Formulación de un Biocontrolador de Erwinia

Carotovora en Polvo, a Partir de una Cepa de

Bacillus Subtilis Utilizando Secado Spray

Tesis presentada como parte

de los requisitos para optar
al grado de Licenciado en
Ciencia de los Alimentos

Carolina Viviana Ojeda Hitschfeld

Valdivia – Chile
2007
PROFESOR PATROCINANTE:

Sra. Marcia Costa Lobo

Ingeniero Civil Bioquímico
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

PROFESOR PATROCINANTE:

Sr. Luigi Ciampi Panno

Ingeniero Agrónomo, M.Sc. Ph. D.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal

PROFESOR PATROCINATE

Sr. Kong Shun Ah-Hen

Ingeniero en Alimentos
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Esta tesis fue financiada y forma parte del proyecto FONDEF D03I 1140 titulado
“Formulaciones y estrategias para mejorar el biocontrol de enfermedades
en cultivos de elevada importancia socioeconómica en chile. Modelos:
Rhizoctonia solani en papas y Erwinia carotovora en calas”.
 Con cariño a todas las personas
que me han acompañado durante
mi vida, en especial a mi familia.
 AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer en primer lugar a dios, quien ha sido mi luz durante este
camino.

Le agradezco a mi familia, Papis Sergio y Vivi, Hermanos Susan, Alonso y

Seba, abuelos, tíos y primos, quienes en la distancia me apoyaron siempre,
dándome fuerza y amor en los momentos difíciles, y por darme la posibilidad de
crecer tanto espiritual como profesionalmente.

A mis profesores y secretarias sin excepción ya que cada uno contribuyo con un
granito a mi formación, pero en especial a la Profe Marcia por confiar en mi, y el
profe luigi por su ayuda y apoyo.

Agradezco también a todos los tesistas, profesionales, y auxiliares tanto del

Centro Tecnológico de la Leche, como de los institutos de Ciencia y Tecnología
de los Alimentos y de Producción y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral
de Chile, por que contribuyeron desinteresadamente a la realización de esta
tesis.

A Roberto quien, si bien llego a mitad de este camino, me entrego la paciencia,

cariño, apoyo y paz que necesitaba, y a sus padres Luigi y Renate, por sus
consejos y calida acogida.

Finalmente, pero no menos importante a mis amigas de siempre Ely, Yasna,

Zelaya, Karen, Ale, Dani, Ellen, Vale, Caro, Clau y compañeros de carrera y de
“U”, con los que compartí esta bella etapa.

A todos gracias.

"Pide y recibirás.
Busca y encontrarás.
Llama y la puerta se abrirá.
Porque quien pide recibe; quien busca encuentra; y a quien llama se le abre la
puerta". (Jesús de nazaret, Mateo 7, 7-8)
 i

ÍNDICE

Capitulo Página

1 INTRODUCCIÓN 1

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3
2.1 Bioconservación 3
2.1.1 Definición de bioconservación 3
2.1.2 Aplicación de bioconservación 4
2.1.3 Importancia de la utilización de control biológico en la agricultura e 5
industria alimentaría
2.2 Técnicas asociadas a la producción de bioconservadores 7
2.2.1 Secado Spray 9
2.2.2 Agente encapsulante 12
2.2.2.1 Maltodextrina 14
2.2.2.2 Carragenina 14
2.2.2.3 Goma Guar 15
2.2.3 Caracterización reológica del formulado (Viscosidad) 15
2.3 Pudrición blanda cremosa, enfermedad de la cala y su control 18
2.3.1 Erwinia carotovora 18
2.3.2 Bacillus subtilis 18

3. MATERIAL Y MÉTODO 20
3.1. Material biológico 20
3.1.1. Cepa patógena 20
3.1.2. Cepa antagonista 20
3.2. Medios cultivo 20
3.3 ingredientes para las formulaciones 21
3.4 Equipos 21
3.5 Ensayos preliminares 21
3.5.1 Comportamiento de Bacillus subtilis sometido a deshidratación por 22
Secado Spray
3.5.2 Prueba de antagonismo 22
3.6 Preparación y secado Spray de Bacillus subtilis 22
3.6.1 Recuperación de la cepa iniciadora del cultivo de Bacillus subtilis 22
3.6.2 Preparación del inóculo 22
3.6.3 Producción de Bacillus subtilis en fermentador 22
3.6.4 Formulaciones para secado 24
3.6.5 Secado Spray de Bacillus subtilis 25
3.6.6 Evaluación de las fórmulas de biopesticidas deshidratadas 26
3.7 Análisis estadístico 26

4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS 27

4.1 Ensayos preliminares. 27
 ii

4.2 Ensayos definitivos. 28

4.2.1 Producción de Bacillus subtilis en fermentador. 28
4.2.1.1 Recuento. 28
4.2.1.2 Densidad óptica. 30
4.2.2 Secado. 32
4.2.2.1 Selección de agente encapsulante “carrier”. 32
4.2.2.2 Temperatura durante el proceso. 34
4.2.3 Viabilidad y capacidad antagonista remanente de los productos 37
deshidratados.
4.2.3.1 Viabilidad remanente de cada producto deshidratado durante 60 37
días.
4.2.3.2 Persistencia de la capacidad antagonista de cada producto 41
deshidratado durante 60 días.

5 CONCLUSIONES. 45

6 RESUMEN 46

7 BIBLIOGRAFIA 48
 iii

INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Resumen de las ventajas y desventajas de microencapsulación 12

por medio del proceso de secado Spray.
2 Fórmulas base de biopesticidas en polvo a partir de un cultivo de 24
108 ufc/mL de Bacillus subtilis.
3 Recuento promedio de unidades formadoras de colonias a 29
muestras tomadas cada 24 h durante la fermentación de Bacillus
subtilis.
4 Densidad óptica (DO 600nm) a muestras tomadas cada 24hr 30
durante la fermentación de Bacillus subtilis.
5 Viscosidades (Pa s) de cada formulación a diferentes 32
revoluciones por minuto medidas en el equipo automático Visco
Star-R.
6 Pendientes e interceptos de la viabilidad de cada una de las 39
muestras, de correlación exponencial.
7 Pendientes e interceptos de la actividad antagonista de cada una 43
de las muestras, de correlación lineal.
 iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Esquema de un sistema de secado Spray. 10

2 Esquema del flujo de aire y de alimentación, durante el proceso de 10
deshidratación en la cámara de secado.
3 Formación de microgota o neblina en un atomizador rotatorio 11
impulsado por aire comprimido.
4 Curvas de fluidez, esfuerzo de corte versus velocidad de 17
deformación.
5 Línea de flujo elaboración controlador biológico deshidratado a 23
partir de una cepa de Bacillos subtilis.
6 Fermentador artesanal capacidad 9L, propiedad de levaduras 25
Collico prestado para realizar la fermentación
7 Secador Spray Niro Atomizer propiedad del Instituto de Ciencia y 26
Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) de la Universidad Austral de
Chile.
8 Recuento promedio de células totales del cultivo de Bacillus subtilis 29
cada 24 horas durante la fermentación.
9 Curva densidad óptica del cultivo de B. subtilis en fermentador 31
cada 24 horas (Do 600nm).
10 Comparación de viscosidad de distintas formulaciones, medida a 33
diferentes revoluciones por minuto.
11 Temperatura de salida promedio de las tres repeticiones, de cada 36
mezcla a la temperatura de entrada de 160ºC.
12 Temperatura de salida promedio de las tres repeticiones, de cada 36
mezcla a la temperatura de entrada de 170ºC.
13 Temperatura de salida promedio de las tres repeticiones, de cada 37
mezcla a la temperatura de entrada de 180ºC.
14 Viabilidad del Bacillus subtilis antes y después del proceso de 38
secado spray.
15 Efecto del secado Spray a tres diferentes temperaturas de proceso 39
de las tres fórmulas durante el almacenamiento a temperatura
ambiente.
16 Viabilidad remanente de cada prototipo, a partir del primer día 40
después de secado y durante el tiempo de almacenamiento a
temperatura ambiente.
17 Diámetro del halo de inhibición a tiempo cero y 7 días después del 41
proceso de secado spray.
18 Halos de inhibición de cada una de los protopipos durante un 43
periodo de 60 días de almacenamiento a temperatura ambiente.
19 Esquema de antagonismo 51
 v

INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Técnica de la gota sobre césped utilizada durante esta 51

investigación.
2 Temperaturas promedio de entrada y salida durante el proceso de 52
secado para cada muestra en ºC.
3 Recuento de unidades formadoras de colonias promedio de cada 53
muestra para los días 1, 7, 14, 21, 28 y 60.
4 Efecto de cada diferente mezcla a igual temperatura de entrada 54
5 Halos de inhibición promedio (mm) de cada muestra para los días 55
1, 7, 14, 21, 28 y 60.
 1

1. INTRODUCCIÓN

El biocontrol de agentes causantes de enfermedades en las plantas ha surgido como

una alternativa eficaz para controlar patógenos en cultivos agrícolas de importancia
comercial. Entre los microorganismos con capacidad antagonista se destacan especies
del género Bacillus, que generalmente ejercen su biocontrol produciendo metabolitos
con actividad antibiótica.
Por otra parte, el desarrollo de nuevas tecnologías y procesos para la conservación de
microorganismos, que aseguren su calidad y estabilidad en el tiempo, resulta ser una
alternativa interesante para la formulación de preparados y creación de nuevos tipos de
bioinsumos agrícolas y/o alimentarios.
La conservación de cultivos microbianos y su actividad, es esencial para facilitar la
investigación e industrialización. Por ello, las cepas valiosas deben ser mantenidas por
prolongados periodos de tiempo sin que sufran alteraciones en su estructura y
funcionalidad. La elección de un método adecuado de conservación y las óptimas
técnicas de proceso, resultan determinantes para mantener intactas sus
características.
En el Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, de la Facultad de Ciencias Agrarias de
la Universidad Austral de Chile, se ha aislado una cepa de Bacillus subtilis (BC10) que
genera reacción antagonista produciendo metabolitos con actividad antibiótica sobre
Erwinia carotovora, patógeno vegetal responsable de enfermedades en calas y papas.
La hipótesis de este trabajo plantea que: “si se aplica un proceso de deshidratación
mediante secado Spray1, bajo condiciones de proceso controladas, a suspensiones
concentradas de Bacillus subtilis (BC10), se obtiene un concentrado celular en polvo,
viable y con capacidad antagonista frente al Erwinia carotovora”.
Objetivo General
Formular un prototipo de un biopesticida deshidratado en base a células de Bacillus
subtilis con actividad antagonista contra Erwinia carotovora
Objetivos específicos

• Definir un medio de suspensión adecuado para el proceso de secado, que permita

obtener una buena recuperación de células viables de Bacillus subtilis con
capacidad antagonista contra Erwinia carotovora

1
Conocido también como secado por atomización o secado por aspersión.
 2

• Determinar las temperaturas de proceso adecuadas para el secado Spray de

Bacillus subtilis en el equipo Niro Minor.

• Determinar la viabilidad de cultivo deshidratado de Bacillus subtilis y su actividad

antagonista.

• Evaluar la estabilidad al almacenamiento del cultivo deshidratado por secado Spray

durante un periodo de 60 días a temperatura ambiente.
 3

2. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA

2.1 Bioconservación
La bioconservación está considerada por diversos autores como una alternativa factible
dentro de las nuevas tendencias en conservación de alimentos. En este sentido, el
consumidor demanda productos menos industrializados, sin aditivos químicos, más
saludables, que no dejen residuos tóxicos para los consumidores, ni alteren las
características organolépticas del producto, sin embargo, que inhiban con eficacia el
crecimiento de microorganismos patógenos y alterantes (ZAMORA, 2005).
Por otra parte, el uso de biocontroladores en el suelo ha comenzado a utilizarse desde
hace unas décadas. Su propósito ha sido, disminuir el uso de agroquímicos en la
producción agrícola, productos altamente contaminantes y que, además de su elevado
costo, traen como consecuencia el desarrollo de resistencia en la población de
patógenos, así mismo, éstos están asociados a problemas de contaminación y
toxicidad (RODRÍGUEZ, 2002).
Según BETTIOL (1991), citado por GIACAMAN (2006), las presiones económicas y
ecológicas, han llevado a las instituciones ejecutoras y financieras a generar
alternativas al control químico exclusivo para la protección de las plantas. Dentro de
estas alternativas, el control biológico es un método relativamente moderno, cuyo
objetivo principal es el mantener, a través de ciertas prácticas y de la introducción de
una biomasa antagonista, todos los componentes del agrosistema en perfecto
equilibrio.
2.1.1 Definición de bioconservación. No existe aún consenso entre los distintos
autores sobre la definición de un cultivo bioprotector. BAKER y COOK (1974), citado
por RODRÍGUEZ (2002) y por GIACAMAN (2006), definen el control biológico como “la
reducción de la densidad del inóculo o actividad productora de la enfermedad de un
patógeno o parásito en su estado activo o latente, por la acción de uno o más
organismos antagónicos en forma natural o por manipulación del ambiente, hospedero
o de los propios microorganismos”.
La bioconservación se define como la extensión de la vida útil o incremento de la
seguridad del alimento utilizando, su microbiota natural o sus metabolitos para inhibir o
frenar el crecimiento y actividad de microorganismos deteriorantes o patógenos.
Normalmente el término “bioprotección” se relaciona con la inhibición del crecimiento
de microorganismos patógenos, y “bioconservación” se relaciona con la inhibición de
microorganismos deteriorantes (ZAMORA, 2005).
Un cultivo bioprotector se define como aquel capaz de aumentar la seguridad
microbiológica de un alimento, sin alterar sus cualidades sensoriales (ZAMORA, 2005).
Además, al ser incorporados en los alimentos no deben generar malos sabores o
 4

texturas incorrectas y ser viables, pero no crecientes (HASSAN, 2003). La aceptación

de la bioconservación depende de la correcta selección y aplicación de los cultivos
bioprotectores adecuados y de, probablemente, determinadas enzimas para sistemas
alimentarios particulares (ZAMORA, 2005).
BATCH (1964) citado por GIACAMAN (2006), lo define como “la acción de
depredadores, parásitos, o patógenos en el mantenimiento de la densidad poblacional
de otro organismo en un promedio inferior del que ocurriría en su ausencia”.
El control biológico, es la práctica o el proceso por el cual, los efectos indeseables de
un organismo se reducen por la acción de otro organismo que no es la planta
hospedera, ni el parásito o patógeno, ni el ser humano. En otras palabras biocontrol
está mediado por un tercero; en el caso del biocontrol microbiano este es un
microorganismo (GIACAMAN, 2006).
Para BETTIOL (1991) citado por GIACAMAN (2006), una manera tradicional y simple
de definir control biológico de enfermedades de plantas es considerarlo como:”el
control de un microorganismo a través de otro microorganismo”.
2.1.2 Aplicación de la bioconservación. La bioconservación no es nueva para el
sector agrícola y alimentario, puesto que, los seres humanos han estado explotando
las bacterias para la producción y preservación de alimentos durante siglos. Los
microorganismos incluyendo bacterias, levaduras, y mohos se han utilizado desde el
principio de la historia, para la producción de leche fermentada, carne, y productos
vegetales, como también para la fermentación de bebidas tales como vino y cerveza.
Muchos ingredientes utilizados en la industria alimentaría, como las vitaminas,
estabilizantes, saborizantes, colorantes, y preservantes son producidos por
microorganismos. El metabolismo microbiano es el responsable de la producción de
agentes preservantes tales como ácidos, dióxido de carbono y alcohol, así como
también de generar cambios que alteran el sabor, la textura, vida útil, seguridad,
digestibilidad, y calidad alimenticia de alimentos fermentados (HASSAN, 2003).
De acuerdo a ZAMORA (2005), para que un cultivo bioprotector pueda ser considerado
como tal debe cumplir con los siguientes requisitos:
1. No debe presentar riesgo para la salud; no producir toxinas, u otros metabolitos
que puedan influir negativamente en la salud del consumidor y no debe ser
patógeno.
2. Debe tener efectos beneficiosos en el producto:
i.Debe integrarse en el producto y aportar efectos beneficiosos para el mismo.
ii.Debe adaptarse con facilidad al producto.
iii.Su actividad protectora debe ser estable.
iv. Su comportamiento ante una serie de parámetros ambientales debe ser
predecible.
v. Debe ser competitivo ante la microbiota endógena.
vi. Debe poseer actividades enzimáticas deseables (gas, limo, etc.).
3. No debe producir efectos sensoriales negativos en un producto fabricado bajo
buenas prácticas de manufactura.
 5

