-SL fiJeron detectadas en la Pl.

No se encontraron células inmunomarcadas en la PDR ni en la PDP, indicando que no

hay reacción cruzada con GH y PRL. Las células ir-SL eran elongadas y mostraron una

polaridad típica, con el núcleo localizado en la parte apical y los gránulos concentrados

en la parte basal de la célula. Las células somatolactínicas son de mayor tamaño y con

mayor cantidad de gránulos en las hembras comparadas con machos.

Hembras

En la hipófisis de las hembras inactivas (no vitelogénicas), las células ir-SL

fueron más pequeñas y suavemente granuladas comparadas con la de las hembras

activas (vitelogénicas) (Fig. 14) y el análisis estereométrico mostró diferencias

altamente significativas (P<0.01) en el área celular (62.9 i 2.1 um, 76.8 i 2.3 um) (Fig.

15). Aunque no fueron cuantificadas, el número de células ir-SL parece ser mayor en
hembras sexualmente activas.

Las áreas celular y nuclear se correlacionaron positivamente (r:0.43; P<0.05)

(Fig. 16). Por su parte, el área celular y el GSI% también se correlacionaron

positivamente (r:0.49; P<0.0l) (Fig. 17).

Machos

Las células ir-SL de la hipófisis de los machos con GSI% bajos fueron más

pequeñas y suavemente granuladas (Fig. 18). En machos con altos valores de GSI%,

aunque no se cuantificó, el número de células ir-SL parece mayor y el área

 Capitulo 2

inmunomarcada se encuentra incrementada comparada con los machos con menor

GSI%. Sin embargo, aunque se observó una tendencia a aumentar el área de las células

ir-SL con el GSI%, esta correlación no fue estadísticamente significativa (Fig. 19). En

ambos casos, el área celular no se correlacionó con el área nuclear (Fig. 20).
 Capítulo 2

-97.4
-óó.2
-45.0
-31.0

-2l.5
-14.4

Fig. ll: Reconocimiento de SL mediante el análisis por Western blot. En los carriles 1 a
3, homogenatos de hipófisis de pejerrey fueron sometidos a una electroforesis en geles
de poliacrilamida (15%) en presencia de SDS y transferidos a membranas de
nitrocelulosa. Luego fueron incubados con anti-rdSL (carril 1), antí-coho salmon SL
(carril 2), anti-saSL (carril 3). En el carril 4 se sembró SL recombinante de Sparus aurata
y se reveló con su antisuero. Las muestras se trataron bajo condiciones reductoras. A la
derecha se indican la movilidad de los standares de PM.

60
 Capítulo 2

-97.4
-óó.2
’ -45.0
-31.0

-21.5
-14.4

Fig. 12:Reconocimiento de SL utlizando diferentes antisueros: anti-saSL (carril 1),anti­

coho salmon SL (carril 2), anti-rdSL (carril 3) y anti-chum salmon SL.. Las muestras se
trataron bajo condiciones reductoras. A la derecha se indican la movilidad de los
standares de PM.

61
 Capítulo 2

Fig. 13: Dos cortes sucesivos de hipofisis de pejerrey, en donde se observan las mismas
células coloreadas con la técnica de PAS (a) y con anti-saSL (b) (flecha). Esto estaría
indicando que las células ir-SL son PAS positivas, x100.

62
 Capítulo 2

Fig. 14 : Cortes parasagitales de hipófisis de pejerrey hembra, en donde se observa el

aspecto de las células ir-SL. (a) GSI 11.9% (b) GSI 2.9 1% y (c) GSI 1.79%. Amedida
que disminuye el GSI% las gónadas son más inmaduras. Nótese la diferencia de
tamaño de las celulas en los diferentes cortes. x 500.

63
 Capítulo 2

(uni)
celular
area

activas inactivas

Fig. 15: Comparación entre el área celular de las células ir-SL en

hembras activas o vitelogénicas e inactivas o no vitelogénicas. Los
valores representan la media i el error standan de la media
(76.8i2.3p.m, 62.9i2.1 um). Las diferencias son significativas
(P<0.01).

l1 O

N
I-lOO
4‘­
N
G

¡­ al

p­ J.

(uni)
nuclear
area
¡—¡ N
l

pd O

J. c UI e 60 70 80 90 100
area celular (umz)

Fig. 16: Correlación entre el área nuclear y el área celular de las

células ir-SL de la hipófisis de hembras de pejerrey (r:0.-'l3;P<0.05).

64
 Capítulo 2

110 ­

S
8e lI
I-I N.

S
(uni)
celular
area

3%

Fig. 17: Relación entre el área de las células ir-SL y el GSI% en

hembras. Cada punto representa la media de 64 células. El área celular
se incrementa significaüvamente concomitante con el GSI% (r:0.49,
P<0.0l).
 Capítulo 2

Fig. 18 : Cortes parasagitales de hipófisis de pejerrey macho, en donde se observa el

aspecto de las células ir-SL. (a) GSI 2.98%, (b) GSI 1.72% y (c) GSI 0.34%. Nótese la
diferencia de tamaño de las células en los diferentes cortes. En la fig. c) las células
presentan un citoplasma reducido y se observa una degranulación importante en el
citoplasma, x 500.

66
 Capitulo 2

celular
(um)
area

Fig. 19.: Relación entre el área celqu y el GSI% en machos. Cada

punto representa la media de 64 células medidas. Aunque se observa
una tendencia positiva. la correlación no es positiva (110.51).

(umz)
nuclear
arca

area celular (umz)

Fig. 20: Correlación entre el área nuclear y el área celular en machos.

La correlación no es positiva (r:0.-l-l).

67
 (.‘npilulo 2

lI-V Discusión

El análisis por Western blot confirmó lo observado por inmunocitoquímica,

todos los antisueros utilizados para poner en evidencia a las células productoras de SL

la reconocieron específicamente.

La banda predominante de aproximadamente 33 kD estan'a indicando que esta

hormona en el pejerrey se encuentra altamente glicosilada, y probablemente en mayor

grado que en otras especies. Cabe aclarar que la movilidad electroforética sirve para

- estimar el PM de una proteina y en la mayoría de los casos no coincide con el PM real

calculado con otros métodos más exactos, tales como la secuenciación de aminoácidos.

Dado que usando el mismo sistema de separación electroforética, el PM de la SL

recombinante de Spams aurata fue estimado en 27 kD, mientras que el PM real

deducido por secuencia de aminoácidos fue de 24 kD (Astola et al., 1996) no se puede

descartar que para la SL de pejerrey se este sobrestimando su PM en uno a tres kD.

Las señales inmunoreactivas a SL de menor PM, probablemente estén indicando

la expresión de formas de SL en estado no glicosilado. La presencia de dos formas de

SL en diferente estado de glicosilación se observó en diferentes especies de teleósteos

(Astola et aL, 1996, Johnson et aL, 1997) y probablemente es lo que suceda en el

pejerrey. Al respecto, es importante destacar que un análisis preliminar de la expresión

de SL a lo largo de la ontogenia del pejerrey demostró que el antisuero contra SL de red

drum (en este caso SL glicosilada) reconoció células ir-SL en juveniles de más de 50

días post eclosión y no antes. Sin embargo, el anticuerpo contra chum salmon SL (SL

no glicosilada) fue efectivo en marcar células ir-SL al día l post eclosión (resultados no

mostrados). Si bien no sabemos cúal es el epitope que reconoce cada antisuero utilizado,

desde que ambos antisueros son efectivos para inmunomarcar SL en adultos, se puede

suponer la expresión de diferentes SL, una presente desde etapas tempranas del

68
 Capilulo 2

desarrollo y otra que se expresaría en etapas posteriores. Para validar esta hipótesis se

requieren análisis más profiJndos los cuales se llevaran a cabo posteriormente a esta
Tesis Doctoral.

Por otra parte cuando se realizó la tinción de PAS ésta demostró que las células

productoras de SL son positivas a este colorante, indicando la presencia de SL en estado

glicosflado.

Las células ir-SL en el pejerrey presentaron en ambos sexos importantes

-cambios relacionados con el estadio reproductivo. En peces maduros, las células ir-SL

aparecieron de mayor tamaño comparadas con las de aquellos peces con gónadas en

regresión. Sin embargo, en machos la correlación entre el área de las células ir-SL y el

GSI% no fue estadísticamente significativa. Estos resultados concuerdan con estudios

realizados en dos especies del género Oncorhynchus (Olivereau & Rand-Weaver,

l994a,b). Recientemente, ha sido reportado un incremento en el número y la actividad

de células ir-SL (caracterizadas por hipertrofia, vacuolización e intensidad de la

inmunomarcación) en relación con el aumento de la actividad gonadal en Oncorhynchus

nilotirms (Mousa & Mousa, l999a). Además el estudio de ejemplares de la misma

especie provenientes de un lago con altos niveles de contaminación, demostró una

declinación en la actividad gonadal de ejemplares adultos junto con una disminución de

la actividad secretora de las células ir-SL (Mousa & Mousa, 1999b).

La relación entre SL y actividad gonadal puesta de manifiesto mediante análisis

morfológico ha sido también correlacionada mediante el estudio de los niveles

hormonales en sangre. En efecto, en el coho salmon, O.kisutch se observó una elevación

de los niveles plasmáticos de SL durante la maduración final (Rand-Weaver et al.,

1992; Rand-Weaver & Swanson, 1993) que fue también correlacionado positivamente

con los niveles plasmáticos de esteroides (Rand-Weaver et al., 1992). En esta especie,

69
 Capilqu J

SL también estimula la esteroidogénesis gonadal in vitro (Planas e! al., 1992). En otra

especie del género Oncorhynchus, el chum salmon O keta , Taniyama et al.(l999)

sugirieron que la expresión del gen de SL es elevada durante la maduración sexual. En

Salmo salar, la gonadectomía reduce significativamente los niveles plasmáticos de SL y

los niveles hipofisarios (Mayer et al., 1998), pero los tratamientos de restitución con

esteroides no lograron restituir los niveles plasmáticos de SL a los niveles controles.

Estos datos estarían indicando una relación entre la síntesis y secreción de SL y la

maduración sexual pero aparentemente por una vía alternativa que no involucra a los

_esteroides gonadales (Mayer et al., 1998).

Otros resultados, en cambio, no han logrado evidenciar esta relación y han

sugerido que el incremento en los niveles de SL correlacionados con el desarrollo

gonadal en salmónidos estaría más relacionado con factores estacionales que con el

desarrollo gonadal en sí mismo (Rand-Weaver et al., 1995). Kakizawa et al. (l995b), no

encontraron una clara correlación entre los niveles plasmáticos de SL y la maduración

gonadal en 0. keta. Mas aún, no se encontraron cambios en los niveles plasmáticos de

SL en dos especies de Scienidos, Sciaenops ocellatus y Micropogonias undulatus (Zhu

& Thomas, 1995).

Los resultados obtenidos y resumidos en este capítulo, aportan una fuerte

evidencia de que SL podría estar involucrada en la reproducción, aunque no podemos

descartar el papel de la temperatura, el fotoperíodo y otros cambios estacionales que se

producen conforme avanza el desarrollo gonadal. Es importante hacer notar que al

menos en la trucha arco iris la temperatura del agua se correlacionó positivamente con

los niveles plasmáticos de SL (Rand-Weaver et al., 1995) y que en el pejerrey la

temperatura está relacionada con distintas etapas del proceso reproductivo (Stn‘jssmann,

1989). Sin embargo, desde que tanto hembras como machos fiJeron sometidos a

condiciones similares de cautiverio y que sólo en las pn'meras se pudo verificar una

70
 ('upimlo 2

correlación significativa entre GSI% y área celular de las células SL, no podemos

desechar la hipótesis de que SL esté implicada, directa o indirectamente, en los procesos

reproductivos de hembras de pejerrey.

