PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS Y SEPARACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
Cárdenas Lesmes Julieth Stefany
RESUMEN
El objetivo principal de la practica de laboratorio fue la identificación y separación
de los aminoácidos presentes en la espinaca por medio de la cromatografía en capa
delgada, utilizando un extracto etanolico de la espinaca y disponiendo de acetato
de celulosa como fase estacionaria y butanol-acetona-ácido acético y agua como
fase móvil y una placa reveladora con una solución de Ninhidrina, permitiendo la
separación de los componentes presentes en la muestra vegetal por diferencia de
solubilidad, de igual manera en este práctica se llevó a cabo reacciones de
reconocimiento de aminoácidos presentes en muestras proteicas (BSA y
ovoalbúmina) utilizadas en el laboratorio con reactivos como Ninhidrina, Millon,
Sakaguchi, y Erlich, obteniendo resultados positivos y negativos que permitieron
reconocer los grupos funcionales de los aminoácidos presentes, con ayuda de
reacciones con resultados coloreados que mostraban la presencia o ausencia de
los grupos presentes en los aminoácidos analizados.
PALABRAS CLAVE
Cromatografía, cromatoplaca, fase móvil, extracto etanolico, reacción de
reconocimiento.
ABSTRACT
The main objective of the laboratory practice was the identification and separation
of the amino acids present in spinach by means of thin layer chromatography, using
an ethanol extract of spinach and having cellulose acetate as stationary phase and
butanol-acetone- acetic acid and water as the mobile phase and a developer plate
with a Ninhydrin solution, allowing the separation of the components present in the
plant sample due to the difference in solubility, in the same way, in this practice,
recognition reactions of amino acids present in protein samples (BSA and
ovalbumin) used in the laboratory with reagents such as Ninhydrin, Millon,
Sakaguchi, and Erlich, obtaining positive and negative results that allowed
recognizing the functional groups of the amino acids present, with the help of
reactions with colored results that showed the presence or absence of the groups
present in the amino acids analyzed you.
KEY WORDS
Chromatography, chromatoplate, mobile phase, ethanol extract, recognition
reaction.
METODOLOGÍA
- Cromatografía
Para la separación de aminoácidos de la espinaca por cromatografía en capa fina,
inicialmente se preparó el extracto etanólico de la espinaca, en la estufa a una
temperatura de 89°C durante 5 minutos se secaron 10 g de espinaca, se trituró el
material seco y se pesaron 5 g en un mortero, se les adicionó 15 mL de etanol con
una probeta aforada, se mezcló, se centrifugo por dos veces para medir 1 mL de
extracto etanólico, aunque por calor se redujo a 0,5 mL.
Se realizaron los patrones de aminoácidos Se prepararon los patrones de
aminoácidos (A, C, D, E, F, H, I, L, M, S, V y W) teniendo en cuenta factores como
la solubilidad y el pH, luego se preparó metanol:agua en un proporción 50:50, con
un pH de 1.70 ajustado con HCl, con una micropipeta se agregaron 2.5 ml de la
solución a los tubos eppendorf en donde estaban los patrones de los aminoácidos,
luego se llevó cada tubo eppendorf al rotavaporador y se dejaron nuevamente en la
gradilla.
La cámara cromatográfica se saturo por 30 minutos, con la fase móvil (butanol –
acetona – ácido acético y agua, en proporciones estipuladas en la metodología.
Se preparó la cromatoplaca (fase estacionaria: acetato de celulosa) con la siembra
de los 12 patrones de aminoácidos y dos extractos de espinaca, para esta
preparación, con una regla se dividió la cromatoplaca en 12 partes iguales de 1 cm
cada uno, en este espacio se procedió a sembrar los patrones y los extractos de
espinaca
Se procede a desarrollar el cromatograma por 40 minutos, se marca hasta dónde
llega el solvente se seca en el horno la placa, se revelan los aminoácidos
sumergiendo la placa en una bandeja de aluminio que contiene ninhidrina.
Nuevamente se deja secar la placa en una estufa a 98oC por 10 minutos y miden
los Rf de los aminoácidos sembrados y por comparación determinar los que están
presentes en la espinaca.
Reacciones de reconocimiento
Reacción con Ninhidrina
Para esta prueba de reconocimiento, se marcaron 7 tubos, el primero como blanco,
el segundo como alanina, el tercero como asparagina, el cuarto como BSA, el quinto
como glicina, el sexto muestra proteica (OVA) ovoalbúmina, y el séptimo como
prolina, luego de agregar 1 mL de los patrones a cada tubo respectivamente se
agregó 1 mL de reactivo de Ninhidrina, luego se llevaron a ebullición durante 10
minutos a 300°C, pasado el tiempo se realizaron las comparaciones y se registraron
los resultados.
