Técnicas moleculares

• Reacción en cadena de polimerasa

• Secuenciación y tipos
• Exosomas y biopsia líquida
• Diagnóstico prenatal no invasivo
• Clonación y tipos
• Medicina de precisión y farmacogenómica
• Modificación génica: CRISPR
 Extracción de ADN
• Exosomas (ver más adelante)
• Células
– Sangre: polimorfonucleares
– Células epiteliales (boca, vagina, piel, folículo
piloso, esperma)
– Sangre materna
– Placenta, líquido amniótico
– Tejidos (toda célula nucleada).
• Antes de realizar cualqiuer técnica molecular es
necesario extraer el material genético, ya sea
ADN o ARN. El ARN es más díficil y se degrada
más rápido.
• EL material genético es purificado y separado de
las proteínas.
• Luego se procede a realizar técnicas de
amplificación (PCR).
• Y a partir de aquí se realizan otras de acuerdo al
objetivo a perseguir.
PCR
• Kary Mullis, 1986: premio
Nobel 1993.

• Es una técnica de
amplificación
enzimática in vitro.
Permite amplificar
fragmentos de ADN en 3
pasos:
1. Desnaturalización del
ADN (95 C).
2. Hibridación (50-65 C)
3. Elongación (por una Taq
polimerasa). (72 C)
Desnaturalizacióm
Hibridación
Elongación
 Resumen

2
3

1
Amplificación por ciclos.
PCR-RT
Utilidades de PCR
• Genotipado: ver el alelo presente.
• Análisis de mutaciones.
• Cuantificar genes relacionados a
enfermedades.

Útil para
TODO
• Diagnóstico DE ENFERMEDADE VIRALES (COVID-
19, VPH), BACTERIANAS (CÓLERA, Y TOS FERINA)
Y GENÉTICAS.
• Tratamiento
– Creación de medicamentos, identificación de dianas
terapeúticas.
• Filiación paterna/materna
• Estudios evolutivos
• Salvamento de especies
• Mejoramiento de alimentos
• Criminalística
– Identificación de cadáveres, violaciones, asesinatos
 PCR
• https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5
gKU
 Diagnóstico de COVID-19 por PCR de
transcripción reversa
• https://www.youtube.com/watch?v=CxSu61U
cQXk
• La PCR de retrotranscripción consiste en
extraer ARN y convertirlo en ADN, y luego
amplificarlo.
• Esta versión se utiliza para el estudio de
microARNs y virus de ARN.
Electroforesis
• Esta técnica se basa en la capacidad de una
sustancia migrar a través de un campo eléctrico.
• La velocidad de migración de las moléculas
depende de su peso y la carga aplicada.
• Existen diferentes tipos.
• Para el estudio de ácidos nucleicos se usan geles
de agarosa. NOS PERMITE VER LOS SEGMENTOS
DEL GEN AMPLIFICACO POR PCR Y DETERMINAR
SU TAMAÑO POR UN MARCADOR.
• Para el estudio de proteínas geles de
poliacrilamida.
https://www.youtube.com/watch?v=K
GZBRfHQU_Y&t=244s
 MUESTRAS ESTUDIADAS
MARCADOR
Secuenciación
• Es el proceso de determinar la secuencia de
nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento
de ADN.
• En la secuenciación de Sanger, el ADN blanco es
copiado muchas veces y se hacen fragmentos de
diferentes longitudes. Nucleótidos fluorescentes
que actúan como "terminadores de cadena"
marcan los extremos de los fragmentos y
permiten la determinación de la secuencia.

