UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA
ASIGNATURA: BIOLOGIA MOLECULAR
ACTIVIDAD DE APRENDIZAJE: DNA RECOMBINANTE

Nombres__________________________________________________________________

1.-Describe los pasos de la formación de ADN recombinante, rellenando los espacios en

blanco con los terminos adecuados según corresponda.

ADN ADN recombinante complementarias Cortan cuatro distintas

dos Enzimas de restricción escalón extremos extremos cohesivos
fosfodiéster fragmentos de restricción Ligasas no apareadas
ocho puentes de hidrógeno puntos de restricción Reconocen secuencias
específica selladoras separan una Unen unión

Se llama ADN recombinante a cualquier molécula de ADN formada por la UNION de

segmentos de ADN de DISTINTAS fuentes.

Las herramientas básicas para su construcción son:

-ENZIMAS DE RESTRICCION , que actúan de la siguiente forma:

1. RECONOCEN  en el ADN SECUENCIAS ESPECIFICA ,

de CUATRO a OCHO nucleótidos, llamadas PUNTOS DE RESTRICCION .

2. CORTAN  y SEPARAN las cadenas de ADN. 

El corte se realiza en forma de ESCALON  entre DOS nucleótidos concretos,

formando FRAGMENTOS DE RESTRICCION .

Las cadenas formadas tienen EXTREMOS  con UNA sola cadena, llamados EXTREMOS

COHESIVOS  que presentan bases NO APAREADAS que pueden formar PUENTES DE
HIDROGENO con otras secuencias de nucleótidos COMPLEMENTARIAS de una SOLA
CADENA
- LIGASAS del ADN (enzimas SELLADORAS)

3. UNEN  los extremos de los fragmentos de ADN, mediante la creación de

enlaces FOSFODIESTER  en los puntos de unión, formando ADN RECOMBINANTE.

2.- PROCESO DE CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA EN UN PLÁSMIDO

Empareja cada paso observado en el esquema superior de la clonación de un fragmento de

DNA en un plásmido, con el proceso correspondiente.

ADN DADOR
 ADN RECOMBINANTE

VECTOR DE CLONACION

PLASMIDO
RECOMBINANTE,CON UN GEN
RESISTENTE AL ANTIBIOTICO
CULTIVO DE BACTERIAS

TRABSFORMACION

CADA BACTRIA PUEDE

INCORPORAR COMO MAXIMO
UN PLASMIDO RECOMBINANTE

BACTERIA NO TRANSFORMADA

ES ELIMINADO EN UN MEDIO
DE CULTIVO CON ANTIBIOTICO
BACTERIA TRANSFORMADA

SOBREVEVIBE EN JUN MEDIO DE

CULTIVO CON ANTIBIOTICO

DUPLICACION

CLONES DE BACTERIAS
TRANSFORMADAS

TODAS LAS BACTERIAS TIENEN

EL MISMO PLASMIDO
RECOMBINANTE

OBTENCION DEL CELULA DNA INSERTO MOLECULA DE CELULA

GEN INSERTO HOSPEDERA DNAr COMPETENTE
E.coli
DUPLICACION DEL BACTERIA CLONES DE INTRODUCCION SITIOS DE
DNAr TRANSFORMADA BACTERIAS DEL DNAr A LA RESTRICCION
TRANSFORMADAS BACTERIA EN EL GEN
INSERTO
3.-ORDENA CORRECTAMENTE LAS FRASES SIGUIENTES, PARA OBTENER LA DEFINICIÓN DE
CLONACIÓN.

La clonación consiste en la obtención de ADN idénticas de dicho fragmento de

muchas copias de un fragmento

LA_CLONACION_DE_UN_FRAGMENTO_DE_ADN_CONSISTE_EN_LA_OBTENCION_DE_MUCHA
S_
COPIAS_IDENTICAS_DE_DICHO_FRAGMENTO_______________________________________
______

4. Ordena correctamente las frases siguientes, para obtener una definición de vector de
clonación y dierenciar sus tipos.

Capaz de entrar en una bacteria, una molécula de ADN pequeña de

bacterias respectivamente de vectores de clonación: artificiales de
levaduras y YAC y BAC que son cromosomas son mayores y los
Cósmidos, cuando los fragmentos normalmente Escherichia coli, y
Existen diversas clases fragmentos pequeños de ADN. de autoduplicarse en
ella. capaces de transportar Un vector de clonación es
Plásmidos y virus bacteriófagos

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5.- A continuación se presenta un esquema general para construir un clon de moléculas de
ADN recombinante utilizando plásmidos y endonucleasas de restricción.

Observar y completar los recuadros del esquema utilizando los términos que figuran al pie del
mismo.