Como mencionáramos anteriormente, las células ir-SL se localizan en la Pl en

proximidad a la NH. El hecho de que se observen variaciones en el área de las células

ir-SL en relación con el estadio reproductivo y la asociación que estas células tienen con

la NH, de alguna manera estaria indicando que algún factor o factores hipotalámicos

intervendrían en la síntesis y liberación de SL. Dado que GnRH es el neuropéptido que

-fundamentalmente interviene en los procesos reproductivos regulando la actividad de

las gonadotrofinas, podría estar regulando también a SL. Es por esto que se plantearon

los experimentos del próximo capítulo, tendientes a ver si existe una relación entre

GnRI-I y las células productoras de SL.

 Capílulo 3

CAPITULO m: RELACIÓN DEL NEUROPÉPTIDO LIBERADOR

DE GONADOTROFINAS (GnRH) Y LAS CÉLULAS
PRODUCTORAS DE SL

III-I Introducción

En todos los vertebrados, el neuropéptido GnRH cumple un rol fimdamental no

sólo en el desarrollo y el mantenimiento de la función reproductiva, estimulando la

- síntesis y liberación de las gonadotrofinas (GtH I y GtH II) hipofisarias sino también en

los cambios comportamentales relacionados con la reproducción. Este neurope'ptido se

sintetiza en determinadas áreas cerebrales alcanzando la hipófisis directamente

(teleósteos) o a través del sistema porta-hipofisario (tetrápodos).

Hasta el momento se han identificado catorce variantes de GnRH (Tabla 2),

doce en vertebrados y dos en protocordados. El nombre de cada una de estas variantes

proviene de la especie en la que file descripta por pn'mera vez. Estas son: mamífero:

GnRH (mGnRH), lamprea GnRH-I (lGnRH-I) y lamprea GnRH-III (lGnRH-III),

chicken GnRH-I (cGnRH-I) y cGnRH-II, catfish GnRH (chnRH), dogfish GnRH

(danRH), salmon GnRH (anRH), seabream GnRH (sbGnRH), herring GnRH
(hGnRH), guineapig GnRH (ngnRH), una variante hidroxilada de la forma de
mamífero (Hyp9)mGnRH, tunicado GnRH-I (thRH-I) y thRH-II y por último
pejerrey GnRH (pGnRH) (Stefano et al., 1997, Fradinger et aL, 2000, Montaner, com.

personal).

Todas estas variantes se caracterizan por ser decapéptidos, con el extremo amino

terminal ciclado formando un piroglutamáto (pGlu), el extremo carboxilo tenninal

amidado (Gly-amida), y porque los residuos 1,4,9 y 10 se encuentran conservados.

El hecho de poseer los extremos amino y carboxilo conservados, sugiere que

 Capitulo 3

estas regiones son importantes para la unión con el receptor, la resistencia a la

degradación enzimática y el disparo de los eventos mediados por receptor en la

liberación de las gonadotrofinas (Stefano, 1999).

mamífero pGLL' HIS TRP SER TYR GLY LEU .-\RG PRO GLY

Guinea Pig - TYR - - - - VAL - - ­

Chicken-l - - - - - - - GLN - ­

Sea Bream - - - - - - - SER - _

Catfish - - - - HlS - - ASN - ­

Salmon ' ' ' - - - TRP LEU - ­

Dogñsh - - - - HlS - TRP LEU - ­

Chicken-ll - - - - HIS - TRP TYR - ­

Lamprea-lll - - - - HIS ASP TRP LYS - ­

Lamprea-l - - TYR - LEU GLU TRP LYS - ­

Tunicado-l - - - - ASP TYR PHE LYS - ­

Tunicado-ll - - - - LEU CYS HIS .-\L.-\ - ­

Hen'íng - - - - HIS - - SER - ­

Tabla 2: Secuencia de aminoácidos de las trece variantes de GnRH. El guión indica los mismos

aminoácidos que en mamífero. Se especifican sólo los aminoácidos que van'an con respecto a mGnRH.

En la actualidad, se sabe que el cerebro de todos los vertebrados, incluso el de

humanos, expresan al menos dos formas de GnRH. una altamente conservada: cGnRH­

Il, y distintas formas que varían de acuerdo con la especie. En teleósteos, se han
caracterizado además de cGan-l-Il otras formas: anRI-I, chnRH, sbGnRI-l,mGnRH,

hGnRH y pGnRH (Carolsfeld et al., 2000, Montaner et aL, com. personal). La

 Capítulo 3

distribución neuroanatómica varía en las diferentes especies y por lo general cGnRH-II

se expresa en cuerpos neuronales localizados en el diencéfalo posterior o cerebro medio.

Otras formas de GnRH (anRH, mGnRI-l y cGnRI-I-l) se encuentran asociadas con el

nervio terminal y se expresan en neuronas distribuidas en el piso del cerebro anterior,

principalmente en el área septal y preóptica.

En el pejerrey se expresan tres variantes moleculares de GnRH: cGnRI-I-ll,

anRH, y una tercer variante descripta por primera vez en el pejerrey, pGnRH por

Stefano et al_, ¡997 y Montaner et a1., (com. personal).

La distribución neuroanatómica de las variantes de GnRH en el encéfalo es la

siguiente: un grupo de neuronas corresponde al Nucleus olfacto retinalis (NOR),

ganglio que se localiza en posición ventral entre el bulbo olfaton'o y la región

anteroventral del telencéfalo, un segundo grupo localizado en el área preóptica anterior,

más específicamente en el Nucleus preoplicus periventricularis (NPP), y un tercer

grupo de neuronas que corresponde al tegmentum dorsal del área mesencefálica,

inmediatamente caudal a la comisura posterior (Stefano, 1999).

Como se mencionara anten'ormente, el caso de los peces teleósteos es único, ya

que al no poseer un sistema porta hipofisario, la adenohipófisis está directamente

inervada por fibras hipotalámicas neurosecretoras (Peter et al, 1990). Las

neurohormonas producidas por estas fibras son liberadas en las proximidades de las

células adenohipofisarias. Las terminales neurosecretoras pueden atravesar la membrana

basal que las separa de las células y contactar directamente con ellas o finalizar en la

membrana basal que separa la NH de la ADH (Peter el al., 1990; Anglade et aL, 1993).

Las fibras que secretan los diferentes neuropéptidos no se encuentran distribuidas

libremente en la adenohipófisis sino que están asociadas con las células blanco. Por lo

tanto la existencia de una asociación intima entre un tipo celular particular y las fibras

neurosecretoras, indicaría que esa neurohonnona estaría involucrada en la regulación de

74
 Capitulo 3

la actividad de ese tipo celular. Un ejemplo de esto es la asociación morfológica

existente entre las fibras GnRHérgicas y los gonadotropos en el goldfish, Carassius

miran/.9 (Kah et al., 1986).

Clásicamente, los gonadotropos eran considerados las células blanco primarias

del neuropéptido GnRH, sin embargo, estudios recientes han demostrado que este

neuropéptido también regula la síntesis y liberación de GH en goldfish (Marchant &

Peter, 1986, Marchant et al., 1989; Chang et al., l990a), Oreochromis sp. (Melamed et

al., 1995, 1996) y en la Cyprinus carpio (Lin et al., 1993). También existen evidencias

- sobre la presencia de receptores para GnRH en somatotropos del goldfish (Cook et al.,

1991) y la existencia de una asociación morfológica de fibras ir-GnRH y este tipo

celular en Onchorynchus mykiss (Parhar & Iwata, 1994). A pesar de esto, GnRH no

puede ser considerado un secretagogo de GH universal en peces teleósteos. Por ejemplo

en trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss no se han obtenido resultados claros (Le Gac

et al., 1993, Blaise et al., 1995; Holloway & Leatherland, ¡997) y el efecto de GnRH en

la secreción de GH está ausente en el catfish, Clarias gariepirms (Bosma et al., 1997).

En Oreochromis mossambials, Weber, et al., (1997), demostraron que la

liberación de PRL de la PDR es también estimulada por GnRH, aunque la mayoría de

las evidencias indican que en peces teleósteos las fibras productoras de GnRH inervan

la PDP y la PI (Anderson et al., 1995; Chiba et al., 1996; Montero et al., 1994; Moons

et al., 1989; Parhar & Iwata 1994) y los lactotropos se encuentran en la PDR.

En el pejerrey, se demostró una asociación íntima entre las fibras de GnRH y las

células productoras de GH y PRL (Stefano, 1999) y posteriormente se determinó la

presencia de receptores a GnRH en estas células (Stefano , 1999).

Sin embargo, existe muy poca información sobre la regulación de la liberación

de SL. Olivereau en 1969 comprobó que autotransplantes de hipófisis mostraban

degeneración de la NH y unas pocas células PAS positivas de tamaño muy pequeño

 Capitulo 3

(presumiblemente células somatolactínicas), sugiriendo que la síntesis y secreción de

SL estaria bajo control positivo de factores hipotalámicos. Posteriormente estudios

histológicos demostraron que fibras originadas en el hipotálamo están en íntimo

contacto con las células productoras de SL de la PI (Rand Weaver et al., l991b, Kaneko

et al., l993a, Olivereau & Rand-Weaver, l994a,b). Por otra parte, Kakizawa et al., en

1997 observaron que dopamina y epinefrina inhiben la liberación de SL mientras que

serotonina y el factor liberador de corticotrofinas (CRF) estimulan la liberación de SL

inhibida por dopamina.

Existen también algunas pocas evidencias que sugerirían que las células

productoras de SL estan’an reguladas por GnRH: En la trucha arco iris, O. mykiss, se vió

que GnRH bloquea la acción inhibiton’a de dopamina sobre la secreción de SL en

cultivo primario de células hipofisarias (Kakizawa et aL, 1997) y en la misma especie

Parhar & Iwata (1994) observaron fibras GnRHérgicas en contacto con células SL. Por

otra parte en salmónidos como, O. kisutch se detectaron variaciones en los niveles

plasmáticos de SL en correlación con el ciclo gonadal (Rand-Weaver el aL, 1992, Rand­

Weaver & Swanson, 1993).

En base a esta bibliografia y a los resultados ya descriptos en el capitulo II

referidos a las variaciones entre las células somatolactínicas y la maduración gonadal se

plantea el siguiente objetivo:

III-II Objetivo

- Establecer la relación entre las células productoras de SL y el

neuropéptido GnRH determinando en primer lugar si existe una asociación
morfológica entre las fibras de GnRH y las células somatolactínicas y de
verificarse esto analizar la presencia de sitios de unión a GnRH en estas células.

76
 ( 'apiluln 3

III-lll Materiales y Métodos

gonallotrotmas 2 somatolactina.

Animales

Ejemplares de pejerreyes adultos de ambos sexos fueron capturados con redes de

- pesca, en la Laguna Salada Grande, Partido de General Madariaga, Provincia de Buenos

Aires. Los cerebros junto con las hipófisis fueron fijados in situ con una solución de

paraformaldehído 4%, ácido pícrico 0.4%, en buffer fosfato salino (PBS, 0.05M, pH

7.4) antes de ser removidos.