4. Debe ser capaz de funcionar como indicador de contaminación microbiana ante

condiciones de abuso de temperatura.
Los agentes de biocontrol logran una mejor reducción de la enfermedad vía un
antagonismo microbiano, que implica una interacción directa con el agente causal de la
enfermedad y/o una acción indirecta que implica al hospedero. El efecto directo, es
generalmente un resultado de un antagonismo entre el agente del biocontrol y el
patógeno debido a una acción antibiótica o a competición y/o al parasitismo del
alimento. Por otro lado, la interacción indirecta resulta del realce de los mecanismos de
la defensa de la planta contra el patógeno invasor. La asociación de ambos efectos
puede ser sensible con algunos agentes del biocontrol (EL HASSNI et al., 2007).
2.1.3 Importancia de la utilización de control biológico en la agricultura y la
industria alimentaría. Una clara utilización de biocultivos, bioprotectores o
bioconservadores son los alimentos fermentados. Se definen como aquellos que han
sido sujeto de la acción de microorganismos o de enzimas para producir cambios
bioquímicos deseables. Los microorganismos pueden ser la microflora presente en los
productos vegetales o animales, o se pueden adicionar, al igual que los sustratos. La
fermentación es un proceso relativamente simple, natural, eficiente, barato, y de baja
energía, usado para la preservación de alimentos y que reduce la necesidad de la
refrigeración. Los productos finales de la fermentación influyen en las características
del producto final y dependen de los microorganismos particulares implicados en la
fermentación (HASSAN, 2003).
El control biológico junto con otras medidas ofrece una solución al problema de la
pudrición blanda en calas provocada por Erwinia carotovora. En este ámbito, se han
descrito algunos microorganismos que tienen efectos inhibitorios sobre Erwinia en
tubérculos de papa (EMMERT y HANDELSMAN, 1999). Entre ellos se puede
mencionar a los géneros Pseudomonas spp. (XU y GROSS, 1986 ab) y Bacillus spp.
(VISSER et al., 1986), citados por GIACAMAN, (2006).
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son ideales como cultivos bioprotectores. Forman
parte de la microflora inicial de muchos alimentos, no existe ninguna indicación de que
representen riesgo para la salud del consumidor y son consideradas como GRAS
(reconocidas generalmente como seguras) por la Food and Drug Administration de
EEUU. Además, se sabe que pueden tener un efecto positivo para la salud,
relacionándose con acciones anticancerígenos y de regulación del transito intestinal
(ZAMORA, 2005).
Las bacterias más usadas pertenecen a los géneros Lactobacillus, Lactococcus,
Estreptococcus, Pediococcus, y Leuconostoc. Se utilizan para la producción de la leche
fermentada, carne, y productos vegetales, y producen el ácido láctico como el producto
final primario de la fermentación. Levaduras del género Saccharomyces, usadas para
la producción del vino, cerveza, y pan, liberan etanol y dióxido de carbono como
productos finales primarios del metabolismo. Los hongos filamentosos tales como
Aspergillus, Penicillium, Mucor, y Rhizopus proveen las enzimas que facilitan la
degradación de substratos para la fermentación (HASSAN, 2003).
Se han descrito diversos sistemas de inhibición microbiana desarrollados por bacterias
ácido lácticas, como la producción de ácidos orgánicos, formación de metabolitos de
 6

oxígeno, compuestos orgánicos, antibióticos y bacteriocinas. Estos mecanismos les

permiten inhibir una gran variedad de microorganismos contaminantes, patógenos y/o
deteriorantes como Escherichia coli, Pseudomonas, Samonella, Clostridium,
Staphilococcus y Listeria, y también hongos y levaduras (ZAMORA, 2005).
Varios antagonistas microbianos, algunos de cuales están disponibles en
formulaciones comerciales, han demostrado poseer potencial para el control del
Rhizoctonia solani en papa u otros cultivos del medio ambiente bajo condiciones
estudiadas. Sin embargo, muchos de estos microorganismos no se han estudiado para
la supresión de la enfermedad de R. solani de la papa en su propio ecosistema de
desarrollo. Aunque la eficacia de muchos agentes del biocontrol se ha demostrado bajo
ciertas condiciones, el control de la enfermedad no es siempre constante. Una forma
para mejorar el biocontrol es utilizar múltiples combinaciones de antagonistas eficaces.
Las ventajas de este acercamiento incluyen diferentes mecanismos de acción, efectos
sinérgicos, y mayor gamas de actividad ecológica. El biocontrol puede ser un medio
eficaz de combate en muchos casos donde el control químico no está disponible o es
difícil de practicar (TALBOT, 2005).
Los microorganismos son fáciles de crecer en grandes cantidades y en diversos
sustratos, siendo ideales para la producción de metabolitos primarios y secundarios.
Los tipos de productos químicos producidos por la fermentación microbiana incluyen
acidulantes, aminoácidos, vitaminas, saborizantes, pigmentos, estabilizadores,
espesantes, surfactantes, dulcificantes, polímeros, antioxidantes y agentes
antimicrobianos (HASSAN, 2003).
Se ha estudiado la capacidad inhibitoria de las bacterias lácticas en carne envasada
refrigerada, productos cárnicos y vegetales fermentados, conservas de verduras y
frutas, carne separada mecánicamente, pescado y productos lácteos. En todos los
casos, se describen efectos positivos o al menos prometedores, con muy pocos
problemas secundarios asociados (ZAMORA, 2005).
Para la mayoría de las enfermedades causadas por los patógenos, las estrategias de
control son muy limitadas o casi-inexistentes. Entre estas, el despliegue de cultivos
resistentes aparece ser el acercamiento más conveniente y más económico, sin
embargo, los genotipos con resistencia natural son escasos. Otras estrategias se
basan, según lo demostrado, en el uso de microorganismos tales como bacterias,
levaduras u hongos que tengan un potencial significativo para inhibir agentes causales
de enfermedad o capacidad de realzar mecanismos de defensa. En el caso del
biocontrol de la fusariosis, (enfermedad que ataca la palma datilera) la mayoría de los
estudios han divulgado el uso de cepas no patógenas de Fusarium solamente o
conjuntamente con bacterias tales como Pseudomonas fluorescens (EL HASSNI et al.,
2007).
Existen muchos microorganismos en los suelos de campos de cultivo que ejercen
cierto grado de control biológico sobre uno o muchos agentes fitopatógenos, a pesar
de las actividades humanas. Sin embargo, el hombre ha hecho intentos por aumentar
la efectividad de los microorganismos antagónicos, ya sea introduciendo poblaciones
nuevas y más prolíficas de antagonistas, al mismo tiempo que se agregan a los suelos
nutrientes o estimulantes del crecimiento de los organismos antagónicos,
incrementándose así la actividad antagónica sobre el patógeno (RODRÍGUEZ, 2002).
 7

2.2 Técnicas asociadas a la producción de bioconservadores

El método de conservación ayuda en la disgregación de las células bacterianas en un
ambiente adverso (por ejemplo, del producto del aparato gastrointestinal) reduciendo
así, potencialmente pérdidas y/o viabilidad de las células. A este proceso de
conservación, (secado y medio de suspensión), se le denomina en conjunto
encapsulación o microencapsulacion. El proceso de conservación y el medio de
suspensión influyen directamente en la viabilidad de las bacterias, bajo condiciones
adversas con respecto a cuando las bacterias estaban en el estado no encapsulado
(HASSAN, 2003).
La encapsulación es definida como una tecnología de empaque de materiales sólidos,
líquidos o gaseosos en miniatura. Esto implica el recubrimiento de un ingrediente
sensible, ya sea puro o una mezcla, dentro de un material, para otorgar protección
contra la humedad, calor u otras condiciones extremas, de modo de mejorar su
estabilidad y aumentar su vida útil. En el encapsulado, la porción activa es designada
como núcleo, fase interna o relleno, y el material encapsulante es llamado cáscara,
recubrimiento o material de pared y puede variar tanto en espesor como en el número
de capas. La forma de las cápsulas es generalmente esférica, pero se ven fuertemente
influenciadas por la estructura del material original no encapsulado (ESCALONA,
2004).
Según PEDROZA (2002), en un sentido amplio, la microencapsulación provee un
medio de envasar, separar y almacenar materiales en escala microscópica para su
liberación posterior bajo condiciones controladas. Dentro del término de
microencapsulación, se incluyen las microcápsulas, las micropartículas, nanocápsulas
y sustancias activas atrapadas o embebidas, aunque existe una terminología
específica dependiendo de la industria de aplicación. Por ejemplo, la farmacéutica hace
una distinción entre microcápsulas y microesferas dependiendo de cómo se encuentre
distribuido el material encapsulado dentro de la partícula.
YOUNG et al. (1993), definen la microencapsulación como una técnica "de embalaje"
en la cual gotas líquidas o partículas sólidas son “embaladas” entre las películas
delgadas (finas) de los agentes que microencapsulan. A la estructura formada por el
agente encapsulador se le llama pared, y el material microencapsulado que se
encuentra en el interior se le llama corazón. La pared protege el corazón contra el
deterioro, limita la evaporación (o pérdidas) de materiales volátiles principales, y libera
el corazón cuando las condiciones son las deseadas.
Las demandas tecnológicas, ya sea en procesos de fabricación como en formulación,
que pueden requerir las bacterias seleccionadas, sobre todo para mantener sus
características funcionales, son numerosas. El proceso de conservación seleccionado
debe asegurar la supervivencia y funcionalidad de las bacterias, dentro de los cuales
de distinguen: ultracongelación, liofilización o secado y también en los productos
alimenticios en los cuales finalmente se formulan (HASSAN, 2003).
El éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial para las actividades
de investigación o industriales basadas en la acción de estos microorganismos.
Tomando como ejemplo los procesos de elaboración de alimentos fermentados, donde
participan cultivos microbianos, se encuentra que el éxito de la producción depende
 8

principalmente y directamente de las técnicas de proceso utilizadas, sin embargo lo

que permite estandarizar y mantener la calidad uniforme del producto final es la
correcta selección, mantención, manipulación, siembra y propagación de la cepas
utilizadas, por lo cual la elección del método de conservación utilizado debe permitir
mantener las características del microorganismo por las cuales fue seleccionado
(ZAMORA, 2005).
Un cultivo de aplicación industrial tiene que reunir determinadas características:
contener el máximo número de células viables, estar libre de contaminantes y ser
activo en las condiciones de procesamiento. Esta claro que no existe un método único
para conservar cultivos de microorganismos, luego la selección de este tiene que
basarse en la naturaleza del cultivo y considerar ventajas e inconvenientes del método
escogido (ZAMORA, 2005). Las condiciones bajo las cuales se almacenan y conservan
las bacterias son también importantes para la calidad de productos en los cuales serán
utilizadas. Los métodos de la encapsulación se han aplicado para aumentar la
supervivencia y la distribución de cultivos bacterianos (HASSAN, 2003).
Los cultivos se siembran en medios estériles en poca cantidad y se mantienen activos
mediante refrigeración, pero sólo para periodos de almacenaje cortos. Sin embargo, los
métodos más utilizados para la conservación masiva de cultivos microbianos son
congelación y deshidratación, que permiten mantener cultivos por prolongados
periodos de tiempo conservando la viabilidad de los microorganismos (ZAMORA,
2005).
La viabilidad de los cultivos depende principalmente de: el medio de cultivo base, el
medio de conservación, la rápida eliminación de los metabolitos, la naturaleza del
medio de suspensión y las condiciones de deshidratación o congelación (HASSAN,
2003)
Para preparar las microcápsulas se dispone de numerosas técnicas, y se ha sugerido
que podrían identificarse más de 200 métodos en la literatura de patentes. No
obstante, algunos autores clasifican a los métodos de encapsulación en: químicos y
físicos o mecánicos.

