10 de Septiembre 2020

Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis de las proteínas de la leche

Laura Valentina Buendia; Michelle Ramirez Buitrago
Estudiantes de pregrado ingeniería química. Universidad de la Sabana. Chía, Colombia

Abstract

The principal objective in this practice was to identify the proteins found in the milk, more
specifically the casein, through different techniques to quantify and analyze correctly the
results, like spectroscopy and electrophoresis. In turn it was verified that the amount of protein
depends on the fat found in the milk, in this way it was proved that the whole milk sample
presented more concentration of casein (protein) compared to the samples of lactose free and
purified milk. Also, it was also verified the electrophoresis technique to identify the proteins
in the samples, nevertheless it is a sensible technique that can be affected by experimental error.

Introducción

La nutrición es el estudio de los procesos orgánicos donde los seres humanos obtienen energía
de los alimentos y bebidas para el desarrollo óptimo de todas sus funciones vitales, crecimiento
y mantenimiento. Este proceso cuenta con tres partes; la primera es el consumo de alimentos y
bebidas, la segunda es el rompimiento de esos nutrientes y la tercera es el viaje de esos
nutrientes a través del torrente sanguíneo a diferentes partes del cuerpo para ser usados como
“combustible” (Miller, 2001). Los alimentos deben contener nutrientes como los lípidos,
proteínas, vitaminas, minerales y glúcidos para obtener una adecuada nutrición. Pueden ser
clasificados con base en su valor nutritivo, estos alimentos se dividen en energéticos donde se
pueden encontrar los glúcidos y los lípidos, reguladores donde se encuentran las vitaminas,
minerales y el agua y reparadores donde se destacan las proteínas (Miller, 2001). Las proteínas
son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos que participan en funciones
como la catálisis, la regulación metabólica, el transporte, la defensa y sirven como material
estructural en todos los organismos vivos (McKee & R. McKee, 2014).

La leche es uno de los alimentos más importantes que deben estar en la dieta de los seres
humanos, debido a que contiene vitaminas, minerales, proteínas, carbohidratos y lípidos.
Existen tres clases de proteínas presentes en la leche como la caseína, lacto albúminas y lacto
globulinas. En las proteínas presentes en la leche, la caseína representa cerca del 77% al 82%
y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína es una proteína conjugada de la leche
del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca; la
mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina
y treonina. La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-
caseína. La fosfoproteína es un grupo de proteínas que están unidas químicamente a una
sustancia la cual contiene ácido fosfórico (Miller, 2001). Por otro lado, la β-lactoglobulina es
la proteína que se encuentra en mayor proporción en el lactosuero de la leche (de vaca) y es
también la mayor fuente de grupos sulfhídricos (Parra, 2009). La α-lactoalbúmina es la segunda
proteína que se encuentra en mayor proporción, no posee grupos sulfhídricos libres
(Kramn,2003).

Para esta práctica de laboratorio es necesario identificar de manera correcta las proteínas que
contiene la leche y analizarlas por medio de métodos de cuantificación y aislamiento a través
de la determinación del punto isoeléctrico de la caseína mediante la absorbancia y el pH, el
análisis del rendimiento de extracción de la caseína, el reconocimiento del método más
adecuado para el análisis de proteínas utilizando espectrofotometría y electroforesis, para
finalmente, interpretar correctamente los resultados obtenidos comparando con los esperados
y literatura.

El punto isoeléctrico es el valor de pH donde las proteínas tienen una carga neta igual a cero.
En el punto isoeléctrico se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo
que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad
y facilitar su agregación (Miller, 2001).

(𝑃𝑘𝑎1 + 𝑃𝑘𝑎2)
PI = [Ecuación 1]
2

La electroforesis es una técnica utilizada para separar fragmentos de macromoléculas, de

acuerdo a su tamaño y carga las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones.
Dicha técnica consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas
de interés y es utilizada para determinar qué proteínas existen en una solución a partir de un
patrón de peso molecular (Academy, 2017).