Procesamiento de las muestras

Una vez removidos los cerebros junto con las hipófisís, las muestras fiJeron

fijadas 24 hs, y luego se almacenaron en una solución de sacarosa 15% en PBS, por 24

hs a 4°C. Posteriormente fiJeron criopreservadas a -20°C en sacarosa 30%,

polivinilpirrolidona (PVP-40) 15%, etilenglicol 30% en PBS 0,05. hasta el momento en

que se realizaron los cortes (Watson et al., l986).

Las muestras fiJeron incluidas en O.C.T. (Tissue-Tek Miles, USA) y cortadas en

crióstato a una temperatura de -20°C. Los cortes parasagitales (30 um) se montaron en

portaobjetos lavados en una solución de ácido clorhídrico/etanol y luego gelatinizados.

Este paso fue fundamental para evitar que los cortes se desprendieran.
 Capitulo 5

Doble inmunomarcacián

Los cortes fueron hidratados por 20 min en una solución de PBS-Tn’tón X-lOO

0.1% (PBS-T), tratados luego en suero normal de caballo e incubados toda la noche a

4°C con el anticuerpo primario LRH 13 (ver Tabla 3). Este anticuerpo reconoce la

región alrededor de los residuos de serina y tirosina de las formas conocidas de Gan-l,

pero tiene baja afinidad por la forma cGnRH-Il en la cual la tirosina esta reemplazada

por la histidina (Park & Wakabayashi, 1986) (Tabla 2). Luego de un lavado en PBS, se

-aplicó el antisuero secundario biotinado anti-raton IgG (Sigma Chemicals Co.) por l

hora a temperatura ambiente. Luego de transcurrido este tiempo, los cortes se volvieron

a lavar en PBS, y se trataron con el complejo Avidina-estreptavidina (ABC) (Vector

Laboratories) y se revelaron con una solución 0.03% 3,3’ diaminobencidina (DAB) en

buffer PBS (pH: 7.6) y 0.02% de H202.Los cortes fueron lavados exhaustivamente en

PBS-T y luego se los incubó con el segundo antisuero primario (anti-chtH y anti-rdSL)

(Tabla 3), toda la noche a 4°C. Luego del lavado con PBS-T, se los incubó con el

segundo antisuero secundario anti-conejo IgG (Sigma Chemicals Co.) por l hora a

temperatura ambiente. Luego de lavar en PBS-T, los cortes fiJeron incubados con el

complejo ABC (Vector Laboratories) y la actividad peroxidasa visualizada con 3­

amino, 9-etil carbazol (AEC). Finalmente los cortes fiieron lavados en agua destilada y

montados en PBS-glicerina. El cromógeno DAB, usado para revelar el primer antisuero

primario da una coloración marrón, mientras que el cromógeno AEC utilizado para

revelar el segundo antisuero primario da una coloración rojiza, lo que permite

distinguirlos fácilmente.
 Capilqu 3

Controles

La especificidad de los antisueros fue validada por preadsorción con el antígeno

correspondiente cuando se disponía del mismo (mGnRH) o por sustitución del antisuero

primario con suero normal de caballo en PBS (GtH, SL).

Antisuero Dilución Generado en Generado contra Provisto por

LRH 13 [:2000 ratón mGnRH Dr.K.W.

Wakabayashj

anú-chd-l 111000 conejo croaker 01H Dr. P.Thomas

anti-rd SL 1:1000 conejo red drum SL Dr. P.Thomas

Tabla 3: Antisueros utilizados en los experimentos dc doble marcación.

b) Determinación de sitios de unión a GnRH en gonadotrogos 2 células productoras

de somatolactina.

Animales

Para cada uno de los experimentos (n15) diecisiete peces sexualmente maduros

provenientes de la Estación Hidrobiológica de Chascomús (Subsecretan‘a de Pesca y

Recursos Naturales, Ministerio de Asuntos Agrarios, Provincia de Buenos Aires) fiieron

transportados al Laboratorio en bolsas plásticas suplementadas con aire. Alli se los

decapitó y se les extrajo la hipófisis.

 (.‘upilulo 3

Cultivoprimario de células hipofisarias

Una vez removidas las hipófisis, estas fiJeron colocadas en cápsulas de Petri (35

mm) en medio de cultivo Leivovitz (L-IS, Sigma, St. Louis, MO), conteniendo 26 mM

de bicarbonato de sodio (Sigma, St. Louis, MO), 50 UI/ml de penicilina (Gibco BRL,

Gaithersburg, IVD) y 50 ug/ml de estreptomicina (Gibco, BRL). En este medio las

hipófisis fiJeron disociadas mecánicamente con tijeras estén'les. Las porciones de tejido

fueron luego transferidas a un tubo tipo Falcon (15 ml) con lO ml de PBS(K) potásico

- estéril (KH2P04/ Kzl-[PO4lO mM, ClNa 0.15 M, pH 7.4) y se dejaron decantar. Luego

el PBS(K) fiJe removido y reemplazado por 2 ml del mismo buffer fresco. La dispersión

enzimática fue realizada incubando el tejido por 20 min a 25 °C, adicionando 200 ul de

Tripsina porcina tipo II 1% v/v (Sigma Chemicals Co.) y 50 ul de una solución 20% p/v

de D-glucosa (Gibco, BRL). La reacción file terminada adicionando 8 ml de medio de

cultivo suplementado con 5% v/v de suero fetal bovino (Gibco, BRL). La suspención

celular se obtuvo por trituración con una pipeta Pasteur (Falcon, Becton-Dickinson,

Lincoln Park, NY) afinada a fuego. Una vez que se obtuvo una suspensión densa de

células, éstas se lavaron resuspendiendolas en 8 ml de medio de cultivo suplementado

con suero y se centrifugando a 1500 rpm por 8 min. El pellet obtenido sé resuspendió en

12 ml de medio de cultivo suplementado con suero. Se determinó la viabilidad celular

según el test de Trypan-Blue (1.5% p/v), contando las células en cámara de Newbauer.

La suspensión celular se sembró (l ml) en multiplacas de 24 placas (Costar,

Corning Costar, Cambridge, MA) en diferentes condiciones, a una densidad aproximada

de 4000 células vivas por placa. Para permitir la adhesión de las células al sustrato éstas

fueron incubadas por una hora a 25 °C en estufa con 95%02-5%C02. Al cabo de este

tiempo se reemplazó el medio por l ml de medio de cultivo fresco, y se incubaron

nuevamente. Cada 4 dias se reemplazó la mitad del medio de cultivo.

80
 (.‘apiIu/o 3

Se analizaron diferentes condiciones de siembra:

-Siembra sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro (Eric-Scientific)

pretratados con poli-L-lisina (PLL) (Sigma Chemicals Co.).

-Siembra sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro (Eric-Scientific)

pretratados con polietilenimina (PEI) (Sigma Chemicals Co.).

-Siembra sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro (Eric-Scientific)

sin ningún tipo de tratamiento.

-Siembra directamente sobre la placa.

-Siembra sobre la placa pretratrada con PLL.

-Siembra sobre la placa pretratada con PEI.

En las diferentes condiciones, la sobrevida analizada a las cinco horas, fue

buena. Sin embargo, cuando se analizaron al día siguiente, las células sembradas sin

cubreobjeto presentaron baja viabilidad, mientras que aquella sembradas sobre

cubreobjeto mostraron buena sobrevida. No se encontraron mayores diferencias en los

cultivos cuyos cubreobjetos fueron pretratados o no. Con estos resultados se decidió

cultivar las células directamente sobre el cubreobjeto sin pretratamiento.

Antes de realizar los ensayos de ligamiento e inmunocitoquímica, las células

fueron incubadas a 25 °C una noche a en condiciones de humedad saturante, 95%02­

5%C02. Se eligió esta temperatura de incubación dado que es era la adecuada para

cultivo de células hipofisarias de otros peces teleósteos (Bosma et aL, 1997; Chang et

(11.,l990b; Ribeiro et al., 1982).

Radioiodinación dela buserelina

Para determinar los sitios de unión a GnRI-I se utilizó un análogo superactivo de

GnRH (GnRH-A, buserelina, Hoescht, Argentina). Ensayos previos en homogenatos de

8|
 Capilulo 3

hipófisis de pejerrey (n: lO, 36 mg) mostraron la factibilidad de utilizar buserelina ( (Kd:

-0.2058 nM y Bm“:1.227 fmol/mg de tejido) como análogo. Esta fue cedida gentilmente

por la Dra. Damasia Becú) y su composición es (D-Ser[Tbu]6,ds—Gly-NH2)-GnRH­

etilamida.

Para marcar radioactivamente la buserelina, se siguió un protocolo similar al

descripto por Clayton er (11., (1979) y Chamson-Reig et aL, (1997); utilizando

Cloramina-T (Cl-T, Sigma Chemicals Co.) en concentraciones limitantes. Se comenzó

agregando 2 mCi de 12SIllevado a 5 ul con buffer fosfato 0.5 M a 2 ug de GnRI-I-A

-diluída en 5 ul de acido acético 0.1N. La reacción comenzó con el agregado de

Cloramina-T (0.2 ug en 10 ul de buffer fosfato 0.05 M, pH 7.5) y dejando reaccionar

por 5 min. Luego se realizó una segunda reacción a la misma concentración y por 2 min.

Las reacción fiie frenada por dilución agregando acetato de amonio 2 mM pH 4.5. El

producto de la reacción se sembró en una columna de Carboxi Metil Celulosa (Sigma

Chemicals Co., 6 x 0.6 cm). Luego de la elución con acetato de amonio 2mM, se

aumentó la fuerza iónica, eluyendo a partir de la sexta fracción con acetato de amonio

lOO mM, pH 4.5.

Las fracciones se recogieron en 150 ul de acetato de amonio 2 mM pH 4.5,

BSA, 5% p/v hasta un volumen final de 1.5 ml. De cada fracción se tomaron lO ul para

la determinación del perfil de marcación en contador gamma (Clinigamma 1272, LKB­

Wallac, Suiza).

Test de ligamiento para sitios (le unión a GnRH-A en hipófisis (le rata

Para determinar las fracciones de elución con mayor actividad especifica, se

realizó un test de unión utilizando homogenatos de hipófisis de rata adulta (30 días). De

cada fracción del pico radioiodinado correspondiente al análogo superactivo se

 (.'apímla 3

determinó la unión máxima y la inespecífica. Para ello se prepararon 5 tubos de

incubación (3 para la unión máxima y 2 para la inespecífica) por cada fi'acción del

eluído de la columna. En cada tubo se colocó aproximadamente 0.35 mg de tejido,

(aproximadamente 800 ug de proteinas totales) y 300 ul de buffer de incubación [Tn's­

HCL lO mM, BSA 0.1% p/v (Sigma Chemicals, Co.) ditiotreitol l mM (Sigma

Chemicals, Co)]. Los homogenatos fueron incubados durante 2 hs en baño de hielo

luego del agregado de ml-GnRH-A (60.000-80.000 cpm) en un volumen total de 500

ul. Los ensayos de unión inespecifica se realizaron con el agregado de 0.2 mM de

-GnRH-A radioinerte. La reacción se detuvo por centrifugación a 13.000 rpm en

microcentn’fuga durante 20 min a 4°C. El sobrenadante fue descartado y la

radioactívidad medida en un contador gamma.

