Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Química y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Practica #6 Levaduras y Hongos multicelulares filamentosos
Nombre Laura Sanely Rivera Campoverde
Grupo 3A
Objetivos de la práctica de laboratorio
1. Identificar macroscópicamente las características morfológicas de los hongos.
2. Diferenciar microscópicamente las estructuras de las levaduras con tinción simple y tinción de Gram.
3. Determinar microscópicamente las levaduras diferenciándolas de las otras bacterias.
4. Aplicar las diferentes técnicas y observar los diversos tipos de hongos existentes.
Marco Teórico
Los hongos son organismos de organización eucariota y de mayor tamaño que las bacterias; estos se
diferencian de las otras Eucariotas, por ser inmóviles. Los hongos poseen un tipo de nutrición heterótrofa.
Pueden ser unicelulares (como las levaduras o multicelulares como los mohos que son hongos filamentosos).
Los hongos al proliferar asumen dos formas básicas que son la de levaduras y la de mohos. Esta última forma
ocurre por la producción de colonias filamentosas multicelulares integradas por túbulos cilíndricos
ramificados llamados hifas, cuyo diámetro varía de 2 a 10 micrómetros (μm).
Recibe el nombre de micelio la masa de hifas entremezcladas, acumulada durante la fase de crecimiento
activo. Algunas hifas se dividen y forman células gracias a la intervención de estructuras cruzadas llamadas
tabiques o septos, que de manera típica se forman a intervalos regulares durante la fase de hifas.
Un grupo de mohos de importancia en medicina que son los zigomicetos produce hifas que rara vez están
tabicadas. Las hifas que penetran en el medio de sustento y absorben nutrientes son las vegetativas o de
sustrato. A diferencia de ello, las hifas aéreas sobresalen de la superficie del micelio y por lo común poseen
las estructuras reproductivas del moho. En una situación de proliferación estandarizada en el laboratorio, los
mohos producen colonias con características propias como la rapidez de proliferación, textura y
pigmentación. Es posible conocer el género (y tal vez la especie) de muchos mohos que afectan humanos,
por el examen microscópico de la ontogenia y la morfología de sus esporas reproductivas asexuales o
conidios.
Todos los hongos cuentan con una pared esencial rígida que es el elemento que les da su forma. Las paredes
están compuestas en gran medida de capas de carbohidratos (cadenas largas de polisacáridos) y también
glucoproteínas y lípidos. Durante la infección las paredes de los hongos desempeñan funciones
fitopatológicas importantes. Los componentes superficiales de la pared son los que median la fijación del
hongo a las células del hospedador. Los polisacáridos de la pared pueden activar la cascada de complemento
y desencadenar una reacción inflamatoria; el hospedador casi no los degrada y se les puede detectar por
medio de tinciones especiales. La pared libera antígenos inmunodominantes que pueden originar respuestas
inmunitarias de tipo celular y anticuerpos característicos útiles para el diagnóstico. Algunas levaduras y
mohos poseen paredes melanizadas, que le dan un color pardo o negro y los hongos con tales características
se denominan dematiáceos.
Los hongos de importancia médica generan dos grandes tipos de esporas asexuales o conidios y, en el caso
de los zigomicetos, las esporangiosporas. Características orientadoras propias de las esporas son su ontogenia
(algunos mohos producen estructuras conidiógenas complejas), y su morfología (tamaño, contorno, textura,
color, y carácter unicelular o multicelular). En el caso de algunos hongos, las células vegetativas pueden
transformarse en conidios (como serían los artroconidios, o las clamidosporas).
LEVADURAS.
Las levaduras son hongos que crecen generalmente por gemación, en forma de agregados sueltos de células
independientes, que pueden ser globosas, ovoides, cilíndricas o alargadas. En algunos casos, forman cadenas
de células alargadas (pseudohifas), adheridas de modo suelto (blastospora), semejantes a un micelio, por lo
que se les denomina pseudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con
frecuencia septado (tabicado). Hay especies de levaduras esporógenas. No existe, por tanto, un límite de
separación definido entre levaduras y otros hongos que forman un micelio típico.
Algunos hongos patógenos para el hombre presentan dimorfismo, pueden existir en la naturaleza en forma de
levadura (forma parasitaria) o en forma filamentosa (forma saprófita).
Las levaduras, cuando crecen sobre medios sólidos, forman colonias de aspecto característico que recuerdan
a las colonias bacterianas. En casi todas las especies de interés industrial, el modo habitual de reproducción
vegetativa es por gemación. A diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por
sus caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la identificación específica.