La leche entera Alquería es una bebida de gran valor nutricional que contiene todos los
carbohidratos, proteínas, minerales y vitaminas de la leche y aporta micronutrientes como la
vitamina A y minerales como el calcio (Alquería, n.d.).

Finalmente, el método de Biuret se basa en la formación de un complejo coloreado entre el

Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. La intensidad de coloración
es directamente proporcional a la cantidad de proteínas y la reacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y por lo tanto,
se recomienda sólo para la cuantificación de proteínas en soluciones muy concentradas
(Fernández Reyes & Galván Cejudo, n.d.)
Metodología

Aislamiento de caseína
Se calentó en un vaso de precipitado agua destilada a una temperatura de 38°C y se
añadieron 50 ml de leche. De manera seguida se agregó con agitación, gota a gota ácido
acético al 1N, hasta que se observó un precipitado. Se centrifugó por 2 minutos a 5000
rpm y se guardó el sobrenadante nombrándolo como solución A. Además, se lavó el
precipitado con 20 ml de etanol. Se centrifugó nuevamente (de nuevo a 2 minutos a
5000 rpm) y se guardó el sobrenadante nombrándolo como solución B.
Finalmente se adicionaron 10 ml de éter etílico y se volvió a centrifugar, se desechó el
sobrenadante, y se extrajo la caseína (precipitado blanco), adicionalmente se secó la
caseína y se pesó para determinar el rendimiento.

Preparación de solución de caseína

Se colocaron 250 mg de caseína en un vaso de precipitado de 50 ml, de manera seguida
20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH al 1N y se agito hasta que se completó la
disolución total de la caseína.
Una vez ya disuelta la caseína se vertió en un matraz aforado de 50 ml, se adicionaron
5 ml de ácido acético al 1N y se diluyó con agua destilada hasta 50 ml. Se guardó una
muestra de la caseína solubilizada como solución C.

Determinación del punto isoeléctrico de la caseína

Se colocaron en 10 vasos limpios los volúmenes expresados en la tabla 1 (ver anexos
1). Se midieron los pH de los vasos, los cuales al ser correctos se encontraban en un
rango de 3 y 6,5. Adicionalmente se añadió 1 ml de solución de caseína a cada vaso,
donde se gastó aproximadamente 10 ml de la solución de caseína. Se agitó suavemente
y se esperó cerca de 3 minutos, luego se midió a 640 nm con cubetas de colorimetría
de 1cm óptico. Se anotaron los resultados.

Cuantificación de proteínas de la leche

Se prepararon las reacciones en 10 tubos de ensayo como se observa en la tabla 2 (ver
anexos 2), se agitó suavemente y se esperó 15 minutos a que se desarrollará el olor en
la oscuridad y se midió la absorbancia de cada tubo a 595 nm.

Electroforesis de las proteínas de la leche

Gel de corrida
 Se ensamblo el cassette según las instrucciones y se preparó el gel de corrida. Se
prepararon 10 ml de acrilamida 10% como se observa en la tabla 3 (anexos 3). Se vertió
cuidadosamente la solución de acrilamida con una pipeta Pasteur en el contenedor por
los 2 vidrios sujetos al cassette y se dejó aproximadamente 1,5 cm de distancia entre la
solución de acrilamida y al vidrio frontal. Luego se añadió el gel de corrida y agua
destilada suavemente para evitar la polimerización irregular. Se esperó unos 15 minutos
para una polimerización total.

Gel de apilamiento
Luego de la polimerización del gel de corrida, se descargó el agua de la superficie del
mismo y se prepararon 4 ml del gel de apilamiento (4%), como se muestra en la tabla 4
(ver anexos 4). Se vertió cuidadosamente el contenido del gel de apilamiento sobre el
gel de corrida polimerizado y se colocó el peine. Se esperó 10 minutos.