Localización de los sitios de unión a GnRH

Los ensayos de unión se llevaron a cabo en cultivos de 7 días, los cuales fueron

lavados por 5 min en una solución salina balanceada, BSS (CaClz lmM, KCl 5.4 mM,

KHzPO4 0.4 mM, MgClz l mM, MgSO4 0.8 mM, NaCl 140 mM, Naz I-lPO4 1.3 mM,

D(+) galactosa 5 mM, piruvato de Na 5 mM, Hepes 5 mM, pH 7.4). La solución de BSS

fue removida y se volvió a agregar BSS fresca. Al cabo de 20 min la BSS file

descartada y reemplazada por 200 ul de BSS conteniendo ml-GnRH-A (80.000 cpm;

500-800 uCi/ug). Las muestras se incubaron 20 min a temperatura ambiente (22 i l°C).
Para la realización de los controles de unión inespecifica se agregó además un exceso de

GnRH-A radioinerte (lO uM).

Las células fueron luego lavadas cuatro veces con l ml de BSS y fijadas con 1.5

ml de paraformaldehido 2 %p/v y glutaraldehído 2%v/v en buffer fosfato, 0. l M, pH 7.4,

durante 20 min en baño de hielo. Una vez fijadas, estas fueron removidas del hielo y a
 Capitulo 3

temperatura ambiente fueron lavadas con las siguientes soluciones: 5 min con buffer

fosfato 0.1M pH 7.4 y luego, también por 5 min en l ml de PBS lO mM (0.15 CINa, pH

7.4). Finalmente, las células fiJeron incubadas con l ml de PBS-BSA 0.5% por 30 min,

y se lavaron tres veces por 5 min con l ml de PBS-Tritón (PBS-T), 0.25%v/v.

Inmunocitoquímica

Luego de la fijación y los lavados posteriores, las células fiJeron removidas del

- hielo e incubadas con los antisueros: anti-chtI-I (111000) y anti-chumSL (111000) (ver

Tabla l) por 40 min a temperatura ambiente. Posteriormente las células fiJeron lavadas

tres veces con PBS-T y se las incubó por 40 min con el antisuero secundario biotinilado,

IgG anti-conejo (Sigma Chemicals Co.). Luego de lavarlas con PBS-T se las incubó por

40 min con el complejo ABC (complejo avidina-biotina peroxidasa) (Vector

Laboratories, Burlingame, CA). Una vez transcurrido el tiempo de incubación se

volvieron a lavar con PBS-T y las células fiieron reveladas. Se utilizaron tres

cromógenos diferentes: DAB, AEC y isotiocianato de fluoresceína (FITC). El

cromógeno que dio una mejor inmunomarcación fiJe el AEC, por lo que fiJe el de

elección en todos los experimentos subsiguientes Para la visualización de las células se

utilizó un microscopio de luz invertida (Olympus). La especificidad de los antisueros se

determinó reemplazando el antisuero primario con suero normal de caballo.

Una vez realizada la inmunocitoquimica, los cubreobjetos se dejaron secar al

aire y en cuarto oscuro fueron embebidos con emulsión nuclear NTBZ (Kodak, Eastman

Kodak, Rochester, NY) a una concentración de lzl en agua destilada. y se expusieron

en cámaras oscuras por lO días a 4°C.

Al cabo de los lO días los cubreobjetos se revelaron con 2,4

diamipholdiclorhídrico (Aldrich) por 5 min, se lavaron en agua destilada por 5 min y se

 (.‘apilulo 5

fijaron con tiosulfato de sodio 20%v/v. Los autoradiogramas se montaron en PBS­

glicerina lzl sobre un portaobjeto y se observaron y fotografiaron con un microscopio

(Polyvar, Reichert) equipado con ópticas con contraste interdiferencial de Nomarski

(CIF).

III-IV Resultados

Doble inmunomarcación

Por medio de la técnica de inmunomarcación doble se pudieron distinguir en un

mismo corte las fibras GnRHérgicas que aparecen en marrón, reveladas con DAB, de

las células adenohipofisarias que aparecen teñidas con una coloración rojiza, reveladas
con AEC.

Las fibras de GnRH inmunomarcadas con LRH 13 se observaron atravesando el

tallo neurohipofisario y alcanzando las tres zonas de la ADH: PDK PDP y PI (Fig.

2 la). Estas fibras presentan un aspecto típico de “cuentas de rosario”.

El anti-chtH reveló un grupo de células que como se explicó en el capitulo I se

encuentran en la PDP y en el borde externo de la PI. Las fibras de GnRH que bajan por

el tallo y llegan a la PDP y a la PI se asocian a ellas (Fig. 21b). Es importante hacer

notar que el antisuero que se utilizó para identificar a las células gonadotróficas no

discrimina entre los dos tipos de gonadotrofinas (GtH I y GtH II).

La inmunomarcación con anti-rdSL mostró un grupo de células bordeando a la

NH en la PI. La doble inmunomarcación reveló una asociación morfológica entre las

fibras de GnRH y estas células (Fig. 2 lc y d).

 (Ïapilrtlo 3

Cultivoprimario (lecélulas hipofisarías

Por disociación mecánica y enzimática de las células hipofrsarias del pejerrey se

obtuvieron 4000 células viables por placa determinadas por el método de exclusión del

Trypan blue. Esta cifra representa aproximadamente 90% de células viables sobre el

total de las disociadas. A las dos semanas de cultivo la viabilidad se seguía manteniendo
alta.

Los pretratamientos de los cubreobjetos tanto con PLL como con PEI no

- mostraron diferencias ni en la adhesión ni en la sobrevida, por lo tanto los cubreobjetos

se utilizaron sin ningún tipo de pretratamiento. En cambio, cuando el cultivo se realizó

directamente sobre la placa, la sobrevida y la adhesión disminuyeron considerablemente

(Tabla 4).

cubre/PLL cubre/PEI cubre placa/PLL placa/PEI placa

5 hs + + + + + +

24 hs + + + +/- +/- +/­

48 hs + + + - - ­

Tabla 4: Resultado de las diferentes condiciones de siembra. (cubre/PLL: siembra sobre cubreobjeto

tratado con poli-L-lísína (PLL). cubre/PEI: siembra sobre cubreobjeto tratado con polietilenimina (PEI).

cubre: siembra sobre el cubreobjeto sin tratar. placa/PLL: siembra sobre la placa tratada con PLL.

placa/PEI: siembra sobre la placa tratada con PEI. placa: siembra directamente sobre la placa. +: alto

porcentaje de sobrevida. +/-: mcdio y -: bajo).

86
 ('apílulo 3

Caracterización inmunocitoquímica (le las células productoras (le GtH y SL en

cultivosprimarios de hipoflsis

En cultivos de un dia las células fueron observadas y medidas, utilizando una

escala milimetrada adosada al ocular del microscopio. Las células inmunoreactivas a

GtH (ir-GtH) midieron aproximadamente entre 9.71 i- 2.34 x 9.02 i 2.l2 um (n:l7;

rango 6.5-13 um) y presentaron una forma redondeada con el núcleo en posición central

o levemente excéntrico (Fig. 22a).

Las células ir-SL presentaron forma elongada, con núcleo excéntrico y

abundante citoplasma (Fig. 22b). El tamaño varió entre 8.4 i 0.89 x 8.8 i 1.78 um (n25;

rango 8-12 um).

En cultivos de siete días las células presentaron las mismas características que en

el dia l. El porcentaje de las diferentes células permanece similar. Sin embargo en los

cultivos de siete días se observaron algunas células gliales, probablemente astrocitos

(Fig.22c).

Localización (le los sitios (leunión a GnRH en las células ir-GtH e ir-SL

Los primeros ensayos de unión se realizaron tanto en cultivos de un día como en

cultivos de siete días y no se observaron diferencias cualitativas, por lo que los

siguientes ensayos se realizaron a los siete dias.

Las imágenes autoradiográficas mostraron, como era de esperar gránulos de

plata asociados a los gonadotropos (Fig. 23 a y b). Cuando se incubó con un exceso de

GnRH-A radioinerte (lOO nM) no se observaron gránulos de plata asociados en ningún

casos (Fig. 23c).

Las células ir-SL también mostraron numerosos gránulos de plata asociados

 Capítulo 3

cuando se las incubó con ml-GnRH-A (Fig. 24 a, b y c). La no aparición de los

gránulos luego de la coincubación con buserelina radioinerte reveló la especificidad de

la unión.
 Capítulo 3

Fig. 21: Cortes parasagitales de hipófisis de pejerrey adulto. a) Fibras GnRHérgicas

alcanzando las tres área de la ADH. La PDR se encuentra a la izquierda (x64), b) Células
ir-GtH en contacto con fibras de GnRH (flechas) en la PDP (x600), c) Asociación entre las
células ir-SL y las fibras de GnRH en la PI (flechas) (x600), d) Detalle de las fibras
poniendose en contacto con las células productoras de SL (x960).

89
 Capítulo 3

n
Á

w“;
l“y

‘55!

Fig. 22: a) Célula ir-GtH en cultivo (x1125), b) Cultivo de células hipofisarias donde se
inmunomarcaron a las células productoras de SL. La flecha indica a una de las cuatro
células marcadas (x32), c) cultivo de siete dias en donde se observa gran cantidad de células
gliales (flechas) (x50).

90
 Capítulo 3

Fig. 23: a) Localización autoradiográfica de 12ISGnRH-Asobre las membranas de células

inmunomarcadas con antí-chtH (flechas). Las cabezas de flecha indican células no
inmunomarcadas pero con sitios de unión a l ZÍ GnRH-A (x500), b) Detalle de célula ir­
GtH con gránulos de plata asociados (x1125), d) Un exceso de GnRH-A radioinerte
suprime la unión del l 2Í GnRH-A en todos los tipos celulares (x500).

91
 Capítulo 3

Fig. 24: Localización autoradiográfica de l 2ISGnRHen las membranas de las células ir-SL
reconocidas con anti-chum salmon SL (flechas), también se observan células no
inmunomarcadas con gránulos de plata asociados (cabeza de flecha)(x500), b) Detalle de
célula ir-SL con gránulos de plata asociados (se observan en negro) (x 600K)y en c) Detalle
de célula productora de SL con gránulos de plata asociados, observadas con microscopio
interdiferencial de Nomarski (xl 125).

92
 ( 'apilulo 3

III-V Discusión

En tetrápodos, el control de la síntesis y secreción de las hormonas hipofisarias

es regulada principalmente por la liberación de sustancias neuroactivas al sistema portal

hipofisario. En peces teleósteos, sin embargo, al no existir un sistema portal, la

inervación de las células secretoras se realiza en forma directa mediante fibras que

llegan hasta sus células blanco a través del tallo hipofisario. Muchas de estas fibras se

on'ginan a nivel hipotalámico y penetran en la ADI-I vía las extensas interdigitaciones

- del tejido neural (Batten et al., 1999). Distintos neuropéptidos principalmente de on'gen

hipotalámico han sido identificados en las fibras que inervan la ADH de peces. Uno de

los más conocidos es GnRH. Este neuropéptido inerva principalmente a los

gonadotropos (Batten et al., 1999).

Los estudios inmunocitoquímicos en pejerrey, han puesto de manifiesto que las

fibras GnRHérgicas alcanzan una amplia distribución en las tres zonas de la ADH:

PDR, PDP y PI.

La presencia de fibras en la PI, donde las células productoras de SL están tan

estrechamente vinculadas a la NH, de alguna manera está indicando que existin'a algún

tipo de asociación. Los experimentos de doble inmunomarcación claramente muestran

una asociación morfológica entre las fibras de GnRH y las células productoras de SL

similar a la que ocurre entre las fibras GnRHérgicas y los gonadotropos.

