26 de agosto 2020
Antioxidantes como parte fundamental de productos funcionales
Laura Valentina Buendia ; Michelle Ramirez Buitrago
Estudiantes de pregrado ingeniería química. Universidad de la Sabana. Chía, Colombia
Abstract
The principal objective in this practice is to quantificate the concentration of ascorbic acid,
Vitamin C, in fruits in this case more specifically in feijoa by the use of spectroscopy. Our
strategy to determine the concentration in each tube was the use of a calibration curve, using
rightly the concept of absorbance. It is shown in this practice that
Introducción
Los radicales libres son aquellos que atacan las células saludables de un organismo
provocando la pérdida de su función y de su estructura. La formación de los radicales libres
se puede controlar gracias a los antioxidantes los cuales son capaces de desactivarlos antes de
que ataquen a las células. Se pueden encontrar los antioxidantes derivados de nutrientes tales
como la vitamina C o ácido ascórbico, carotenoides, y otros compuestos de bajo peso
molecular. (Percival M. 1998).
Los antioxidantes son sustancias que se utilizan para preservar el alimento del deterioro o de
la decoloración debido a la oxidación, se pueden encontrar los que inhiben la formación de
radicales libres como donantes de hidrógeno y los que interfieren en la cadena de radicales
libres al formar compuestos más estables. Dependiendo de su modo de acción se pueden
clasificar como antioxidantes primarios o secundarios, los primarios son aquellos que
reaccionan con los radicales formando productos más estables y los secundarios son aquellos
que reducen la velocidad de la reacción de iniciación. (Eskin y Przybylski, 2000).
La vitamina C o ácido ascórbico es un ácido con propiedades antioxidantes que actúa como
cofactor enzimático el cual está implicado en reacciones fisiológicas importantes. (Pérez,
2010) La vitamina C es de vital importancia para el correcto funcionamiento del organismo,
su consumo previene o disminuye el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, cáncer,
escorbuto, resfriados y entre otras enfermedades. La cantidad diaria de consumo varía según
la edad y sexo entre rangos de 15 mg a 90 mg aunque los fumadores deben añadir 35 mg más
a su dieta para poder combatir los radicales libres que genera el humo del cigarillo
(Jackson,2011).
La acción de la vitamina C es suministrada por el ácido L-ascórbico (AA) y su forma
oxidada, el ácido dehidroascórbico (DHAA) (Ledezma-Gairaud, 2006). Para esta práctica de
laboratorio es necesario examinar los antioxidantes derivados de nutrientes como la vitamina
C mediante la preparación de soluciones problemas y de una curva de calibración con el fin
de obtener la concentración de las muestras problemas y de los diferentes tubos,
reconociendo el comportamiento del antioxidante empleado bajo condiciones de aditivos,
radicales libres, productos funcionales y oxidaciones, para finalmente, interpretar
correctamente los resultados obtenidos comparando con los esperados y literatura.
La feijoa es una fruta exótica de sabor ácido y dulce, tiene alto contenido de vitamina C,
aporta una alimentación rica en nutrientes, para prevenir algunas enfermedades, gracias a sus
propiedades medicinales actúa como anticancerígeno, antiviral, antimicrobiano, antioxidante
y también funciona como preventivo de gastritis y ulceras. La feijoa tiene una actividad
contra bacterias que junto con sus características antioxidantes permite considerarlo como
materia prima para la producción de nuevos medicamentos ( Ortega, 2017).
Metodología
Preparación de las soluciones problemas
Solución al 10% muestra vegetal a estudiar
Para la solución al 10% de feijoa se peso 1 g y se macero en 10 ml de ácido
oxálico (0,15%), se filtró con gasa y se recibe este filtrado en un matraz
cubierto totalmente de papel aluminio. Se determina la densidad pesando un
ml del filtrado.
Solución problema diluida (P2)
se agregó 1 ml del filtrado o centrifugado a 9 ml de ácido oxálico (0,15%), la
prueba para los tubos problema (P) se realizó por triplicado (ver anexo 1).
Determinación de la absorbancia
Como se trata de una muestra sólida, se añade 1 ml de filtrado, diluido y sin
diluir (tubos 7-12) en lugar de la solución patrón (tubos 1-6), de esta manera
se determina la absorbancia.