• Como métodos químicos pueden citarse: coacervación compleja, polimerización

interfacial, gelificación iónica, incompatibilidad polimérica y atrapamiento geles o en
liposomas.
• Entre los métodos físicos se encuentran: secado por aspersión y la encapsulación
por lecho fluidizado como los más comunes

La selección del método está en función del presupuesto, los costos, las propiedades
del material a encapsular, el tamaño deseado de las microcápsulas, la aplicación y de
los mecanismos de liberación. Existen varios métodos para lograr la encapsulación de
ingredientes entre los que se encuentran: secado Spray, recubrimiento en suspensión
de aire, extrusión, Spray cooling y Spray chilling, coacervación, complejos de inclusión
y polimerización interfacial. (PEDROZA, 2002).
El método de secado Spray es el método más utilizado en la industria de alimentos,
debido a que es un proceso económico, flexible y produce partículas de buena calidad.
 9

2.2.1 Secado Spray. (Secado por atomización) El método de secado por atomización
es uno de los más importantes métodos para secar determinados productos líquidos
como leche concentrada, extractos concentrados de café, huevos, extractos de
levadura, caseína, zumos de frutas, té, sangre y otros concentrados proteicos. Para
ello se atomiza (es decir, se transforma en aerosol o niebla) una solución o suspensión
más o menos viscosa del producto, las pequeñas gotas líquidas así formadas se
arrastran y deshidratan en una corriente de aire dando un polvo seco antes de caer
sobre las paredes interiores de la torre de secado, las partículas de polvo al final del
proceso tienen una forma esférica vacía en su interior que permite una fácil
rehidratación (ZAMORA, 2005).
La calidad del producto tratado no se altera debido a que la intensa evaporación
protege al producto del efecto de la elevada temperatura del aire caliente (el proceso
de evaporación absorbe buena parte del calor aportado). En realidad, la energía
aportada en forma de calor cede al producto el calor latente de vaporización haciendo
que el incremento de temperatura de las partículas (debido al calor sensible) sea muy
bajo. Por otra parte, la tasa de reacciones degradativas disminuye a bajos contenidos
de humedad, y eso favorece que el corto tiempo de exposición de la partícula seca a
temperaturas elevadas no comporte un deterioro importante al producto (ZAMORA,
2005).
Este proceso consiste en atomizar el material que se encuentra en estado líquido, ya
sea como solución o como dispersión, en forma de finas gotas sobre una corriente de
gas calentado. Cuando las pequeñas gotas del líquido toman contacto con el gas a
mayor temperatura se produce una rápida evaporación del solvente, formándose una
fina película del material de recubrimiento que se encuentra disuelto en él. Las
microcápsulas usualmente caen en el rango de varios micrones hasta
aproximadamente 200 µm. En este proceso, se pueden identificar tres pasos básicos:

• Preparación de la dispersión o emulsión a ser procesada.

• Homogeneización de la dispersión.
• Atomización de la masa dentro de la cámara de secado.

Este proceso se realiza en un secador Spray que se compone básicamente de un

sistema de alimentación del líquido, un dispositivo de atomización (disco que gira a alta
velocidad), una cámara de atomización y un sistema colector del producto seco
(ESCALONA, 2004).
La rápida evaporación del agua del recubrimiento durante su solidificación mantiene el
material núcleo por debajo de los 100ºC, a pesar de las altas temperaturas utilizadas
en el proceso. Esto, junto a que el tiempo de exposición a temperaturas elevadas es
muy corto (5 a 20 s) hace a este proceso apropiado para materiales sensibles al calor
(PEDROZA, 2002).
Este método es el más ampliamente usado para encapsular ingredientes alimenticios y
es el más económico. También se ha utilizado para la elaboración de dietas
microencapsuladas para acuicultura, aunque no de manera intensiva. Este proceso es
en sí uno de deshidratación, pero se considera también de encapsulación ya que
puede producir partículas que atrapan el material a cubrir (PEDROZA, 2002).
 10

FIGURA 1 Esquema de un sistema de secado Spray2

Flujo de
alimentación
Flujo de
aire: Línea
roja.

Producto
en polvo

FIGURA 2 Esquema del flujo de aire y de alimentación, durante el proceso de

deshidratación en la cámara de secado.3

El “Secado Spray” corresponde a la transformación de un fluido en un material sólido,

atomizándolo en forma de gotas minúsculas en un medio de secado en caliente
(PEDROZA, 2002).

2
http://www.kr.cd-pco.com/press_events/Dynamics/22/inzo.html
3
http://br.geocities.com/abgalimtec/desidratacao.html
 11

FIGURA 3 Formación de microgota o neblina en un atomizador rotatorio

impulsado por aire comprimido.4
La distribución del tamaño de las partículas obtenidas por este método es en general
menor a 100 µm, aunque hay que destacar que ello depende de las condiciones del
proceso. El proceso consiste de la preparación de la emulsión o suspensión del
material a encapsular en una solución de encapsulante, la atomización y la
deshidratación de las partículas atomizadas. La adecuada selección del atomizador y
el agente encapsulante, son factores críticos. Una de las grandes ventajas de este
proceso, además de su simplicidad, es que es apropiado para materiales sensibles al
calor, ya que el tiempo de exposición a temperaturas elevadas es muy corto (5 a 30 s)
(PEDROZA, 2002)
Las ventajas del secado por atomización según MASTERS (1991), citado por ZAMORA
(2005), son las siguientes:

• Las especificaciones de los polvos permanecen constantes a lo largo del secado

cuando las condiciones de secado son constantes.
• Una operación de secado continua y fácil se puede adaptar a un control automático
completo.
• Existe un amplio intervalo de diseño de secadores, adaptables y que se pueden
aplicar a materiales sensibles al calor, corrosivos y abrasivos.

Las desventajas más grandes de este proceso son los costos de instalación, eficacia
térmica, calor residual, y manejo del aire agotado en condiciones de saturación.
Los encapsulantes o materiales formadores de pared más utilizados para este método
han sido: Carbohidratos (almidón y derivados, maltodextrinas, jarabes de maíz,
ciclodextrinas, carboximetilcelulosa y derivados); gomas (arábiga, mezquite, alginato
de sodio); lípidos (ceras, parafinas, grasas) y proteínas (gelatina, proteína de soya,
caseinatos, suero de leche). Desde luego que el tipo de material encapsulante tendrá

4
http://www.niroinc.com/html/drying/fdspraychem.html
 12

influencia en la estabilidad de la emulsión antes de secar, en el tamaño de partícula, en

las propiedades de flujo, en las mecánicas y en la vida útil del material deshidratado
(PEDROZA, 2002).
La encapsulación por medio del secado Spray es el método más usado por la industria
alimentaría por ser de bajo costo, económico y flexible, existe una gran variedad de
equipos en el mercado que producen partículas de alta calidad. Las ventajas y
desventajas del secado Spray se resumen en el CUADRO 1 cuando el secado Spray
con pequeñas cantidades de agente ligante como proteínas o polisacáridos solubles en
agua se obtiene partículas pequeñas y es posible controlar la estructura porosa de los
gránulos (HASSAN, 2003).
CUADRO 1 Resumen de las ventajas y desventajas de microencapsulacion por
medio del proceso de secado Spray.

Ventajas Desventajas
Materiales encapsulados son solubles
Tecnología conocida solo en agua con una baja a moderada
viscosidad.
Solo el 20-30% de la partícula es
Producción de gran cantidad de capsulas
corazón.
Muchos materiales encapsulados están Al encapsular compuestos con alto
aprobados para empleo de alimentos. contenido lipídico estos se oxidan.
Perdida de compuestos de bajo punto de
Variedad de tamaños de partículas
ebullición.
Útiles para ingredientes sensibles al
calor. Es necesario utilizar un agente
Excelente dispersión de las antiaglomerante.
microcápsulas en medios acuosos.

FUENTE. HASSAN, 2003.

2.2.2 Agente encapsulante. Independientemente del método para preparar las
microcápsulas, el primer paso para encapsular un ingrediente es la selección de una
matriz de encapsulación adecuada o carrier (PEDROZA, 2002).
Existe una amplia variedad de materiales de recubrimiento; sin embargo, es importante
considerar las características de éste en cuanto a flexibilidad, fuerza o resistencia,
permeabilidad, facilidad de aplicación, naturaleza hidrofóbica o hidrofílica, ya que todas
ellas influirán en las características del producto final (ARANCIBIA, 1981 y
ESCALONA, 2002). A estas características se le debe adicionar una condición
expresada por HASSAN (2003), quien dice que el agente encapsulante ideal debe
cumplir con buenas características reológicas y facilidad de manipulación al momento
de la encapsulación.
En vista de la utilidad del microencapsulación hay algunas publicaciones que se
ocupan del efecto de diversos polisacáridos y de los materiales de la cápsula
especialmente (HASSAN, 2003).
 13

La encapsulación de ingredientes en la industria de alimentos permite: (DZIEZAK,

1988)

• Estabilizar el material núcleo.

• Controlar la liberación del material núcleo (velocidad y comienzo de la liberación).
• Separar reactivos o componentes incompatibles en una formulación.
• Protección de componentes sensibles del alimento (luz, humedad, calor).
• Aseguramiento contra pérdidas nutricionales.
• Utilización alternativa de ingredientes sensibles.
• Incorporación de mecanismos de liberación inusuales de tiempo dentro de la
formulación.
• Enmascarar o preservar sabores y aromas.
• Transformar ingredientes líquidos en sólidos fácilmente manejables.

Entre los materiales de recubrimiento utilizados están los polisacáridos (almidón,

maltodextrinas, ciclodextrinas, carboximetilcelulosa, gomas arábica, mezquite, alginato
de sodio), lípidos (ceras, grasas) y proteínas (gelatina, proteína de soja, caseinatos,
suero de leche, zeína) (PEDROZA, 2002).
Cuando se usan polisacáridos como agentes encapsulantes, como en el secado por
aspersión, también deben revisarse detalladamente sus propiedades funcionales. Por
ejemplo, las maltodextrinas se usan en combinación con goma arábiga para contribuir
en la continuidad estructural durante la formación de la película encapsulante, al
combinar dos compuestos de muy diferente peso molecular (aproximadamente 1.8 kDa
y 1.700 kDa respectivamente) mejorando con ello la eficiencia de encapsulación de
aceites, aún de bajo peso molecular. Sin embargo, el grado de hidrólisis de las
maltodextrinas también es un factor a considerar, ya que muy bajos equivalentes de
dextrosa no tienen el efecto positivo mencionado (PEDROZA, 2002).
Otro tipo de agente ampliamente utilizado en la formación de paredes de las
microcápsulas cuando se encapsula por secado por aspersión, son proteínas como los
aislados del suero de leche, que resultan adecuados para este proceso donde una de
las restricciones es usar sólo materiales que aún en alta concentración sean de baja
viscosidad, condición que cumplen. Pueden utilizarse solas o combinadas con
carbohidratos para modificar las propiedades de la pared y el tamaño de las partículas.
El uso de proteínas de suero de leche tiene efecto sobre la morfología de las
microcápsulas haciéndolas más esféricas y de superficie tersa en comparación con las
de polisacáridos (PEDROZA, 2002).
La microencapsulación en la industria de alimentos generalmente se aplica a
sustancias volátiles, condimentos, vitaminas, aceites esenciales y oleorresinas,
bacterias, enzimas, y minerales. Aunque muchas técnicas de microencapsulación han
sido desarrolladas, el secado Spray o por aspersión es el más usado comúnmente
para microencapsular ingredientes de alimentos (GOUNG et al, 1993).
El material de la pared para microencapsulación por secado Spray debe poseer alta
solubilidad y capacidad de emulsificación para la formación de la película, y además
buenas propiedades al momento de secar; además, sus soluciones concentradas
deben tener viscosidad baja. Aunque muchos “carrier” estén disponibles para usos no
alimenticios, la variedad de materiales aprobados para usos de alimentos es limitada e
 14

incluye gomas naturales, hidratos de carbono, ceras, y algunas proteínas (GOUNG et

al, 1993).
En la actualidad existen numerosos ingredientes encapsulados: agentes saborizantes,
ácidos, bases, endulzantes artificiales, colorantes, preservantes, agentes leudantes,
aromas y nutrientes (DZIEZAK, 1988).
La encapsulación es definida como una tecnología de empaque de materiales sólidos,
líquidos o gaseosos en miniatura. Esto implica el recubrimiento de un ingrediente
sensible, ya sea puro o una mezcla, dentro de un material para otorgar protección
contra la humedad, calor u otras condiciones extremas, de modo de mejorar su
estabilidad y aumentar su vida útil. En el encapsulado, la porción activa es llamada
núcleo, fase interna o relleno, y el material encapsulante es llamado cáscara,
recubrimiento o material de pared y puede variar tanto en espesor como en el número
de capas. La forma de las cápsulas es generalmente esférica, pero se ven fuertemente
influenciadas por la estructura del material original no encapsulado (DZIEZAK, 1988).
2.2.2.1 Maltodextrina. La FDA define las maltodextrinas como un polímero sacárido
nutritivo no dulce que consiste en unidades de D-glucosa unidas principalmente por
enlaces α (1-4) y que tienen un equivalente de dextrosa (ED) menor que 20. Es
preparado como un polvo blanco o en solución concentrada por hidrólisis parcial del
almidón de maíz o de papa con ácidos permitidos o enzimas. Las maltodextrinas son
clasificadas por su ED. El ED se relaciona con el grado de polimerización (GP) de la
molécula de almidón, de acuerdo a ED = 100/GP. El grado de polimerización
corresponde al número de unidades monoméricas o monosacáridas. A más alto ED
mayor es el número de unidades monosacáridas y los polímeros son de cadena más
corta. La glucosa (dextrosa) posee un ED = 100 y el almidón es aproximadamente
cero. Debido a que las maltodextrinas consisten en una mezcla de polímeros de varios
largos (glucosa, maltosa, oligosacáridos y polisacáridos) el ED es un valor promedio.
Las maltodextrinas presentan baja higroscopicidad, buena solubilidad y bajo poder
edulcorante. Son utilizadas en la industria de alimentos en caramelos (30%), pastelería
(20%), sopas y caldos (20%), productos lácteos (10%), bebidas cítricas (10%),
alimentos para bebés (10%), entre otros (ESCALONA, 2002).
2.2.2.2 Carragenina. Es un polisacárido que naturalmente llena los vacíos en la
estructura celular de algas rojas. Polisacárido de alto peso molecular con unidades de
galactosa y 3,6-anhidrogalactosa (3,6-AG), tanto sulfatado como no sulfatado, unido
por enlaces 1,3 y 1,4 a acoplamientos glicosídicos. Varias las disposiciones que
ocurren naturalmente de componentes crean tres tipos básicos de carragenina,
comúnmente mencionaba kappa, beta, y lambda. Las variaciones de estos
componentes influyen en la fuerza de gel, textura, solubilidad, sinergismos, y la
temperatura a la que solubiliza. Todas las carrageninas son solubles en el agua
caliente, desarrollando muy bajo viscosidad en fluidos durante este proceso (HASSAN,
2003).
Los geles formados pueden ser licuados nuevamente calentándolos a
aproximadamente 5-10 grados sobre la temperatura de gelificación (40-70°C). La
carragenina pertenece a una familia de hidrocoloides que poseen diferentes
propiedades y, por lo tanto, poseen una amplia variedad de usos. Los empleos más
importantes están en el agua y mezclas a base de leche, que se utilizan como
 15

cobertura de tortas o en bebidas de chocolate (usos de hinchamiento en alimentos

calientes-procesados, y usos de hinchamiento en alimentos procesados por frío)
(HASSAN, 2003).
La carragenina ha tenido mucha utilidad en la industria alimentaría como mezcla o
componente exclusivo en gran variedad de productos como agente encapsulados de
microorganismos y reductor de la pérdida de humedad, la oxidación, o la
desintegración. Los geles de carragenina son termo reversible. A causa de su
reactividad con ciertas proteínas, la goma ha encontrado el empleo en concentraciones
bajas (típicamente 0,01 al 0,03 %) en un número de productos de alimentación
(HASSAN, 2003).

