Pruebas Bioquímicas
Fichero de pruebas bioquímicas.
HIDROLISIS DE ALMIDON
Medio de cultivo: Agar Almidón
Sustrato: Almidón (polímero de glucosa).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Glucosa.
Revelador: Lugol.
Fundamento: El lugol con el almidón forman un complejo color
café-púrpura que desaparece cuando el almidón ha sido degradado.
DEGRADACION DE LA CASEINA
Medio de cultivo:Agar Leche Descremada
Sustrato: Caseína (proteína).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Caseinasa (Proteasa, exoenzima).
Revelador: No requiere
Fundamento: Las proteasas son excretadas al medio para la
degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que
le confiere el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada
desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano.
HIDROLISIS DE LA LECTINA Y REDUCCIÓN DEL TELURITO
Medio de cultivo:Agar yema de huevo/Agar Baird Parker
Sustrato: Lecitina.
Enzima: Lectinasa
Producto: Fosforilcolina.
Revelador: No requiere
Fundamento:Algunos microorganismos producen lecitinasa que
hidroliza la lecitina (fosfolípido). Se utiliza el agar yema de huevo.
Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su
alrededor.
LICUEFACCION DE LA GELATINA
Medio de cultivo:Gelatina nutritiva
Sustrato:Gelatina (proteica)
Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima).
Producto: Aminoacidos.
Revelador: No requiere o puede emplearse el carbón activado
en polvo.
Fundamento:La gelatina es una proteína que tiene la
capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa
en los aminoácidos que la componen pierde su característica
de gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten la
visualización macroscópica como la gelatina adherida a
carbón activado.
FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Medio de cultivo: Medio base rojo de fenol más carbohidrato o
polialcohol, con campana de fermentación (Durham).
Sustrato:Carbohidrato o polialcohol.
Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima).
Vía: Fermentativa.
Indicador: Cualquier indicador de pH.
Fundamento: Los compuestos de carbono (carbohidratos o
polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren de ser
degradados en monómeros y transportados a la célula para
posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía
fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto orgánico
se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formación de gas
capturado en la campana de fermentación.
OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN
Medio de cultivo: Hugh and Leifson
Sustrato:Carbohidratos
Enzima: Fermentativa y/u Oxidativa.
Vía: Fermentativa y/u Oxidativa.
Producto: Acido pirúvico.
Indicador: Azul de bromotimol u otro indicador ácido/base.
Fundamento: Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos
procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia
es la necesidad de oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por
prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con
aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno.
La fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza las vías de
la Glucólisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas fosfato y
Entner-Doudoroff.
ROJO DE METILO / VOGES PROSKAUER
Medio de cultivo: Caldo RM/VP
Sustrato:Glucosa.
Vía: Fermentación ácida o neutra.
Producto: Acido orgánicos o acetoína
Indicador: Solución de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%.
Fundamento: Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos
orgánicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio
(viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por
debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato
formadas, reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan para formar
ácido acético y fórmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del fórmico
a CO2 y H2 en cantidades iguales, Fermentación butilenglicólica: en ésta,
parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido
láctico, fórmico y acético, la mayor parte del piruvato se condensa
formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol,
productos que son neutros.
Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba de Voges-
Proskauer): Se agrega un poco de α-naftol al 5% en etanol (medio adquiere
aspecto lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que desaparece el aspecto
lechoso, se agita fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la
parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración).
.
UTILIZACION DEL CITRATO
Medio de cultivo: Medio de Citrato de Simmons
Sustrato: Citrato de sodio.
Vía: Varias dependientes del pH del medio.
Producto:Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato,
CO2, lactato/Acetoína y CO2 en condiciones ácidas.
Indicador: Azul de bromotimol.
Fundamento: Un microorganismo que puede utilizar el citrato
como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio
del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de
nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
MEDIO SIM (SULFHÍDRICO INDOL MOVILIDAD)
Medio de cultivo: Medio SIM (medio semisólido)
Sustrato: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano.
Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína
desulfurilasa-
Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y tiptofanasa.
Producto-H2S e Indol.
Revelador:Sales de Fe
2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído
(DMABA).
Fundamento:En presencia de tiosulfato en el medio o la
degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados,
algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las
enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas
incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para
producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso
metálico.
AGAR DE HIERRO KLIGER (KIA)
Medio de cultivo: Agar hierro de Kligler
Sustrato: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos –SH de
la cisteína.
Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína
desulfurilasa-
Producto-Ácidos mixtos y H2S
Indicador:Rojo de fenol y sales de Fe
2+ .
Fundamento: En presencia de tiosulfato en el medio o la
degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados,
algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las
enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas
incoloro H2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el
citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro
insoluble de sulfuro ferroso metálico.
El medio de Kligler está diseñado para la identificación de
enterobacterias y otras bacterias Gram negativas.
UREASA
Medio de cultivo: Caldo urea o agar urea de Cristensen.
Sustrato: urea
Enzima: ureasa
Producto Amoniaco
Indicador:Rojo de fenol.
Fundamento:La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera
dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se
vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba
positiva es color bugambilia.
DESCARBOXILASAS
Medio de cultivo: Medio base de descarboxilasas u otros medios
como LIA o MIO
Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina).
Enzima:Descarboxilasas
Producto Amoniaco
Indicador:Púrpura de bromocresol. .
Fundamento:Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se
convierten en diaminas lo que incrementa el pH del medio y el
indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las
descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias.
REDUCCIÓN DE NITRATOS.
Medio de cultivo:Caldo nitratos
Sustrato: Nitrato de sodio.
Enzima: Nitrato reductasa.
Producto Nitritos
Revelador:Reactivos de Griess.
Fundamento: El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido
sulfanílico y dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La reacción de
color se debe a la formación de un compuesto diazonio, p-
sulfobenceno-azo- α-naftilamina. Cuando la prueba resulta
negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir
químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los
reactivos de Griess el compuesto colorido.
PRUEBA DE LA COAGULOSA
Medio de cultivo:Plasma de conejo
Sustrato: Factores de la coagulación
Enzima:Coagulasa (estafilocoagulasa).
Producto:Coagulo
Revelador:No requiere
Fundamento: La enzima producida por S. aureus es excretada al
medio extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta
enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el
plasma y formar un coagulo visible
OXIDASA.
Medio de cultivo:Nutritivo
Sustrato:Compuesto reducido.
Enzima:Oxidasa.
Revelador:Compuesto oxidado.
Revelador: Reactivo de Kovacs, diclorhidrato de tetrametil-p-
fenilendiamina (TPD) al 1%, solución incolora
Fundamento:Se basa en la producción bacteriana de una enzima
oxidasa intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de
citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido
por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor
de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de
electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del
reactivo incoloro en pocos segundos formándose un producto
colorido
