MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EMPLEADOS EN MICOLOGIA
1. ¿Qué ventajas proporciona la implementación de un estricto control de calidad de medios de cultivos
y reactivos en el laboratorio de micología?
Ventajas control de calidad de medios de cultivo
1. Mejoramiento de aislamiento del hongo
2. Se asegura que los medios se han preparado correctamente, no se sobrecaliente, sean estériles para
así evitar la contaminación de estos, controlar su función y asegurar el crecimiento de hongos
3. Permite la obtención de cultivos más puros
4. Se obtiene un diagnóstico confiable y eficaz
5. Se observan mejor las estructuras
Control de calidad de los reactivos
1. Permite comprobar el correcto funcionamiento para la identificación de hongos
2. Comprobar si estos están o no contaminados para evitar falsos positivos y falsos negativos
3. Se aumenta los casos negativos cuando el koh 10% está precipitado
2. ¿Cómo se realiza el control de calidad interno de las diferentes tinciones que se utilizan para el
examen directo de muestras sospechosas para investigación de hongos?
Los reactivos deben cambiarse mínimo una vez al año y siempre que se observe contaminación o cambios
en su aspecto o su funcionalidad.
Examen en fresco con clarificación por KOH: Al momento de prepararlo se evalúa su capacidad
al comprobar que puede disolver un poco de muestra de esputo; y en el uso diario, hay que
observar que no tenga contaminación ni precipitados.
Tinción de blanco de calcofluor: El control debe realizarse siempre que se prepare un nuevo lote
y siempre que se realice tinción; se usa Candida albicans en suspensión acuosa para el control
positivo y Escherichia coli suspendida en solución salina para el negativo.
Tinción de cinta china para la observación de la cápsula polisacárida de Cryptococcus spp: Siempre que
se realice la tinción, comprobar la esterilidad del reactivo y añadir control positivo de
Cryptococcus albidus suspendido.
Tinción con azul de lactofenol: debe comprobarse la esterilidad del reactivo siempre que se
realice la tinción. No es necesario utilizar controles positivos y negativos, sino que simplemente
debe teñirse la estructura de color azul.
3. ¿Diga tres condiciones que se deban cumplir para contar con un medio de cultivo de calidad
adecuada?
1. Esterilidad del medio, se comprueba la existencia o ausencia de contaminaciones, se esteriliza a
110°C de 15 a 20 min
2. Temperatura y luz adecuada del medio
3. Una buena consistencia en el medio y condiciones adecuadas de humedad en él
4. Capacidad de provisión del crecimiento
5. Almacenamiento adecuado
6. Ph ligeramente ácido tendencia a la neutralidad, cada vez que se prepare el medio debe ser de 7 + -
0,5
4. Las condiciones ambientales requeridas para desarrollar los ensayos relacionados con la Micología
Médica son similares a las de cualquier laboratorio de Microbiología. Sin embargo, existen ciertas
peculiaridades que deben considerarse a la hora de realizar la manipulación de muestras clínicas y de
hongos patógenos. Qué consideraciones de bioseguridad y de limpieza deben tenerse en cuenta en el
laboratorio de micología?
Todo laboratorio debe tener un nivel 3 de bioseguridad, si se realiza el aislamiento en muestras clínicas e
identificación al nivel de especie de cepas provenientes de pacientes sospechosos de padecer una
infección causada por un hongo patógeno nivel 3 de peligrosidad. Se debe manejar los hongos
filamentosos dentro de una cabina de bioseguridad para evitar contaminaciones cruzadas. - La limpieza en
las zonas de cultivos se realiza con etanol al 70% - Las estufas con halacid al 1%, bencilbenzoato al 20%
ó con formalina si está permitido.
En el laboratorio se debe hacer revisión y mantenimiento periódico del equipo electromecánico, motores,
centrífugas, agitadores.
Tener fuera de laboratorio un área de almacenamiento de reactivos medios de cultivo se materiales
diversos
Manipular los productos químicos con guantes resistentes
Usar pipetas automatizadas tener dentro de laboratorio un extinguidor
5. Revise la información acerca de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados en
micología y agrúpelos con base en su uso y/o características afines.