La “Carragenina Lambda (λ)” es la única fracción de carrageninas que no requiere de

calor para su solubilización, es soluble en agua y leche fría, impartiendo alta viscosidad
en estos sistemas haciéndola altamente recomendable para preparaciones en polvo
instantáneas, poseen un contenido aproximado de 35% de éster sulfato y 0% de 3,6
AG lo que le confiere su alta capacidad de agente espesante y estabilizante
(GELYMAR, 2007)
2.2.2.3 Goma Guar. La goma Guar es un polisacárido de alto peso molecular que se
obtiene del endosperma de la semilla del Syamopsis tetragonolobus, planta que
pertenece a la familia de la leguminosas, su aspecto corresponde a un polvo blanco o
ligero amarillo de sabor neutro o insípido, químicamente la goma Guar es un
galactomanano formado por monómeros de manosa y galactosa en una relación de
2:1, tiene un bajo contenido de proteínas (4,5%). La molécula de Guar es un polímero
lineal de peso molecular aproximado de 220 kDa (GELYMAR, 2007).
Se dispersa y solubiliza en agua fría y caliente, y es insoluble en solventes orgánicos.
Se hidrata fácilmente y aporta alta viscosidad a bajas concentraciones, la viscosidad
depende de la concentración, temperatura, tiempo de agitación, tamaño de partícula,
actúa sinérgicamente con la goma xantán produciendo notable aumento de viscosidad,
es de naturaleza no iónica y es compatible con prácticamente todos los hidrocolides de
origen vegetal, incluyendo almidones y CMC. El rango de pH óptimo de trabajo es de 3
a 11. (GELYMAR, 2007).
Tiene diversos usos en alimentos, productos farmacéuticos y aplicaciones industriales.
Se puede usar como ingrediente por si solo o en combinación con otros hidrocolides
como goma xantán. Su característica como fijador de agua lo hace ideal como agente
de hidratación rápida en la formulación de soluciones coloidales viscosas (GELYMAR,
2007).
2.2.3 Caracterización reológica del formulado (Viscosidad). Además de cumplir la
función de carrier, el agente encapsulante le da al fluido las características reológicas
apropiadas para que, a su paso por el atomizador, genere las microgotas del tamaño y
consistencia adecuados, para el secado en la cámara.
El conocimiento de las características reológicas es de gran importancia práctica en la
optimización de operaciones industriales, como el bombeado, mezclado,
calentamiento, enfriamiento, secado por aspersión (Spray) y otros que involucran
transferencia de masa y calor (PERRY, 1997).
 16

Un fluido es una sustancia que sufre continuas deformaciones cuando se le somete a

un esfuerzo de corte o cizalla y la resistencia que ofrece el fluido a estas
deformaciones se denomina consistencia. La viscosidad (µ) es para líquidos simples o
newtonianos una medida de su consistencia (PERRY, 1997).
La fuerza por unidad de área que se requiere para el movimiento de un fluido se define
como F/A y se denota como “σ” (tensión o esfuerzo de corte o cizalla). Según Newton
la tensión de cizalla o esfuerzo cortante es proporcional al gradiente de velocidad
(dV/dy). En los fluidos llamado newtonianos la proporcionalidad es lineal y constante.
Si se duplica la fuerza, se duplica el gradiente de velocidad, ello lo indica la Ley de
Newton, expresada por:

⎛ dV ⎞
τ = µ ⎜⎜ ⎟⎟ , donde µ es la viscosidad.
⎝ dy ⎠
La viscosidad se define como la relación del esfuerzo cortante en un punto (τ) y el
gradiente de velocidad; es una medida de la fricción interna del fluido, que tiende a
oponerse a cualquier cambio dinámico del movimiento (REID y SHERWOOD, 1968).
El estudio de la respuesta de los materiales a esfuerzos se conoce como reología. En
este concepto el fluido newtoniano es viscoso. Los fluidos no newtonianos también son
materiales viscosos en los cuales el esfuerzo cortante esta relacionado con la tasa de
corte dV dy . Un fluido no newtoniano cuyo comportamiento se describe mediante la
n
⎛ dV ⎞
ecuación: τ = k ⎜⎜ ⎟⎟ , donde τ es el esfuerzo cortante, k y n son constantes. Con
⎝ dy ⎠
n <1 se conoce como pseudoplástico; este nombre se origina porque con el incremento
de la tasa de corte, existe una curiosa disminución de la viscosidad efectiva. Es decir,
con un incremento en el gradiente de velocidad el liquido se adelgaza, es decir la curva
pseudoplástica cae por debajo de la línea del fluido newtoniano. En la FIGURA 4 se
muestra la curva esfuerzo de corte-gradiente de velocidad. Muchos fluidos no
newtonianos son pseudoplásticos. Por otra parte, si n >1, el fluido se conoce como
dilatante; aquí el fluido se engruesa con un aumento del esfuerzo de corte (SHAMES,
1999).
A modo de resumen. Los fluidos newtonianos muestran una relación lineal entre τ y
dV dy . En este caso τ = µ (dV dy ) , donde µ es la “viscosidad verdadera” (FRYER,
1997). Los fluidos pseudoplásticos y dilatantes muestran una relación no lineal entre
τ y dV dy que en ambos casos se representa por la “Ley de la Potencia”
n
⎛ dV ⎞
τ = k ⎜⎜ ⎟⎟ ; k y n son parámetros del modelo de flujo.
⎝ dy ⎠
k se denomina “índice de consistencia” mientras que n es el “índice de
comportamiento”. Para los fluidos pseudoplásticos se cumple que n<1 mientras que
n>1 ocurre para los dilatantes. La Ley de la Potencia representa al fluido newtoniano
cuando n=1 (FRYER, 1997).
 17

FIGURA 4. Curvas de fluidez, esfuerzo de corte versus velocidad de deformación.

FUENTE: FRYER (1997).
Las medidas de viscosidad se realizan con aparatos denominados viscosímetros o
reómetros. Este último término se reserva para aparatos más complejos que son
capaces de explorar un amplio intervalo de esfuerzos cortantes y velocidades de corte
así como de registrar variaciones de los parámetros reológicos con el tiempo (FRYER,
1997).
Los diferentes reómetros son clasificados por el fundamento en el que basan la medida
que puede ser, el originar un flujo mediante una presión conocida (viscosímetros de
flujo) u originando un movimiento circular en el interior de un receptáculo
(viscosímetros rotacionales) (FRYER, 1997).
Los rotacionales son equipos muy versátiles que pueden estudiar el comportamiento
reológico en cualquier rango incluso en fluidos con partículas en suspensión. Son de
gran precisión. Pueden estudiar incluso viscoeláscidad. Se basan en un elemento
rotacional que impone una determinada velocidad de rotación para la que se calcula la
velocidad de corte correspondiente y el esfuerzo cortante que requiere del elemento
motor. No pueden ser usados en línea (FRYER, 1997).
Los de cilindros concéntricos y platos tienen un rango de aplicación muy grande.
Por su geometría τ y dV dy pueden ser deducidos muy fácilmente. Son aparatos de
precisión, normalmente automatizados y por ello son caros. No son adecuados para
medir fluidos con partículas en suspensión (FRYER, 1997).
 18

2.3 Pudrición blanda cremosa, enfermedad de la cala y su control

La enfermedad conocida como pudrición blanda cremosa o pudrción húmeda, es
provocada por Erwinia carotovora y cepas de Bacillus subtilis pueden ejercer su
control.
2.3.1 Erwinia carotovora. Según KUNSTMANN (2002), la patología más importante
que afecta a cala, provocando importantes pérdidas económicas, es la incidencia de la
pudrición blanda en tejidos de túberos, causada por Erwinia carotovora subsp.
carotovora.
Los miembros del género Erwinia, pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, son
bacilos rectos 0,7-1,5 µ, Gram negativos, no esporulados, móviles por flagelos
perítricos. Son anaerobios facultativos, catalasa negativa y oxidasa positiva, las
colonias son usualmente blancas, grises o amarillentas, con temperaturas óptimas de
cultivo de 27-30º C (GIACAMAN, 2006).
Dentro del género Erwinia, se encuentra un grupo patogénico que se caracteriza por
causar la putrefacción blanda en muchas especies de plantas a nivel mundial. Dentro
de este grupo se encuentran, E. carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp.
atroséptica, las que crecen a temperaturas diferenciales, es decir E. carotovora subsp.
carotovora crece a 27 y 33,5°C, y atroséptica crece a 27°C (GIACAMAN, 2006).
Las bacterias del género Erwinia que causan pudrición blanda se encuentran sobre la
superficie de las plantas o en el suelo. Las vías de penetración son a través de heridas
o de aperturas naturales en la superficie de la planta. Una vez dentro, estos residen en
el tejido vascular y espacio intracelular del tejido parenquimático. La principal arma que
utilizan estas bacterias para causar la enfermedad, es la producción de múltiples
exoenzimas, como las pectinasas, celulasas y proteasas, que destruyen la pared
celular tanto del túbero como del tallo de la planta. Erwinia carotovora, es un miembro
de la familia Enterobacteriaceae recientemente llamadas Pectobacterium carotovorum.
Son Gram negativos, poseen flagelos perítricos, producen enzimas pectinolíticas que
causan pudrición blanda y se encuentra a nivel mundial sobre un amplio rango de
hospederos (GIACAMAN, 2006).
Las plantas infectadas se tornan amarillas, emitiendo un fuerte olor desagradable,
pudiendo ser completamente macerada al cabo de unos días provocando su muerte
(GIACAMAN, 2006). BLOM y BRONCEA (1999) citado por GIACAMAN (2006), aclara
que la infección no siempre resulta en la putrefacción blanda de los tejidos, sino que,
en algunas oportunidades la bacteria puede permanecer en forma latente durante
mucho tiempo.
2.3.2 Bacillus subtilis. En la búsqueda y selección de microorganismos como
agentes de biocontrol, el género Bacillus spp. ha resultado de gran eficacia en el
control de fitopatógenos (GIACAMAN, 2006).
Las especies incluidas el género Bacillus spp. comprenden un gran número de
diversas formas bacilares, son Gram positivas, oxidasa y catalasa positivas. Son
bacterias móviles por flagelos perítricos y aerobios estrictos en su mayoría. En medios
de cultivo líquidos crecen formando un “velo” en la superficie. Los miembros de este
género son capaces de producir endosporas, las que resisten altas temperaturas y
 19

factores físicos perjudiciales como la desecación, la radiación, los ácidos y los

desinfectantes químicos (GIACAMAN, 2006).
Bacillus como grupo ofrece varias ventajas sobre otras bacterias para la protección
contra patógenos de la raíz debido a su capacidad de formar endosporas, y al amplio
espectro de actividad de sus antibióticos. El tratamiento de semillas con agentes
biocontroladores es apropiado para el biocontrol de los patógenos del suelo y de la
propia planta. Hay mucha información de cepas de Bacilus spp. que reprimen
patógenos del suelo. La colonización de la rhizosfera y el control de la enfermedad
desde la raíz con especies de bacilos introducidos como inóculos de la semilla, ha sido
también divulgado (CAVAGLIERI et al., 2005).
Bacillus subtilis, es la especie tipo del género, se encuentra comúnmente en el suelo y
se caracteriza por ser una bacteria Gram positiva, catalasa positiva, producir una gran
variedad de proteasas y otras enzimas que le permiten degradar una variedad de
sustratos naturales contribuyendo al ciclo nutritivo. Respecto a las características de
las colonias, éstas se pueden observar redondeadas o irregulares, de superficie opaca,
color crema o café (GIACAMAN, 2006).
B. subtilis, es un microorganismo inocuo, no es considerado patógeno o toxigénico de
los humanos, animales, o plantas, por lo que el potencial riesgo asociado al uso de
este, en instalaciones industriales es bajo. Es usado en la producción comercial ya que
posee una reconocida actividad antimicrobiana, lo cual ha permitido emplearlo como un
agente de control biológico. Bacillus subtilis produce más de dos docenas de
antibióticos, donde la clase predominante son los de naturaleza peptídica (GIACAMAN,
2006).
 20

3. MATERIAL Y METODOS

La presente investigación consistió en diseñar prototipos y posterior evaluación in vitro

de un biopesticida deshidratado en base a una cepa de Bacillus subtilis (BC10). Esta
presenta actividad antagonista al agente causal de la pudrición humeda Erwinia
carotovora. La evaluación considera viabilidad de la cepa y persistencia de la
capacidad antagonista frente al patógeno.
Las experiencias prácticas se realizaron en las Plantas Piloto Productos Lácteos y de
Procesamiento de Productos Vegetales, laboratorios del Instituto de Ciencia y
Tecnología de Alimentos (ICYTAL) y laboratorio de Bioinsumos del Instituto de
Producción y Sanidad Vegetal, de la Universidad Austral de Chile, Valdivia, Xª Región.
3.1 Material biológico utilizado
Para realizar el estudio se usaron dos cepas bacterianas:
3.1.1 Cepa patógena. La cepa patógena utilizada es Erwinia carotovora aislada de
túberos de calas putrefactas, facilitada por el Instituto de Producción y Sanidad
Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile. Esta cepa
se mantiene en agar inclinado en refrigeración a 5ºC y se debe reactivar en caldo soja
en horno a 25ºC durante 24 horas antes de utilizar.
3.1.2 Cepa antagonista. Corresponde a una cepa de Bacillus subtilis (BC10), aislada
desde el ambiente natural en el laboratorio de fitopatología del Instituto de Producción
y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de
Chile. Esta cepa es mantenida en medio melaza a temperatura ambiente.
3.2 Medios de Cultivo

• Agar Papa Dextrosa APD, (Oxoid), para recuento de Bacillus subtilis y para
efectuar las pruebas de actividad antagonista.
• Caldo cerebro corazón (Difco), para hidratar y reactivar la cepa de Bacillus subtilis
deshidratado.
• Caldo soja (Difco), para reactivar Erwinia carotovora.
• Agua peptonada medio de dilución (peptona al 0,01%) para efectuar recuentos de
Bacillus subtilis.
• Medio melaza. Medio utilizado para cultivar Bacillus subtilis, ha demostrado tener
alto rendimiento de biomasa, bajo costo y fácil preparación, además de mantener
la capacidad antagonista de la cepa (GIACAMAN, 2006), contiene:

- Melaza de remolacha, proporcionada por la empresa Levaduras Collico.

- Azúcar Iansa como fuente de sacarosa.
 21

- Extracto de levaduras, Difco.

- Sulfato de amonio (NH4)2SO4, Merck.
- K2HPO4, KH2PO4, J.T.Baker.
- Agua corriente de la llave, como fuente agua y de sales para medio melaza.
- Antiespumante.

3.3 Ingredientes para las formulaciones

• Carragenina Lambda, Gelymar.

• Goma Guar, Gelymar.
• Maltodextrina de 19-20% ED, Prinal.

