INGENIERÍA EN ELECTROMEDICINA

INSTRUMENTACIÓN CLÍNICA (BIE-29)

Exposición #1

Profesor: Ing. Sebastián Madrigal Solano

Estudiantes:
María Celeste Araya Villalobos (20180120091)
Pamela Echeverría Obando (20180110839)
Daniela Piedra Bolaños (20180110983)

II Cuatrimestre, 2020
San Pedro, San José

1
 Índice
Introducción......................................................................................................................... 4
Objetivos.............................................................................................................................. 5
General .....................................................................................................................5
Específicos................................................................................................................5
Principio anatómico del microscópio ...................................................................................6
Microscopio convencional................................................................................................... 7
Historia..................................................................................................................... 7
Principio de funcionamiento ................................................................................. 11
Partes ...................................................................................................................... 13
Tipos ...................................................................................................................... 15
Especificaciones técnicas básicas .......................................................................... 16
Marcas y Costos...................................................................................................... 17
Microscopio de fluorescencia ............................................................................................ 18
Historia ....................................................................................................................18
Principio de Funcionamiento ................................................................................. 20
Partes ...................................................................................................................... 23
Tipos ....................................................................................................................... 25
Accesorios .............................................................................................................. 26
Diagrama de bloques .............................................................................................. 27
Esquemático ................................................................................................27
Óptico .........................................................................................................28
Especificaciones técnicas del equipo ......................................................................29
Certificaciones del equipo ...................................................................................... 31
Marcas y Costos ......................................................................................................32
Microscopio de barrido de electrones ................................................................................ 33
Historia ................................................................................................................... 33
Principio de Funcionamiento ..................................................................................35
Partes del microscopio.............................................................................................38
Especificaciones técnicas del equipo ......................................................................48

2
Conclusiones .......................................................................................................................49
Bibliografía..........................................................................................................................50

Índice de figuras
Figura 1: Microscopio utilizado por Hooke .........................................................................8
Figura 2:Microscopio italiano del siglo XVII.......................................................................9
Figura 3:Microscopio acromático creado por Lister ………...............................................10
Figura 4: Partes del microscopio Motic Convencional........................................................13
Figura 5:Franja del espectro electromagnético....................................................................18
Figura 6:Diagrama de energía Jablonski .............................................................................19
Figura 7: Diagrama de Jablonski simplificado.....................................................................21
Figura 8:Intensidad relativa del espectro..............................................................................22
Figura 9: Partes del microscopio fluorescente……............................................................. 23
Figura 10: Filtros fluorescentes……....................................................................................24
Figura 11:Microscopio MicroTime 200 STED - PicoQuant............................................... 25
Figura 12:.Diagrama esquemático……............................................................................... 27
Figura 13: Diagrama Óptico del microscopio de fluorescencia…….................................. 28
Figura 14:Microscopía electrónica de barrido......................................................................33
Figura 15: Microscopía electrónica de barrido 2 .................................................................35
Figura 16: Diagrama de cañón constituido por filamento de tungsteno, cilindro de
Wehnelt y el ánodo.........................……..............................................................................39
Figura 17: Componentes de un lente de MEB.....................................................................40
Figura 16:. Secuencia del proceso de formación de la imagen............................................41
Figura 17:Esquema de un equipo de MEB..........................................................................44
Figura 16: Esquema que muestra los principales componentes en un MEB.......................44
Figura 17: Partes del microscopio MultiSEM 505/506.......................................................46

Índice de tablas
Tabla 1. Principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia con su espectro de
absorción y emisión.……………………………………………………………………..21
Tabla 2. Accesorios para el microscopio Leica M205FA ………………………………26
Tabla 3. Especificaciones técnicas Leica M205FA ……………………………….…….29
Tabla 4. Especificaciones técnicas básicas Leica M205FA ………….…………………30
Tabla 5. Características de las fuentes de electrones utilizadas por MEB………………38
Tabla 6. Especificaciones técnicas ...................…….........................................................4

3
 Introducción

La microscopia es una ciencia que se encarga de las aplicaciones y los usos relacionados a
los microscopios, los cuales permiten observar microparticulas que no se pueden apreciar a
simple vista. Los microscopios son utilizados en gran cantidad de campos educativos,
formativos, profesionales y son muy utilizados en la microbiologia y la medicina. Son de
gran utilidad en el diagnostico de patologias, asi como el conomiento de nuevos
microorganismos.
En el presente trabajo se ampliara sobre tres tipos de microscopios, el microscopio de
fluorescencia, el microscopio optico convencional y el miscroscopio de barrido de electrones.
Especificamente de su historia, principio de funcionamiento, partes, tipos o variantes de
estos, especificaciones tecnicas, y las diferentes marcas y costos presentes en el mercado.
Como futuros ingenieros en electromedicina debemos conocer sobre este tipo de equipos, ya
que nos podriamos enfrentar en algun momento a una reparacion o limpieza de los mismos.

4
 Objetivos

General
 Investigar las particularidades a profundidad de los microscopios convencional, de
fluorescencia y de barrido de electrones

Específicos
 Analizar el principio de funcionamiento de los microscopios convencional, de
fluorescencia y de barrido de electrones
 Detallar especificaciones, accesorios, consumibles y las partes de los microscopios
convencional, de fluorescencia y de barrido de electrones
 Indagar marcas, costo y certificaciones de los microscopios convencional, de
fluorescencia y de barrido de electrones
 Explicar los diagramas de bloques de cada microscopio
 Sugerir mejoras tecnológicas de los microscopios convencional, de fluorescencia y
de barrido de electrones

5
 Principio Anatómico
La mayoría de muestras en los laboratorios clínicos son de tejidos animales y plantas,
estas son observadas por medio del microscopio. Debido a la importancia de las pruebas para
con la salud y conocimeinto, se resaltarán las funciones de cada estructura que es visible ante
un microscopio.

Tabla 1. Estructuras celulares

Estructura Celula animal Celula vegetal
(presente sí o no) (presente sí o no) Funcion en la celula

Lugar donde se encuentran todos los organelos. Esta

Citoplasma Sí Sí
constituido por agua, sales y otras moléculas.
Membrana
Sí Sí Protege a la celula de toso su entorno.
celular
Mantiene la forma de la celula ademas le brinda
Pared celular No Sí
resistencia y rigidez, esta fuera de la membrana celular.

Contiene todo el material genetico. En el nucleolo se

Nucleo / Sí Sí
forman los ribosomas.
Nucleolo
Fabrica las proteinas de la célula para que esta pueda
Ribosomas Sí Sí
subsistir.
Liso tiene ribosomas y produce grasas o lipidos. Rugoso
Reticulos Sí Sí contiene uniones de ribosomas y participa en la
endoplasmaticos produccion de proteinas.
Recibe los elementos producidos por los reticulos lisos y
Aparato de Sí Sí
rugosos.
Golgi
Es producido por el apaato de Golgi y se encargan de
Sí No
Vesiculas almacernar las sustancias producidas por el RE.

Almacena sustancias pero tambien se encarga de regular

No Sí
Vacuolas la presion de la celula animal.

Sí No Realiza la digestion celular en la celula animal.

Lisosomas
Es el suministro energetico de la celula, convierte los
Sí Sí
Mitocondria enlacen quimicos de azucar en energia.

No Sí Da la pigmentacion verde a las plantas, contiene clorofila.

Cloroplastos

Red de filamentos de proteina lo cual mantiene la forma

Sí Sí
Citoesqueleto de la celula y permite el movimiento celular.
Se encargan de la division celular y se encientran dentro
Centriolos Sí No del cito esqueleto.