Colocación de las muestras

Ya que el gel de apilamiento está polimerizado, se colocó el cassette en el tanque de
electroforesis con aproximadamente 500 ml del tampón en el que se encontraban los
electrodos sumergidos. Se quitó el peine y se colocaron las muestras con unas
micropipetas (ver anexo 5). Se sometieron a calentamiento de 100°C por 5 minutos y
de manera inmediata se secaron a hielo. Se sembraron 20 µL de las muestras en los
pocillos de los geles de la electroforesis. Se incluyó un estándar de peso molecular en
uno de los pocillos (5 µL). Adicionalmente se sometieron las muestras a electroforesis
aplicando una corriente de 30 mA y se observó la corrida por 40 minutos, al finalizar
la corrida se extrajeron los vidrios y se separaron. Se sumergió el gel en una solución
colorante durante 3 horas. Transcurrido el tiempo, se sumergió el gel en una solución
decolorante o en agua caliente por 5 minutos. Se observaron las bandas proteicas y se
midieron las distancias.

Resultados y Cálculos

1. Aislamiento de la caseína:

Tabla 1. Aislamiento de la caseína.

Muestra de leche alquería Entera

Volumen de leche tomado (mL) 50

 Volumen de agua usada (mL) 60

Volumen de ácido acético 1N requerido para 2,1

cortar la leche (mL)

Caseína seca (g) 1,8943

Se determinó el rendimiento de extracción de la caseína de la siguiente manera:

𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎
R = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑡𝑜𝑚𝑎𝑑𝑜

1,8943 𝑔
R=
50 𝑚𝐿

R = 0,0379 g/mL

Se pasó a % peso a peso utilizando la densidad de la leche, la cual aproximadamente es de

1,034 g/mL (Artica,2014) de la siguiente manera:

1,034 𝑔 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒
50 mL leche * ( ) = 51,7 g leche
1 𝑚𝐿 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒

𝑔 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎
R= 𝑔 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒
1,8943 𝑔 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎
R= = 0,0366 gcaseína / gleche
51,7 𝑔 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒

%P/P = 3,66%

2. Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína:

Tabla 2. Absorbancia y pH para determinación del punto isoeléctrico.

Tubo pH ABS a 640 nm

1 3,09 0,041

2 3,23 0,046

3 3,36 0,054
 4 3,51 0,067

5 3,87 0,109

6 4,03 0,172

7 4,4 0,176

8 4,63 0,189

9 4,93 0,194

10 5,01 0,052

Con los datos de pH y absorbancia de la tabla 2, se realizó la gráfica de absorbancia Vs pH

para determinar de manera experimental el punto isoeléctrico de la caseína.

Figura 1. Absorbancia Vs pH.

Se determinó la transmitancia con la fórmula y se realizó la gráfica de transmitancia Vs pH.

Abs= -log(T) [Ecuación 2]

1
𝑇= [Ecuación 3]
10 𝐴𝑏𝑠
Figura 2. Transmitancia Vs pH.

3. Cuantificación de proteínas de la leche:

Se determinó la concentración de cada tubo con la ecuación C1V1 = C2V2 donde C1 es la

concentración estándar, V1 es el volumen tomado de albúmina en cada tubo, V2 es el volumen
total de albúmina en los 5 tubos y C2 es la concentración que se quiere determinar.

Tabla 3. Absorbancias (595 nm) para la realización de la curva de calibración.

Patrón Muestras

Concentración Absorbancia a 595 Muestra Absorbancia a 595

(mg/mL) nm nm

0,333 Leche
0,086 0,331

0,667 Sln`A
0,137 0,416

1,000 Sln`B
0,206 0,147

1,333 Sln`C
0,25 0,273

1,667
0,298

Con la concentración y absorbancia de los tubos (Tabla 3), se realizó la curva de calibración.
 Figura 3. Curva de calibración.

Se determinó la concentración de las muestras con la ecuación de la recta, teniendo en cuenta

que y es la absorbancia correspondiente a cada muestra (Tabla 3) y x es la concentración que
se quiere determinar:

y = mx + b

𝑦−𝑏
x=
𝑚

Tabla 4. Concentración de caseína en las muestras a partir de la curva de calibración.