MEDIOS PARA
Aislamiento Identificación Determinación de otras Aislamiento e
primario bioquímica características identificación
Agar sabouraud Gelatina al 12%: Agar harina de maíz o Gelatina liquida: Para
dextrosa identificación de corn meal agar: para identificar Norcadia sp
Norcadia spp, que al lograr la esporulación de
crecer licuan la gelatina hongos, para lograr
reproducción sexuada de
algunas especies.
Agar sabouraud Medio modificado de Medio de arroz: para Medio de la leche
modificado: wickerham: para la lograr esporulación de los desnatada: para
ejemplo (Medio diferenciación de las dermatofitos. identificación de
mycosel, dermacel, especies de Cándida, Actinomicetos.
mycobiotic) dada su capacidad de
asimilación de diferentes
carbohidratos.
Agar sangre: para Azucares al 1%: Para Medio de agar arroz: Medio de tiamina para
el aislamiento hacer la diferenciación de lograr esporulación de dermatofitos: Para
primario o de las diferentes especies de dermatofitos. identificación
repique de levaduras, basándose en dermatofitos.
Actinomicetos como la fermentación de estos
Nocardia spp, cuatro azucares.
Actinomyces spp. y
Streptomycesspp.
También para aislar
Cryptococcus spp.
Medio de kamiski Medio de leche: para Medio con vitaminas:
modificado: para el observar la formación de para lograr el aislamiento
aislamiento primario clamidosporas de Cándida de dermatofitos exigentes
y la esporulación de albicans como Trichophyton
los hongos verrucosum.
patógenos que son
los agentes de la
dermatomicosis y
las micosis
intermedias.
Medio de borelli: Medio para Chromagar candida:
para el aislamiento clamidosporas: utiliza para el aislamiento e
primario y la para lograr la producción identificación de algunas
esporulación de de clamidosporas de la especies del género
hongos ambientales Cándida albicans.. Candida
Gel de agar: para preparar
placas de inmunodifusion
que detectan la reacción
antígeno-anticuerpo en
micosis profundas y
oportunistas.
Medio de papa y
zanahoria: utiliza para
inducir el crecimiento de
las formas sexuadas y las
formas de resistencia o
picnidias de los hongos.
Czapeck almidon agar:
para esporulación de
mohos negros.
Medio de jelli: para el montaje de placas de Czapeck almidon agar:
cultivo. para esporulación de
Agar urea de christensen: para diferenciar mohos negros.
cryptococcus de otras levaduras Agar harina de maíz
(corn meal agar) mas
twin 80: para observar
formación de
clamidosporas y observar
morfología de levaduras.
Medio de Kelly: para
revertir los hongos
dimórficos de su forma
miceliar a levaduriforme
Agar ascosporas: para
lograr el crecimiento de las
formas sexuadas de las
levaduras.
Papa dextrosa agar-pda:
para la diferenciación de
algunos dermatofitos, al
hacer evidente su
pigmento y la morfología
de su colonia.
REACTIVOS Y COLORANTES
Examen directo- Coloraciones Coloraciones Coloraciones para
montajes húmedos histopalogicas observar estructuras
micoticas a partir de
medios de cultivo
Hidróxido de potasio Hematoxilina y eosina Wright Azul de lactofenol
(KOH) al 10% (HyE)
Negro de clorazol E Acido peryodico de Giemsa Eritrosina
Schiff (PAS, por su sigla
en inglés)
Calcoflúor blanco Plata metenamina de Diff-Quik Hidrato de cloral
Gomori (Grocott)
Tinta china Fontana Mason Gram
Nigrosina Mucicarmina de Meyer Azul de
toluidina-O
Azul de alcial (con o sin
hialuronidasa)
6. Cuál es el pH óptimo de los medios de cultivo para hongos?. Qué efecto adicional positivo tiene este
pH en el aislamiento de los hongos?