6
 Microscopio convencional
Historia
El microscopio óptico convencional es una de las mas grandes creaciones de la
historia, marcando un antes y después en el estudio de la ciencia, especialmente en los
campos de la medicina y biología. Se conoce al primer microscopio diseñado como
microscopio compuesto ya que antiguamente se utilizaban las famosas lupas para lograr
aumentar el tamaño de los objetos, a esta se le conocía también como microscopio simple ya
que contaba con un único lente. (Lanfranconi, M. 2001)
No se sabe con exactitud quien fue el verdadero inventor del primer microscopio ya
que se tienen datos de posibles creadores desde 1590 a 1620. Popularmente se dice que el
primer creador es Zacharias Janssen, el se encontraba trabajando con su padre en el taller
anteojos en 1590 se le ocurrió unir dos lentes en tubo y se dio cuenta que el aumento que
lograba era aun mayor que el que obtenía con uno solo. Aunque en ese momento no se le
daba el uso que tiene hoy en día su principio de funcionamiento básico es el mismo, ya que
tiene un lente objetivo y otro ocular. (Lanfranconi, M. 2001)
En 1612 Galileo Galilei dio a conocer su prototipo modificando uno de sus
telescopios, combinando una lente cóncava con una convexa dentro de un cilindro de una
especie de cartón rodeado de un cuero verde, para lograr enfocar se tenia que desplazar todo
el cilindro dentro de un anillo de hierro. Luego de estos modelos se agregó un tercer lente
con el cual se logro un aumento aun mayor al momento de visualizar muestras. (Lanfranconi,
M. 2001)
Gracias a este equipo se realizaron increíbles descubrimientos de los que hasta el momento
no se tenían idea.
Se podría decir que uno de los descubrimientos mas importantes fue el de la
observación del corcho hecha por Hooke, ya que no se entendía porque este era tan compacto,
pero a la vez tan liviano. Al observarlo con el microscopio noto que estaba formado por una
serie de celdillas rectangulares a las que decidió llamar “células” debido a su similitud con
las habitaciones encontradas en los monasterios. (Lanfranconi, M. 2001)

Figura 1. Microscopio utilizado por Hooke

7
 Fuente: Lanfranconi, M. (2001)
Hooke se encontraba tan fascinado con el uso del microscopio que en 1665 publico
su libro llamado Micrographia, en este se pueden encontrar unos dibujos increíblemente
detallados de las observaciones microscópicas. (Lanfranconi, M. 2001)
Otro importante descubrimiento se dio en 1773 cuando Otto Müller logro observar bien
detalladamente aquellos microorganismos para clasificarlos en bacilos y espirilos.
Además, podemos citar una serie de acontecimientos importantes (Lanfranconi, M.
2001):
 El holandés Jan Swammerdam con el uso del microscopio observó insectos dándole
prioridad en su conformación, también descubrió que la sangre no es un líquido
uniforme rojo, sino que existen sustancias que le dan ese color.
 Nehemiah Graw botánico ingles se dedico al estudio de los órganos de reproducción
de las plantas, gracias a esto descubrió́ los granos de polen.
 Reigner de Graaf fue un anatomista que realizó estudios similares a los de Grew, pero
en animales descubriendo ciertos elementos del ovario que desde ese momento se
conocen como folículos de Graaf.
 Marcello Malpighi fue uno de los microscopistas más grandes de la historia gracias a
su descubrimiento. Los primeros estudios los realizó con pulmones de rana,
observando ahí una compleja red de vasos sanguíneos demasiado pequeños para
observar a simple vista, ya que también se encontraban muy unidos entre si. Cuando

8
 se dispuso a seguir el recorrido de los vasos hasta la unión con los mas grandes, se
dio cuenta que estos últimos eran venas en una dirección y arterias en dirección
opuesta. Por lo tanto, noto que las arterias y las venas se encuentran unidas mediante
una red de vasos llamados capilares.

Figura 2. Microscopios italianos del sigo XVII

Fuente: Lanfranconi, M. (2001)

El microscopio fue teniendo mejoras muy lentamente a lo largo de los años, uno de
los problemas mas grandes que tenia era la aberración cromática (luz de colores alrededor de
la muestra), la cual impedía ver con claridad los detalles de las muestras. (Lanfranconi, M.
2001)
No fue hasta 1820 que el óptico Joseph Lister diseño el primer microscopio
acromático capaz de eliminar los anillos de luz de colores alrededor de las muestras que
limitaban ver la muestra de manera clara. Gracias a este Lister logro darse cuenta que los
glóbulos rojos tenían forma de discos bicóncavos. Este microscopio acromático fue un gran
paso para llegar a tener lo que hoy día conocemos como microscopio óptico, ya que fue la
base en la que se realizaron los siguientes perfeccionamientos. (Lanfranconi, M. 2001)

Figura 3: Microscopio acromático creado por Lister

9
 Fuente: Lanfranconi, M. (2001)

Otro problema que se fue solucionando con el tiempo es la capacidad de resolución y

el poder de magnificación, esta limitación era dada por la longitud de onda de la luz.
Esta limitante se acabo en 1930 con la aparición del microscopio electrónico, que a diferencia
del microscopio óptico tenia una capacidad de aumento de 1000 veces el tamaño de la
muestra observada. Con este por primera vez se pudo observar ADN, virus y pequeñas
organelas. (Lanfranconi, M. 2001)

10
Principio de funcionamiento
El microscopio óptico convencional posee dos sistemas de lentes, el objetivo y el
ocular, instalados en los extremos opuestos de un tubo cerrado. La función del lente objetivo
es crear una imagen amplificada del objeto que se desea examinar, esta imagen se proyecta
hacia arriba cerca del extremo superior del tubo del microscopio, y se le llama “imagen
aérea”, debido a que esta se forma en el aire, esto quiere decir que, si se retira el lente ocular,
y se instala una pequeña pantalla translucida en este plano, esta imagen se podría apreciar.
Pero esto no se realiza así, ya que esta “imagen aérea” se logra apreciar a través del
lente ocular, este tiene una función de ampliar aún más esta imagen, como lo haría una lupa,
la única diferencia es que una lupa amplía un objeto real y el lente ocular amplía una imagen
aérea. La imagen final es percibida en la retina del ojo, esta imagen se llama “imagen virtual”,
debido a que los rayos de luz no provienen verdaderamente de esta imagen, si no que parece
que se originan ahí. (Leica, 2000)
El aumento total del microscopio es el producto del aumento inicial producido por el
lente objetivo y el aumento secundario producido por el lente ocular. El aumento en el
microscopio no posee un límite, lo que posee un limite es el poder de resolución, que se
define como la capacidad de apreciar los detalles más finos. Esto quiere decir que al seguir
aumentando la imagen se irá poniendo borrosa y no se podrán apreciar los detalles de esta,
por el límite del poder de resolución. Entonces lo que existe es un límite de aumentos útiles,
por lo que al incremento excesivo del aumento se le llama “aumentos vacíos”, porque
hablamos de aumentos más allá del límite útil respecto a la reproducción de detalles finos.
(Leica, 2000)
Respecto al poder de resolución, este depende del diseño del objetivo. Si el objetivo
logra captar un gran cono angular de luz proveniente de la muestra, tendrá mayor poder de
resolución que un objetivo que capte un cono de luz más pequeño. Si logra captar más luz,
se apreciarán mejor los detalles. (Leica, 2000)
Otro aspecto importante a tomar en cuenta es la apertura numérica, esta determina la
eficiencia del condensador y del lente objetivo. Esta se representa con la fórmula: (A.N. =
ηsinα), en la cual η indica el índice de refracción del medio, que exista entre el objetivo y el
espécimen o condensador, y α, que representa la mitad del ángulo máximo del cono de luz