Muestra Concentración de caseína (mg/mL)

Leche 1,842

Sln`A 2,369

Sln`B 0,699

Sln`C 1,482
Se determinó la concentración de caseína para cada muestra teniendo en cuenta el factor de
dilución de cada muestra, se realizó mediante la ecuación de C1V1 = C2V2 , donde C2 es la
concentración hallada a partir de la curva de calibración (Tabla 4), V 2 es el volumen final en
cada tubo después de agregar soluciones en la cuantificación de proteínas, V 1 es la alícuota
tomada de cada muestra para la realización de soluciones en la cuantificación de proteínas y
C1 es la concentración que se quiere determinar.

Tabla 5. Concentración de caseína en las muestras.

Muestra Concentración de caseína (mg/mL)

Leche 552,6

Sln`A 3,948

Sln`B 1,165

Sln`C 2,47

Se determinó la cantidad de proteína total en 100 mL de leche de la siguiente manera:

𝑚𝑔
100 mL * 552,6 𝑚𝐿 = 55260 mg

En la electroforesis de las proteínas de la leche se obtuvo el siguiente gel:

Figura 4. Gel de electroforesis.

Se utilizó el siguiente patrón de gel de electroforesis de opti protein marker G266:

Figura 5. Patrón de gel de electroforesis.

Se realizó una tabla de la distancia de las bandas y el log en base 10 del PM en kDa, teniendo
en cuenta el patrón de Tris-Glycine 4-20%, para posteriormente realizar una gráfica de
distancia Vs Log PM.

Tabla 6. Distancias de las bandas y log en base 10 de los pesos moleculares del patrón.

Distancia (cm) Log PM (kDa)

0,7 2,3892

1,0 2,2553

1,3 2,1303

2,2 2,0000

2,8 1,8751

3,5 1,7993

4,3 1,6812
 5,2 1,5441

6,1 1,3979

6,6 1,3010

7,2 1,2304

7,4 1,0414

Figura 6. Gráfica de distancia Vs Log PM.

Con la ecuación de la recta de la gráfica (Figura 6), donde x es la distancia de la banda que se
quiere determinar. El valor determinado con la ecuación se eleva a la 10, es decir, 10 y y de esta
manera se determinó el PM de las bandas que tienen las flechas (Figura 4).

y = mx + b
Tabla 7. Distancias, log en base 10 de los pesos moleculares hallados con la ecuación de la recta y el PM de las muestras.

Distancia (cm) Log PM (kDa) PM (kDa)

4,4 1,655 45,242

4,8 1,586 38,582

6,4 1,309 20,4052

Análisis

En un principio, es necesario aclarar los datos expuestos en la tabla 1, donde se observa