3.4 Equipos
Para llevar a cabo los ensayos fueron necesarios los siguientes equipos:

• Autoclave, All-American modelo x2430(25x).

• Bomba peristáltica, Watson Marlon 3025.
• Balanza analítica, Arquimed.
• Cámara de flujo laminar, Factomed y Eaci Envirco.
• Circulador de agua termorregulado, HAAKE. FK..
• Compresor, Mosay Compressor 3HP Italia.
• Compresor, Hydrovane, 50L-18Bar.(Fluid Force).
• Espectrofotómetro, Spectronic Genesys 5.
• Fermentador artesanal, facilitado por Industria Levaduras Collico S.A..
• Horno 25ºC, Imperial II incubator.
• Horno 32ºC, Memmert Cientec.
• pHímetro, Mitutoyo CD-6”C (Hanna Instrument).
• Pie de metro, Bench Meters,(Hanna instrument).
• Refrigerador, Bosch.
• Secador, Niro Atomizer serie 1853, Denmark.
• Shaker, Agitador orbital termorregulado, Max Q 4000 (BI Barnstead).
• Viscosímetro, Visco Star –R, Fungilab S.A.
• Materiales de uso habitual de laboratorio, tales como: matraces, probetas, material
de vidrio para almacenaje y toma de muestra, cronómetro, cubetas, pipetas,
micropipetas, placas de Petri de vidrio y desechables, etc.

3.5 Ensayos preliminares

Se realizaron pruebas preliminares, para comprobar la factibilidad de someter a la cepa
BC10 de Bacillus subtilis, a un proceso de deshidratación a altas temperaturas como el
secado Spray.

500mL Bacillus subtilis con Secado Spray

1 x 109ufc/ml + Temperatura entrada: 170ºC
150g maltodextrina Temperatura salida: 93ºC
 22

3.5.1 Comportamiento de Bacillus subtilis sometido a deshidratación por

Secado Spray. Se preparó una fórmula de cultivo de Bacillus subtilis de 109 ufc/mL en
medio melaza (500 mL) y se mezcló con maltodextrina, se dejó reposar por 12 h en
refrigeración y se secó por atomización en un equipo Niro Atomizer con temperaturas
del aire de entrada y salida 170ºC y 93ºC, respectivamente.
3.5.2 Prueba de antagonismo. La prueba de antagonismo se realizó a muestras de
cultivo celular líquido y en polvo hidratado. Se utilizó la técnica de gota sobre césped
(ANEXO 1) en duplicado.
3.6 Preparación y secado Spray de Bacillus subtilis
En la FIGURA 5 se muestra un esquema de los pasos a seguir para la preparación y
posterior secado de Bacillus subtilis.
3.6.1 Recuperación de la cepa iniciadora del cultivo de Bacillus subtilis. La cepa
iniciadora del cultivo para el presente ensayo, debe tener buena viabilidad y capacidad
antagonista frente a E. carotovora. Al momento de comenzar el ensayo se contaba con
B. subtilis (BC10) conservado de tres métodos distintos, entre los cuales se debió
escoger la cepa que presente mejor respuesta al momento de realizar pruebas de
antagonismo enfrentándolo con dos cepas de E. carotovora y que a su vez presente
rápida reactivación y morfología característica en su estado no esporulado.
Los cultivos puros de B. subtilis (BC10) estaban congelados en leche y glicerol, y
deshidratado ( muestra de pruebas preliminares). Se procedió a sembrar 0,1 mL, 0,1
mL y 0,1 g respectivamente, en 10 mL Caldo Cerebro Corazón y se incubó a 32ºC por
24 horas. Posteriormente, se sembró en estrías por agotamiento en placas con agar
APD y se incubó a 32ºC. Paralelamente, a cada uno se le realizaron pruebas de
antagonismo enfrentándoles a dos cepas de Erwinia carotovora. Fue necesario realizar
tinción de Gram a una colonia aislada de cada placa para comprobar pureza y
morfología.
3.6.2 Preparación del inóculo. A partir de una cepa pura de Bacillus subtilis
reactivada en caldo cerebro corazón, se inoculó al 1% en medio melaza estéril y se
incubó en agitador orbital a 120 rpm a 32ºC por 72 h o hasta alcanzar un mínimo de
108ufc/mL. Para obtener de esta manera, 600 mL de inóculo para la fermentación. Se
tomó una muestra de 5 mL, para realizar recuento de células viables (ufc/mL), medir
densidad óptica del cultivo (DO600nm) y preparar un nuevo inóculo.
3.6.3 Producción de Bacillus subtilis en fermentador. Para realizar este ensayo se
requería de 15 L de cultivo, con altas concentraciones de biomasa (mínimo 108ufc/mL),
los cuales se obtuvieron por medio de un sistema de producción por lotes, en un
fermentador con capacidad máxima 9 L, y que, cuenta con los requerimientos mínimos
para el desarrollo del Bacillus subtilis, es decir, con sistema de aireación y control de
temperatura (FIGURA 6).
El sistema de aireación se logró mediante una parrilla perforada ubicada en la base
interna del equipo, circuito al cual se conecta un compresor de aire. El aire que ingresa
al fermentador es filtrado para mantener la pureza del cultivo y su flujo se controlará
manualmente según los requerimientos del cultivo. El equipo no contaba con sistemas
de agitación forzada.
 23

Recuperación y
activación de cepa pura
Verificar pureza y
morfología Preparar medio melaza

Repicar cepa

Producción inóculo (32°C-48 h)

Verificar pureza,
morfología y recuento
de células totales

Producción de cultivo en
fermentador (32°C-72 h)
Recuento de células
totales inicial y c/24 h

Almacenamiento y
decantado de cultivo (24 h)
Verificar pureza y
morfología

Preparación muestras
Recuento, prueba
antagonismo,
viscosidad

Enfriado (24 h)

Secado muestras

Recuento y prueba
Análisis muestras antagonismo

FIGURA 5 Línea de flujo elaboración controlador biológico deshidratado a partir

de una cepa de Bacillus subtilis
 24

El sistema de calefacción se logró mediante un serpentín interno el cual se conectaba

a un circulador de agua termorregulado que mantenía la temperatura del proceso a
32ºC. El fermentador no contaba con control de pH, por lo tanto el medio de cultivo
melaza, fue preparado con buffer pH 5,5, y agua de la llave para aportar sales. El
fermentador con 7,5 L de medio melaza fue esterilizado en autoclave y luego se
inoculó con 600 mL de cultivo.
El crecimiento de cultivo fue controlado en base a muestras a tiempo 0, 24, 48 y 72 h
determinando cada vez:

• Pureza, mediante tinción de Gram,

• Recuento de Unidades Formadoras de Colonia (ufc/mL), y
• Densidad óptica (DO600nm).

Una vez terminada la fermentación se usó un recipiente estéril de 15 L, donde se

acopiaron los lotes de producción de Bacillus subtilis, estos se mantuvieron a
temperatura ambiente, estático y sellado, hasta que fueron dosificadas en muestras
para deshidratado mediante secado Spray.
3.6.4 Formulaciones para secado. El secado Spray del Bacillus subtilis, fue la etapa
más sensible del experimento, debido a las altas temperaturas que implica el proceso.
El cultivo celular, que fue seleccionado y preparado, para ser secado, en las etapas
anteriores, presentó baja viscosidad y bajo contenido de sólidos, características
importantes de un fluido que se desea secar.
Se prepararon tres fórmulas, en base al cultivo de Bacillus subtilis, las cuales se
diferenciaban entre si, por el tipo y cantidad de agente aglutinante que se le adicionó,
lo que aumentará la viscosidad y el contenido sólidos en suspensión. Los agentes
aglutinantes que se usaron en las diferentes fórmulas, se muestran en el CUADRO 2.
CUADRO 2 Fórmulas base de biopesticidas en polvo a partir de un cultivo de 108
ufc/mL de Bacillus subtilis

Agente aglutinante en base de 500 ml de cultivo

Fórmula
celular
1 50 g Maltodextrina y 1,5 g Carragenina λ
2 6 g Goma Guar
3 150 g Maltodextrina

El proceso comenzó con el pesaje de las materias primas y posteriormente se

adicionaron lentamente a matraces con 500 mL de cultivo, con agitación a temperatura
ambiente hasta lograr una solución homogénea. Finalmente se dejó en reposo a
temperatura de refrigeración por 24 h para inducir la esporulación del Bacillus subtilis,
condición favorable al momento de aplicar secado Spray.
Las viscosidades de cada formulación fueron medidas a temperatura de 25ºC en el
viscosímetro Visco Star –R, equipo automático, a diferentes revoluciones por minuto de
manera de obtener una curva comparativa de viscosidad de cada mezcla y determinar
de esta manera con que tipo de fluido se está trabajando.
 25

FIGURA 6 Fermentador artesanal capacidad 9L, propiedad de levaduras Collico

prestado para realizar la fermentación.
3.6.5 Secado Spray de Bacillus subtilis. Las fórmulas 1, 2, 3, se deshidrataron en
una torre de secado Spray NIRO Atomizer (FIGURA 7). Los parámetros de proceso
utilizados, para cada fórmula se muestran a continuación, donde se indica con x cada
prototipo obtenido, los que se recepcionaron directamente en un frasco de vidrio estéril,
para evitar contaminación y que absorbiera humedad.
Temperatura Entrada (ºC) Temperatura Salida (ºC)
Fórmula
160 170 180 85/95 90/100 95/105
1 1.1 1.2 1.3 1.1 1.2 1.3
2 2.1 2.2 2.3 2.1 2.2 2.3
3 3.1 3.1 3.1 3.1 3.1 3.1
 26

FIGURA 7 Secador Spray Niro Atomizer propiedad del Instituto de Ciencia y

Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) de la Universidad Austral de
Chile.
3.6.6 Evaluación de las fórmulas de biopesticidas en polvo logradas. Una vez
deshidratadas las fórmulas, a cada una se le realizó un recuento de unidades
formadoras de colonia (ufc/mL), y prueba de antagonismo.
Los análisis antes mencionados se realizaron a las 24 h para continuar a los días 7, 14,
21, 28 y 60 días, después de secada cada fórmula.
3.7 Análisis estadístico
Para el análisis de los resultados se usó Microsoft Excel aplicando regresión a cada
experimento, observando las pendientes, determinando la existencia de diferencias
entre las fórmulas, desde el punto de vista de la viabilidad de la célula y de su
capacidad antagonista.
 27

4. PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS

Las características propias de las bacterias del genero Bacillus las hace resistentes a
diversas condiciones del medio ambiente, lo que sugiere que puedan ser
comercializadas como ingredientes de biopesticidas, ya que al ser formadoras de
endosporas, pueden permanecer en estado de latencia durante largos períodos de
tiempo resistiendo condiciones desfavorables (VENEGAS et al., 2005).
Entre los microorganismos más importantes usados en el control biológico se
encuentran las bacterias del género Pseudomonas y Bacillus y hongos de los géneros
Glioctadium, Fusarium y Trichodema (BETTIOL, 1991). El género Bacillus incluye una
variedad de especies de importancia industrial y es conocido históricamente por su
amplio uso en la conservación de alimentos. B. subtilis, es un microorganismo
considerado no patógeno o toxigénico de los humanos, animales, o plantas, por lo que
el potencial riesgo asociado a su uso en instalaciones industriales es bajo. Esto es
confirmado por GIACAMAN (2006), quien afirma que B. subtilis, es la especie tipo del
género Bacillus que con mayor frecuencia ha sido informada por su capacidad de
producir sustancias antibióticas contra patógenos vegetales.
Por otra parte, se tiene conocimiento que la cepa B. subtilis BC-10, presenta actividad
antagonista contra E. carotovora, estudios preliminares lo confirman (GIACAMAN,
2006).
4.1 Ensayos preliminares
Son numerosos los estudios que demuestran la efectividad de B. subtilis para ejercer
antagonismo contra hongos y bacterias patógenas, mediante la producción de
sustancias bactericidas o bacteriostáticas. La posible aplicación de esta cepa a cultivos
de carácter comercial y su capacidad de formar esporas rápidamente al someter la
célula a un cambio de temperatura, llevó a la idea de estudiar una forma de producirla
masiva y económicamente, por lo cual se pensó en someter esta cepa a secado Spray,
para obtener un producto deshidratado, que sea fácil de transportar, comercializar y
usar, estableciéndose que para este ultimo punto el producto resultante, debiera
contener células viables, con actividad antagonista y ser estable en el tiempo. Por lo
tanto, para la realización de este trabajo fue fundamental realizar ensayos preliminares,
que consistieron en producción de una pequeña porción de cultivo concentrado en
polvo para de verificar la premisa de que la cepa resistía el tratamiento.
El producto obtenido en el prueba preliminar presentó una apariencia granular similar a
la leche en polvo, aroma dulce producto de la melaza, y color café lechoso, el
rendimiento no fue determinado dado el pequeño volumen de trabajo. El recuento de
células viables practicado reveló un promedio de 109 ufc/mL, no obstante lo dificultoso
que resultó estimarlos, dada la esporulación de la cepa.
Asimismo, tanto muestras de polvo, tal cual, como suspensión líquida reconstituida
presentaron evidente antagonismo frente a Erwinia carotovora, la primera, sin
 28

embargo, presentó una excesiva demora ya que al encontrarse deshidratada tardó mas
tiempo en salir de su estado esporulado, por lo tanto para efectos posteriores la prueba
de antagonismo se realizará luego de una hidratación previa de las células por un
periodo no mayor a las 12 horas.
Según los resultados obtenidos de los ensayos preliminarmente, se pudo concluir, que
sí es posible producir, a partir de un concentrado celular de Bacillus subtilis, un
biopesticida en polvo con actividad biológica antagonista frente a Erwinia carotovora.
4.2 Ensayos definitivos
Es importante señalar que previo a esta etapa se produjo un siniestro de consideración
en dependencias del ICYTAL, donde se perdieron todos los equipos automáticos
(fermentador de 14 L New Brunswick, centrífuga continua y equipo concentrador de
microfiltración Sprintrex) donde se tenía programado realizar las fermentaciones.
Lo anterior desencadenó una serie de contratiempos por lo que se debió optar por usar
equipos artesanales antiguos reacondicionados para desarrollar este trabajo.
4.2.1 Producción de Bacillus subtilis en fermentador.
La producción del cultivo de B. subtilis se realizó en un fermentador artesanal, que
cuenta sólo con control de temperatura y aireación, este es un sistema muy
rudimentario, considerando que existe tecnología con la cual es posible producir un
cultivo puro con control de temperatura, aireación, pH, toma muestras en línea, etc.
Al realizar la fermentación es importante analizar las muestras al microscopio para
controlar la pureza del cultivo, además de la concentración, durante la fermentación,
fue posible apreciar que se trataba de bacilos Gram positivos y en algunos casos con
esporas en su interior.
4.2.1.1 Recuento. Resulta particularmente complejo efectuar recuentos de células
viables de B. subtilis, ello debido a la facilidad para formar endosporas, lo cual entrega
resultados poco exactos. Es así como, no obstante las muestras obtenidas son
analizadas inmediatamente realizando las diluciones correspondientes, durante este
procedimiento es probable que la célula forme esporas, por lo tanto al momento del
recuento en placa se observaban colonias en diferentes estados de crecimiento,
producto de esto el recuento se realizó a las 24 horas de incubación a 32ºC. Los
resultados obtenidos, (CUADRO 3) a pesar de la dificultad propia del género Bacillus,
fueron similares para el original y su duplicado (duplicado en placa). Las colonias que
se desarrollaron se apreciaban de una forma y tamaño irregular, de borde estrellado y
textura seca y opaca. Ambas observaciones confirman la pureza del cultivo y coinciden
con lo indicado por GIACAMAN (2006).
Sin embargo existen antecedentes previos, que indican que los recuentos celulares a
cepas de Bacillus, no se pudieron llevar a cabo debido a sucesivos incrementos y
reducciones, dando resultados poco lógicos y no repetitivos, bajo las mismas
condiciones medioambientales algunas bacterias pueden reactivarse rápidamente,
formando grandes colonias mientras que otras retardan su activación observándose
colonias muy pequeñas.
 29

CUADRO 3. Recuento promedio de unidades formadoras de colonias a muestras

tomadas cada 24 h durante la fermentación de Bacillus subtilis.