11
que penetra o sale de la lente, proveniente de o en dirección al objeto enfocado en el eje
óptico. (Motic Incorporation Ltd, 2010).
No podemos olvidar en el funcionamiento el sistema de iluminación, este permite al
usuario apreciar de mejor manera las muestras que se quieran analizar. Por lo general no se
trabaja con la máxima iluminación que permite la apertura numérica, ya que cuando esta es
casi igual a la apertura numérica del objetivo, se disminuye el contraste. Por esto dependiendo
de la muestra se va utilizar la iluminación. En las muestras de contraste alto con detalles muy
pequeños se debería iluminar la apertura numérica por completo. (Leica, 2000)
Por otro lado, si la muestra es de contraste bajo se debe disminuir el cono de
iluminación de la apertura numérica, esto con el fin de evitar que la imagen quede borrosa
por el poco contraste. El ajuste ideal de la apertura numérica iluminada corresponde a la
mejor relación entre poder de resolución y contraste. (Leica, 2000)

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Partes del microscopio convencional
Figura 4. Partes del Microscopio Motic Convencional

Fuente: Motic (2013)

Es importante conocer las partes y conceptos relacionados con el microscopio óptico
convencional:
Sistema Óptico
 Fuente de luz: Es de vital importancia, ya que genera un haz de luz que da sobre la
muestra, y al utilizarla de manera adecuada permite apreciar mejor los detalles.
(Mundo Microscopio, 2020)
 Condensador: Se sitúa bajo la platina del microscopio. Se encarga de recoger la luz
y dirigirla sobre el objeto que se está examinando. Este posee amplia apertura
numérica, lo que facilita su uso en la mayoría de objetivos de medio y gran aumento.
(Motic Incorporation Ltd, 2010).
 Diafragma: Permite regular la cantidad de luz que da sobre la muestra. Por lo general
se ubica debajo de la platina. (Motic Incorporation Ltd, 2010).

13
  Objetivo: Conjunto de lentes que se encuentran más cerca de la muestra y se
encargan de la primera etapa de aumento de la muestra. En los microscopios
modernos existen diversos lentes objetivos, ubicados en el revólver. Su respectivo
aumento y apertura numérica se ubica en su parte lateral. (Mundo Microscopio, 2020)
 Ocular: Como se habló anteriormente proporciona la segunda etapa de ampliación
de la muestra. A través de él es que la persona observa la muestra. Si poseen solo uno
se llaman monoculares, dos binoculares y en algunos trinoculares. (Mundo
Microscopio, 2020).
 Prisma óptico: El prisma lo que hace es dividir el haz de luz proveniente del objetivo
para llevarlo a dos oculares distintos. (Mundo Microscopio, 2020).

Sistema Mecánico
 Base: Es la pieza que proporciona estabilidad al equipo, sobre ella se montan las
demás piezas. Muchas veces poseen unos soportes de goma para que el microscopio
no se deslice. (Mundo Microscopio, 2020).
 Platina: En esta se coloca la muestra que se va observar. La platina tiene un agujero
en el centro por donde pasa la luz para iluminar la muestra, además posee dos pinzas
que evitan que la muestra se mueva. (Mundo Microscopio, 2020).
 Brazo: Constituye el armazón del microscopio, y se encarga de conectar todas sus
partes. Principalmente conecta los lentes objetivos y oculares, con la superficie donde
se coloca la muestra. (Mundo Microscopio, 2020).
 Tornillo Macrométrico: Se encarga de ajustar de forma rápida la posición vertical
de la muestra respecto al lente objetivo. Con este se logra obtener un primer enfoque
de la muestra. (Mundo Microscopio, 2020).
 Tornillo Micrométrico: Con este se logra obtener un mayor enfoque de la muestra,
debido a que mueve la platina de una forma lenta y con gran precisión. (Mundo
Microscopio, 2020).
 Revólver: Pieza giratoria que permite seleccionar el objetivo más adecuado.
Normalmente se puede escoger entre 3 y 4 objetivos. (Mundo Microscopio, 2020).

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Tipos
 Microscopio monocular: Solo posee un ocular, es un microscopio muy simple que
pueden utilizar estudiantes principiantes en el uso de un miscroscopio, casi nunca es
utilizado en ámbitos profesionales. (Mundo microscopio, 2020)
 Microscopio binocular: Posee dos oculares, por lo que se puede observar la muestra
con ambos ojos. Es muy utilizado en las universidades y en otros laboratorios más
avanzados. (Mundo microscopio, 2020)
 Microscopio trinocular: Esta variante incluye un ocular adicional, en el cual se puede
conectar una cámara para obtener imágenes de las muestras. (Mundo microscopio,
2020)
 Microscopio digital: Posee una cámara en lugar del ocular, esto permite obtener
digitalmente la imagen de la muestra. (Mundo microscopio, 2020)
 Microscopio invertido: La fuente de luz y el objetivo se encuentran en posición
invertida respecto al microscopio convencional. Con este microscopio se pueden
observar células vivas y tejidos que se mantienen constantemente hidratados dentro
del recipiente. (Mundo microscopio, 2020)
 Microscopio estereoscópico: Posee dos oculares, pero la diferencia de este con un
microscopio binocular convencional, es que en este la imagen en cada ocular es
distinta. (Mundo microscopio, 2020)

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Especificaciones técnicas básicas
En cuanto a las especificaciones generales del microscopio óptico convencional nos
basamos en el Basic Biological Microscope (BA210) de Motic, entre las cuales podemos
citar las siguientes (Motic, 2013):

 Cabezal binocular/trinocular tipo Siedentopf, 30° de inclinación, 360° de rotación

(división de la luz 100:0/20:80).
 Distancia interpupilar 55-75mm.
 Oculares de gran campo y alto punto focal, N-WF10X/20mm, con ajuste dióptrico
en ambos ojos y protectores de caucho.
 Revólver cuádruple inverso.
 CCIS® EF-N Plan 4X, 10X, 40X S y 100X S-Oil.
 Sistema de enfoque coaxial, macro y micrométrico.
 Platina mecánica incorporada con mandos coaxiales en posición baja (mandos a
mano derecha).
 Condensador Abbe enfocable A.N. 0.90/1.25 con diafragma de iris y ranura.
 Iluminación por lámpara halógena de 6V/30W o LED de 3W
 Alimentación universal 100-240V
 Incluye filtro azul, aceite de inmersión, cable de alimentación, llave Allen, tornillo de
fijación y funda protectora de vinilo.

Además, se deben tomar en cuenta otras especificaciones o condiciones de funcionamiento.