Si bien se ha puesto de manifiesto una estrecha asociación entre GnRH y células

ir-SL, podría suceder que esa célula en contacto con la terminal nerviosa no tuviese los

receptores especificos y estos se encontraran localizados en células cercanas que

respondieran a ese estímulo. Por lo tanto era importante investigar la presencia de

receptores a GnRH (sitios de ligamiento) en las células productoras de SL. Los sitios de

unión específicos para GnRH se localizaron no solamente en las células GtI-l sino
 Capítulo 3

también en las células productoras de SL.

Luego de la incubación de un cultivo pn'mario de hipófisis de pejerrey con 125l

GnRH-A, una cantidad significativa de gránulos de plata se asoció especificamente

tanto con los gonadotropos como con las células ir-SL.

En la literatura existen evidencias farmacológicas y morfológicas que involucran

a GnRH en la liberación de SL. Los experimentos realizados por Kakizawa et al. (1997)

donde demuestra que GnRH revierte los efectos inhibitorios de dopamina, sumados a

las observaciones realizadas por Parhar & Iwata (1994) en 0. mykiss apoyan nuestros
- resultados.

Por otro lado, los resultados presentados por Stefano (1999) también en pejerrey

demostrando que existe una asociación entre las fibras de GnRH y las células

productoras de PRL y GH contribuyen a explicar la presencia de fibras de GnRH en la

PDR donde, como mencionáramos en el primer capítulo, sólo se han detectado células

productoras de PRL y ACTH. También en las células GH y PRL se han detectado sitios

de unión para GnRH (Stefano, 1999). Estos resultados concuerdan con experimentos

fisiológicos realizados en otras especies, donde se observa una liberación tanto de PRL

como de GH estimulada por GnRH (Weber et aL, 1997; Marchant et aL, 1989, Trudeau

er al., 1992).

Como se ha comentado en la introducción, existen tres variantes de GnRH en

pejerrey. Si bien no se sabe fehacientemente cual es la variante que expresan las fibras

que contactan con las células ir-SL debido a la falta de especificidad de los antisueros

utilizados, los resultados presentados por Stefano el al. en 1997 sugerirían que ésta sería

pGnRH puesto que es la única variante identificada mediante HPLC y RIA, en la

hipófisis de pejerrey. Esta variante se sintetizaría a nivel del área preóptica en el núcleo

preóptico periventricular desde donde nacen las fibras que inervan a la hipófisis

(Stefano, 1999). Asimismo, estos resultados sugen'rían que esta nueva variante de

94
 Capitulo 3

GnRH, también inervaría los diferentes tipos celulares en la hipófisis de pejerrey y que

éstas células con sitios de unión a GnRH responden simultáneamente a esta variante de
GnRI-l durante el ciclo sexual. La falta de conexión directa de las restantes variantes de

GnRI-I(anRH y cGnRH II) con la hipófisis no descarta totalmente la posible acción de

éstas sobre los distintos tipos celulares hipofisarios, puesto que la neurohormona podría

alcanzar la hipófisis por vía sanguínea. Esta hipótesis es reforzada por el hecho que en

Clarins gariepinus, donde a pesar de no haberse encontrado una inervación directa de

neuronas ir-cGnRH II en la hipófisis, cGnRH II es 150 veces más potente que chnRI-I

- en su capacidad de inducir la liberación de GtH [I aunque el contenido hipofisario de cf

GnRH es 700 veces superior a cGnRI-l II (Schulz et aL, 1995).

 Conclusiones

{CONCLUSIONES FINALES]

Los resultados obtenidos a lo largo del presente trabajo de Tesis nos permiten

concluir lo siguiente:

b En la hipófisis del pejerrey, Odontesthes bonariensis, los diferentes tipos

celulares se distribuyen de la siguiente manera: Las células productoras de PRL se

encuentran en el borde externo de la PDR, mientras que los corticotropos se ubican

_en la misma área pero internamente, bordeando a la NH. El antisuero (anti-hACTI-I)

utilizado para poner en evidencia los corticotropos mostró reacción cruzada con

células de la PI, indicando presuntamente la presencia de células productoras de

MSH. Las células productoras de GH se localizan en la PDP bordeando a la NH. En

esta misma zona también se encuentran las células productoras de TSI-I y los

gonadotropos. Estos últimos también se ubican en el borde externo de la PI. Las

células productoras de SL se encuentran en la PI bordeando la NH.

b En la hipófisis del pejerrey existirían células que expresan GtH I, células

que expresan GtI-I II, y células que expresan ambas gonadotrofinas.

b La somatolactina en el pejerrey se puso en evidencia utilizando cuatro

antisueros diferentes. Todos los antisueros revelaron por Western blot una banda

principal de aproximadamente 33 kD. Por otra parte mediante la técnica de PAS se

pudo determinar que las células ir-SL son PAS positivas. Estos resultados indicarían

que SL en la hipófisis del pejerrey está glicosilada.

96
 Conclusiones

b El área de las celulas ir-SL muestra grandes diferencias entre las hembras

activas sexualmente o vitelogénicas y las hembras inactivas o no vitelogénicas. Una

correlación positiva se observa entre el área de las células productoras de SL y el

GSI%. En machos, a pesar de observarse una tendencia a aumentar el área de las

células ir-SL con el GSI%, esta correlación no fue estadísticamente significativa.

Estas observaciones concuerdan con resultados obtenidos en otras especies por otros

autores y de alguna manera estarían involucrando a la SL en algunos aspectos de la

reproducción.

b Se observa una clara asociación morfológica entre las células productoras

de SL y las fibras GnRHérgicas. Los experimentos de localización de sitios de unión

para GnRH mostraron que las células productoras de SL tienen receptores para este

neuropéptido y que éste por lo tanto puede ser uno de los responsables de regular su

síntesis y/o liberación.

Si analizamos cada uno de estos resultados podemos ver que la SL se

encuentra altamente conservada, como ya se citó, ya que cualquiera de los antisueros

utilizados, que fueron desarrollados en representantes de órdenes tan heterogéneos

como Perciformes, Salmoniformes y Cypriniformes, reconocen a la SL de pejerrey.

Las células productoras de SL varían con el ciclo sexual, esto se ve claramente en

hembras. La asociación entre las células ir-SL y las fibras de GnRH, y la presencia

de sitios de unión a GnRH en estas células sugerirían una relación entre la SL y la

reproducción. Debemos, sin embargo aclarar que también se han observado sitios de

unión a GnRH en lactotropos, somatotropos (Stefano et aL, 1999) y gonadotropos.

Esto estaría indicando o bien que GnRH tendría un amplio rol regulando la actividad

de muchas células hipofisarias o que GnRH actuan’a como un controlador general de

97
 ( bue/"siones

aquellas hormonas relacionadas con la reproducción. Si bien es claro el papel de las

gonadotrofinas y la hormona de crecimiento en los procesos reproductivos, no es tan

claro el rol de la prolactina.

A partir de estas conclusiones se abren nuevos e interesantes interrogantes.

Por un lado determinar in vitro e in vivo el efecto directo de GnRH sobre la síntesis

y/o liberación de SL. Por otra parte diseñar experimentos que permitan determinar el

efecto que SL ejerce sobre las gónadas. Finalmente queda un gran interrogante por

dilucidar y es la presencia o no de SL en otros vertebrados.

 Bibliogrq/¡a

BIBLIOGRAFIA

Amemiya, Y., Sogabe, Y., Nozaki, M., Takahashi, A., & Kawauchi, H. (1999).

Somatolactin in the white sturgeon and African lungfish and its evolutionary

significance. Gen Com Endocrinol l 14(2), 181-190.

Anderson, E, Bogerd, J., Borg, B., Sharp, P.J., Sherwood, NM. & Goos, H. (1995).

Characterization and localization of gonadotropin-releasing hormone in the brain

and pituitary of the three-spined stickleback, Gasterouteus aculeatus. Cell Tissue

Res 279z489-493.

Anglade, I., Zandbergen, T. and Kah, O. (1993). Origin of the pituitary innervation in

the goldfish. Cell Tissue Res 273: 345-355.

Astola, A., Pendón, C., Ortiz, M. & Valdivia, M. (1996). Cloning and expression of

somatolactin, a pituitary hormone related to growth hormone and prolactin from

gilthead, Spams aurata. Gen Comp Endocrinol 104, 330-336.

Ayson, F.G., de Jesus, E.G., Amemiya, Y., Moriyama, S., Hirano, T. & Kawauchi, H.

(1999). Isolation and cDNA cloning of somatolactin in rabbitfish (Siganus

guttatus). Gen Comp Endocrinol 115(2), 292-300.

Ball, J.N. & Baker, B.I. (1969). The pituitary gland: Anatomy and histophysiology. En

“Fish Physiology”, Vol. 2, The Endocrine System”. Editado por W. Hoar and D.

Randall, Academic Press, New York. pp. l-l lO.

99
 Bibliografia

Ball, J.N. & Batten, T.F.C. (1981). Pituitary and melanophore responses to background

in Poecillia Iatipinna (Teleostei): Role of the pars intermedia PAS cells. Gen

Comp Endocrinol 44, 233-248.

Ball, J.N., Uchiyama, M., & Pang, P.K.T. (1982). Pituitary responses to calcium

deprivatíon in a euryhaline teleost, Fundulus heteroclitus, adapted to artificial

seawater. Gen Comp Endocrinol 46, 480-485.

Batten, T.F.C. & Schreibman, M.P. (1986). Immunocytochemical demonstration of

pituitary cell types in the teleost Poecilia latipinna, by light and electron

microscopy. Gen Comp Endocrinol 63, 139-154.

Batten, T.F.C., Moons, L. & Vandesande, F. (1999). Inervation and control of the

adenohypophysís by hypotalamic peptidergic neurons in teleosts fishes: EM

immunohistochemical evidence. Microsc Res Techniq 44, 19-35.

Blaise, 0., LeBail, P.Y. & Weil, C. (1995). Lack of gonadotropin-releasing hormone

action on in vivo and in vitro growth hormone release, in rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss). Camp Biochem Physiol C l lO,133- 141.

Bonetto, A.A. & Castello, H.P. (1985). Pesca y piscicultura en aguas continentales de

América Latina. Secretaria general de los Estados Americanos (OEA),

Washington D.C., pp. 118.

Boschi, E.E. & Fuster de Plaza, M.L. (1959). Estudio biológico pesquero del pejerrey

del embalse del Río Tercero (Basilichthys bonariensis). Departamento de

Investigaciones Pesqueras, Secretaria de Agricultura y Ganaderia. Buenos Aires,

Pub. Nro 8. pp. 61.

lOO
 Bibliografia

Bosma, P.T., Kolk, S.M., Rebers, F.E.M., Lescroart, 0., Roelants, 1., Willems,

P.H.G.M. & Shulz, R.W. (1997). Gonadotrophs but not somatotrophs carry

gonadotropin-releasing hormone receptors: Receptors localization, intracellular

calcium, and gonadotrophin and GH release. J Endocrinol 152, 437-446.

Burgus, R., Butcher, M., Amoss, M., Ling, N., Monahan, M., Rivier, J., Fellows, R.,

Blackwell, R., Vale, W. & Guillemin, R. (1972). Pn'mary structure of ovine

hypothalamic luteinizing hormone-releasing factor (LRF). P Nat! Acaa’ Sci USA

69, 278-282.

Calvo, J. & Morn'coni, E. (1974). Citología adenohipofisaria del pejerrey (Basilichtys

bonariensis). Ser. Inf. C.I.C. (Prov. de Buenos Aires, Argentina), ll, 1-10.