Preparación de la curva de calibración
Para la preparación de la curva es necesario resaltar que esta se prepara con los
tubos 1 al 6 (los tubos 7-12 son las muestras problema a las que se les adiciona
reactivos simultáneamente).Se prepararon las soluciones en los tubos como
indica la tabla 1 (ver anexo 1), se mezcló y se aseguró que el medio fuera
ácido. Después de dejar reposar 10 minutos, se añadió lo descrito en la tabla 2
(ver anexo 1), se mezcló bien, se dejó reposar por 20 minutos y se aseguró
que el pH fuera básico. Finalmente se agrega lo descrito en la tabla 3 (anexo
2), nuevamente se mezcla bien, se observa que el pH sea básico y de manera
seguida se mide la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm.
Resultados
Tabla 1. Datos Feijoa.
Fuente vitamina C Feijoa
Peso cápsula vacía (g) 11,5647
Peso cápsula con fruta (g) 12,5698
Para determinar el peso de la fruta de feijoa se restó el peso de la cápsula con fruta con el
peso de la cápsula vacía.
Peso de la fruta: 1,0051 g
Inicialmente se tiene 1 litro de solución de ácido oxálico a 0,15% p/v y se le adicionan 500
mg de vitamina C. Se obtiene como concentración de la solución patrón 2,84 x10-3M.
Para determinar la concentración de cada tubo, se realizó con la ecuación C1V1 = C2V2 donde
C1 es
la concentración patrón de la solución de ácido ascórbico (2,84x10-3M) , V1 es el
volumen inicial de ácido patrón de cada tubo (L), V2 es
el volumen final de cada tubo (0,01L)
y C2 es
la concentración que vamos a determinar.
Tabla 2. Datos para la realización de la curva de calibración.
Tubo Volumen adicionado Concentración (M) Absorbancia (540 nm)
de ácido ascórbico (L)
1 0,0001 0,0000284 0,153
2 0,0002 0,000056 0,337
3 0,0004 0,0001136 0,651
4 0,0006 0,0001704 0,790
5 0,0008 0,0002272 0,957
6 0,001 0,000284 0,153
Figura 1. Curva de calibración.
Tabla 3. Promedio de las absorbancias de las muestras problemas.
Tubo Absorbancia (540 Promedios de
nm) absorbancia (450 nm)
P7 Pprom (Muestra sin
0,427 diluir)
P8 0,326 0,386
P9 0,405
P10 Pprom (Muestra diluida)
0,101
P11 0,114 0,1013
P12 0,089
Con la ecuación de la recta se determinó la concentración patrón con reacción, teniendo en
cuenta que y es el promedio de la absorbancia de las muestras problemas (no diluida y
diluida) y x es la concentración que queremos determinar:
y = mx + b
x=
Tabla 4. Concentración determinada con la curva de calibración y el promedio de la absorbancia de las muestras problemas.
Concentración muestra sin diluir (M) 0,0000708
Concentración muestra diluida (M) -0,00000111
Como la concentración de la muestra diluida da negativo, se desprecia dicho valor y la
concentración de la muestra sin diluir se pasa a unidades de:
a. m
g de ácido ascórbico/100 ml de jugo.
0,0000708 * (* (* ( = 0,012469
b. m
g de ácido ascórbico/100 g de fruta.
Tabla 5. Concentración de ácido ascórbico en las unidades correctas.
Concentración de ácido ascórbico (mg/100 ml de 1,247
jugo)
Concentración de ácido ascórbico (mg/100 g de 1,241
fruta)
Concentración de ácido ascórbico en Unidades 24,94
Internacionales (UI/100 mL muestra)
Para determinar el coeficiente de extinción molar se utilizó la ley de Lambert-Beer utilizando
como valor de concentración la de la muestra sin diluir, el promedio de la absorbancia para la
muestra sin diluir y la altura del pozo proporcionada por la guía, de la siguiente manera:
A = ε·c·l
ε =
Análisis y discusión
Inicialmente, respecto a la determinación de Vitamina C en las muestras problema,
esta se llevó a cabo por medio de la construcción de una curva de calibración, se realizó por
medio del cálculo de la absorbancia en diferentes patrones que tenían diferentes
concentraciones de ácido ascórbico. Como se puede observar en la figura 1, en la ordenada
se trató la absorbancia, mientras que en la abscisa la concentración molar de las soluciones
patrón. La gráfica nos permitió determinar una ecuación de la recta, donde “Y” es la
absorbancia, “X” la concentración, la pendiente se puede aproximar como el coeficiente de
extinción molar. En un inicio el valor del coeficiente de determinación era menor a 0,95 por
lo que se decidió eliminar el último dato de concentración generando así un valor aceptable
para el coeficiente (mayor a 0,95) . No obstante, como se puede observar en la figura 1,
existe cierta desviación entre los puntos, esto se debe a que ciertos tubos cuentan con una
mayor concentración de ácido ascórbico, lo cual se pudo desarrollar por distintos factores
experimentales.