(Motic Incorporation Ltd., 2010):
 Uso obligatorio en interiores
 Altitud máxima: 2000 m
 Temperatura ambiente: 15 °C a 35 °C
 Humedad relativa máxima: 75% para temperaturas de hasta 31ºC, descenso lineal
hasta una humedad relativa del 50% a 40°C.
 Fluctuaciones del suministro eléctrico: no deben superar ±10% de la tensión normal.
 Presión atmosférica: entre 75 kPa y 106 kPa
 Evitar escarcha, condensación, infiltraciones de agua y lluvia

16
Marcas y costos
Cuando se va adquirir un microscopio convencional es importante conocer las diferentes
marcas y costos que ofrece el mercado, buscando el que ofrezca mejor calidad de imagen, un
adecuado sistema de iluminación, y en general que posea una mecánica suave, rígida y segura
en cada uno de los movimientos. Entre las marcas más reconocidas y utilizadas en el mercado
tenemos:
 Motic
 Olympus
 Leica

El Basic Biological Microscope (BA210) de Motic se utiliza mayoritariamente en centros

educativos y formativos, su configuración estándar se adapta de forma ideal a las necesidades
de institutos de educación secundaria, universidades y facultades de medicina. Este
microscopio tiene un precio aproximado de 600 dólares. (Motic Incorporation Ltd, 2010).
El microscopio CX23 de Olympus está diseñado para microscopía educativa, es fácil de
transportar, debido a su tamaño compacto, peso ligero, y las empuñaduras antideslizantes. Se
puede ajustar fácilmente la distancia interpupilar, la altura del punto focal y las dioptrías
derecha e izquierda para enfocar mejor, todo esto nos garantiza una observación cómoda.
Además, posee un almacenamiento sencillo. Este tiene un costo aproximado de 1700 dólares
(OLYMPUS, 2019)
El microscopio compuesto Leica DM3000 facilita el trabajo debido a que es compacto
y no necesita de mucho mantenimiento. Posee un sistema de iluminación con una vida útil
de 20 años, lo que hace que se ahorren costos de cambio de lámparas. Este microscopio
ofrece excelentes condiciones para que los estudiantes aprecien los detalles más precisos en
el estudio de las ciencias biológicas. Ronda un valor de 900 dólares. (Leica, 2020)

17
 Microscopio de fluorescencia

Historia

La fluorescencia fue un fenómeno de luminiscencia descrito en 1852 por George

Gabriel Stokes, en donde una molécula llamada fluorocromo o fluoróforo en estado natural
o estable, se “exita” y adsorbe luz de menor longitud de onda entre 400 y 700 nanómetros,
lo que produce que emita luz o radiaciones visibles o invisibles durante 0,5 a 20
nanosegundos (Samaniego, 2009).
Figura 5. Franja del espectro electromagnético

Fuente: (National Aeronautics and Space Administration- NASA, s.f.)

A pesar de este descubrimiento, hasta 1930 pudo ser explicada físicamente por el
ucraniano Alexander Jablonski; quién es conocido como padre de la espectroscopía de
fluorescencia. El hallazgo lo realizó mientras realizaba su tesis doctoral, titulada “Sobre la
influencia del cambio de las longitudes de onda de la luz de excitación en los espectros de
fluorescencia”. (Michael W. Davidson, 2009)
Jablonski, para explicar la evidencia experimental obtenida en el campo, creó el
“Diagrama de Energía Jablonski”, donde se explica la absorción y emisión de luz:
“El diagrama representa los estados electrónicos de una molécula a medida que
cambia de una a otra. Ilustra un estado electrónico basal, el primer estado y a veces,
un segundo estado excitado electrónico. En cada nivel de energía, los fluoróforos
pueden existir en varios niveles de energía vibracional, que están representados por
múltiples líneas horizontales dibujadas para cada estado electrónico. Las transiciones
entre estados se representan mediante líneas verticales que atraviesan la región entre
el suelo y los estados excitados.” (Michael W. Davidson, 2009)

18
 Figura 6: Diagrama de Energía Jablonski

Fuente: Michael W. Davidson, 2009

Entre 1911 y 1913 Otto Heimstaedt and Heinrich Lehmann desarrollaron el primer
microscopio de fluorescencia como consecuencia del microscopio UV. Se usó para observar
bacterias, protozoos, algunos tejidos animales y vegetales. Además se pudo apreciíar algunas
sustancias como la albúmina, elastina y queratina. Se dice que en el año 1955, el microscopio
de fluorescencia costaba unos $8000, lo que eran en el 2009 unos $100,000. (Barbier, 2016)
Luego de estos enormes avances basados en la florescencia, aparecen en 2014 tres
científicos: Eric Betzig, William E. Moerner y Stefan W. Hell, ellos fueron galardonados al
premio Nobel de Química de ese año, después de haber logrado un microscopio de alta
resolución que permite ver las muestras a unos 10nm
Este microscopio logra utilizar un método llamado agotamiento de emisión
estimulada que permite disminuir un área que está iluminada por un láser bajo del límite de
difracción. Este método es posible superando el límite de Abbe. Abbe es una característica
en materiales que permite medir la claridad o transparecia óptica. Ese número existe luego
de comparar el índice de refracción de ese material con varias longitudes de onda. (Perdomo
& Ballén, 2006)

19
Principio de funcionamiento del equipo

Este tipo de microscopio se basa en el proceso de fluorescencia que de acuerdo a

Monteleone (2017) es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual
un material absorbe radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz cuya
energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido.

Esta fluorescencia se produce cuando se irradia un átomo o molécula con la cantidad

de energía en forma de radiación (energía lumínica) suficiente para que el átomo pase de un
estado fundamental a un estado excitado; es decir, un electrón que se encuentra en su nivel
de energía equilibrado debido a esa radiación, pasa a un nivel de energía mayor. Debido a
esto, el átomo se convierte en inestable. Por esa inestabilidad, el átomo tiende a regresar a un
equilibrio que se va a lograr al momento en que ese electrón que se encuentra en un orbital
más enérgico, regrese a su estado inicial por medio de la emisión lumínica con menor energía.

Lo anterior está comprobado de acuerdo al estado fundamental de la materia, que

explica que cada átomo o molécula en su estado natural, tiene una estructura específica de
sus niveles de energía (A. Requena, 2014). Ese electrón subirá de nivel enérgico en una forma
directamente proporcional a la energía que se le aplicó al principio.

El ciclo anterior de una molécula que se encuentra en estado fundamental y al ser

expuesta a una longitud de onda específica llega a un estado de excitación y luego emisión
de esa energía, el físico Aleksander Jablonski realizó un diagrama con el fin explicarlo una
mejor manera, basándose en el comportamiento que tienen los fluoróforos de una molécula
o fluorocromos que son utilizados en la muestra.

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 Figura 7. Diagrama Jablonski simplificado

Fuente: Daniel J. Narváez Armas (2016)

Armas (2016) define un fluorocromo como un marcador colorante empleado en

investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes y un fluoróforo
como parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de
fluorescencia.

Además, agrega que existen múltiples tipos de fluorocromos y cada uno de estos tiene
el espectro de absorción y emisión específico. Estas dos características van a depender de la
estructura y composición química de la molécula.

Tabla 2. Principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia con su espectro de

absorción y emisión.

Fuente: tabla elaborada por el autor Daniel J. Narváez Armas

21
 Menciona Sigaut (2015) que el objetivo principal de este microscopio es identificar
las sustancias específicas de una muestra orgánica o inorgánica, por medio de la observación
de las propiedades características de emisión mientras se ilumina con radiación de una
longitud de onda acorde a esa sustancia. Por medio de un filtro de barrera que permiten el
paso de la luz fluorescente emitida que bloquea la luz UV y un filtro de excitación que
selecciona las longitudes de onda específicas de la luz UV-visible que fueron emitidas por la
fuente, se logra separar la luz fluorescente emitida de la luz de excitación.
El resultado final será que las muestras que brillan van a tener un fondo oscuro que
posee un contraste suficiente para poder detectarse y entre más oscuro sea este fondo, mayor
eficiencia tendrá el microscopio.
Las fuentes de radiación (longitudes de onda) van a depender del tipo de lámpara que
se utilice, ya sea lámpara de arco de Mercurio, lámpara de arco de Xénon o lámpara de haluro
metálico
Figura 8. Intensidad relativa del espectro

Fuente:

22
Partes, tipos, accesorios, consumibles

Figura 9. Partes del microscopio fluorescente

Fuente: imagen elaborada por Kenneth R. Spring y Michael W. Davidson

Partes del microscopio fluorescente:

 Sistema de cámara digital:

 Tubos de observación u ocular: es un elemento óptico que permite la observación de
la imagen de la muestra con dos etapas de ampliación.
 Escudo UV: bloquea la luz UV
 Objetivo: es el componente óptico que se encuentra más cerca de la muestra. Se
encarga de producir la primera etapa de aumento.
 Platina: lugar donde es colocada la muestra. Se encuentra en posición vertical
respecto al objetivo.
 Condensador: se encarga del paso de la luz que provienen de la lámpara
 Diafragma: : regula el paso de la luz que incide en la muestra
 Lente colector: se encarga de realizar una colecta de luz
 Lámpara de Halógeno Tungsteno

23
  Lámpara de Epifluorescencia
 Base: es la pieza en la cual se monta el resto de elementos. Se encuentra en la parte
inferior del microscopio.
 Fuente de alimentación: incluye un transformador independiente para alimentar a la
lámpara.