Cambre, M. L , Verdonck, W., Ollevier, F., Vandesande, F., Batten, T. F. C., & Kuhn,

E. R. (1986). Immunocytochemical identification and localization of the

different cell types in the pituitary of the seabass (Dicentrarchus labrar). Gen

Comp Endocrinol 61, 368-375.

Carolsfeld, J., Powell, J.F.F, Park, M., Fischer, W.H., Craig, A.G., Chang, J.P., Rivier,

J.E., and Sherwood, N.M. (2000). A novel form of gonadotropin-releasing

hormone (GnRH) in herring sheds ligth on evolutionary pressures. En prensa.

Cavari, B., Noso, T., & Kawauchi, H. (1995). Somatolactin, a novel pituitary protein:

lsolation and characterization from Spaurus aurata. Mol Mar Biol Biotechno/ 4,
117-122.

lOl
 Bibliografia

Chamson-Reig, A., Lux-Lantos, V.A.R., Tesone, M. & Libertun, C. (¡997). GnRH

receptors and GnRH endocrine effects on luteoma cells. Endocrine 6, 165-171.

Chang, J.P., Yu, K.L., Wong, A.O.L. & Peter, R.E. (l990a). Differential actions of

dopamine receptors subtypes on gonadotropin and growth hormone release in

vitro in golfish. Neuroendocrinolog/ 51: 661-674.

Chang, J.P., Cook, H., Freedman, G., Wiggs, A.J., Somoza, G.M., Leeuw, R. & Peter,

R.E. (l990b). Use of pituitary cell dispersion method and primary culture system

for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the golfish,

Carassius auratus. Gen Comp Endocrinol 77, 256-273.

Cheng, K.W., Chan, Y.I-l., Chen, Y.D., Yu, K.L., and Chan, KM. (1997). Sequence ofa

cDNA clone encoding a novel somatolactin in goldfish, Carassius auratus.

Biochem Bioph Res C 232, 282-287.

Clayton, R.N., Harwood, J.P. & Catt, J.K. (1979). Gonadotropin-releasing hormone

analogs binds to luteal cells and inhibits progesterone production. Nature

28290-92.

Chiba, A., Sohn, Y.C., and Honma, Y. (1996). Distribution of neuropeptide Y and

gonadotropin-releasing hormone immunoreactivitíes in the brain and hypophysis

of the ayu, Plecoglossus altivelis (teleostei). Arch Histol Cytol 59, 137-148.

Cook, H., Berkenbosch, J.W., Femhout, M.J., Yu, K.L., Peter, R.E., Chang, J.P. &

Rivier, J.E. (1991). Demonstration of gonadotropin-releasing hormone receptors

on gonadotrophs and somatotrophs of the goldfish: an electron microscope

study. Reg-ul Peptides 36, 369-378.

 Bibliografia

Copeland, P.A. & Thomas, P. (1993). Isolation of gonadotropins subunits and evidence

for two distinct gonadotropins in Atantic croaker (Micropogonias Imdulatus).

Gen Comp Endocrinol 9 l, l 15-125.

Del Valle, A. (1991). Cría de pejerrey en Japón. Informe técnico. JICA (Agencia de

cooperación internacional de Japón).

Dores, R.M., Hoffman, N.E., Chilcutt-Ruth, T, Lancha, A., Brown, C., Marra, L., &

Youson, J. (1996). A comparative analysis of somatolactin-related

immunoreactivity in the pituitaries of four neopterygian fishes and one

chondrostean fish: an immunohistochemical study. Gen Comp Endocrinol 102,1,

79-87.

Ekengren, B., Peute, J., & Fridberg, G. (1978). Gonadotropic cells in the Atlantic

salmon, Salmo salar: An experimental, immunocytological, and electron

microscopical study. Cell Tissue Res. 191, 187-203.

Elizur, A., Zmora, N., Rosenfeld, H. Meiri, l., Hassin, S., Gordin, H., & Zohar, Y.

(1996). Gonadotropins B-GtH I and B-GtH II from the gilthead seabream, Spams

aurata. Gen Comp Endocrinol 102, 39-46.

Follénius, E., & Dubois, MP. (1980). localization of anti-ACTH, anti-MSH, and anti­

aendorphin reactive sites in the fish pituitary. En “Synthesis and Release of

Adenohypophyseal Hormones”. Editado por M. Jutisz & KW. McKerns, pp.

197-208. Plenum, New York.
 Bibliografia

Fradinger, E.A., von Schalburg, K., & Sherwood, NM. (2000). An evolutionary

perspective on GnRH in fish. Proceedings of the 6lhInternational Symposium on

Reproductive Physiology of Fish. Editado por B. Norberg, O.S. Kjesbu, GL.

Taranger, E. Andersson & S.O. Stefansson. pp 35-38.

Fridberg, G., Lindahl, K. and Ekengren, B. (1981). The thyrotropic cell in the Atlantic

salmon, Salmo salar. Acta ZooI-Slockholm 62, 43-51.

García-Hernández, M.P., García-Ayala, A., Elbal, M.T., & Agulleiro, B. (l996). The

adenohypophysís of mediterranean yellowtail Serio/a dumerilii (Risso, 1810): an

immunocytochemical study. Tissue Cell 28 (5) 577-585.

García-Hernández, M.P, Koide, Y., Diaz, M.V., & Kawauchi, H. (1997). Isolation of

two distinct gonadotropins from the pituitary gland of mediterranean yellowtail,

Serio/a dumerilii Risso, 1810. Gen Comp Endocrinol 106, 389-399.

Hassin, S., Elizur, A., & Zohar, Y. (1995). Molecular cloning and sequence analysis of

stn'ped bass (Morone saxatilis) gonadotropin I and II subunits. J Mol Endocrinol

15, 23-35.

Heiser, N. (1993). Acid-base regulation in response to changes of the enveiromental:

Characten'stics and capacity. En “Fish Ecophysiology”. Editado por J.C. Rankin

and F.B. Jensen, Chapman & Hall, London, pp. 207-230..

Holloway, A.C.& Leatherland, J.F. (1997). The effects of N-Methyl-D,L-aspartate and

gonadotropin-releasing hormone on in vitro growth hormone release in steroid­

primed immature rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen Comp Endocrinol

107, 32-43.

l04
 Bibliogrq/ïa

Iraqi, F., Gong, Z., Hew, C.L., & Crim, L. (1993). Isolation and characterization of

somatolactin genes from two cold water marine teleost, lumpfish (Cycloptenls

lumpus) and halibut (Hippoglossus hippoglossus). Mol Mar Biol Biotechnol 2,

96-103.

Jackson, K., Goldberg, D., Ofir, M., Abraham, M., & Degani, G. (2000). Cloning,

sequencing of B th-I-I, B GtH-II and growth hormone cDNA of the blue

gourami (Trichogaster trichopterus) and their expression during the different

-stages of oogenesis. Proceedings of the 6th International Symposium on

Reproductive Physiology of Fish. Editado por B. Norberg, O.S. Kjesbu, G.L.

Taranger, E. Andersson & S.O. Stefansson pp. 489

Johnson, L.L., Norberg, B. Willis, M.L. Zebroski, H. & Swanson, P. (1997). Isolation,

characterization, and radioimmunoassay of atlantic halibut somatolactin and

plasma levels during stress and reproduction in flatfish. Gen Comp Endocrinol
105, 194-209.

Kah, O.P., Brenton, J.G., Dulka, J., Nuñez-Rodriguez, J., Peter, R.E., Corn'gan, J.E.,

Rivier, J.E. & Vale, W.W. (1986). A reinvestigation of the GnRI-I

(Gonadotropin-Releasing Honnone) systems in the goldfish brain using

antibodies to salmon GnRH. Cell Tissue Res 244z327-337.

Kakizawa, S. Kaneko, T., Hasegawa, S., and Hirano, T. (1993). Activation of

somatolactin cells in the pituitary of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by

low environmental calcium. Gen Camp Endocrinol 91, 298-306.

l05
 Bibliografia

Kakizawa, S. Kaneko, T., Hasegawa, S., and Hirano, T. (l995a). Effects of feeding,

fasting, background adaptation, acute stress, and exhaustive exercise on the

plasma somatolactin concentrations in rainbow trout. Gen Comp Endocrinol 98,

137-146.

Kakizawa, S., Kaneko, T., Ogasawara, T. & Hirano, T. (l995b). Ghanges in plasma

somatolactin levels during spawning migration of chum salmon (Oncorhynchus

keta). Fish Physiol Biochem 14, 93-101.

Kakizawa, S., Kaneko, T., and Hirano, T. (1996). Elevation of plasma somatolactin

concentrations during acidosis in rainbow trout. J Exp Biol 199, 1043-1051.

Kakizawa, S., Kaneko, T. & Hirano, T. (1997). Effects of hypothalamic factors on

somatolactin secretion from the organ-cultured pituitary of raibow trout. Gen

Comp Endocrinol 105, 71-78.

Kaneko, T., Kakizawa, S., Yada, T., & Hirano, T. (l993a). Gene expression and

intracellular localization of somatolactin in the pituitary of rainbow trout. Cell

Tissue Res 272, 11-16.

Kaneko, T., Kakizawa, S., and Yada, T (l993b). Pituitary of “cobalt” variant of the

rainbow trout removed from the hypothalamus lacks most of the pars intermedia

and neurohypophysial tissue. Gen Comp Endocrinol 92, 31-40.

Kaneko, T. (1996). Cell biology of somatolactin. Int Rev CytoI 169, 1-24.

Kardong, K.V. (1995). Vertebrates comparative: Anatomy, function and evolution.

Editado por Brown publishers, 777 pp.

¡06
 Bibliogrqfia

Koide, Y., Noso, T., Schouten, G., Peute, J., Zandbergen, M.A., Bogerd, J., Schulz,

R.W., Kawauchi, H., & Goos, J.J.Th. (1992) Maturational gonadotropin from

the Atlantic catfish, Clarias gariepinus: Pun'fication, characterization

localization, and biological activity. Gen Comp Endocrinol 87, 327-341.

Koide, Y., Ioth, H., & Kawauchi, H. (1993). lsolation and characten'zation of two

distinct gonadotropins, GtI-I I and GtI-I II , from the binito (Katsuwonus

ple/amis) pituitary glands. Int J Pept Pro! Res 41, 52-65.

_Le Gac, F., Blaise, 0., Fostier, A., Le Bai], P.Y., Loir, M., Mourot, B. & Weil C.

(1993). Growth hormone (GH) and reproduction: a review. Fish Physiol

Biochem l l, 219-232.

Le Provost, F., Leroux, C., Martin, P., Gaye, P., & Djiane, J. (1994). Prolactin gene

expression in ovine and caprine mammary gland. Neuroendocrinology 60, 305­

313.

Lin, Y.W.P., Rupnow, B.A., Pn'ce, D.A., Greenberg, R.M., & Wallace, R.A. (1992).

Fundulus heteroclitus gonadotropins. Cloning and sequencing of gonadotropic

hormone (GtH) I and II B-subunits using the polymerase chain reaction. M01 Cell
Endocrinol 85, 127-139.

Lin, X.W., Lin, H.R., & Peter, R.E. (1993). Growth hormone and gonadotropin

secretíon in the common carp (Cyprinus carpio L): in vitro interactions of

gonadotropin-releasing hormone, somatostatin and dopamine agonist

apomorphine. Gen Comp Endocrinol 89, 62-71.

lO7
 Bibliogrqfia

Lo, T.B., Huang, F.L., Lin, C.S., Chang, Y.S., & Huang, C.J. (1991). Bull Inst Zoo!