El pH debe oscilar entre 5 y 6. El efecto adicional positivo se da al adicional sustancias inhibidoras del
recibimiento bacteriano o acidificación ligeramente del PH con ácido clorhídrico permitiendo la
inhibición del crecimiento bacteriano. En levaduras y hongos se requiere una temperatura de 37°C
7. Diga en el diagnóstico de qué tipo de infecciones micóticas son útiles los medios cromogénicos?
Son medios selectivos diferenciales usados para el aislamiento de levaduras fundamentalmente del género
cándida, es posible utilizarla como medio primario a partir de diferentes muestras clínicas con una buena
recuperación lo que facilita y agiliza la detención de infecciones. Los medios cromogénicos identifican
presuntivamente a las levaduras más que todo a las candidas como candidas albicans, c. krusei, c.
tropicalis,c. kefyr, [Link], c. glabrata y c. parapsilosis, la morfología y el color característico
dependerá de la marca comercial. La cepas no identificables presentan un color variable entre rosado,
violeta, blanco, marrón y crema. también se le pueden añadir fluconazol u otro antibiótico para la
detección de algunas cepas resistentes y además también nos ayuda en la detección de otros hongos como
lo son c. neoformans, trichosporon spp. , rhodotorula spp. ya que estos pueden crecer en el medio pero
deben ser subcultivos en medio no selectivos para una identificación definitiva.
8. En el diagnóstico de las micosis, diga cuál es el aporte de los hemocultivos automatizados por el
método de lisis centrifugación?
Fungemias: el método de elección es el de lisis-centrifugación que recupera levaduras y hongos
dimórficos. Consiste en un tubo de lisis cuyo contenido es polianetol sulfonato de sodio como
anticoagulante, saponina como agente lítico de eritrocitos, leucocitos y macrófagos, polipropilenglicol
como antiespumante y un fluoroquímico inerte de alta densidad. Luego se somete a la muestra a una
centrifugación a alta velocidad que permite la concentración de microorganismos en el sedimento que se
siembra en medios de cultivo específicos. En general, este método permite mejorar en un 25 a 50% la
detección de hongos levaduriformes y filamentosos
9. Cómo haría el control de calidad del medio Agar
sabouraud dextros-SDA
Control de calidad: medio de cultivo de color ambar,
transparente, solido y sin precipitado. con un ph de 5,6 +o- 2.
para el control de crecimiento e inhibición se utilizan los
siguientes microorganismos:
10. Por qué el medio SDA modificado debe utilizarse
simultáneamente con otros medios?
Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento y diferenciación de hongos patógenos como los
dermatofitos, hongos dimorficos y hongos resistentes a la cicloheximida a partir de muestra contaminada
con bacterias y hongos saprófitos de rápido crecimiento. Este medio inhibe el crecimiento de algunos
hongos de importancia clínica razón por la que es importante integrarlo en el aislamiento primario con
otros medios sin sustancias electivas.
11. Al momento de realizar un cultivo, cómo aprovecharía las diferencias existentes en la composición
del sabouraud simple y el sabouraud modificado?
Aprovecharía las diferencias de estos, dependiendo el tipo de hongo que quiero aislar al realizar el
cultivo, ya que el Agar Sabouraud simple es más eficiente a la hora de aislar hongos oportunistas y
ambientales, mientras tanto el Agar Sabouraud modificado es mejor para realizar el aislamiento de
hongos patógenos.
12. Mencione la utilidad de los componentes de la tinción de azul algodón de lactofenol.
El fenol mata el hongo, el ácido láctico es un agente aclarante que preserva la estructura del hongo, la
glicerina previene la desecación y el azul de algodón colorea la quitina y celulosa del hongo. El fenol
tiene la capacidad de inactivar la flora acompañante las enzimas además no permite estallar la célula
13. Al procesar el examen directo y cultivo para estudio micológico de una muestra clínica, qué
diferenciación haría usted en el uso del KOH al 10% y el azul de lactofenol?