Figura 10. Filtros fluorescentes

Fuente: imagen elaborada por Kenneth R. Spring y Michael W. Davidson

Filtros fluorescentes:

 Fuente de emisión fluorescente

 Filtros de excitación: permiten el paso de de longitudes de onda específicas que
provienen de la fuente de luz. Esas longitudes de onda pueden pasar por medio del
camino de iluminación.
 Filtros de barrera o filtros de emisión: se encargan de eliminar o absorber las
longitudes de onda de excitación que pasan hacia el detector
 Espejos dicróicos: estos filtros son diseñados de forma especializada, con el propósito
de reflejan únicamente las longitudes de onda de excitación y deja pasar de forma
eficiente las ondas de emisión.

24
Tipos de microscopios fluorescente

Microscopio STED (Stimulates Emmision Depletion)

La microscopía por agotamiento de emisión estimulada es un método muy reciente.
Fue en el año 2014 cuando los científicos Eric Betzig, William E. Moerner y Stefan W. Hell
fueron galardonados al premio Nobel de Química. Se trata de un microscopio que permite
obtener imágenes con una resolución cercana a los 10 nm, lo que implica una alta resolución.
Utiliza el método por agotamiento de emisión estimulada, que se encarga de disminuir
el área de iluminada por un láser debajo del límite de difracción. Este método es posible
superando el límite de Abbe. Abbe es una característica en materiales que permite medir la
claridad o transparecia óptica. Ese número existe luego de comparar el índice de refracción
de ese material con varias longitudes de onda. (Perdomo & Ballén, 2006)

Figura 11. Microscopio MicroTime 200 STED - PicoQuant

Fuente: imagen obtenida de PicoQuant

25
Accesorios
Tabla 3. Accesorios para microscopio Leica M205 FA
Accesorio Función Imagen
Controla el enfoque, la rueda de filtro, la
Interruptor de iluminación y las posiciones de memoria
pie individuales.

Controla el enfoque del motor

Volante

Tiene botones giratorios que se pueden

Pantalla
programar de acuerdo a las necesidades.
Inteligente
táctil

Escanea zonas de gran tamaño con

aumentos grandes
Etapa de
escaneo XY

Se adaptan a diferentes ángulos de visión.

Beneficia al usuario(s)

Tubos
ergonómicos

Varian la altura del microscopio y se

Módulo adaptan al usuario.
ergonómico

Fuente: imágenes obtenidas de Leica Microsystems

26
 Diagrama de bloques (eléctrico, neumático, electrónico)
Diagrama de bloques esquemático de microscopio de fluorescencia
Figura 12. Diagrama esquemático

Fuente: imagen elaborada por Chien-Jung Lo

1. Láser de 488 nm 9. Espejo dicróico

2. Láser de 532 nm 10. Objetivo
3. Filtro de densidad neutra 11. Etapa piezoeléctrica
4. Lente 12. Lente
5. Interruptor eléctrico 13. Cámara EMCCD
6. Lente 14. Campo de iris
7. Campo de iris 15. Bulbo Halógeno de Tungsteno
8. Lente

27
 Figura 13. Diagrama óptico del microscopio de fluorescencia

Fuente: Daniel J. Narváez Armas

1. Filtro de emisión
2. Espejo dicroico
3. Filtro de excitación
4. Objetivo
5. Espécimen

28
Especificaciones técnicas del equipo

Tabla 4. Especificaciones técnicas

Marca Leica
Modelo M205 FA
Dimensiones 340x390x90mm
(ancho x profundidad x
altura)
Peso 5,8 Kg
Tipo de zoom Automatizado con FusionOptics

Platina Platinza deslizante, platinas termostatizadas MATS, platina

semiesférica, giratoria de polarización Leica IsoPro, platina de
movimiento X-Y (manual y motorizada
Iluminación LED5000 SLI, LED5000 MCI y LED5000 RL, fluorescencia,
oblicua, coaxial, fuentes de luz fría

Distancia interpupilar 50 mm a 105 mm

Conexión con el USB
ordenador
Óptica estándar Rango de zoom 7.8x-160x
Resolución Máximo 525 lp/mm
Distancia de 61.5 mm (apocromático plano)
trabajo
Campo visual ∅ 29.5 mm–1.44 mm
Valores máximos Número de 1 280×
aumentos
Resolución 1050 lp/mm

Ancho de 476 nm
estructura visble
Campo visual ∅ 59 mm

Fuente: creación propia basado en especificaciones del equipo

29
 Tabla 5. Especificaciones técnicas básicas
Distancia interpupilar 50 mm a 105 mm

Conexión con el ordenador USB

Temperatura de operación 10º C – 40ºC
Temperatura de -10º C – 55ºC
almacenamiento
Humedad 10% – 90% (sin condensación)
Altitud de operación 0m – 2000m
Grado de contaminación 2
ambiental

Puertos y conectores 1 USB (2.0)

3 CAN
1 poder (33V)
Suministro de poder
Entrada 100 – 230 VAC ± 10 %, 50/60 Hz, 0.5 A – 1.2 A
Salida 33 VDC, max 3.03 A (100 W)
Categoría de sobretensión II
Fuente: creación propia basado en especificaciones del equipo

30
Certificaciones del Equipo

Los microscopios Leica M165 FC, Leica M205 FA / M205 FCA fueron diseñados,
producidos y probados bajo el cumplimiento de las siguientes normas:
 IEC EN 61010-1 : primera parte de requisitos generales de seguridad de equipos
eléctricos para medición, control y uso en laboratorio
 EN 60950-1  equipos de tecnología de la información. Primera parte de requisitos
generales de seguridad
 EN 55011: 2016 clase Bsupresión de interferencia de radio
 EN 61000-3-2 : 2014  compatibilidad electromagnética en general. Límites por
emisiones corriente armónica. 16 A por fase
 EN 61000-3-3 : 2013  compatibilidad electromagnética. Limitación de variaciones
de tensión, fluctuaciones. 16 A por fase.
 DIN EN 61326 : 2013  inmunidad al ruido
 EN 50581:2012  evaluación de productos eléctricos y electrónicos respecto a la
restricción de sustancias peligrosas

31
Marcas
Exiten múltiples marcas que se especializan en manufactura y distribución de
microscopios de fluorescencia
 Leica Microsystems: tiene en la lista de productos una amplia gama de
microscopios de tipo ópticos, quirúrgicos, digitales y confocales. Los
microscopios de fluorescencia más recientes son Leica M205 FCA y Leica
M205 FA. Estos tienen un rango de precio entre $20 000 y $24 000
 PicoQuant: el microscopio de fluorescencia confocal MicroTime 200 tiene
una resolución temporal con una sensibilidad única de molécula única. Su
costo ronda entre los $18 000
 Olympus: fabricante especializado en precisión óptica y digital. También
cuenta con gran cantidad de microscopios, dentro de estos se encuentran el
microscopio de fluorescencia automatizado BX63 y el precio en el mercado
es aproximadamente $25 000

32
 Microscopio de barrido de electrones

Historia
La microscopía electrónica de Barrido surge en 1897 con el descubrimiento de los
rayos catódicos, nombre que correspondía al flujo de electrones. El científico A. Masson
generó una chispa eléctrica en una bobina de inducción a través de un recipiente de vidrio
donde se había realizado un vacío parcial y se observo que en lugar de una descarga eléctrica
se presentaba un resplandor.
Figura 14. Microscopia electrónica de barrido

Fuente: José Jesús Mena Delgadillo.