Cortes con enzimas de restricción

Unión del inserto al vector(DNA ligasa)

Molécula de ADN recombinante

Introducción del DNAr a  célula hospedera 

Cromosoma bacteriano

Selección de las células con DNA recombinante

Multiplicación clonal de bacterias

recombinantes
Bacteria más vector  Unión del inserto al vector(DNA ligasa)
Introducción del DNAr a  Vector plasmidico
célula hospedera 

Cortes con enzimas de Sitios de restriccion

restricción
Cromosoma bacteriano Molécula de ADN recombinante

Multiplicación clonal de Selección de las células con DNA recombinante

bacterias recombinantes
6. Síntesis de DN complementario. Usar los términos siguientes para completar los pasos
para la obtención de cDNA

DNA      DNA complementario      DNA polimerasa      ADNc      ARNm      ARNm      ARNm
maduros      cadena doble      cadenas sencillas      clonación      complementario      continuas
intrones      maduración      mayor      menor      sencilla      transcripción      transcriptasa
inversa      vectores de clonación

Los pasos para la obtención de clones de ADNc son:

1. Se extraen los ARNm maduros  de una célula. 

2. Por la acción del enzima transcriptasa inversa   , se obtiene una molécula de ADN
complementario  de cadena sencilla.
3. La DNA polimeraza utiliza las cadenas sencillas de ADNc como molde para la
síntesis de moléculas de cadena doble.
4. El ADN se inserta en vectores de clonacion y se someten al proceso de clonacion.

La colección completa de clones derivada de todos los ARNm de una célula, forman

la biblioteca de ADN complementario, caracteriza por:

- Los clones no posee intrones , que son eliminados en el proceso

de maduracion del ARNm.

- Los clones están formados únicamente por secuencias codificantes continuas.

- Se obtiene mayor número de los genes que tienen un mayor grado de transcripcion,

que de los genes que poseen un grado menor

7.- Completar la definición de Enzimas de restricción, usando los términos siguientes

bacterias circulares Cohesivos degradado diana de restricción Endonucleasas

enzima de restricción exógeno ligasas molécula Plásmidos puentes de
hidrógeno Romos vector

Una  es una enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro
de una molecula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de
restriccion. Las dianas de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, que suelen ser
palindromes.

También conocidas como enzimas de Restricción, lo que hacen realmente es romper 2

enlaces fosfodiester en la doble cadena, dando lugar a dos extremos del DNA, que pueden
ser romos ( cuando los enlaces rotos coinciden) o cohesivos / escalonados. Estos últimos
tienen más tendencia a volver a unirse de modo espontáneo utilizando los puentes de
hidrogeno entre las bases ( Apareamiento de Watson & Crick)

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas
llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse
independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo
de vectores están los plasmidos, moléculas circulares de ADN halladas en las vacterias.

Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan in vivo como
parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema es análogo a
un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio ADN y el
ADN exógeno, siendo este último degradado por la enzima de restricción. El ADN propio no
es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por
metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos
metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas).

8.- Alicuotas de una muestra de DNA  fue sometido a digestión con dos enzimas de
restricción: 1=EcoRI y 2=PstI. Se incubó por separado con cada enzima de restricción 1 y 2
y luego con ambas. Se sometió a electroforesis en gel de agarosa obteniéndose las
siguientes bandas:

          Enzima 1:      1 banda de 45 Kb y una banda de 15 Kb

          Enzima 2:      1 banda de 43 Kb, 1 de 10 Kb y 1 7 Kb

          Enzima 1 y 2:   1 banda de 35 Kb, 1 de 10 Kb, 1 de 8 Kb y 1 de 7 Kb

a) EL siguiente esquema representa el mapa de restricción lineal: coloca el tamaño de

cada fragmento indicando la enzima correspondiente.

1=EcoRI

2=PstI

10kb 35kb 7Kb 8Kb

b) Cuál de las siguientes corridas electroforéticas representa este mapa. Justificar

B) La disposición de bases con las sgtes bandas corresponde ala posición que tiene la
figura B

9. Se desea obtener trigo transgénico que sea resistente al ataque de un hongo. Al

investigar en publicaciones científicas se halló que la cebada tiene genes de resistencia,
entonces se decidió clonar esos genes de la cebada para luego utilizarlos en la obtención
del trigo transgénico. Se buscó en bases de datos la secuencia del gen de la cebada para
analizar con qué enzimas de restricción podría cortar el gen de interés, el resultado de su
análisis se encuentra en la fig 1.

Una vez cortado el gen de interés deberá insertarlo dentro del vector de clonacion que
se muestra en la figura 2, para lo cual deberá cortar en el sitio de clonación múltiple
cortando con alguna enzima de restricción. ¿Qué enzima/s habrá elegido? ¿Por qué?, y
cual será la estrategia de unión entre ambas moléculas para obtener la molécula de DNA
recombinante?
10.- Enlazar lo que aparece a la derecha con su correspondiente de la izquierda.

1. Introducción del ADN en el interior celular con micromanipuladores. F a)Biolistica

2. Introducción del ADN con descargas eléctricas. E b)Transduccion

3. Se utiliza un virus para introducir el ADN. B c)Competentes

4. El transportador del ADN es un liposoma. D d)Lipofeccion

5. Introducción del ADN en el interior celular con microproyectiles de e)Electroporacion
DNAr A

6. Variación de la permeabilidad de las membranas celulares por f)Microinyeccion

diferentes tratamientos. C