Reacción de Millon
Para esta prueba de reconocimiento, se marcaron 4 tubos, el primero como blanco,
el segundo con Y (tirosina), el tercero con BSA y el cuarto con fenol, posteriormente
se agregó 1mL de reactivo de Millon con ayuda de una micropipeta, se realizaron
las comparaciones y se registraron los resultados.
Reacción de Sakaguchi
Para esta prueba de reconocimiento se marcaron 3 tubos de ensayo el primero
como blanco, el segundo con R (arginina) y el tercero muestra proteica (OVA)
ovoalbúmina. Se adicionaron 3 mL del reactivo a cada tubo se dejaron por 10
minutos en baño de hielo, posteriormente se le agregó a cada tubo 3 mL de NaOH
40% se continuó el procedimiento con el baño de hielo, se adicionaron 5 mL de alfa
naftol y finalmente 3 gotas del reactivo de Sakaguchi para cada tubo, se agitaron y
se hicieron las comparaciones, los resultados fueron registrados.
Reacción de Ehrlich
Para esta prueba de reconocimiento se marcaron 4 tubos de ensayo el primero
como blanco, el segundo con BSA, el tercero muestra proteica (OVA) ovoalbúmina
y el cuarto con W (triptófano), a estos 4 tubos se les agregó 1 mL de ácido
sulfanílico, posterior a ello, se agregó a cada tubo 1 mL de nitrito de sodio, se dejó
en reposo durante 15 minutos y luego a cada tubo se le agregó 1mL de patrón
correspondiente a la etiqueta del tubo, para el tubo marcado como blanco se agregó
agua destilada, posterior a ello se dispuso cada tubo en el rotavaporador para una
mezcla homogénea, después se agregó a cada tubo 0.5 mL de amoniaco en
solución. Se hicieron las comparaciones y los resultados fueron registrados.
RESULTADOS
1. Tabla de datos
1.1. Cromatografía
Tabla 1. Descripción de los rangos determinados de RF en la prueba de cromatografía de
placa delgada para la espinaca.
Compuesto Distancia Distancia el Rf Nombre del
desde el límite del compuesto
centro de la solvente probable
mancha
1 4.4 cm 13.50 0.326 Alanina
2 0.70 cm 13.50 0.052 Cisteína
3 3.90 cm 13.50 0.289 Aspártico
4 4.40 cm 13.50 0.326 Glutámico
5 7.70 cm 13.50 0.570 Fenilalanina
6 1.90 cm 13.50 0.140 Histidina
7 7.10 cm 13.50 0.526 Isoleucina
8 8.25 cm 13.50 0.611 Leucina
9 6.60 cm 13.50 0.489 Metionina
10 3.20 cm 13.50 0.237 Serina
11 6.50 cm 13.50 0.481 Valina
12 7.30 cm 13.50 0.541 Triptófano
13
0.6 0.044
1.7 0.126
3.4 0.252
4.1 0.304 Espinaca
6.4 13.50 0.474
6.9 0.511
7.1 0.526
7.7 0.570
8.1 0.6
1.2. Reacción con Ninhidrina
Tabla 2. Resultados de las reacciones en el ensayo de Ninhidrina
MUESTRA REACTIVO RESULTADO OBSERVACIONES
ADICIONADO
Blanco Negativo Tomó una coloración
incolora
Alanina Positivo Coloración púrpura
Asparagina Positivo Coloración café claro
BSA 1 mL de reactivo de Positivo Coloración azul
Ninhidrina intenso
Glicina Positivo Coloración azul-
violeta
OVA Positivo Coloración azul-
violeta intensa
prolina Positivo Coloración amarilla
intensa
1.3. Reacción de Millon
Tabla 3. Resultados de las reacciones en el ensayo de Millon
MUESTRA REACTIVO RESULTADO OBSERVACIONES
ADICIONADO
Blanco Negativo Coloración incolora
Tirosina Positivo Coloración rojo claro
positivo Coloración rojo claro,
BSA 1 mL de reactivo de el tubo presenta
Millon burbujas
Fenol Positivo Coloración rojo
ladrillo
1.4. Reacción de Sakaguchi
Tabla 4. Resultados de las reacciones en el ensayo de Sakaguchi
MUESTRA REACTIVO RESULTADO OBSERVACIONES
ADICIONADO
Blanco 1 ml de NaOH 40% Negativo Coloración naranja
Arginina 5 ml de alfa-naftol Positivo Coloración roja
3 gotas de reactivo
OVA de Sakaguchi Positivo Coloración rosado
claro
1.5. Reacción de Ehrlich
Tabla 5. Resultados de las reacciones en el ensayo de Ehrlich
MUESTRA REACTIVO RESULTADO OBSERVACIONES
ADICIONADO
Blanco Negativo Coloración amarillo
suave
BSA 1 mL de reactivo de Positivo Coloración naranja
Millon fuerte
OVA Positivo Coloración naranja
rojiza
Triptófano Negativo Coloración amarillo
suave
2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
2.1. Cromatografía
Imagen 1. Cromatografía en capa delgada de la espinaca, separación de los aminoácidos
presentes.