El científico H. Geissler perfecciono los tubos de descarga y se les conoce como

“tubos Gleissler”. En 1869 J.W. Hittorf, hizo observaciones con estos tubos y observó que a
medida que se iba haciendo un vacío, se notaban resplandores en forma de líneas gruesas
entre los electrodos, de diferentes colores, rosa, azules hasta que en una presión 1x10-3mm
de Hg se vio una luz verdosa emanaba del cátodo y se dirigía hacia el ánodo. El físico alemán
E. Goldstein les denomino rayos catódicos.
En 1923, el físico francés Luis de Broglie propuso que los electrones tienen asociada
una onda de longitud de onda λ y una frecuencia, v. Y dichos electrones podían ser utilizados

33
como una radiación, con la diferencia y ventaja de que el haz de electrones acelerados tienen
una longitud de onda mucho menor en comparación con los haces de luz.
En 1927 y 1928, Denis Gabor agrupo un conjunto de bobinas dentro de una cubierta de hierro
dulce para diseñar la primer lente electromagnética y se llegaría a perfeccionar por M. Knoll
y E. Ruska.
1931, el físico E. Ruska construyo el primer Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)
y posteriormente en 1937 se construyo el Microscopio Electrónico de Barrido.
A partir de 1972, se inicia el procesamiento digital de imágenes.

34
Principio de funcionamiento
El funcionamiento de este microscopio se basa en la utilización de un fino haz de
electrones que se hace impactar contra una muestra llevando a cabo un barrido sobre la
misma. Como consecuencia de esta interacción emergen de la muestra varios tipos de
señales: fotones de bajas energías, rayos X, electrones de Auger, electrones retrodispersados
y electrones secundarios.
Cada una de estas señales puede ser recogida por un detector con el fin de obtener
imágenes o llevar a cabo un análisis de la composición elemental de la muestra. Para obtener
imágenes de alta resolución se utilizan electrones secundarios los cuales son colectados por
un detector, obteniendo después del procesamiento de las señales, una imagen en un tubo de
rayos catódicos.
Este instrumento tiene un funcionamiento de barrido de la superficie de una muestra,
esto por un haz de electrones cuyo diámetro es de 4 nm a 200 nm, obtenido por lentes
eletromagnéticas formadas por el paso de corriente de bobinas. El haz de electrones
interacciona con la muestra, se generan varios tipos de señales, las cuales son colestadas por
una serie de detectores. Por último, se produce una imagen en un monitor TV que es
almacenada en una placa fotográfica que se puede convertir en una imagen digital.

Figura 15. Recuperada de microscopia electrónica de barrido 2

Fuente: José Jesús Mena Delgadillo.

En esta figura se muestra la interacción de los electrones del haz primario con la
muestra, unos generan varios tipos de señales y otros electrones son absorbidos, transmitidos
y difractados (los últimos se utilizan en el Microscopio Electrónico de Transmisión MET)

35
 Permite caracterizar una gran variedad de materiales, como nano-estructurados,
aleaciones metálicas, polímeros, minerales, fibras, películas delgadas, biomateriales y en
algunos casos muestras con alto contenido en humedad.
Los materiales restrictivos para realizar análisis son aquellos con propiedades
magnéticas, a menos, que se fijen apropiadamente en alguna matriz de contención.
Tipos de señales emitidos por la muestra
 Señales con carácter de ondas electromagnéticas, como rayos X y
catodoluminiscencia.
 Señales compuestas por e-, que incluyen e- reflejados, e- secundarios, transmitidos
y absorbidos
 Solamente en el caso de especímenes semiconductores, señales de fuerza
electromotriz
De estos tipos solo importan los electrones, en particular, los secundarios y a los
reflejados ya que son éstos los que serán recogidos por el detector y finalmente expresadas
en términos de brillos y oscuros sobre la pantalla. Una parte de estos, después, pueden
emerger siguiendo direcciones más o menos opuestas a la del haz.

La resolución del MEB depende de los siguientes parámetros:

 Longitud de onda: la relación entre la longitud de onda promedio del haz de
electrones y la resolución del MEB esta dada por la ecuación de Abbe. En esta
escuación si la longitud de onda disminuye, entonces la resolución del MEB también
se va a reducir, en función del valor de la longitud de onda el instrumento óptico
tendrá una mayor posibilidad para revelar estructuras más pequeñas en la superficie
del espécimen.
𝜆
𝑅 = 𝐾 𝑛 𝑠𝑒𝑛𝛼 donde:

R: Resolución
𝜆: Longitud de onda
𝐾: Constante òptica
n: índice de refracción del medio.
𝛼: Ángulo de apertura.

36
  Voltaje de aceleración: esta se da por medio de la ecuación de De Broglie. Se puede
inferir que a longitudes de ondas pequeñas se incrementa la velocidad con la cual son
acelerados los electrones. A mayores voltajes de aceleración, la longitud de onda
disminuye y se incrementa la resolución del aparato.
ℎ
𝜆= donde:
𝑚𝑣

𝜆: Longitud de onda de la radiación

ℎ: Constante de Planck.
𝑚: Masa del electrón.
𝑣: Velocidad del haz de electrones.

Mayor voltaje Menor longitud Mayor resolución

de aceleración de onda

 Diámetro del haz de electrones: este influye en la resolución del MEB y depende
de la capacidad del sistema óptico-electromagnético (lentes). Entre más pequeño sea
el diámetro de la punta del haz con la cuál se barre la superficie de la muestra, va a
tener mayor sensibilidad para detectar sus rasgos topográficos. Si la punta tiene un
menor diámetro la imagen obtenida va a tener una mejor resolución. Es necesario
lograr un balance entre el diámetro de la punta del haz y la corriente necesaria, es
decir si se requiere una gran resolución, se utiliza un haz de diámetro pequeño, pero
si se aumenta el diámetro del haz, entonces es necesario aplicar un mayor voltaje de
aceleración.
 Profundidad de campo: esta es la distancia entre dos planos en relación con el objeto
que se observa en foco con el plano imagen, esto se refiere a: la capacidad que tiene
el microscopio para formar imágenes en foco de la estructura de un objeto a diferentes
niveles de profundidad. Con el MEB se pueden obtener grandes niveles de
profundidad de campo, esta es la característica es la que les proporciona el aspecto
tridimensional a las imágenes obtenidas con el MEB.

Partes principales del MEB

1) Columna electrón-óptica: esta compuesta por:

37
  Cañón: esta constituido por 3 partes: El cátodo o fuentes de electrones del haz
de electrones, el cilindro de Wehneit, y el ánodo. El cilindro Wehneit y el
ánodo son cilindros con un pequeño orificio por donde pasa el haz emitido
por el filamento hacia las lentes electromagnéticas.
Hay 3 tipos de cátodo que son: El filamento de tungsteno (W), el filamento
de Hexaboruro de lantano (La B6) y el cátodo de emisión de campo. Estas son
fuentes de electrones utilizadas actualmente en microscopia electrónica de
barrido.
Tabla 1. Características de fuentes de electrones utilizadas por MEB.
Filamento Diámetro de la Corriente del haz Duración Vació requerido
fuente (𝐴/𝑐𝑚2 ) (Torr)
Tungsteno (W) 50m 1.75 40-80 hrs 10−6
Hexaboruro de 10−10
lantano 10m 65  1000 hrs
Emisión de campo 10nm 103 𝑎 106  3 años 10−11

Fuente: José Jesús Mena Delgadillo.