el peso de la caseína en gramos, valor que se utilizó para determinar el rendimiento de la caseína
el cual dio un resultado de 0,0336 por gramo de leche, comparado con Revilla (1998) el
rendimiento de la caseína en la leche es de 0,0264, cabe aclarar que este valor fue calculado
tomando la caseína alfa, beta y kappa. Es posible observar que se tratan de valores bastante
cercanos entre sí, sin embargo, el rendimiento experimental tuvo un mayor valor, esto se debe
a que la cantidad de caseína en la leche depende de muchos factores, teniendo en cuenta que
representa del 77% al 82% de las proteínas de la leche. Siguiendo con esta idea, la cantidad de
proteína varía según la raza de la vaca y a su vez con la proporción de grasa en la leche
(Unión,2020), por lo tanto, no todas las muestras son iguales, sin embargo, al tratarse de un
valor mayor que el reportado por la literatura se puede asegurar que la extracción fue bastante
efectiva.
En cuanto a la figura 1, se representaron los valores de absorbancia versus pH con el
propósito de hallar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína, como se observa en
la figura mencionada el punto más alto será aquel que se tomará como punto isoeléctrico. Este
procedimiento se realizó, teniendo en cuenta la definición de punto isoeléctrico, en el cual, se
encuentran en equilibrio las cargas positivas y negativas, y es el momento donde la proteína
tiene una mayor posibilidad de ser precipitada, cabe aclarar que el punto isoeléctrico se trata
de un pH donde la carga neta es cero (Miller, 2001). En estas condiciones se eliminan las
interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria de la proteína lo que provoca
su precipitación, es decir, la solubilidad de una proteína es mínima en este punto,
desapareciendo cualquier fuerza de repulsión electrostática. Por lo tanto, nuestro punto
isoeléctrico experimental es de 4,19 (figura 1), mientras que se reporta un valor de punto
isoeléctrico para la caseína de 4,6 (Gonzales, 2019) Teniendo en cuenta que el pH de la leche
es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente se solubiliza como
sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se
neutraliza y la proteína neutra precipita. (Miller, 2001). Como el valor reportado en la literatura
se trata de 4,6 se espera que la curva de calibración tenga un vértice alrededor de este valor.
De manera contraria, se encuentra la figura 2, donde se representa la transmitancia
versus el pH, a su vez esta gráfica se usa para hallar el punto isoeléctrico, sin embargo, contrario
a la figura 1, el punto isoeléctrico es aquel que se encuentre en el punto más bajo de la gráfica.
Es necesario resaltar que se calcularon estos valores siguiendo la ecuación 2, de donde se
despejó la transmitancia obteniendo la ecuación 3 y se reemplaza los valores de absorbancia
con los que se obtuvieron experimentalmente.
A parte de ello, se determinó por medio de espectrofotometría la concentración de
caseína en una muestra de leche entera, por medio de la ecuación de la recta expresada en la
figura 3. Esta curva de calibración se realizó a partir de un patrón de albúmina. Como se observa
en la misma figura, se trata la absorbancia como abscisa y la concentración como ordenada de
las soluciones patrón. En cuanto a la ecuación de la recta, y modela la absorbancia y x la
concentración. por medio de esta ecuación y reemplazando valores en y fue posible hallar las
concentraciones de caseína en cada tubo. En cuanto a estos resultados, estos se refieren a las
muestras diluidas (tabla 4) por lo tanto se realizó un factor de dilución donde fue posible hallar
la concentración real de caseína.
Los resultados de este procedimiento se encuentran expuestos en la tabla 5, donde
claramente la muestra con mayor concentración de caseína es la leche pura, tal y como se
esperaba. Por consiguiente, en las soluciones se observa una clara disminución de la
concentración, sin embargo, la solución A contiene mayor cantidad de caseína que la B o la C
y esto se debe a que fue el sobrenadante recogido inmediatamente después de cortar la leche, a
diferencia de la B, la cual fue sobrenadante que se lavó por lo cual tiene sentido que su
concentración de la proteína sea mínima. De igual manera sucede con la solución C ya que al
contener tan poca cantidad de caseína, ser llevada a un volumen relativamente alto y
encontrarse humedecida con éter etílico no se esperaba una alta concentración y fue
comprobado como se expresa en la tabla 5.
Finalmente, en la práctica se realizó una prueba de electroforesis para definir de qué
proteína de la leche se trataba, por medio de las bandas proteicas y el marcador de peso