Para el caso de la espinaca se encontró una gran cantidad de muestras de
aminoácidos presentes en esta verdura, determinando por medio de esta
cromatografía, encontrando aproximadamente 12 aminoácidos, estos siendo
cisteina, histidina, ácido aspártico, acido glutámico, serina, valina, triptófano,
fenilalanina y leucina.
Tabla 5. Comparación de los Rf presentes en la espinaca
Aminoácido RF RF Al observar las correspondientes comparaciones
muestra patrón con los RF de la muestra de la espinaca con la de
los patrones, se puede determinar que existen
Cisteina 0.044 0.048 varios aminoácidos que posee la espinaca, como la
cisteina, histidina, serina, triptófano, fenilalanina y
Histidina 0.140 0.176 leucina, ya que sus RF coinciden muy aproximado y
al observar la placa se distinguen, al comparar con
la tabla de composición de aminoácidos del
Serina 0.237 0.208 preiniforme encontré coincidencia de estos, hubo
unos pequeños porcentajes de error en los RF de la
espinaca y esto se debe a que la variación se dio
triptófano 0.541 0.529
por la aparición de una mancha grande, y esto
cambió la precisión del RF.
fenilalanina 0.570 0.593 Encontré la aparición con un RF alto en la espinaca
de la fenilalanina y comparándolo con el patrón son
muy precisos, aunque en la tabla de composición no
leucina 0.611 0.658
aparece, es posible decir que la espinaca tiene gran
cantidad de fenilalanina y que es muy afín a la fase
móvil.
Solvente: fenol:agua (80:20) “Medina, M. Maria, Gallo (2013)”
Cada una de las manchas de la mezcla de aminoácidos obtenidas puede
identificarse comparando su migración con las manchas de los patrones. El valor
del recorrido relativo (Rf) de cada aminoácido es el mismo cuando está en una
mezcla de aminoácidos que cuando está sólo “Rodriguez, F ( 2017)”.
Al comparar con un experimento hecho, y comparar los RF de los aminoácidos
encontrados con la espinaca y el experimento, es posible decir que hay una gran
similitud ya que están muy relacionados y sus RF son similares.
2.2. Reacción con Ninhidrina
Según los resultados obtenidos, gracias a que la prueba de ninhidrina determina
con violeta-azuloso a la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario;
como es el caso de la Alanina, Asparagina, Glicina y prolina, de igual manera fue
posible determinar que en las muestra proteicas como BSA Y OVA, existen estos
grupos amino libres, la ninhidrina es un agente oxidante de los grupos alfa-amino
liberando amoniaco, CO2 y el correspondiente aldehído, así como la forma
reducida de la ninhidrina hidrindantina, la hidrindantina reacciona con el
amoniaco para poder presentar la coloración azul-violeta, a excepción de la prolina,
que como es posible evidenciar en la tabla 2, que da una coloración amarillenta (en
la prolina el grupo amino está sustituido) y café para la asparagina que tiene
un grupo amido en la cadena lateral (Osorio, 2017). Este proceso se da por
una desencadenante de reacciones como lo son la formación de una imina, luego
hay una descarboxilación, luego se hidroliza la imina y por último hay una
condensación.
2.3. Reacción de Millon
Imagen 2. Reacciones en la prueba de millón. ( alcoholes azul, ac carboxílico negro, amina
rojo, cetona verde)
En la prueba de millón, el fundamento químico que relaciona las reacciones es que
hay una disolución con una parte de mercurio con ácido nítrico, lo cual en presencia
de altas cantidades de mercurio habrá una producción Nitrato de mercurio que en
medio ácido reacciona con el grupo -OH de la tirosina produciendo una coloración
roja característica. Para el último momento de la reacción se va a liberar óxidos de
nitrógeno. En el experimento, el momento en el que se calienta la muestra va a
permitir que el precipitado se vuelva rojo por la reacción entre el mercurio y el grupo
OH lo cual explica por qué se da la coloración roja en las muestras LA TIROSINA,
EL FENOL Y LA CLARA DE HUEVO. En donde por ejemplo en la muestra BSA dio
un resultado de un color rojo pálido por la presencia de albúmina.