Filamento de tungsteno (W).
Alambre de aproximadamente 0.01 de diámetro con punta en forma de V de 100m
de diámetro, cubierto con un cilindro de W, el cual tiene un orificio en la punta por donde se
cruzan los electrones. A este proceso se le llama emisión termoiónica, esto se calienta a 2700
grados centígrados aproximadamente dentro del cañón en alto vacío, este emite electrones y
estos forman una nube en la punta del filamento (alrededor) y son atraídos por el ánodo
aplicando voltaje positivo de 5KV – 30KV, respecto al cátodo. A esta diferencia de potencial
se le llama voltaje de aceleración.
Cátodo de emisión de campo.
Se le llama también cátodo frío, debido a que es de tungsteno y tiene una forma de
rodillo con una punta fina en uno de sus extremos. La emisión de electrones no es por efecto
termoiónico, sino por un proceso por emisión de campo. Estos electrones son extraídos del
cátodo por dos placas que funcionan como ánodos, cuando el cátodo es conectado a un
potencial negativo relativo al ánodo, el campo eléctrico en la punta del filamento es tan

38
intensa que se reduce la barrera que evita que los electrones salgan de la punta y por esto los
electrones pueden saltar y salir del cátodo.

Figura 16. Diagrama de cañón constituido por filamento de tungsteno, cilindro de

Wehnelt y el ánodo.

Fuente: José Jesús Mena Delgadillo.

Tipos de lentes MEB

 Lente electrostática: Esta se da por efecto de diferencias de potencial
eléctrico entre el filamento, dentro del cañón de Wenhneld y el ánodo. El haz
de electrones al pasar a través de las líneas equipotenciales del campo
electromagnético se comporta como la luz al pasar por un medio de menor a
mayor índice de refracción, esto define la primera imagen de la nube de
electrones formada en la punta del filamento.
 Lente electromagnética: Consisten en un conjunto de bobinas o solenoides
enrollados por donde se hace pasar una corriente eléctrica que hace un campo
magnético. Están cubiertas por hierro dulce y tienen un pequeño hueco en el
interior que los conecta con dos piezas que son llamadas piezas polares que
tienen la función de concentrar el flujo magnético. En este tipo se
comprenden dos tipos de lentes: la lente condensadora y el lente objetivo, son

39
 usadas para disminuir el diámetro del haz primario de electrones (10-15 m)
que se le denomina crossover generado en el cañón; hasta una punta muy fina
de 5 y 200 nm con lo cual es barrida la superficie de la muestra.

Figura 17. Componentes de un lente de MEB.

Fuente: José Jesús Mena Delgadillo

En la figura 4, se puede ver que estos microscopios cuentan con un cañón de
electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una
imagen aumentada. Las lentes electromagnéticas se utilizan para crear campos que
dirigen y enfocan el haz de electrones, las lentes convencionales utilizadas en los
microscopios ópticos no funcionan con los electrones. De la misma forma, el sistema
de vacío es una parte importante ya que los electrones pueden ser desviados por las
moléculas del aire, de modo que estas características son esenciales.

Figura 18. Secuencia del proceso de formación de la imagen.

40
 Fuente: Harald Fjeld, University of Olso (Noruega).

Cámara de la muestra
Es una plataforma en donde se coloca un porta-espécimen y el tamaño puede variar
con la amplificación del microscopio. La muestra puede ser pequeña de aproximadamente
15 milímetros hasta 12 cm de longitud. La plataforma donde se colca la muestra puede rotar,
inclinarse o moverse en un espacio de ejes X, Y, Z (esta última es la distancia del lente
objetivo a la superficie de la muestra).
El término WD es la distancia de trabajo, esta define la distancia de la base el lente
objetivo a la superficie de la muestra.
Es recomendable tener precaución con la muestra, esto debido a que si se posiciona
demasiado alta se puede pegar al detector de electrones retrodispersados o al lente objetivo
en el momento que se vaya a enfocar. La cámara de la muestra esta aislada de las vibraciones
externas que pueden deteriorar la resolución y en ella se acomodan varios aditamentos que
forman parte del sistema de detección y que amplían las aplicaciones del MEB.

Sistemas de detección.
Constituye el puente entre el haz electrónico y la pantalla donde las interacciones del
haz con la muestra dan la información deseada. Se encarga de recolectar distintas señales
como: electrones secundarios, electrones retrodispersados, electrones Auger, etc. Que
provienen del espécimen debido a la interacción del haz de electrones con los átomos de la
muestra. Estas radiaciones dan diferentes clases de información cuando se coloca en un
detector especifico para cada una de ellas. En un principio, un detector debe satisfacer
requerimientos como:

41
  Alta sensibilidad: la señal que debe ser recogida se encuentra entre 1pA
(10−12 ) y 1 nA ( 10−9 ), equivalente a 106 − 109 e- por segundo.
 Alta frecuencia: el detector debe ser capaz de responder a cambios arbitrarios
en la intensidad de señal, ocurren en función de la velocidad de barrido. Para
la formación de la imagen de TV, la frecuencia debe ser superior a 30 MHz.
 Amplitud dinámica: para una serie de condiciones, la señal que es detectada
puede variar entre dos puntos en diferentes magnitudes (100:1). El detector
debe ser capaz de trabajar en este rango sin pérdida de linealidad.
 Eficiencia: la señal recogida es más débil en unas zonas de la muestra que en
otras. La eficiencia del detector es un factor limitante del sistema por la
calidad de la imagen.
 Tamaño físico pequeño: cuando se trabaja en alta resolución la distancia de
trabajo debe ser muy pequeña, lo que puede condicionar el tipo de detector a
utilizar.
 Características de la cámara: la cámara del portamuestras se suele abrir con
frecuencia para cambiar la muestra, deben ser estables a los cambios vacío-
aire, oscuridad-luz.
Los dos principales tipos de detectores que se utilizan son:
 Detector de centelleo: se usa para detección de electrones secundarios y en menor
proporción para electrones retrodispersados. Es una jaula de Faraday (colector),
centellador, tubo de cristal, fotomultiplicador y preamplificador.
En este tipo de detectores, los electrones secundarios son atraídos hacia el colector,
el cual es conectado a un potencial de 200 eV esto asegura que estos sean atraídos y
acelerados al centellador usualmente compuesto de plástico, vidrio o Ca F. Entonces,
los electrones producen fotones conducidos por el tubo de vidrio hasta el
fotomultiplicador, se crea una cascada de electrones al chocar con los electrodos; por
último, la señal es amplificada en el preamplificador y enviada al tubo de rayos
catódicos dando como resultado la imagen de la muestra.
 Detector de estado sólido: semiconductor delgado y plano. Existen dos tipos; uno
se usa para la detección de electrones retrodispersados y el otro para la colección de
la señal característica de rayos X.