Un aspecto a resaltar son los valores de absorbancia obtenidos en la tabla 5,
comparando los valores con los expuestos en la tabla 2 (como absorbancia patrón) se puede
observar que la absorbancia para las muestras diluidas es bastante menor a los valores de
absorbancia patrón, por lo cual es posible decir que la recta no fue lo suficientemente apta
para determinar la concentración de la muestra diluida. Acerca de la absorbancia de la
muestra sin diluir, la diferencia no es de gran tamaño.
Con respecto a la tabla 4 se obtuvo un valor de concentración negativo para las
muestras diluidas, por lo cual fue necesario descartar dicho dato debido a que no se pueden
presentar concentraciones negativas en una sustancia, como se mencionó anteriormente, la
curva no abarca todas las concentraciones, por lo que al no ser tan amplia no acoge el dato de
concentración de muestra diluida. Sin embargo, se esperaba que la concentración de ácido
ascórbico en la muestra diluida fuera mayor que en las sin diluir, ya que el ácido oxálico es
recomendado para la estabilización del ácido ascórbico durante la extracción (Ponting,1943).
como se observa en la tabla 5 se obtuvo los valores de concentración de ácido ascórbico
teniendo en cuenta la concentración de la muestra sin diluir dando como resultado 1,241 mg
de ácido ascórbico / 100 g de feijoa. Al comparar lo obtenido con la literatura, se reportan
para la feijoa 40 mg / 100 g de feijoa (Pirazan,2019). Contrastando con nuestros resultados,
nos da un porcentaje de error del 97%, esto se pudo presentar debido a diferentes factores
experimentales, tales como no cubrir de manera correcta los tubos de ensayo con el papel
aluminio por lo cual la muestra estuvo en contacto con la luz solar, cabe resaltar que la
vitamina C es termosensible y su degradación térmica se debe a la apertura o cierre del anillo
de lactona y la formación de compuestos aquirales (Mendoza). A su vez existen tres rutas
para la degradación de ácido ascórbico: la vía oxidativa catalizada, donde hay transferencia
de dos electrones, la vía bajo condiciones anaeróbicas y finalmente la vía oxidativa no
catalizada, donde el oxígeno molecular ataca directamente el mono anión ascorbato, abriendo
el anillo de lactona (Mendoza, 2017). En este caso creemos se generó la tercera oxidación
descrita ya que esta tiene una energía de activación muy baja y se puede dar en temperatura
ambiente (Pelichotti, 2012). Siendo esta y la entrada de la luz a la muestra las que creemos
los principales factores que afectaron las medidas, aunque no se descartan como factores la
mal medición con las micropipetas u otra medida tomada que no haya sido realmente exacta.
Finalmente para el cálculo del coeficiente de extinción molar, se aplicó la ley de
Lambert-Beer donde se tomaron los valores absorbancia promedio de la tabla 3 y de
concentraciones promedio, de la tabla 4 donde el valor encontrado fue de 5451,98 M-1 cm-1.
Sin embargo, otra manera de determinar el valor del coeficiente, es por la ecuación de la recta
(ver figura 1) donde se aproximó la pendiente al valor del coeficiente de extinción molar,
dándonos como resultado un valor de 3961,4 M-1 cm-1.Se evidencia claramente la diferencia
de valores no obstante esto se debe a que para el cálculo del primer valor se tomaron las
concentraciones y la absorbancia solo de la mezcla sin diluir, teniendo en cuenta que fue con
estos valores con los que se realizó la concentración de ácido ascórbico (ver tabla 5), por
motivos ya mencionados antes. Cabe resaltar que la información en la literatura del
coeficiente de extinción del ácido ascórbico es escasa por lo que no se logró comparar con los
resultados obtenidos.
Conclusiones
Se logró encontrar la cantidad de vitamina C presente en la muestra problema, presentándose
un porcentaje de error del 97% entre el valor de la concentración (ácido ascórbico)
experimental que fue de 1,241 mg / 100 g y la teórica que fue de 40 mg / 100 g de feijoa, por
lo tanto se tuvo en cuenta propiedades de la vitamina C, como su termosensibilidad y su
capacidad oxidante.
Asimismo, la concentración de ácido ascórbico en la muestra diluida presentó un valor de
-0,00000111 M, el cual al ser negativo no fue tomado en cuenta, esto se debe a que la curva
de calibración no abarcó todas las concentraciones y de esta manera no acogió el dato de
concentración de muestra diluida.