Muestra Recuento de células totales (ufc/mL)*

Inóculo 7,00E+09
0 horas 5,50E+07
24 horas 1,68E+09
48 horas 3,64E+09
72 horas ** 2,00E+10
(*)
Corresponde al promedio de tres lotes de producción.
(**)
Este recuento corresponde al tiempo 0, o recuento previo al secado.

1,00E+11

2,00E+10

1,00E+10
3,64E+09
Recuento (ufc/mL)

1,68E+09

1,00E+09

1,00E+08 5,50E+07

Recuento (ufc/mL)

1,00E+07
0 horas 24 horas 48 horas 72 horas

Tiempo de fermentación

FIGURA 8 Recuento promedio de células totales del cultivo de Bacillus subtilis

cada 24 horas durante la fermentación.
En el sistema de fermentación utilizado el cultivo presenta un crecimiento lento con
niveles de biomasa bajos, obteniéndose un recuento de 2*1010 ufc/mL a las 72 h de
proceso (FIGURA 8), estudios realizados por GIACAMAN (2006) demuestran que esta
cepa es capaz de alcanzar concentraciones más altas en periodos de tiempo
considerablemente menores.
Es así como, GIACAMAN (2006), realizó estudios de cinética de crecimiento de la cepa
BC10 en medio melaza los cuales mostraron una corta fase exponencial con un rápido
crecimiento de cuatro a seis horas, alcanzando la fase estacionaria al cabo de las seis
a siete horas aproximadamente, proceso de fermentación realizada en un equipo
automático.
 30

Cabe destacar, que la concentración alcanzada en la fermentación es muy importante

para la producción del biopesticida, ya que a mayor concentración al final de proceso
de fermentación (inicial de secado), se puede obtener mayor concentración en el
producto deshidratado. Siendo entonces posible alcanzar biomasas más altas
concentrando el cultivo antes de utilizarlo.
4.2.1.2 Densidad óptica. Las muestras fueron tomadas en conjunto con las de
recuento de unidades formadoras de colonias, reservándose bajo condiciones de
refrigeración por el periodo de espera andes de ser analizadas. Al momento de realizar
la medición de densidad óptica, éstas eran homogenizadas y diluidas tres veces para
obtener valores confiables. En lo reportado por GIACAMAN (2006) la cepa fue diluida
hasta 6 veces.
Existen estudios previos de esta célula en los cuales se realizaron curvas de
crecimiento que relacionan los recuentos (ufc/mL), con densidad óptica, indicando
claramente los periodos de crecimiento, fase estacionaria y latencia, no obstante no fue
posible guiarse por esas curvas, ya que el proceso de fermentación usado presenta
condiciones muy distintas, observándose un lento crecimiento de la cepa.
En el CUADRO 4 y FIGURA 9 se presentan datos y gráfico que indican la tendencia,
magnitud y tiempo de crecimiento de la cepa durante la fermentación.
CUADRO 4. Densidad óptica (DO 600nm) a muestras tomadas cada 24 h durante la
fermentación de Bacillus subtilis.

Muestra Densidad óptica 600nm

Inóculo 2,3760
Tiempo 0 0,6805
24 horas 0,9105
48 horas 1,0665
72 horas 1,7175

Se puede observar a partir de los datos entregados en el CUADRO 4, que el proceso

de fermentación presentó deficiencias, ya que las absorbancias obtenidas son bajas y
el tiempo de fermentación muy extenso, esto es producto de condiciones deficientes,
sin control automático de pH, y aireación sin agitación.

Los resultados obtenidos bajo este procedimiento, no son exactos (no se realizó
repetición) lo que podría justificar los bajos resultados y la diferencia con respecto
análisis de investigaciones previas de GIACAMAN, 2006. Sin embargo, cabe destacar
que los equipos utilizados para los procesos de fermentación en matraz agitado en
Shaker y de fermentación por “batch” de 7,5 litros no son los mismos, mostrando la
mayor diferencia en el fermentador, respecto de lo también efectuado por GIACAMAN,
2006.
Es posible apreciar que el inóculo presenta mayor densidad óptica que el producto
obtenido del fermentador, de lo cual se podría deducir que es mejor durante este
experimento realizar cultivos en matraz y no en fermentador, pero, la capacidad de
producción es fundamental al momento de disminuir tiempos totales de proceso
 31

(fermentación-secado), por lo que es necesario realizar los cultivos en fermentador.

Además es importante considerar que el equipo utilizado era de emergencia y, por lo
tanto, presentaba deficiencias para controlar los parámetros óptimos de proceso.

10
Densidad óptica (600nm)

1,7175

1,0665
0,9105
1 0,6805

densidad óptica (600nm)

0,1
0 horas 24 horas 48 horas 72 horas

Tiempo de fermentación

FIGURA 9 Curva densidad óptica del cultivo de B. subtilis en fermentador cada

24 horas (Do 600nm).

GIACAMAN (2006), llevó a cabo la producción de la cepa de B. subtilis en las

modalidades de cultivo en matraz agitado, batch de 1 L, batch de 14 L y cultivo
continuo de 1 L. La densidad óptica obtenida del cultivo en batch de 14 L fue tres veces
mayor a la del cultivo “batch” de litro y 4 veces mayor a la obtenida en matraces
agitados, esto estaría relacionado al hecho de que en los fermentadores de laboratorio
se está regulando el pH, la temperatura, el flujo de oxígeno y la agitación en forma
automática, en cambio el cultivo en matraces carece de tal control. Por otro lado, el
equipo en que se realizaron los cultivos en batch de 14 L permite una mejor aireación y
agitación que un sistema batch de L.

El seguimiento del cultivo mediante análisis de densidad óptica, resulto ser

fundamental para observar el crecimiento de esta cepa, sin embargo, no fue
contrastado ni calibrado con otros procedimientos.
Por otra parte, se puso énfasis en la realización de recuentos de células viables a
través de la determinación de unidades formadoras de colonias (ufc/mL) intentando
perfeccionarlo hasta obtener resultados representativos y repetitivos, ya que durante el
proceso de elaboración del biopesticida la célula se somete a deshidratación, siendo
por lo tanto la única opción para determinar viabilidad celular en el tiempo.
A pesar de que el proceso de fermentación es un factor primordial para obtener un
producto de alta viabilidad, ya que la concentración final del producto deshidratado es
 32

directamente proporcional a la concentración del cultivo a secar, debido a los

inconvenientes del equipo artesanal, el ensayo se dirigió a estudiar el porcentaje de
viabilidad residual, para de esta manera, extrapolar los resultados a procedimientos
similares en los que se cuente con concentraciones superiores.
4.2.2 Secado.
Una ves realizadas las pruebas preliminares, con las cuales se concluye que es posible
deshidratar células de B. subtilis, se continua con la investigación, seleccionando
agentes encapsulantes y temperaturas de proceso de secado spray.
4.2.2.1 Selección del agente encapsulante “carrier”. Las sustancias que se usaron a
modo de “carrier” fueron maltodextrina, carragenina λ y goma Guar, para lo cual se
tomaron en consideración sus propiedades funcionales, costo y referencias de
estudios previos donde fueron utilizados.
A continuación se esquematiza la concentración de “carrier” que conforman cada una
de las formulas a modo de referir posteriormente a las fórmulas 1, 2 o 3.

Concentración de cada Formulación

F1 F2 F3
10% p/v Maltodextrina + 0,3% p/v 1,2% p/v Goma 30% p/v
Carragenina λ Guar Maltodextrina

Previo al proceso de encapsulación mediante secado Spray, se realizaron diferentes

pruebas donde se varió el porcentaje de “carrier” de modo de formar una solución de
viscosidad adecuada para el proceso de secado Spray, realizando inspecciones
visuales y mediante el equipo Visco Star-R
CUADRO 5. Viscosidades (Pa s) de cada formulación a diferentes revoluciones
por minuto medidas en el equipo automático Visco Star-R.

Viscosidad de cada formulación (g/cm*s)

Revoluciones por
minuto F1 F2 F3
5 0,092 0 0
6 0,098 0 0
10 0,089 0 0
12 0,086 0 0
20 0,0795 0 0,021
30 0,0715 0 0,019
50 0,0675 0,0175 0,0235
60 0,0655 0,0185 0,0245
100 0,0645 0,021 0,0305

Es posible observar (FIGURA 10) que las viscosidades de cada muestra resultaron
diferentes, destacando por su diferencia la muestra “F1” que contiene 10% de
maltodextrina y 0,3% de carrageninaλ, esta formulación presenta mayor viscosidad por
 33

su contenido de carragenina λ, polisacárido que se caracteriza por tener alta capacidad

viscosante, por sobre las otras dos formulaciones que se diferencian por el tipo y
contenido de sólidos. Cabe destacar que la muestra “F3” presenta un contenido de
sólidos adecuado para proteger a las células durante el secado.

0,12

0,1
Viscosidad (Pa s)

0,08

0,06

0,04

0,02

0
5 6 10 12 20 30 50 60 100

Revoluciones por minuto (Rpm)

Formulación 1 Formulación 2 Formulación 3

FIGURA 10 Comparación de viscosidad de distintas formulaciones, medida a

diferentes revoluciones por minuto.
La característica de cada una de estas mezclas a destacar al momento de observar la
grafica la viscosidad versus revoluciones por minuto es que las mezclas difieren en el
tipo de fluido que representan. La mezcla “F1” constituye un fluido característico
pseudoplástico que al aumentar la velocidad de deformación (revoluciones por minuto)
disminuye su viscosidad y el esfuerzo cortante. Las mezclas “F2” y “F3” representan un
fluido típico dilatante el cuál aumenta su viscosidad y esfuerzo cortante al aumentar la
velocidad de deformación, estas dos últimas mezclas, sin embargo difieren en grado de
viscosidad, esto se debe a las características particulares de cada “carrier”.
La torre de secado cuenta con un aspersor rotatorio que gira por sobre las 1000rpm lo
que determina que la viscosidad de entrada a la cámara de secado para el caso del
fluido pseudoplástico disminuye y para los fluidos dilatantes la viscosidad aumenta.
También se puede apreciar de la gráfica anterior, una tendencia a estabilizar la
viscosidad de los fluidos “F1” y “F2” no así el fluido “F3” que aun se muestra aumento a
las 100rpm.
ESCALONA (2004), utilizó 10% de maltodextrina y 2% de aislado proteico de soja
(APS) como agentes encapsulantes de colorantes alimentarios, mayores porcentajes
de APS elevaron la viscosidad dificultando el secado Spray.
WAGNER y WARTHESEN (1995), estudiaron el efecto de dextrosa equivalente, (DE)
de almidones y la influencia del porcentaje de agente encapsulante, para α y β
carotenos de zanahoria, en la efectividad de encapsulación. Encontraron que
 34

almidones hidrolizados de alto DE retienen mejor los productos a encapsular. Además

demostraron que cuanto mayor es la proporción de agente encapsulante utilizado en la
mezcla, menos es la velocidad de degradación ya que cuando hay más agente
encapsulante el contenido de carotenos superficiales es menor; la velocidad de
degradación disminuye en un 75 % cuando se utilizó 25% de almidón hidrolizado 15
DE. Maltodextrinas de bajo DE dan baja estabilidad porque contienen grandes
cantidades de azúcares de cadena larga que causan que la barrera sea inflexible y
más permeable al oxígeno.
Del párrafo antes citado, se puede deducir que al utilizar alto porcentaje de
maltodextrina como agente encapsulante (F3), existe una mayor proporción de células
que quedan atrapadas por el agente y no expuestas la superficie, lo que contribuye a
una mejor viabilidad del producto después de ser sometido a secado Spray, y al mismo
tiempo una mejor estabilidad en el tiempo, ya que las células se van liberando
paulatinamente.
Aunque las proteínas son un agente ampliamente utilizado en formulados
deshidratados, para este caso se prefirió trabajar con polisacáridos, y almidones,
buscando el efecto de éstos en la conformación del polvo, es decir contenido de
sólidos y viscosidad del fluido previo secado Spray, sin considerar las capacidades de
fuente de energía que éstos puedan tener al reconstituir el producto antes de su
aplicación. Cabe destacar que la Maltodextrina es ampliamente utilizada en
formulaciones en polvo, ya que presenta excelentes cualidades al momento de
hidratar.
4.2.2.2 Temperatura durante el proceso. Para un correcto secado Spray la
preparación de la materia prima se debe realizar bajo condiciones higiénicas, de modo
de no contaminar los cultivos; el concentrado celular fue dosificado a matraces
estériles en raciones de 500 mL de cultivo puro por mezcla a deshidratar, luego se les
adicionó el o los carrier correspondiente(s), una vez homogenizado el formulado, se
dejó en reposo durante 24 horas a temperatura de refrigeración para promover la
esporulación de las células.
En esta etapa se cuenta con tres distintas mezclas, cada una de ella fue sometida a
tres temperaturas de entrada diferentes durante el proceso de secado Spray, de esta
manera se obtuvieron 9 formulados deshidratados distintos rotulados con numeración
por ejemplo “1.1”, donde el primer numero indica la mezcla y el segundo numero indica
la temperatura de secado utilizada, cada proceso de deshidratación fue repetido tres
veces. La elección de las temperaturas de proceso fue en base al ensayo preliminar y
la bibliografía existente para procesos similares.
Las temperaturas de proceso utilizados por ESCALONA (2004), fueron:

• T° entrada = 117 ± 5°C y T° salida = 75 ± 5°C para la solución con maltodextrina, y

• T° entrada = 95 ± 5°C y T° salida = 65 ± 5°C para la solución con APS.