Acad Sin Monog 16, 19-38.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., FarT,A.L & Randall, R.J. (1951). Protein measurement

with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-275.

Lu, M., Swanson, P. & Renfro, L. (1995). Effect of somatolactin and related hormones

on phosphate transport by flounder renal tubule primary cultures. Am J Physiol

268 37, R 577- R 582.

Lytras, A., Quan, N., Vrontakis, M.E., Shaw, J.E., Cattini, P.A., & Friesen, H.G. (1993).

Growth hormone expression in human Burkitt lymphoma serum-free Ramos cell

line. Endocrinology 132, 620-628.

Marchant, T.A. & Peter, R.E_ (1986). Seasonal variation in body growth rates and

circulating levels of growth hormone in the goldfish, Carassius aztratus. J Exp

Zoo! 237: 231-239.

Marchant, T.A., Chang, J.P., Nahomiak, C.S. & Peter, R.E. (1989). Evidence that

gonadotropin-releasing hormone also functions as a growth hormone releasing

factor in the goldfish. Endocrinology 124, 2509-2518.

Margolis-Kazan, H. & Schreibman, M.P. (1981). Cross-reactivity between human and

fish pituitary hormones as demonstrated by immunocytochemistry. Cell Tissue

Res 221: 257-267.

108
 Bibliogrqfia

Matsuo, I-l., Baba, Y., Nair, R.M.G., Arimura, A. & Schally, A.V. (1971). Stmcture of

the porcine LH- and FSH- releasing hormone. I The proposed amino acid

sequence. Biochem Biophy Res Co 43, 1334-1339.

Mayer, I. Rand-Weaver, M. & Borg, B. (1998). Effects of gonadectomy and steroids on

plasma pituitary levels of somatolactin in Atlantic salmon, Salmo salar. Gen

Comp Endocrinol 109, 223-231.

Melamed, P., Eliahu, N., Levari-Sivan, B., Oñr, M., Farchi-Pisanti, 0., Renteier­

Delrube, F., Smal, J., Yaron, Z. & Naor, Z. (1995). Hypotalamic and thyroidal

regulation of growth hormone in tilapia. Gen Comp Endocrinol 64:396-400.

Melamed, P., Gur, G., Elizur, A., Rosenfeld, H., Sivan, B., Rentier-Delrue, F. & Yaron,

Z. (1996). Differential effects of gonadotropin-releasing hormone, dopamine and

somatostatin and their second messengers on the mRNA levels of gonadotropin

IIB subunits and growth hormone in the teleost fish, tilapia. Neuroendocrinology

64, 320-328.

Montero, M., Vidal, B., King, J.A., Tramu, F., Vandesande, S., Dufour, S. & Kah, O.

(1994). Immunocytochemical localization of mammalian GnRI-I (gonadotropin­

releasing hormone) and chicken GnRI-I-II in the brain of the European silver eel

(Anguilla anguilla). J Comp Endocrinol 64, 396-400.

Moons, L., Cambre, M., Ollevier, F. & Vandesande, F. (1989). Immunocytochemical

demonstration of close relationships between neuropeptidergic nerve fibers and

hormone-producing cell types in the adenohypophysis of the Sea bass

(Dicenlrarchus labrax). Gen Comp Endocrinol 73, 270-283.

109
 Bibliogrq/¡a

Mousa, M. & Mousa, S.A. (l999a). lmmunocytochemical study on the localization and

distribution of the somatolactin cells in the pituitary gland and the brain of

Oreochromis niloticus (Teleostei, Cichlidae). Gen Comp Endocrinol ll3, l97­

21].

Mousa, M. & Mousa, S.A. (l999b). Immunocytochemical and histological studies on

the hypophyseal-gonadal system in the freshwater Nile tilapia, Oreochromis

niloticus (L.), during sexual maturation and spawning in different habitats. J Exp
Zoo]. 284, 343-354.

Munro, AD. (1985). The structure of the adenohypophysis of Aequia'ens pulcher

(Teleostei, Cichilidae). I. Histological and immunohistochemical studies. Gen

Comp Endocrinol 60, 215-226.

Nelson, J. (1994). Fishes of the world. 3rdEd. Editado por J. Wiley & Sons, Inc.. New

York. pp. 600.

Nozaki, M.A., Naito, N., Swanson, P., Mijata, K, Nakai, Y., Oota, Y., Suzuki, K., &

Kawauchi, H. (¡990). Salmonid pituitary gonadotrophs I. Distinct cellular

distribution of two gonadotropins, GtH I and GtH II. Gen Comp Endocrinol 77,
358-367.

Nozaki, M.A., Gorbman, A, & Sower, S.A. (1994). DifiJsion between the

neurohypophysis and the adenohypophysis in lampreys, Petromyzon marinus.

Gen Comp Endocrinol 96, 385-39 l .

llO
 Bibliografia

Oguri, M. (1983). Dermal melanophore and renal melanin-containing cells in the

“cobalt” variant of rainbow trout. Bull Jpn Soc Sci Fish 49, 1679-1681.

Okada, T., Kawazoe, I., Kimura, S., Sasamoto, Y., Aida, K., & Kawauchi, H. (1994).

Purification and characterization of gonadotropin I and II from pituitary glands

of tuna (Tumms obesus). Int J Pepi Prot Res 42, 69-80.

Olivereau, M. (1969). Activité de la pars intermedia de l'hypophyse autotransplantée

chez l’Anguille. Z. Zellforsch. Mikros. Anar 98, 74-87.

Olivereau, M. (1976). Les cellules gonadotropes hypophysaires du Saumon de

l’Atlantique: Unicite our dualite?. Gen Comp Endocrinol 28, 82-95.

Olivereau, M., Aimar, C., and Olivereau, JM. (1980). PAS-positive cells of the pars

intermedia are calcium sensitive in the golfish maintained in a hyposmotic

milieu. Cell Tissue Res 212, 29-38.

Olivereau, M., Olivereau, JM, and Aimar, C. (l98la). Specific effect of calcium ions

on the calcium-sensitive cells of the pars intermedia in the goldfish. Cell Tissue
Res 214, 23-31.

Olivereau, M., Chambolle, P. & Dubourg, P. (l981b). Ultrastructural changes in the

calcium sensitive (PAS-positive) cells of the pars intermedia of eels kept in

deionized water and in normal and concentrated sea water. Cell Tissue Res 219,
9-26.

lll
 Bibliografia

Olivereau, M. & Olivereau, J.M. (l982a). Calcium sensitive cells of the pars intermedia

and osmotic balance in the eel. I. Responses to changes in the environmental

cacium and magnesium. Cell Tissue Res 222, 231-241.

Olivereau, M. & Olivereau, J.M. (l982b). Calcium sensitive cells of the pars intermedia

and osmotic balance in the eel. II. Responses to calcium-free sea water. Cell

Tissue Res 225, 487-496.

Olivereau, M. & Nagahama, Y. (1983). Immunocytochemistry of gonadotropic cells in

the pituitary of some teleost species. Gen Comp Endocrinol 50, 252-260.

Olivereau, M. & Rand-Weaver, J.M. (l994a). Immunocytochemical study of the

somatolactin cells in the pituitary of Pacific salmon, Oncorhynchus nerka, and

0. keta at some stage of the reproductive cycle. Gen Comp Emdocrinol 93, 28­
35.

Olivereau, M. & Rand-Weaver, J.M. (l994b). Immunoreactive somatolactin cells in the

pituitary of young, migrating, spawning and spent chinook salmon,

Oncorhynchus tshawytscha. Fish Physiol Biochem 13, 141-151.

O’Neal, K.D., Montgomery, D.W., Truong, T.M., & Yu-Lee, L.Y. (1992). Prolactin

gene expression in human thymocytes. M01Cell Endocrinol 87, Rl9-23.

Ono, M. & Takayama, Y. (1992). Structures of cDNAs encoding chum salmon

pituitary-specific transcription factor, Pit-l/GHF-l. Gene 226, 275-279.

 Bibliografia

Ono. M, Takayama, Y., Rand-Weaver, M., Sakata, S., Yasunaga, T., Nono, T., &

Kawauchi, H. (1990). cDNA cloning of somatolactin, a new pituitary protein

related to growth hormone and prolactin. P Nail Acad Sci USA 87, 4330-4334.

Ono, M., Harigai, T., Kaneko, T., Sato, Y.,Ihara, S., & Kawauchi, H. (1994). Pit-l/GH

factor-l involvement in the gene expression of somatolactin. Mol Endocrinol 8,

109-115.

Parhar, I.S. & lwata, M. (1994). Gonadotropin releasing hormone (GnRH) neurons

project to growth hormone and somatolactin cells in the Steelhead trout.

Histochemistry 102: 195-203.

Park, MK. & Wakabayashi, K. (1986). Preparation of a monoclonal antibody to

common aminoacid sequence of LHRH and its application. Endocrinol Jap 33,
257-272.

Pendon, C., Martinez-Barbera, J.P., & Valdivia, MM. (1994). Cloning of a

somatolactin-encoding cDNA from sole (Solea senegalensis). Gene 147, 227­

230.

Peter, R.E., Yu, K., Marchant, T.A & Rosenblum, P.M. (1990). Direct neural regulation

of the teleost adenohypophysis. J Exp Zool . 4, 84-89.

Peter, R.E. & Marchant, T.A. (1995). The endocrinology of growth in carp and related

species. Aquacwlture 129, 299-321

Peute, J., Goos, H.J.Th., de Bruyn, M.B.A. & Van Oordt, P.G.W.J. (1978).

Gonadotropic cells of the rainbow trout pituitary during the annual cycle:
 Bibliografia

Ultraestructure and hormone content. Ann Biol Anim Biochem Biophys 18, 905­
910.

Planas, J., Swanson, P., Rand-Weaver, M. & Dickhofï, W.W. (1992). Somatolactin

stimulates in vitro gonadal steroidogenesis in coho salmon, Oncorhynchus

kisutch. Gen Comp Endocrinol 87, 1-5.

Quérat, B. (1994). Molecular evolution of the glycoprotein horrnones in vertebrates.

Perspectives in Comparative Endocrinology. NRC Canada, Canada. Editado por

Davey, K.G., Peter, R.E. 8LTobe, S.S. pp. 27-35.

Quérat, B. ([995). Structure relationships between "fish" and tetrapod gonadotropins.

Reproductive Physiology of Fish. Fish Symposium 95, Austin, USA, Editado

por Goetz, F.W.& Thomas, P. pp. 7-9.

Rand-Weaver, M; Noso, T., Muramoto, K. & Kawauchi, H. (199la). Isolation and

characterization of somatolactin, a new protein related to grth hormone and

prolactin from Atlantic cod (Gadus morhua) pituitary glands. Biochemistry 30,
lSO9-l515.

Rand-Weaver, M., Baker, B.J., & Kawauchi, H. (l99lb). Cellular localization of

somatolactin in the pars intermedia of some teleost fishes. Cell Tissue Res 263,
207-215.

Rand-Weaver, M., Swanson, P., Kawauchi, H., & Dickhoff, W.W. (1992).

Somatolactin, a novel pituitary protein: Puñfication and plasma levels during

reproductive maturation of coho salmon. J Endocrinol 133, 393-403.

ll4
 Bibliogrq/ía

Rand-Weaver, M, Kawauchi, H., & Ono, M. (l993a). Evolution of the structure of the

growth hormone and prolactin family. En “The Endocrinology of Growth,

Development, and Metabolism in Vertebrates” Editado por MP. Schereibman,

C.G. Scanes, and P.K.T. Pang, pp. 13-42. Academic Press, San Diego.