KOH al 10% es el método más utilizado en las diferentes muestras clínicas y éste disuelve la queratina y
digiere parcialmente los componentes proteicos, facilitando así la visualización de los elementos
fúngicos. Permite observar los elementos fúngicos presentes en tejidos queratinizados y los esclerotes
ubicado entre los tejidos
Nota: esta capacidad digestiva se puede mejorar cuando se somete a calentamiento suave.
El azul de lactofenol es otra tinción especial que se realiza a partir de cultivos, en el cual el fenol
destruye la flora acompañante, el ácido láctico conserva las estructuras fúngicas y el azul algodón tiñe la
quitina de la pared del hongo para ayudar en su identificación. Se utiliza para preparar plagas de cultivo y
clasificación taxonómica
14. Revise el fundamento de las siguientes coloraciones: Ácido peryodico de Schiff (PAS), calcofluor
blanco, plata- metenamina de Gomori (GROCOTT)
Acido peryodico de schiff: en esta coloración las paredes celulares de los hongos se oxidan en presencia
del ácido peryodico y se forman aldehídos que luego reaccionan con la fuscina de schiff y colorean los
carbohidratos de la pared celular de color magneta o rosado brillante . este método es bastante utilizado
ya que la mayoría de hongos de muestras clínicas toman la tinción, sin embargo el procedimiento es
bastante complicado y requieren diferentes reactivos y etapas lo cual consume bastante tiempo.
Calcofluor blanco. Es un fluorocromo que se ve como un polisacárido con enlaces Beta 1-3 y Beta 1-4
presente en polímeros tales como la celulosa y la gelatina el colorante fluorescente cuando se une a una
fuente ultravioleta de longitud de alta sensibilidad para definir claramente los elementos micóticos en
muestras clínicas requiere un microscopio de fluorescencia
Plata- metenamina de Gomori (GROCOTT): Esta se basa en que, en presencia de ácido crómico los
grupos hidroxilo de los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; estos, a
su vez reducen el complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloración café anegro, debido al
depósito de la plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos.
15. Diga el fundamento y uso del medio CHROMagar Cándida
Fundamento: El CHROMagar Cándida es un medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento
y diferenciación de levaduras patógenas y saprofitas en muestras de origen clínico. La peptona es la
fuente de nitrógeno en el medio, la glucosa es la fuente de energía. La diferenciación entre las especies
del género Candida se logra a través de los sustratos cromogénicos contenidos en el medio de cultivo,
sobre los que actuarán las enzimas hexosaminidasa, glucosidasa y fosfatasa alcalina. Estas reacciones
enzimáticas provocan la generación de pigmentos coloreados que permiten la identificación presuntiva de
estas levaduras. El cloranfenicol inhibe la mayoría de los contaminantes bacterianos.
Usos: Diferenciar de forma rápida y confiable las especies más comunes de candida. Con la inclusión de
sustratos cromógenos en el medio, las colonias de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei producen colores
diferentes, lo que permite la detección directa de estas especies de levaduras en la placa de aislamiento.
Las colonias de C. albicans presentan un color de verde claro a mediano, las colonias de C. tropicalis, de
azul verdoso a azul metálico y las colonias de C. krusei, rosado claro con borde blancuzco. Es posible que
otras especies de levaduras producen su color natural (crema) o presenten un color rosado o malva de
claro a oscuro (por ejemplo, Candida [Torulopsis] glabrata y otras especies).
16. ¿Cuál es la función del tween80 en los medios de cultivo para hongos?
En los medios de cultivos para hongos el Tween 80 (o polisorbato 80) es agregado estimular la formación
de Clamidoconidias, esto gracias a la presencia de ácidos oleicos.
17. Cual es la sensibilidad del KOH al 10% para la identificación de hongos en los exámenes directos?
La sensibilidad del KOH al 10% es bastante variable dependiendo del hongo que se esté diagnosticando.
Puede tener alta sensibilidad, como enn el diagnóstico de Onicomicosis, cuya sensibilidad es de un 61%,
o en el diagnóstico de Pitiriasis Versicolor, que la sensibilidad es de 78%. Mientras que es muy baja en
diagnóstico de la Histoplasmosis y la Neumocistocis.