El flujo de aire 600 l/h, velocidad de alimentación 5ml/min, presión de atomización fue
20 psi.
 35

Las temperaturas antes citadas, ESCALONA (2004), son bajas debido a las
características de la sustancia a deshidratar y lo sensible que esta puede ser a la
temperatura. En la presente investigación se tiene en conocimiento, por los ensayos
preliminares, que B. subtilis, cepa BC-10 es resistente a temperaturas altas de
proceso.
CORCORAN et al. (2004), utilizaron una temperatura de entrada 170 ºC y salida entre
85-90 ºC para el estudio de la supervivencia de un lactóvacilo probiótico en presencia
de sustancias prebióticas, formulo un producto en a base de una combinación de
probióticos en un esfuerzo por generar productos combinados polvo.
HASSAN (2003), Realizó un estudio de influencia de material de encapsulación y
viabilidad de Lactobacillus acidophilus posterior a un proceso de sacado Spray, bajo
los siguientes parámetros de proceso: temperatura de entrada del aire de secado 170
ºC y temperatura de salida 55 ºC. Parámetros similares encontramos en otros autores
como ZAMORA, (2005) que utilizó dos temperaturas de entrada de 170 y 160 ºC, con
diferentes temperaturas de salida, entre 90-99 ºC y 80-85 ºC para la primera y 80-85ºC
para la segunda. Por su parte YOUNG et al, (1993) utilizaron temperaturas de 160ºC
de entrada y 80 ºC de salida.
La torre de secado Spray NIRO Atomizer, cuenta con un sistema de control de la
temperatura por medio de resistencias que calientan el aire de entrada a la cámara de
secado, por lo tanto la temperatura de entrada (160ºC, 170ºC y 180ºC) fue regulada y
se mantuvo constante durante el proceso de deshidratación. La temperatura de salida
del producto deshidratado, fue variable, ya que está se controla mediante el flujo de
alimentación a la cámara de secado.
El equipo de secado utilizado en este estudio, no cuenta con un sistema de
alimentación que genere un flujo constante y cuantificable, por lo tanto la alimentación
se realizó por gravedad (lo que varió levemente la velocidad de alimentación), y fue
regulada sólo por medio de una llave mariposa manual de poca precisión.
En las siguientes figuras (FIGURAS 11, 12 y 13) se representan, las temperaturas de
salida cada 3 minutos durante los procesos de secado, a una temperatura de entrada
constante e igual para las diferentes mezclas. Las tablas de datos se encuentran en el
ANEXO 2 donde se incluye un detalle de la temperatura de entrada y salida de cada
proceso de secado.
La temperatura de entrada para estas tres mezclas se mantuvo constante a 160ºC, y
se puede observar como a una temperatura de entrada similar la temperatura de salida
varia según la característica particular de cada mezcla. Es así como se puede destacar
que la F2 que presenta una viscosidad más baja y menor contenido de sólidos,
presentó la temperatura de salida más elevada, demostrando que la temperatura de
salida se ve afectada por el flujo de alimentación y éste a su vez por la viscosidad y el
contenido de sólidos.
En conclusión a mayor viscosidad y contenido de sólidos, menor temperatura de salida,
lo cual es ideal para que el producto no se altere.
En las FIGURAS 12 y 13, se puede observar como el efecto de la temperatura afecta
las características reológicas de los formulados, que al aumentar la temperatura
 36

disminuye la viscosidad de un fluido pseudoplástico, lo que implica que el flujo de

alimentación se altera, la temperatura de salida aumenta.

105,0

100,0

95,0
Temperatura (ºC)

90,0

85,0

80,0

75,0

70,0
1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (s)
Temperatura salida fórmula 1 Temperatura salida fórmula 2
Temperatura salida fórmula 3

FIGURA 11 Temperatura de salida promedio de las tres repeticiones, de cada

mezcla a la temperatura de entrada de 160ºC.

115,0

110,0

105,0
Tempetura (ºC)

100,0

95,0

90,0

85,0

80,0
1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (s)

Temperatura salida fórmula 1 Temperatura salida fórmula 2

Temperatura salida fórmula 3
 37

FIGURA 12 Temperatura de salida promedio de las tres repeticiones, de cada

mezcla a la temperatura de entrada de 170ºC.

120,0

115,0

110,0
Tempratura (ºC)

105,0

100,0

95,0

90,0
85,0

80,0
1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (s)
Temperatura salida fórmula 1 Temperatura salida fórmula 2
Temperatura salida fórmula 3

FIGURA 13 Temperatura de salida promedio de las tres repeticiones, de cada

mezcla a la temperatura de entrada de 180ºC.

4.2.3 Viabilidad y capacidad antagonista remanente de los productos

deshidratados. Cada prototipo de mezcla deshidratada fue almacenado en frascos de
vidrio estériles de capacidad medio litro y mantenidas a temperatura ambiente ( ± 20ºC)
durante 60 días. Se extrajeron muestras los días 1, 7, 14, 21, 28 y 60 para realizar los
respectivos recuentos, verificando el porcentaje de viabilidad remanente y pruebas de
antagonismo, verificando persistencia de la capacidad antagonista.
4.2.3.1 Viabilidad remanente de cada producto deshidratado durante 8 semanas.
Es evidente que después de un proceso de deshidratación por calor la viabilidad
disminuye drásticamente en la mayoría de los casos; la FIGURA 14 muestra la
viabilidad del B. subtilis después del proceso de secado Spray, mostrando las
diferentes muestras obtenidas, según “carriers” y temperatura de proceso.
Es posible apreciar que todas las mezclas disminuyen su viabilidad en uno o dos ciclos
logarítmicos, producto del proceso de secado Spray al que fueron sometidas, si bien
los valores que se observan son relativamente altos estos pueden ser aun mayores si
el proceso de fermentación se realizara en un equipo automatizado y que cuente con
las condiciones adecuadas para un crecimiento rápido y mayor del B. subtilis lo que
entregaría mejores resultados post-secado.
Existen estudios que demuestran que es posible mantener la viabilidad después del
proceso de deshidratación por atomización. ZAMORA (2005), demostró que la
viabilidad se mantenía cuando neutralizaba el pH de sus muestras, confirmando una
relación entre neutralidad y supervivencia de las cepas, factor que no fue considerado
 38

en este estudio ya que se mantuvo el pH del medio en el que crece el B. subtilis (pH
5,5 valor de pH de los suelos del sur de Chile).

1,00E+10

1,00E+09
Viabilidad (ufc/g)

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06
1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3
Prototipos
Muestras
Recuento tiempo cero Recuento después de secado

FIGURA 14. Viabilidad del Bacillus subtilis antes y después del proceso de
secado Spray.
Para obtener la viabilidad remanente de cada una de las mezclas es necesario realizar
recuento de unidades formadoras de colonia. Los resultados obtenidos se grafican en
la FIGURA 15, la cual muestra los recuentos de unidades formadoras de colonia
promedio realizado a intervalos de 7 días a partir del primer día posterior al secado, es
posible apreciar la tendencia que tiene cada mezcla a través del tiempo de
almacenamiento, evidenciando una tendencia común a disminuir la viabilidad, los datos
de origen se encuentran en el ANEXO 3.
Es posible apreciar una marcada disminución a partir de la tercera semana de
almacenamiento a temperatura ambiente. ZAMORA (2005), obtuvo resultados
similares en un estudio realizado con BAL mantenidas a diferentes temperaturas de
almacenamiento, demostrando que para el caso de las BAL a temperaturas más bajas
la viabilidad es superior.
Los prototipos 3.2 (30% Maltodextrina, Te=170ºC), 1.3 (10% Maltodextrina y 0,3%
Carragenina λ, Te=180) y 2.3 (1,2% Goma Guar, Te=180ºC) presentaron menor
estabilidad durante el tiempo de almacenamiento, siendo cada una representante de
una mezcla encapsulante, coincidiendo únicamente dos de ellas en la temperatura de
entrada, esta coincidencia se puede deber al bajo contenido de sólidos de las dos
mezclas la cual sometida a altas temperaturas no es capaz de proteger las células, por
otra parte, al poseer menos agente encapsulante, una mayor proporción de células
queda adherida en la superficie y no dentro de la micro-cápsula, contribuyendo también
a la disminución de la supervivencia de las células de B. subtilis.
 39

1,0E+09

1.1
1.2
1,0E+08
1.3
Recuento (ufc/g)

2.1
2.2
2.3
3.1
1,0E+07 3.2
3.3

1,0E+06
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63
Tiempo (días)

FIGURA 15 Efecto del secado Spray a tres diferentes temperaturas de proceso

de las tres fórmulas durante el almacenamiento a temperatura
ambiente.
Si bien a simple vista es posible observar el mejor resultado, es necesario realizar un
análisis de regresión, ya que existe una correlación exponencial negativa entre la
viabilidad de la cepa y el tiempo de almacenamiento. Según la siguiente ecuación:

y = a ⋅ e bX (1)

Donde: a = intercepto
b = pendiente

Del análisis antes mencionado se obtuvieron las siguientes pendientes.

CUADRO 6 Pendientes e interceptos de la viabilidad de cada una de las
muestras, de correlación exponencial.

Muestras Pendiente Ln a
1.1 -0,0093 3,000E+07
1.2 -0,0097 9,000E+07
1.3 -0,0319 4,000E+07
2.1 -0,0052 1,000E+07
2.2 -0,0204 7,000E+07
2.3 -0,0395 1,000E+08
3.1 -0,0125 2,000E+07
3.2 -0,0475 2,000E+08
3.3 -0,0259 4,000E+07
 40

Es posible observar que el prototipo 2.1 (1,2% Goma Guar, Te=160ºC) presenta una
menor pendiente por lo tanto su viabilidad se mantiene estable, lo que indica que el
producto no ve alteradas sus características de viabilidad durante el tiempo de
almacenamiento. En contraste con lo antes mencionado se puede observar que los
prototipos 3.2 (30% Maltodextrina, Te=170ºC), 1.3 (10% Maltodextrina y 0,3%
Carragenina λ, Te=180ºC) y 2.3 (1,2% Goma Guar, Te=180ºC) presentaron la mayor
pendiente, corroborando lo antes dicho al observar la gráfica representada en la
FIGURA 15.
Estudios previos muestran que carotenos de zanahoria encapsulados con
maltodextrina por secado Spray siguen una cinética de degradación de pseudo-primer
orden (WAGNER y WARTHESEN, 1995).
Otro alcance que se puede realizar a partir de los recuentos de unidades formadoras
de colonia es el porcentaje de viabilidad remante, considerando como 100% al primer
recuento obtenido después del secado Spray.

140,0

120,0

100,0

1.1
Viavilidad remanente (%)

1.2
80,0
1.3

2.1
60,0
2.2

2.3
40,0 3.1

3.2

20,0 3.3

0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (días)

FIGURA 16 Viabilidad remanente de cada prototipo, respecto del primer día

después de secado y durante el tiempo de almacenamiento a
temperatura ambiente.
Los resultados que se observan son similares a los demostrados por el análisis de
regresión exponencial. Manteniéndose el ranking de muestras con mejor y peor
viabilidad tal como se observa a los 60 días de cada muestra de la FIGURA 16.
No es posible observar relación directa entre el tipo de agente encapsulante y la
temperatura de proceso aplicada, en el ANEXO 4 se presenta una serie de gráficos
que relacionan las diferentes mezclas a una misma temperatura de proceso.
 41

Si se considera como conclusión solamente las 24 horas después del secado por
atomización el mejor prototipo seria el 3.2, sin embargo, es más importante considerar
la estabilidad del producto a través del tiempo de manera que el consumidor tenga un
producto de calidad estable al momento de comprar y de aplicarlo en un cultivo.
En la atomización la pérdida de viabilidad celular puede suceder a causa de la
deshidratación e inactivación térmica debido a las temperaturas que alcanzan las
células durante el proceso (ZAMORA, 2005).
4.2.3.2 Persistencia de la capacidad antagonista de cada producto deshidratado
durante 60 días. Al momento de elaborar un biocontrolador, es muy importante
considerar qué factor es más importante al momento de evaluar el producto. Para este
estudio los factores más relevantes a evaluar después de someter al B. subtilis al
proceso de deshidratación por medio del secado Spray, fueron la mantención de la
viabilidad y la conservación de la capacidad antagonista, de estos dos últimos el factor
más relevante al momento de concluir qué muestra es mejor o peor, es la conservación
de la capacidad antagonista.
La capacidad antagonista se puede ver afectada por los procesos térmicos a los que
se somete las células, es así como, ZAMORA (2005) afirma que existen estudios que
demuestran que la capacidad antagonista de un cultivo se pierde después de
someterlo a un proceso de deshidratación por secado Spray, sin embargo, estudios
realizador por este mismo autor, demuestran que después secar por atomización una
cepa de BAL, conservaron su capacidad antagonista.