42
Sistema de Vació.
Estas tienen como finalidad producir el vació necesario para el haz de electrones no
sea desviado por los átomos del medio. Existen varios tipos de bombas de vació: mecánica
(10−3 Torr), difusora (10−6 Torr), turbomolecular (10−10 Torr) y iónica (10−11 Torr). Cada
una alcanza diferentes valores de vació como en los paréntesis.
Formación de la imagen.
La formación inicia en el cañón al calentarse el filamento por la corriente alterna y
dar un haz de electrones primario, este es atraído por el ánodo mantenido a un voltaje
positivo, con respecto al filamento (5-30 KeV). El haz de electrones sigue su curso a través
de la lente condensadora y el lente objetivo, se disminuye el diámetro a un diámetro final.
El barrido del haz sobre la superficie de la muestra se hace a través de bobinas de
barrido, ubicadas cerca del lente objetivo, se mueve primero horizontal y después
diagonalmente sin tocar superficie, para regresar justo a un punto debajo del inicio de la
primera línea de barrido.
Voltaje de aceleración.
La ecuación De Broglie, dice que conforme se incrementa el voltaje de aceleración
se obtiene una mejor resolución. En algunos casos, cuando se utiliza voltajes altos se genera
una cantidad de señal innecesaria (ruido), esta va a producir que el detalle en las estructuras
de la muestra no sea la mejor calidad porque se aumenta la brillantez en las orillas de las
superficies que se le llama efecto de borde.
Es necesario elegir un voltaje de aceleración de acuerdo con lo que se necesita, entre
15 y 20 Kev en material biológico, según la resistencia de la muestra. En material inorgánico
como mineral o metal entre 20 y 25 Kev. Para observar detalles finos de la superficie de una
muestra, se recomienda utilizar un voltaje intermedio de 15 Kev. Si para la muestra se
requieren aumentos pequeños y no importa ver tanto el detalle, se aplica un voltaje de
aceleración bajo y aumentar la corriente por medio de una lente condensadora.

Distancia de trabajo (DW).

La distancia entre el lente objetivo y la muestra (DW) al cambiarla produce
variaciones en la resolución y en la profundidad del campo. Al incrementar WD se perderá

43
resolución, pero se tendrá una mejor profundidad de campo. Al disminuir WD se tendrá una
mejor resolución, pero la profundidad de campo será menor.
Figura 19. Esquema de un equipo MEB

Fuente: Harald Fjeld, University of Olso (Noruega).

Figura 20. Esquema que muestra los principales componentes en un MEB.

Fuente: Harald Fjeld, University of Olso (Noruega).

Ventajas del MEB

 Gran profundidad de campo que le da apariencia tridimensional a las imágenes
permitiendo enfocar y observar amplias zonas de la muestra al mismo tiempo.

44
  Puede producir imágenes de alta resolución (de hasta 3nm), los detalles muy
cercanos en la muestra pueden ser observados separadamente a alta magnificación.
 Relativamente sencilla preparación de la muestra y que se pueden observar muestras
de tamaños desde centímetros hasta del orden de nanómetros.
Limitaciones del MEB
 Por las características de funcionamiento, se requiere que las muestras sean
conductoras y que estén libres de humedad.
 No es posible observar la estructura interna y detalles ultraestructurales de las
muestras.
Aplicaciones del microscopio electrónico de barrido
 En metalurgia se emplea para la caracterización de materiales metálicos, estudio de
sus transformaciones, análisis de fallos, etc.
 En petrología y mineralogía, para la caracterización de minerales.
 En la construcción se utiliza para el estudio del cemento y de las reacciones árido-
hormigón.
 En cristalografía, para la caracterización de vidrios y materiales cerámicos mediante
el estudio de las frases, estructura cristalina, poros, bordes de grano, etc.
 En electrónica, para el estudio tanto de materiales semiconductores como de
dispositivos (control de calidad de circuitos integrados).
 En biología, para la identificación de estructuras biológicas, complejos moleculares
e incluso moléculas.
 En botánica, como ayuda para la clasificación de los diferentes grupos vegetales en
sus distintas categorías taxonómicas mediante el estudio morfológico de esporas,
pared celular, estomas, etc.

45
Partes del microscopio MiltiSEM 505/506

Figura 21. Partes del microscopio MultiSem 505/506

Fuente: Harald Fjeld, University of Olso (Noruega).

46
Marcas
o ZIGMA 300: Este es un nuevo microscopio de barrido, lo distingue porque en vez
de iluminar las muestras con partículas de luz, lo hace con un haz de electrones, como
si fuera una corriente electrónica. El haz de electrones tiene una longitud de onda muy
corta, lo cual permite ver todos los detalles a nivel nanoscópico en la superficie de la
muestra, quiere decir, la millonésima parte de un milímetro.
o HITACHI S-3700n: se adapta a gran variedad de muestras, su diseño tiene una
cámara flexible que permite el análisis analítico superior.
o HITACHI S-S-570: es una fuente de filamento de Tungsten. Cuenta con detectores
de electrones secundarios menores, y un detector de dispersión de retorno.
o EVO 15 PARA LAS CIENCIAS DE LA VIDA: de la familia ZEISS EVO, este se
puede adaptar con precisión a sus necesidades, ya sea ciencias de la vida, ciencias de
los materiales o en el aseguramiento de la calidad industrial de rutina y análisis de
fallos.
o MultiSEM 505/506: se consigue una velocidad de adquisición de hasta 91 haces de
electrones en paralelo. Esta diseñado para un funcionamiento continuo y fiable las 24
horas del día. permite obtener una imagen de 1 cm2 con un tamaño de píxel de 4 nm
en menos de 3 horas. Está equipado con un soporte para muestras que cubre un área
de 10 cm x 10 cm. Captura imágenes grandes de secciones para su posterior
reconstrucción en 3D. Examina grandes conjuntos de muestras con diferentes
tratamientos y compara los resultados.

47
Especificaciones Técnicas

Tabla 6. Especificaciones técnicas

Marca Carl ZEISS
Modelo MultiSEM 505/506
Tamaño 1250 x 1200 x 2600 mm
Tamaño de mesa y PC 1153 x 980 x 1350 mm
Altura máxima ≤ 30 mm
Peso máximo ≤ 0.2kg
Tamaño máximo en XY 100 x 100 m2
Máxima planeidad ≤500nm
Tiempo de intercambio de muestras ≤5min
Peso de mesa y PC 112kg
Sistema de operativo del controlador Windows 7 (64 Bit)
principal
Display 2 monitores, 1920 x 1080 pixel, 24”
Peso del microscopio 1700kg
Fuente: creación propia, basado en especificaciones técnicas

48
Conclusiones

El microscopio óptico convencional es uno de los más utilizados para la formación

de estudiantes principalmente en la secundaria y en la universidad, en los ámbitos de las
ciencias biológicas y la medicina. Existen diversos tipos de microscopios ópticos
convencionales, los cuales se clasifican por su cantidad de oculares (monoculares,
binoculares, trinoculares), otros poseen una cámara en lugar del ocular, este se llama
microscopio digital, o el microscopio invertido, donde la posición de la fuente de luz y la del
objetivo es opuesta a la del microscopio convencional.
También se puede recalcar el funcionamiento del microscopio de fluorescencia que
permite observar tejidos animales y vegetales por medio del proceso de fluorescencia que
conlleva desde la excitación de un átomo o molécula porque se le induce una radición
determinada para que un electrón se mueva a un próximo nivel enérgico que produce la
inestabilidad de esa molécula, por lo que se hace cumplir la ley del estado fundamental de la
materia, donde toda molécula inestable, busque nuevamente el estado basal en el que se
encontraba. Llegar a esa estabilidad, le tomará al átomo, nuevamente emitir radiación.
El microscopio electrónico de barrido se diferencia de los otros microscopios porque
este utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen. Este
microscopio también se diferencia por dar imágenes de alta resolución, esto permite que se
identifiquen muestras muy especificas. Se lograron determinar los tipos de señales emitidos
por la muestra, los parámetros que deben tener la resolución, los tipos de lentes, sistemas de
detección y los requerimientos que estos deben de tener para un mejor funcionamiento.
Conforme a todo esto se puede determinar las diferencias que tienen estos microscopios y
como cada uno tiene una función característica.

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