• Las técnicas de secuenciación de nueva

generación son estrategias nuevas a gran escala
que aumentan la velocidad y reducen el costo de
la secuenciación del ADN.
 SECUENCIACIÓN SANGER
https://www.youtube.com/watch?v=oeJoTZCRrv
U&t=37s
 SECUENCIACIÓN DE NUEVA
GENERACIÓN (NGS)
• https://www.youtube.com/watch?v=ToKUGz_
YhC4
 TIPOS DE SECUENCIACIÓN
• La secuenciación y la PCR son las principales
técnicas utilizadas en el diagnóstico de
enfermedades a nivel molecular.
– Transcriptoma
– Exoma
– Panel
Transcriptoma
• Transcriptoma: conjunto de todos los ARNs
de una población celular específica.
Transcriptoma
• Usos
– Para estudio de diferenciación celular en células
madres y carcinogénesis.
– Determinar biomarcadores para evaluar riesgos.
– Análisis de los mecanismos moleculares que
controlan el desarrollo embrionario temprano.
Panel de genes
• Panel de genes: si se conoce la enfermedad se
realiza un panel de genes conocidos para
dicha enfermedad.
Panel de genes
• El número de genes analizados es variable (pueden
estudiarse 5, 12, 30 o más de 100 genes para intentar
encontrar la mutación que disparó la enfermedad) y el
conjunto de genes que se analiza en un único estudio
se denomina Panel.
• Existen paneles para enfermedades neurológicas,
cardiológicas, oftalmológicas y muchas otras
especialidades.
• Cuando se encuentra la mutación responsable de la
enfermedad se sugiere estudiar a los familiares
directos para conocer la posibilidad que tienen de
transmitir o desarrollar la misma patología.
 Eje panel

Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen

Exoma
• Exones (180.000) < 2% del genoma humano,
pero contienen ~85% de las variantes
patogénicas conocidas
• El conjunto de todos los exones del genoma
recibe el nombre de Exoma. Se analizan todos
los genes codificantes de proteínas, cuando no
se conoce el gen causante de una
enfermedad.
• TAE: trastorno del espectro autista.
Exoma Vs Panel
Clonación
• Es una técnica por la cual se crean copias
idénticas de una molécula (ADN) o de un
organismo ya formado, de forma in vitro o
artificial.

• Variedad de procesos usados para producir

copias genéticamente idénticas de un ente
biológico. El material copiado o clón, tiene la
misma composición biológica que el original.
• Se pueden clonar, genes, células, tejidos, y
organismos enteros.
Existen 3 tipos:
• Génica: clonar genes
• Reproductiva: crear un organismo completo.
• Terapeútica: se crean embriones para
obtener células madres con el mismo ADN
que el donante y utilizarlas células en
tratamientos o terapias celulares.
(autotransplante).
https://www.youtube.com/watch?v=cRgSIXMpKxg
 Pasos de la clonación
Organismo donador de una célula somática.

Organismo #2, para ser receptor, de este se toman óvulos.

A las 2 células se le extra el núcleo.

Se desecha el del óvulo.

Se introduce el núcleo somático al citoplasma del óvulo.

Sufre división celular.

 Embrión clonado.

Se toman las células y se Se implanta el embrión

aplican al paciente que en el útero de un tercer
donó la célula somática. animal.
Terapeútica Reproductiva
https://www.youtube.com/watch?v=LLqH2i5RvEw
https://www.youtube.com/watch?v=uneFgdgY38k
 Utilidades
• Clonación de animales en peligro de extinción.
• Clonación de animales domésticos.
• Terapia celular e ingeniería tisular.
• Medicamentos.