Fue posible comprobar el uso de la ley de Lambert-Beer y de la ecuación de la recta para el
cálculo del coeficiente de extinción molar obteniendo los valores de 5451,98 M-1 cm-1 y
3961,4 M-1 cm-1 respectivamente. La diferencia de resultados se debe a los datos con los que
se calculó el coeficiente por lambert beer donde solo se tuvo en cuenta los datos trabajados
(muestra sin diluir)
Es recomendable tener conocimiento acerca del estado de la muestra y de cómo se trataron
los datos recolectados, permitiendo así una explicación más profunda y certera acerca del
porcentaje de error.
Bibliografía
Abril Diaz, N., Barcena Ruiz, A., Fernandez Reyes, E., Galván Cejudo, A., Jorrin Novo, J.,
Peinado Peinado, J., Toribio Meléndez-Valdés, F. and Túnez Fiñana, I., n.d.
Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
Córdoba: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, pp.3-8.
Eskin, N.A.M. y R. Przybylski. 2000. Antioxidants and Shelf Life of Foods. En: N. A. M.
Eskin y D. S. Robinson (eds.). Food Shelf Life Stability: Chemical, Biochemical and
Microbiological Changes. CRC Press, Boca Ratón, Florida Fennema, O. R. 1996. Food
Chemistry. Marcel Dekker, Inc., New York
Jackson, C., 2011. Vitamin C. Hauppauge, N.Y.: Nova Science Publishers, pp.1-12.
Ledezma-Gairaud M. 2006. Validación del método: Determinación de vitamina C total por
cromatografía líquida de alta resolución “HPLC”. Tecnología en marcha. Vol. 17-4.
Mendoza-Corvis FA, Arteaga-Márquez MR, Pérez-Sierra OA. 2017. Degradación de la
vitamina C en un producto de mango (Mangifera indica L.) y lactosuero. Corpoica Cienc
Tecnol Agropecu Ria. 18(1):125-137
Ortega, V. (2017). Desintoxica tu cuerpo con la feijoa. El Espectador.
<https://www.elespectador.com/cromos/estilo-de-vida/desintoxica-tu-cuerpo-con-la-feijoa/.>
Pérez,G.(2010). Ácido ascórbico. Acidoascorbico.com. Available at:
<https://www.acidoascorbico.com.>
Percival M. 1998. Antioxidants. Clinical Nutrition Insights.Nut031 1/96 Rev.10/98
Pelichotti, S. (2012). “Determinación de vitamina C en jugo de naranja expuesto a
distintas condiciones”. Facultad de ciencias exactas. Cátedra química analítica.
Pirazan, Y., Perez, J., Padilla, M. and Ayala, A., 2019. EXTRACCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE VITAMINA C (ÁCIDO ASCÓRBICO) ENFEIJOA (Acca
sellowiana Berg), JUGO COMERCIAL SOKA, PASTILLA CEBIÓN YMUESTRA
PROBLEMA POR MÉTODO COLORIMÉTRICO. Bogotá: Universidad Distrital Francisco
José De Caldas, p.8.
Ponting, J., 1943. Extraction of ascorbic acid from plant materials. In: ACS, 15th ed. Ind.
Eng. Chem. Anal., p.389.
Anexo 1. Tablas de volúmenes de los reactivos empleados en la metodología.
Tabla 1: Volúmenes de reactivos (2-nitroanilina y nitrito de sodio) para preparar curva de
calibración (tubos 1-6) y muestras problema (P) (tubos 7-12)
Reactivo B 1 2 3 4 5 6 P
7 8 9 10 11 12
2-nitroanilina 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
(ml)
Nitrito de 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
sodio (ml)
Tabla 2: Volúmenes de reactivos (etanol absoluto, patrón ácido ascórbico y ácido oxálico)
para preparar curva de calibración (tubos 1-6) y muestras problema (P) (tubos 7-12)
Reactivo B 1 2 3 4 5 6 P
7 8 9 10 11 12
Etanol 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8
absoluto
(ml)
Patrón - 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - - - - - -
ácido
ascórbico
(ml)
Filtrado - - - - - - - 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
(ml)
Ácido 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 - - - - - - -
oxálico
(ml)
Anexo 2. Tablas de volúmenes de los reactivos empleados en la metodología.
Tabla 3: Volúmenes de reactivos (NaOH y Agua destilada) para preparar curva de
calibración (tubos 1-6) y muestras problema (P) (tubos 7-12)
Reactivo B 1 2 3 4 5 6 P
7 8 9 10 11 12
NaOH 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
10% (ml)
Agua 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7
destilada
(ml)