molecular protein marker G266. En la figura 4 se observan los resultados de la sesión
experimental, donde se obtuvieron tres resultados, uno del carril 3, que corresponde a la
purificación de leche entera alquería, otro en el carril 4, correspondiente a leche entera alquería
y un último en el carril 5, leche descremada alquería. De manera seguida, se realizó la gráfica
del logaritmo del peso molecular versus la distancia recorrida, como se observa en la figura 6,
con los valores teóricos del marcador de peso molecular, en la figura 5 del carril de Tris-
Glycerine 4-20%. Usando la ecuación de la recta de la figura 6, reemplazando x por el valor de
la distancia de las bandas que se quieren determinar y elevando este resultado a la 10
(procedimiento contrario de logaritmo) fue posible hallar el peso molecular de las bandas, en
kDa, tal y como se expone en la figura 7, cabe aclarar que la distancia recorrida es inversamente
proporcional al peso de la proteína, por lo tanto a mayor peso molecular, menor distancia (Kratz
,2010). En cuanto a la relación de los pesos moleculares para definir la proteína, se puede decir
que los primeros dos valores expuestos en la tabla 7 son muy altos, por lo tanto, se pueden
considerar como caseína α-(s2) teniendo en cuenta que su peso molecular se encuentra entre
25,226 y 25,893 (Kram,2003) y es la proteína dentro de la leche con mayor peso molecular.
Sin embargo no es posible confirmar con absoluta certeza de que proteínas se trata ya que en
la figura 4, se observa que la proteína del carril 3 tiene un peso mayor que la del carril 4 puesto
que, como se mencionó antes a mayor peso menor desplazamiento por lo tanto se puede pensar
que la proteína cuyo peso es de 45,242 kDa se asocia a la caseína α-(s2) y la proteína cuyo peso
es 38,582 kDa se puede asociar a la caseína α-(s1) ya que el valor teórico del peso molecular
de esta es de 23,615 kDa, lo cual tiene sentido pensando que su peso es menor por lo tanto su
desplazamiento es mayor que el de la primera proteína , teniendo congruencia con los datos de
la figura 4 y la tabla 7. No obstante la desviación de los valores experimentales es muy grande,
esto se debe a errores de medida, ya que las distancias tomadas de las bandas no son
completamente perfectas. Además, en cuanto a la última proteína expuesta en la tabla 7, se
puede pensar que se trata de kappa- caseína ya que el peso de esta varía entre 19,006 y 19,037
kDa (Kram,2003) aproximándose bastante al valor experimental de 20,405 kDa, de igual forma
que se justificó anteriormente, no es un dato del que se tenga total certeza puesto que el error
instrumental pudo ser muy alto.
Por último, al observar los carriles de la figura 4, es posible analizar distintas
características de los carriles. En primer lugar, cabe aclarar que se trató el método de Biuret,
donde la intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de proteínas. Como se
mencionó antes, en el carril 4 se trata la leche entera y siguiendo el concepto del método de
Biuret, es posible entender que la leche entera cuenta con una alta cantidad de proteínas, debido
a cómo se distinguen las bandas y la coloración del carril. Sin embargo, al contrastar con los
datos obtenidos en espectrofotometría se complementa el argumento ya que se asegura que la
leche entera contiene la mayor concentración de caseína. Por otro lado, en los carriles del 5 al
7 se trata la leche descremada, por lo tanto, sus carriles son poco visibles hasta el punto de no
poder observarlos con claridad y ser prácticamente invisibles. Al comparar con la literatura, es
de esperar que la leche descremada tenga menor concentración de proteínas, teniendo en cuenta
que esta dependen de la grasa de la leche (Unión,2020). Adicionalmente, los carriles del 1 al 3
tratan la purificación de leche entera donde se realiza un proceso de pasteurización para destruir
los microorganismos patógenos, pero al ser un tratamiento suave no modifica de manera
relevante las características de la leche (A. Lurueña, 2012) y es entendible que en este proceso
de purificación de la leche haya pérdida de proteínas, por lo tanto, en estos carriles el color es
notorio sin embargo no es completamente distinguible. Finalmente, complementando con los
resultados obtenidos en espectrofotometría, se puede decir que los resultados entre ambas
técnicas son lógicos ya que la solución de leche entera cuenta con la mayor concentración de
proteínas (carril 4), la solución A tiene una concentración aceptable, aunque pequeña al
compararla con la de leche entera (carriles 1 y 5) y por último la solución B y C cuentan con
una concentración mínima de caseína (carriles 2, 3 ,6 y 7).
Conclusiones