Rand-Weaver, M. Pottinger, T.G., and Sumpter, J.P. (l993b). Plasma somatolactin

concentrations in salmonid fish are elevated by stress. J Endocrinol 138, 509­

515.

_Rand-Weaver, M., & Swanson, P. (1993). Plasma somatolactin levels in coho salmon

(Oncorhynchus kisutch) during smoltification and sexual maturation. Fish

Physiol Biochem ll, 175-182.

Rand-Weaver, M., Pottinger, T.G. & Sumpter, J.P. (1995). Pronounced seasonal

rhytth in plasma somatolactin levels in rainbow trout. J Endocrinol 146, 113­

ll9.

Ribeiro, L. & Ahne, W. (1982). Fish cell culture: Initiation of a line of pituitary cells

from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In

vitro 18, 419-420.

Ringuelet, R. (1943). Piscicultura del pejerrey o aterinicultura. Colección Agro,

Editorial Suelo Argentino. pp 162.

Ringuelet, R. (1967). Peces argentinos de agua dulce. Comisión de Investigaciones

Científicas de la Provincia de Buenos Aires. pp 467-473.

115
 Bihllqurqliu

Safford, S.E. (1992). Purification and chemical and biological charactenzatiou of

prolactin and somatolactin and partial characterization of growth hormone li'om

two marine teleost, red drum, Sciaenops ocellatus and Atlantic crouker,

Micropogonias undulatus. Ph.D thesis, University of Texas at Austin. Austin,

TX.

Schachter, B.S., Durgerian, S., Harlan, R.E., Pfafï, D.W., & Schivers, B.D. (1934).

Prolactin mRNA exists in rat hypothalamus. Endocrinology l 14, 1947-1940.

_Schreibman, M.P., Leatherland, F.J. & McKeown, B.A. (1973). Functional morphology

of the teleost pituitary gland. Am Zool 13, 719-742.

Schreibman, M.P., Holtzman, S. & Cepn'ano, L. (1990). The life cycle of the brain­

pituitary-gonad axis in teleost. “Progress in Comparative Endocrino/ogr".

Editado por Epple, A., Scanes, C.G. & Stetson, M.H.,. Wiley/Liss, New York,

pp. 399-408.

Schulz, R.W., Bogard, J., Bosma, P.T., Peute, J., Rebers, F.E.M., Zandbergen, MA, &

Th Goos, H.J. (1995). Physiological, morphological and molecular aspects of

gonadotropins in fish with special reference to the Arican catfish, ('lurius

gariepinus. Proceeding of the 5”! International Symposium on Reproductive

Physiology of Fish. Texas, 1995. Editado por FW. Goetz & P. Thomas, pp.2-9.

Siegmund, I., Troncoso, S., Caorsi, C.E., & González, C.B. (1987). Identification and

distribution of the cell types in the pituitary gland of Austromenia'ia ¡al/clut'ia

(Teleostei, Atherinidae). Gen Comp Endocrinol 67, 348-355.

ll6
 Bibliografia

Simon, N., & Reinboth, R. (1974). Adenohypophyse und hypothalamus.

Histophysiologische untersuchungen bei Lepomis (Centrarchidae). Adv Anal

¡{mb/yo! Cell Biol 48,1-82.

Sower, S.A. (1998). Brain and pituitary horrnones of lampreys, recent findings and their

evolutionary significance. Am Zoo] 38, 15-38.

Stefano, A.V., Canosa, L F., D’ Eramo J.L, Fn'dman, 0., Afl‘ani, J.M., and Somoza,

G.M. (1997). GnRH molecular variants in the brain and pituitary gland of

pejerrey, Odontesthes bonariensis (Atheriniformes). Immunological and

chromatographic evidence for the presence of a novel molecular variant. Comp

Biochem Physiol 118C, 335-345.

Stefano, A.V. (1999). Carcaterización bioquímica de las variantes de GnRH

(gonadotropin-releasing hormone) presentes en cerebro e hipófisis de pejerrey,

Odontesthes bonariensis. Localización neuroanatómica y relación con distintas

hormonas hipofisarias.Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. pp. 124.

Strüssmann, C.A.(l989). Basic studies on seed production of pejerrey Odontesthes

bonariensis. PhD. thesis, Tokyo University of Fisheries, Tokyo. pp. 351.

Suzuki, K., Kawauchi, H. &. Nagahama. (1987). Biological characterization of two

distinct gonadotropins fi'om chum salmon pituitaries. Proceeding 1“ Congr. Asia

and Oceania Soc. Camp. Endocrinol., Nagoya. 1987. Editado por E. Ohnishi, Y.

Nagahama & H. Ishizaki, pp. 173-174.

ll7
 Bibliografia

Suzuki, K., Kawauchi, H. & Nagahama, Y. (l988a). Isolation and characterization of

two distinct gonadotropins from chum salmon pituitary glands. Gen Comp
Endocrinol 7 l, 292-30] .

Suzuki, K., Nagahama, Y., & Kawauchi, H. (l988b). Steroidogenic activities of two

distinct salmon gonadotropins. Gen Comp Endocrinol 71, 452-458.

Suzuki, K., Kawauchi, 1-1.,& Nagahama, Y. (l988c). Isolation and characterization of

subunits of two distinct gonadotropins. Gen Comp Endocrinol 71, 302-306.

Swanson, P., Suzuki, K., & Kawauchi, H. (1987). Isolation and biochemical

characterization of two distinct gonadotropins from coho salmon, Oncorhynchus

kisutch. Am 200127, 79a.

Swanson, P. (1991). Salmon gonadotropins: reconciling old and new ideas.

Reproductive Physiology of Fish. Fish Symp 91, Sheffield, UK, Editado por

Scott, A.P., Sumpter, J.P., Kime, D.E., Rolfe, M.S. pp. 2-7.

Tadokoro, N., Koibuchi, N., Ohtake, H., Kawatsu, T., Kato, Y., Yamaoka, S., &

Kumasaka, T. (1995). Expression of prolactin gene in human decidua during

pregnancy studied by in situ hybridization histochemistry. Endocr J 42, 537­

543.

Takayama, Y., Ono, M., Rand-Weaver, M., & Kawauchi, H. (l99la). Greater
conservation of somatolactin, a presumed pituitary hormone of the growth

hormone/prolactin family, than of growth hormone in teleost fish. Gen Comp

Endocrinol 83, 366-374.

118
 Biblitmrq/Ïa

Takayama, Y., Rand-Weaver, M., Kawauchi, H. & Ono, M. (l99lb). Gene structure of

chum salmon somatolactin, a presumed pituitary hormone of the growth

hormone/prolactin family. Mol Endorinol 5, 778-786.

Tanaka, H., Kagawa, I-I., Okusawa, K., & Hirose, K. (1993). Pun'fication of

gonadotropins (PmGtH I and II) from red seabream (Pagrus major) and

development of a homologous radioimmunoassay for Pm GtI-I II. Fish Physiol

Biochem lO, 409-418.

_Taniyama, S., Kitahashi, T., Ando, H., Ban, M., Ueda, H. and Urano, A. (1999).

Changes in the levels of mRNAs for GI-I/prolactin/somatolactin family and Pit­

l/GHF-l in the pituitaries of pre-spawning chum salmon. J Mol Endocrinol 23,

189-198.

Trudeau, V.L. (l997). Neuroendocrine regulation of gonadotrophín II release and

gonadal growth in the goldfish, Carassius auratus. Reviews of Reproduction. 2,

55-68.

Trudeau, V.L., Somoza, G.M., Nahomiak, C.S. & Peter, R.E. (l992). Interactions of

estradiol with gonadotropin-releasing hormone and thyrotropin-releasing

hormone in the control of growth hormone secretion in the goldfish.

Neuroendocrinology 56, 483-490

Tsuneki, K. & Gorbman, A. (1975). Ultrastmcture of anten'or neurohypophysis and the

pars dístalis of the lamprey, Lamperra tridemata. Gen Comp Endocrinol 25,
487-508.

ll9
 Bibliogra ¡u

Ueda, H. & Hirashima, T. (1979). On two different types of putative gonadotropins in

the pituitary gland of the masu salmon, Oncorhynchus masou. Anno! Zoo! Japon
52,114-124

Ueda, H., Young, G. & Nagahama, Y. (1983). Immunocytochemical identification of

thyrotropin (TSH)-producing cells in pituitary glands of several species of

teleost with antiserum to human TSH |3subunits. Cell Tissue Res 231, 199-204.

Van Der Kraak, G., Suzuki, K., Peter, R.E., Itoh, H. & Kawauchi, H.(l992). Properties

of common carp gonadotropin I and gonadotropin II. Gen Comp Endocrinol 85,
217-229.

Van Eys, G.J.J.M. (1980). Structural changes in the pars intermedia of the cichlid

teleost Saratherodon mossambicus. Gen Comp Endocrinol 49, 277-285.

Vissio, P.G., Paz, D.A. & Maggese, M.C. (1996). The adenohypophysis of the swamp

eel, Synbranchus marmoratus: An immunocytochemical analysis. Biocell 20,

155-161.

Watson, R.E., Wiegand, S.J., Clough, R.W. & Hoffman, G.E. (1986). Use of

cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue

morphology. Peptides 7, 155-159.

Weber, G.M., Powell, J.F.F., Park, M.,Fisher, W.H.,Craig, A.G., Rivier, J.E., Nanakon,

U., Parhar, I.S., Ngamvongchon, S., Grau, EG. & Sherwood, N.M. (1997).

Evidence that gonadotropin releasing hormone (GnRH) functions as a prolactin­

releasing factor in a teleost fish (Oreochromis mossambicus) and primary

structures for three native GnRI-Imolecules. J Endocrinol 155, 121-132.
 Bibliogrqfia

Wilson, D.M., Emanuele, N.V., Jurgens, J.K., & Kelley, MR. (1992). Prolactin

message in brain and pituitary of adult male rats is identical: PCR cloning and

sequencing of hypothalamic prolactin cDNA from intact and

hypophysectomized adult male rats. Endocrinology 131, 2488-2490.

Yan, H. Y., and Thomas, P. (1991). Histochemical and immunocytochemical

identification of the pituitary cell types in three sciaenid fishes: Atlantic croaker

(Micropogonias undulatus), Spotted seatrout (Cynoscion nebulosus) and Red

drum (Sciaenops ocellatus). Gen Comp Endocrinol 84, 389-400

Yan, L., Swanson, P. & Dickhofl‘, W.W. (1992). A two receptor model for salmon

gonadotropins (GtH l and GtH II). Biol Reprod 47, 418-427.

Yang, B.Y., Arab, M., & Chen, T.T. (1997). Cloning and characterization of rainbow

trout (Oncorhynchus mykiss) somatolactin cDNA and its expression in pituitary

and nonpituitary tissues. Gen Comp Endocrinol 106, 271-280.

Zhu, Y. & Thomas, P. (1995). Red drum somatolactin: Development of a homologous

radioimmunoassay and plasma levels afler exposure to stressors or various

backgrounds. Gen Comp Endocrinol 99, 275-288.

Zhu, Y. and Thomas, P. (1996). Elevations of somatolactin in plasma and pituitaries and

increased alfa-MSl-I call activity in red drum exposed to black background and

decreased illumination. Gen Comp Endocrinol lOl, 21-31.

Zhu, Y. and Thomas, P. (1997). Studies on the physiology of somatolactin secretion in

red drum and Atlantic croaker. Fish Physiol Biochem l7, 271-278.