12
Diametro Halo inhibición

10

8
(mm)

0
1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3
Prototi
Muestraspos
Tiempo cero
Tiempo cero Despues
Después de secado
secado

FIGURA 17 Diámetro del halo de inhibición a tiempo cero y 7 días después del
proceso de secado Spray.
Antes de hacer una evaluación de la FIGURA 17, es necesario destacar que los
valores de halos de inhibición que se observan después del proceso de secado
corresponden al día 7, por problemas técnicos no fue posible contar con los halos de
inhibición del día 1.
 42

Como se observa en la FIGURA 17 la capacidad antagonista no se vio afectada por

proceso de secado Spray, sin embargo, se observa una leve disminución y se
destacan por conservar en mayor grado la actividad antagonista los prototipos 1.1
(11% aprox. de agente encapsulante) y el 3.3 (30% de agente encapsulante),
mostrando que no existe relación entre la temperatura de proceso y la actividad
antagonista, pero que si existe relación entre el contenido de sólidos y la capacidad
antagonista.
La capacidad antagonista después del proceso de deshidratación persiste. Sin
embargo, CAVAGLIERI et al. (2005), reconocen generalmente que la expresión del
antagonismo por un microorganismo hacia un patógeno en medio de cultivo no se
puede tomar como evidencia de que el microorganismo controlará el patógeno en el
campo. Por otra parte, ZAMORA (2005), obtuvo resultados que indicaron una
correlación importante entre el antagonismo registrado in vitro y la eficacia de B.
subtilis CE1 en la inhibición de los F. verticillioides en grano del maíz y en ensayos del
invernadero.
Se realizó un estudio de persistencia de la actividad antagonista a través del tiempo
comenzando el día 7 hasta el día 60. La FIGURA 18 indica una tendencia a perder la
capacidad antagonista a través del tiempo para algunos prototipos como la 2.3 y 3.2,
mostrando una tendencia similar al caso de la viabilidad ya que estas dos muestras
disminuyen su capacidad antagonista a partir del día 28, sin embargo, existen otras
muestras que a pesar de la disminución de su viabilidad, mantiene la capacidad
antagonista. Como el caso de los prototipos 1.1 y 3.3, confirmando lo afirmado
anteriormente, que relaciona la capacidad antagonista con el contenido de sólidos. La
tabla de datos de origen se encuentra en el ANEXO 5.
También es posible relacionar el efecto de la viscosidad, ya que justamente las mezcla
1 y 3 son las que presentan mayor viscosidad, coincidentemente la temperatura de
salida de estas dos muestras fueron entre un rango de 90-100 ºC, aseverando lo
demostrado por ZAMORA (2003), quien probó similares temperaturas de entrada
variando las temperaturas de salida, encontrando que la mayor supervivencia se
obtenía con una temperatura de salida más baja.
Para poder determinar qué prototipo resulta mejor, hay que considerar la estabilidad de
sus características en el tiempo, para esto se debió realizar un análisis de regresión,
con la dificultad que los diferentes prototipos se comportan en relación a modelos
distintos, por lo cual sus pendientes no son comparables.
Sin embargo, se realizó el análisis considerando aquellas muestras que presentaban
una correlación lineal, ya que son las que se comportan de manera más estable en el
tiempo, las otras mezclas se descartaron por la desigualdad (correlación polinomial) de
sus datos y por ende de su comportamiento.
Los prototipos seleccionados son, en definitiva, aquellas que presentan mejores
resultados al momento de evaluarlas desde el punto de vista de su capacidad
antagonista.
 43

13

12

11

1.1
10
1.2
Halos inhibición (mm)

9
1.3
8 2.1

7 2.2

2.3
6
3.1
5
3.2
4 3.3

2
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63
Tiempo (días)

FIGURA 18 Halos de inhibición de cada una de los prototipos durante un periodo

de 60 días de almacenamiento a temperatura ambiente.
En el CUADRO 7 es posible observar, desde el punto de vista de las pendientes, los
prototipos que presentan mejores resultados son 3.3 y 3.1, mostrando relación con el
medio encapsulante adicionado, por su parte, la muestra 1.1 si bien presenta un
excelente intercepto, su pendiente aumenta a medida que pasa el tiempo, mostrando
una tendencia negativa.
CUADRO 7 Pendientes e interceptos de la actividad antagonista de cada una de
las muestras, de correlación lineal.

Prototipos Pendiente Intercepto

1.1 0,0406 11,69

1.2 ---------- ----------
1.3 ---------- ----------
2.1 ---------- ---------
2.2 0,0398 7,75
2.3 0,0667 8,35
3.1 0,0251 7,87
3.2 ----------- ----------
3.3 0,0125 9,80

Es posible inferir que existen diferencias entre los dos resultados, es decir, respecto del
estudio de viabilidad y la actividad antagonista, ya que los resultados no son
coincidentes. Sin embargo, considerando factores como:
 44

• que la viabilidad se puede mejorar con un aumento en la concentración inicial de

bacterias
• que el contenido de sólidos y agente encapsulante influye al momento de proteger
la célula
• que una viscosidad mayor aporta a la reducción de la temperatura de salida

• que una temperatura de salida baja ayuda a conservar las características

antagonistas del cultivo
• que la estabilidad de la capacidad antagonista en el tiempo es el principal factor a
considerar para la producción de un biocontrolador.
Se puede determinar que los prototipos constituidos por un concentrado celular de B.
subtlilis y una con 30% de maltodextrina (prototipo 3.3) y otra con 10% de
Maltodextrina y 0,3% de Carragenina λ (prototipo 1.1), son las más adecuadas para
producir un controlados biológico en polvo, mediante el método de deshidratación por
atomización.
 45

5. CONCLUSIONES

De acuerdo a los objetivos planteados en este estudio y de los resultados obtenidos, se

desprenden las siguientes conclusiones:

• Es posible aplicar un proceso de deshidratación mediante secado Spray, a un

concentrado celular de Bacillus subtilis manteniendo su viabilidad y capacidad
antagonista frente a Erwinia carotovora, obteniéndose de esta forma un
biopesticida efectivo, de fácil transporte y aplicación.

• No fue posible determinar un medio de suspensión con un agente encapsulante

que entregue una misma respuesta respecto de viabilidad y persistencia de la
capacidad antagonista.

• El prototipo 3.2 (Maltodextrina 30%) presentó una buena respuesta a la

viabilidad a las 24 horas del proceso de secado y el prototipo 2.1 (Goma Guar
1,2%) presentó una buena viabilidad en el tiempo hasta los 60 días.

• El prototipo 1.1 (Maltodextrina 10% y carragenina 0,3%) presentó una muy

buena actividad antagonista a las 24 horas del proceso de secado y el prototipo
3.3 mostré una alta persistencia de la capacidad antagonista en el tiempo,
hasta los 60 días.

• Respecto de las temperaturas de proceso, no se evidencia el efecto de la

temperatura de entrada en los resultados (viabilidad y capacidad antagonista).
Sin embargo, sí se aprecia que temperaturas de salida más bajas entregan
mejor respuesta a los resultados evaluados.

• De los parámetros evaluados el más importante es la persistencia de la

capacidad antagonista, que en mejor grado fue logrado con las mezclas 3
(Maltodextrina 30%) y 1 (Maltodextrina 10% y carragenina 0,3%) que
presentaban mayores consistencias (µ) y contenido de sólidos, lo que se asocia
con la formación de la microgota y el efecto protector a la célula.
 46

6. RESUMEN

Secado “Spray” de Bacillus subtilis y su Actividad Antagonista contra

Erwinia carotovora
La finalidad de este estudio fue aplicar un proceso de deshidratacion por atomización a
suspensiones concentradas de Bacillus subtilis, como método de conservación para
obtener un biocontrolador de fácil aplicación y con capacidad antagonista contra
Erwinia carotovora, patógeno responsable de la pudrición húmeda bacteriana que
afecta a cultivos comerciales de cala (Zantedeschia spp.). Para lograr el objetivo de
esa investigación, se procedió inicialmente con la producción de un cultivo puro en un
fermentador (capacidad 10 L) controlándose temperatura, aireación y crecimiento del
cultivo, seguido de la adición de un agente protector. Finalmente esta mezcla se
somete a deshidratación por medio de secado Spray a temperaturas controladas,
donde se estudiaron diferentes agentes protectores (maltodextrina, goma guar y
carragenina λ) y temperaturas de proceso (Te=160ºC, te=170ªC, te=180ºC),
generándose 9 prototipos de biopesticidas. Para determinar el prototipo ideal, se
estudió la persistencia de la capacidad antagonista y la respectiva viabilidad in vitro por
un periodo de 60 días. Los resultados obtenidos se analizaron por medio de regresión
exponencial para el caso de la viabilidad y regresión lineal para la capacidad
antagonista, contrastando las pendientes respectivas y seleccionándose el prototipo
que presentó la menor pendiente respecto de su actividad antagonista.

Palabras claves: Secado Spray, Bacillus subtilis, biocontrolador, Erwinia

carotovora.
 47

SUMMARY

Spray Drying of Bacillus subtilis and its Antagonistic Activity against

Erwinia carotovora

The purpose of this study was to apply a process of Spray drying to concentrated
suspensions of Bacillus subtilis, as a method of conservation to obtain a biocontroller of
easy application and with antagonist capacity against Erwinia carotovora, pathogen
responsible of bacterial soft rot which affects the commercial production of callas
(Zantedeschia spp.). To achieve the objective of this research, initially must be
proceeded with the development of a pure culture in a 10L fermentor controlling
temperature, aeration and growth of the culture, followed by the addition of a protective
agent. Finally this mixture is dehydrated by means of Spray drying at controlled
temperatures, where different protective agents (maltodextrina, guar gum and
carragenina) and process temperatures were studied (Te=160ºC, Te=170ªC,
Te=180ºC), ending up in the generation of 9 prototypes biopesticides. In order to
determine the ideal prototype, the persistence of the antagonistic capacity and the
respective viability in vitro was studied for a period of 60 days. The obtained results
were analyzed by means of exponential regression in the case of the viability and linear
regression for the antagonistic capacity, comparing the respective slopes and selecting
the prototype that presented the lowest slope respect to its antagonistic activity.

Key words: Spray drying, Bacillus subtilis, biocontroller, Erwinia carotovora.

 48

7. BIBLIOGRAFIA

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14-03-2006.
 50

ANEXOS
 51

ANEXO 1

Técnica de la gota sobre césped utilizada durante esta investigación.

La técnica consiste en sembrar sobre una placa con Agar Papa Dextrosa (APD) con un
cotón estéril un césped de la cepa patógena E. carotovora (previamente reactivada) y
dejarla secar la placa por 15 min aproximadamente en cámara de flujo laminar. A
continuación se deben rotular las placas sobre la base de vidrio (o plástico) y marcar
puntos guías lugar donde luego se aplica 5 µL de cultivo celular o 7 µL de hidratado de
cultivo celular en polvo, sobre el césped tomando como referencia los puntos guías
(FIGURA 19).
Posteriormente, las placas deben ser nuevamente secadas, durante 30 min en cámara
de flujo laminar, e incubadas en horno a 25ºC durante 24 h y a continuación, en horno
a 32ºC durante 24 h. Finalmente se mide el radio del halo de inhibición. Para el caso de
prueba de antagonismo con cepa hidratada, el periodo de incubación a 32ºC se debe
extender hasta 72 h. Para obtener el hidratado de cultivo celular en polvo se dispuso
0,1 g de este último en 10 mL de agua peptonada estéril, la fórmula se agitó bien y
luego de incubó por 12 horas a 32ºC.

Césped de
a Erwinia
carotovora

Colonias de a
B. subtilis

a: diámetro de halo inhibición de Bacillus subtilis frente a Erwinia carotovora

FIGURA 19. Esquema de la prueba antagonismo.

 52

ANEXO 2

Temperaturas promedio de entrada y salida durante el proceso de secado para

cada muestra en ºC.

Promedio secados 1.1 Promedio secados 1.2 Promedio secados 1.3

Tiempo(min) Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura
entrada salida entrada salida entrada salida
fórmula 1 fórmula 1 fórmula 1
0 160,0 87,7 170,0 96,3 180,0 117,3
3 160,0 93,7 168,7 99,0 179,7 111,0
6 159,3 95,0 170,3 106,3 181,7 113,0
9 159,0 95,3 168,7 108,3 180,0 111,7
12 160,0 97,0 170,3 110,0 179,0 109,0
15 159,7 98,0 170,3 109,7 179,3 108,7
18 161,0 97,3 169,3 109,0 180,0 107,7
21 161,3 94,0 170,0 108,7 180,3 108,0
Promedio secados 2.1 Promedio secados 2.2 Promedio secados 2.3
Tiempo(min) Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura
entrada salida entrada salida entrada salida
fórmula 2 fórmula 2 fórmula 2
0 160,0 101,3 170,0 96,7 180,0 93,7
3 159,0 96,7 169,0 94,7 180,3 94,3
6 160,0 97,7 170,3 96,0 182,0 94,7
9 160,0 99,7 170,0 97,7 181,0 93,3
12 160,3 98,3 172,3 98,7 180,7 95,0
15 160,0 97,3 169,7 95,7 180,0 91,0
18 159,3 97,7 169,3 95,3 180,0 93,3
21 160,3 98,0 170,0 95,3 179,7 93,3
Promedio secados 3.1 Promedio secados 3.2 Promedio secados 3.3
Tiempo(min) Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura
entrada salida entrada salida entrada salida
fórmula 3 fórmula 3 fórmula 3
0 160,0 79,3 169,3 88,3 180,0 87,7
3 159,0 86,0 169,7 88,7 179,3 90,0
6 161,0 85,7 170,3 89,3 180,3 91,3
9 159,7 86,3 172,0 88,3 180,7 93,3
12 160,3 84,7 169,7 90,0 180,3 93,0
15 160,7 85,0 170,3 89,0 180,3 91,0
18 161,3 84,3 170,0 87,0 180,0 89,7
21 160,0 83,3 169,7 87,3 179,7 91,7
 53

ANEXO 3

Recuento de unidades formadoras de colonias promedio de cada muestra para

los días 1, 7, 14, 21, 28 y 60.

Muestra Promedio Promedio Promedio Promedio Promedio Promedio

/Día 1 7 14 21 28 60
1.1 3,4E+07 3,3E+07 3,1E+07 2,8E+07 2,5E+07 2,0E+07
1.2 8,9E+07 8,6E+07 7,8E+07 7,2E+07 5,9E+07 5,2E+07
1.3 3,6E+07 3,2E+07 2,73E+07 2,5E+07 7,8E+06 6,5E+06
2.1 1,1E+08 1,0E+08 1,3E+08 1,0E+08 9,7E+07 8,3E+07
2.2 5,9E+07 6,3E+07 5,2E+07 5,1E+07 3,8E+07 1,9E+07
2.3 1,4E+08 1,3E+08 1,3E+08 1,1E+08 5,2E+07 1,6E+07
3.1 2,4E+07 2,4E+07 1,9E+07 2,6E+07 1,5E+07 1,2E+07
3.2 2,0E+08 1,9E+08 1,9E+08 1,8E+08 3,7E+07 1,6E+07
3.3 3,4E+07 3,4E+07 3,0E+07 2,5E+07 1,5E+07 8,3E+06
 54

ANEXO 4
Efecto de cada diferente mezcla a igual temperatura de entrada

Efecto de la mezcla, temperatura entrada 160ºC

Viabilidad remanente, % 100,0

80,0

60,0

40,0

20,0

0,0
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63

Tiem po (días) 1.1 2.1 3.1

Efecto de la mezcla, temperatura entrada 160ºC

120,0
Viabilidad remanente, %

100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63
Tiem po (días)
1.2 2.2 3.2

Efeto de la mezcla, temperatura entrada 170ºC

100,0
Viabilidad remanente, %

80,0

60,0

40,0

20,0

0,0
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63

Tiem po (días) 1.3 2.3 3.3

 55

ANEXO 5

Halos de inhibición promedio (mm) de cada muestra para los días 1, 7, 14, 21, 28
y 60.

Muestra Promedio Promedio Promedio Promedio Promedio

/Día 7 14 21 28 60
1.1 11,63 11,22 10,54 10,42 9,38
1.2 7,78 7,94 7,70 9,47 8,90
1.3 7,92 8,75 9,27 9,62 8,83
2.1 7,61 8,16 9,40 11,30 10,18
2.2 7,16 8,02 9,15 10,07 9,57
2.3 6,91 7,85 7,81 6,47 4,08
3.1 8,26 8,17 8,14 8,66 9,43
3.2 8,43 9,07 9,97 10,98 7,33
3.3 9,72 9,83 10,49 10,13 10,47