• https://www.youtube.com/watch?v=xnNNV74
iRR0
Clonación molecular
• ADN recombinante: Es un método de
clonación molecular (génica).
• Se unen secuencias génicas que no están
de forma natural en ese genoma.
• Se utilizan ligasas para unir el gen al
plásmido.
• Enzimas de restricción para cortar.
• Método de producción de insulina.
(primer medicamento recombinante).
• Las llamadas enzimas de restricción se
especializan en el corte de las
moléculas de ADN.
• Se caracterizan por hacer el corte en
lugares específicos, lo que significa
que cada enzima de restricción hará
una incisión única en una secuencia
de ADN en particular, llamada el sitio
de reconocimiento de secuencia.
https://www.youtube.com/watch?v=rjj8ZuCr10w
 Biopsia líquida
• Permite el estudio de
tumores a partir de
muestras de sangre.
• Los tumores liberan
moléculas y células a
los fluidos corporales.
El análisis de estos
componentes puede
revelar gran parte de
la información que
dan las biopsias de
tejido.
-Células tumorales
-ADN tumoral
-microARNS
-exosomas
Tras purificar el
ADN libre
circulante, éste
será sometido
a un análisis
genómico
molecular.
Ventajas
• Detección del cáncer en estadios tempranos.
• Identificar las mutaciones del ADN
• Monitorizar las respuestas de los pacientes a
la terapia durante el tratamiento y una vez
acabado éste. Esta monitorización puede
permitir ajustes del tratamiento en tiempo
real.
• Establecer tratamiento oportuno.
• Técnica cómoda, y no dolorosa.
Limitaciones
• Muchos tipos de cáncer carecen
de biomarcadores bien establecidos.
• El ADN tumoral circulante de la sangre puede
no representar el ADN del tumor total.
Diagnóstico prenatal no invasivo

 El ADN fetal está

presente sangre
periférica materna.
 Diagnóstico prenatal no invasivo

• Características:
– Está fragmentos de
pequeño tamaño.
– Coexiste con ADN
materno.
• Se pueden estudiar:
– Células fetales
(ccfDNA)
• ADN fetal(cffDNA)
Ventajas
• Se evitan las pruebas
invasivas necesarias para
llegar a un diagnóstico
genético.
• Determinación del sexo por
amplificación de secuencias
del cromosoma Y. Todas las
enfermedades ligadas al
cromosoma X son
susceptibles de ser
indicación clínica para el
test de determinación del
sexo fetal.
• Es posible determinar
el factor Rh: permite la
supresión del
tratamiento de
inmunoprofilaxis en
aquellas gestaciones en
las que se
diagnosticaba el feto
como Rh(−).
• Diagnóstico de las aneuploidías:
gracias a la aplicación de la
secuenciación masiva se pueden
detectar las trisomías 13, 18 y 21
en sangre materna.
• Diagnóstico Enfermedades de
herencia dominante: La presencia
o ausencia del alelo mutante
paterno en sangre materna nos
permitirá concluir si el feto es
afecto o sano respectivamente
para dicha enfermedad. Ej. La
enfermedad de Huntington (CH),
distrofia miotónica
Terapéutica genética
• Existen
diferentes
tratamientos
disponibles
dirigidos a
personas con
genes
específicos. Sin
modificación
genética.
Inhibidores de la enzima poli ADP
ribosa polimerasa(PARP)
• Este
medicamento es
para afectados
de mutaciones
de BRCA 1 Y
BRCA 2 con
cáncer.

Mejorar el control de la enfermedad a largo plazo.

 Inmunongenética del cáncer: CAR-T
• Tipo de tratamiento en el que
linfocitos T del paciente se
modifican en el laboratorio
para que ataquen células
cancerosas. Las células T se
extraen de la sangre del
paciente, y en el laboratorio,
se les añade el gen para un
receptor especial que se une
a cierta proteína de las células
cancerosas del paciente.
Grandes cantidades de células
T con CAR se producen en el
laboratorio y se administran al
paciente mediante infusión.
Aplicado a diferentes
leucemias.

https://www.youtube.com/watch?v=UZpHu0gl6LU&pbjreload=10
Modificación genética en humanos

• Tecnología
CRISPR/Cas9: es una
herramienta
molecular utilizada
para “editar” o
“corregir” el
genoma de
cualquier célula in
vivo.
 CRISPR-Cas
• https://www.youtube.com/watch?v=ZoE-
G7YPvZQ
• Kahoot de 10 preguntas miércoles. 4-6