En primer lugar, el rendimiento obtenido experimentalmente de 0,0336 sobrepasa el expuesto

en la literatura de 0,0264, dando a entender que el procedimiento fue óptimo, sin embargo, se
cree que la diferencia se debe a las características de la leche, principalmente la cantidad de
grasa y proteínas de esta dependen de la raza de la vaca.

Fue posible comprobar por medio del análisis de espectrofotometría y electroforesis que la
cantidad de proteínas en la leche entera que es de 55260 mg sobrepasa de gran manera las que
se encuentran en la leche purificada, así como las de la leche deslactosada.

Por otro lado, fue posible determinar las proteínas que se encontraban en la leche, dándonos
como resultado para la primera y con un peso experimental de 45,424 kDa caseína α-(s2), cuyo
peso teórico es de 25,226 kDa. Para la segunda proteína con un peso de 38,582 kDa se definió
como caseína α-(s1) cuyo peso es menor, aunque no en gran medida a la primera proteína, y
finalmente se definió la última banda de peso 20,4052 como kappa-caseína comparando con el
peso teórico de 19,006 kDa. Es necesario considerar la gran posibilidad de error instrumental,
al medir distancias, así que no es posible asegurar con total certeza los resultados.

Se logró determinar que el punto isoeléctrico en una gráfica absorbancia Vs pH es el punto más
alto de la gráfica porque en determinado pH la caseína se precipita y al ser directamente
proporcional la concentración y la absorbancia es el pH donde la absorbancia es la mayor, por
lo tanto, el punto isoeléctrico de la caseína experimentalmente es de 4,19.

Se encontró una concentración de caseína en la leche entera de 552,6 mg/ml, en la solución A

de 3,948 mg/ml, de la solución B de 1,165 mg/ml y de la solución C de 2,47 mg/ml, siendo
resultados congruentes con lo expuesto en la literatura y las características de cada muestra
problema.

Al comparar los resultados de espectrofotometría y electroforesis, es posible concluir que se

complementan y coinciden ya que los resultados de concentración de caseína concuerdan con
los expuestos en los carriles del gel, no obstante, cabe resaltar que la espectrofotometría es más
útil para tener una visión global de la concentración de proteínas, no tanto para su
cuantificación.
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Revilla, A., 1985. Tecnología De La Leche. San José, Costa Rica: Instituto Interamericano de
Cooperación para la Agricultura, p.15.
Anexos 1

Tabla 1: Volúmenes a utilizar de cada uno de los reactivos para determinación del pI

Tubo Acetato Ácido acético Ácido acético pH resultante

sódico 0,1N 0,1N (ml) 0,01N (ml) aproximado
(ml)

1 0,5 9,5 - 3,2

2 1,0 9,0 - 3,6

3 1,5 8,5 - 3,8

4 2,0 8,0 - 4,0

5 3,0 7,0 - 4,2

6 4,0 6,0 - 4,5

7 6,0 4,0 - 4,7

8 8,0 2,0 - 5,1

9 6,0 - 4,0 5,5

10 8,0 - 2,0 6,1

Anexo 2

Tabla 2: Volúmenes a utilizar de cada una de las soluciones en la cuantificación de proteínas

Tubo Agua Albúmina Leche Extracto Biuret (ml)
(ml) (ml) (ml) (ml)

B 1,8 - - - 1,2

1 1,6 0,2 - - 1,2

2 1,4 0,4 - - 1,2

3 1,2 0,6 - - 1,2

4 1,0 0,8 - - 1,2

5 0,8 1,0 - - 1,2

Leche 1,79 - 0,01 - 1,2

Sln A - - - 1,8 1,2

Sln B - - - 1,8 1,2

Sln C - - - 1,8 1,2

Anexo 3

Tabla 3: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del gel de corrida

Solución Volumen

Agua destilada 3,4 mL

Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.4 mL

Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5 mL

SDS 10% 100 µL

Persulfato de amonio 10% 150 µL

TEMED 10 µL

Anexo 4

Tabla 4: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del gel de apilamiento

Solución Volumen

Agua destilada 6,1 mL

Acrilamida-bisacrilamida 30% 1,3 mL

 Tris/HCl 1M pH 6.8 2,5 mL

SDS 10% 100 µL

Persulfato de amonio 10% 50 µL

TEMED 10 µL

Anexo 5

Muestras:

1. Leche 2µL. Buffer sample o de muestra 18µL (Solución con Azul de Coomassie)
2. Solución A 10µ. Buffer sample 10µL
3. Solución B 10µL. Colorín 10µL
4. Solución D 10µL. Colorín 10µL
5. Estándar peso molecular 5 µL