Imagen 3. Reacción de la prueba de millón. en la cual Ese ecnuentran grupos funcionales
en reacción (alcohol verde (fenol)) ¨Firu, D (2012)¨
2.4. Reacción de Sakaguchi
Del hidróxido de sodio con arginina se obtiene una solución alcalina, permitiendo
que el grupo guanidino del aminoácido arginina reaccione con el alfa-naftol y el
hipobromito de sodio del reactivo sakaguchi, formando un complejo color rojo y esto
muestra presencia de un grupo guanidino o guanidino. De ahí que sea una
indicación de la presencia de arginina libre de proteínas que contengan arginina, el
desarrollo de otro color como amarillo, es alterado debido a la presencia de más
aminoácidos como grupos aminos, histidina y triptófano. “Bruce, C (1962)”.
Para el caso de la ovoalbúmina, su resultado fue positivo, este por contener arginina
en su composición, reacciona de forma homogénea dando una coloración rosado
suave por la pequeña cantidad de este aminoácido, evidenciando la presencia del
grupo guanidino o guanidino.
Imagen 4. Reacción de sakaguchi con sus respectivos grupos funcionales.
2.5. Reacción de Ehrlich
Mediante esta reacción se detecta la presencia de grupos imidazol o fenoles en la
muestra. Los fenoles y el grupo imidazol (característico de la histidina) reaccionan
con el ácido diazobenceno sulfónico y forman productos de sustitución que se
tornan rojo al alcalinizar el medio. “Quesada, M (2007)”
El grupo imidazol de la tirosina reacciona con el ácido diazobenceno sulfonico
(encerrado en amarillo) y forman un producto de sustitución que se tornan rojo al
alcalinizar el medio. En la tabla de resultados 5 se puede observar la prueba
positiva con tirosina anteriormente explicada que se presencia como resultado un
color rojo.
Para el caso del la clara de huevo, su resultado fue positivo debido a que en su
composición poseen anillos fenólicos y nitrogenados, como por ejemplo la tirosina ,
que al reaccionar con el ácido diazobenceno sulfónico y el nitrito de sodio, forma
una sal de diazonio fuerte, dando una coloración roja-naranja fuerte, así se
determina la presencia de tirosina e histidina en la clara del huevo, ya que estos
dos aminoacidos son positivos en la prueba de Ehrlich.
CONCLUSIONES
- Por medio de la cromatografía de capa fina, se pudo determinar y separar
aminoácidos de muestras proteicas, como en este caso la espinaca, y esta
separación se da por la cadena lateral del aminoácido, teniendo en cuenta
su polaridad, los que poseen su RF más alto es porque son más afines a la
fase móvil, ya que el solvente los desplaza hasta arriba de la placa, y los más
afines a la fase estacionaria poseen un RF pequeño.
- Mediante el método de ensayo con ninhidrina, se concluye se presentan
grupos alfa-aminoácidos con grupos aminos primarios en las muestras, como
es el caso de la Alanina, Asparagina, Glicina y prolina
- Por medio del ensayo de millón, se concluye que los reactivos que contengan
tirosina van a reaccionar con el anillo fenólico del reactivo millón que tiene un
comportamiento característico frente a las sales de Mercurio a pH ácido,
formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y los
péptidos y proteínas que la contienen.
- En el ensayo de sakaguchi logramos concluir que los grupos guanidinio
presentes en la cadena lateral de la solución que contenga Arginina, va a
reaccionar con soluciones de alfa-naftol en presencia de Bromo en medio
alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos.
- Para el caso de la reacción con la clara de huevo, su resultado fue positivo,
debido a la presencia de arginina por lo que logra reaccionar el alpha naftol
con los grupos aminos libres este aminoácido.
REFERENCIAS
Firu, D (2012). Aminoacidos y proteinas. Recuperada la información el 01 de septiembre de
2020 de la pagina web: [Link]
Medina, M. Maria, Gallo (2013). Identificación del aminoácido libres por cromatografía de
capa fina. recuperada la información el 01 de septiembre de 2020 de la pagina web:
[Link]
Osorio, M. M. (2017). Práctica 2. Pruebas cualitativas de identificación de aminoácidos y
proteínas. Recuperado el Septiembre 01, 2020, de [Link]
mx/document/instituto-tecnologico-de-sonora/bioquimica/practicas/practica-2-pruebas-
cualitativas-de-identificacion-de-aminoacidos-y-proteinas/2977424/view
Quesada, M (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica (1a Edición).
Recuperada la información el 01 de septiembre de 2020 de la pagina web:
[Link]
+diazo++histidina&source=bl&ots=oFnfsnq16d&sig=ACfU3U3KNyJTBvIIh6vwyasmkoVGt
Y4sgQ&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwit4YaG877gAhUkzlkKHaDoD_gQ6AEwCXoECAkQA
Q#v=onepage&q=reacción diazo histidina &f=false
Rodríguez, F ( 2017). Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina.
recuperada la informacion el 01 de septiembre de 2020 de la pagina web:
[Link]
fina/#Resultados