1. Pruebas morfológicas:
Aspecto de las colonias
Observación microscópica de los cultivos
Presencia de ascosporas
2. Pruebas fisiológicas
Temperatura máxima de crecimiento
Crecimiento en presencia de cicloheximida
Capacidad de utilizar diversos compuestos como fuente única de carbono
Capacidad de utilizar diversos compuestos como fuente única de nitrógeno
Capacidad de fermentación de diferentes azúcares
Capacidad de crecimiento con altas concentraciones de glucosa.
Actividad ureasa}
Observación de levaduras.
Las colonias de levaduras suelen ser de color crema, más o menos lisas, o de aspecto seco y plegadas, y de
tamaño variable. Por ello, el aspecto morfológico de la colonia no representa un habitualmente carácter
distintivo importante entre las diferentes especies.
IDENTIFICACION DE HONGOS
Consideraciones para tener en cuenta para identificar hongos
Examen macroscópico de los cultivos
Una vez transcurrido el tiempo de incubación de los especímenes inoculados en la práctica anterior se debe
realizar una evaluación macroscópica de los cultivos realizados a partir de la muestra de interés en medio de
cultivo Sabouraud y Mycosel y a partir del monitoreo ambiental Sabouraud.
1- Se deben observar los medios de cultivo por su parte posterior o reverso de esta manera se deben
reportar características importantes:
La presencia o ausencia de crecimiento
El tamaño de las colonias
Color
Apariencia
Una vez realizado este examen se procederá a evaluar las mismas características en la parte anterior o
anverso se debe evaluar, además, si el crecimiento del hongo ocurrió en las zonas de inoculación y si su
aspecto es algodonoso, terreo o aterciopelado como el de los hongos filamentosos o cremosos como las
levaduras.
MEDIOS DE REACTIVOS Y
MATERIALES EQUIPOS
CULTIVO/CEPAS COLORANTES
Algodón Cultivo de levaduras Alcohol Mechero
Fósforos Cultivo de hongos Algodón de Azul de Lacto fenol Microscopio
Placas portaobjetos Kit de Gram
Placas cubreobjetos Aceite de cedro
Asa micológica Lugol
Hilo de inoculación
Lápiz graso
Papel filtro
Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc
Procedimiento
1. Técnica de la Lamina y laminilla
1. Preparar la suspensión de la muestra microbiana en una laminilla, usar Lugol o algodón de azul de
lactofenol como medio de suspensión.
2. Tomar adecuadamente la muestra, con las dos asas, desde la superficie del alimento para observar el
hongo completo.
3. Agregar la laminilla.
4. Observar con las lentes de 10X o 40X
2. Técnica de Gram: Observación de Levadura Cándida en fluido vaginal
Frotis
1. Rotula la placa
2. Extender la muestra sobre el portaobjetos y dejar secar a temperatura ambiente hasta que este
totalmente seca
Fijación
Se pasa por la llama del mechero (3 veces) teniendo la precaución de no exponerla demasiado al fuego
directo, ya que esto perjudica la evaluación de la forma y tinción de las bacterias. Una vez seca la lámina se
tiñe.
Tinción
1. Disponga la preparación bacteriana sobre la cubeta diseñada para realizar la tinción
2. Cubra la lámina con Cristal violeta durante 1 minuto.
3. Lave el exceso de colorante con agua
4. Cubra con Lugol durante 1 minuto.
5. Lave el exceso de Lugol con agua.
6. Decolore con solución alcohol-acetona durante 20 segundos.
7. Lave con abundante agua para eliminar el exceso de disolvente.
8. Cubra la lámina con Safranina durante 30 segundos.
9. Lave el exceso con agua
10. Secar la preparación entre 2 láminas de papel filtro y observar al microscopio con aceite de inmersión
en el objetivo de 100x
3. Técnica de la cinta adhesiva
Coloración de estructuras de hongos
1. Encender el mechero, tener precaución con la manipulación para evitar quemaduras.
2. En una lamina portaobjetos debidamente identificada colocar de una a dos gotas de una solución de
azul de lactofenol.
3. Tomar una pinza estéril y flamearla, dejarla enfriar.
4. Tomar una cinta adhesiva de aproximadamente 2x3 cm y depositarla sobre una de las colonias
presentes en el medio Sabouraud inoculado con la muestra con el fin de captar estructuras del hongo
de interés.
5. Retirar suavemente la cinta y a manera de cubreobjeto depositarla sobre una gota de azul de
lactofenol.
Visualización de estructuras de hongos
Tomar las laminas donde previamente se realizo la tinción de azul de lactofenol y llevarlas al microscopio
para su visualización, enfocar la placa teñida con el azul de lactofenol y enfocarla con el objetivo de 4x y
explorar en busca de estructura de hongos, luego visualizar con el objetivo de 10x reportar lo que se visualiza
en la libreta de apuntes. Una vez haya finalizado la visualización descartar la laca en el guardián de
bioseguridad.
4. Técnica de Siembra con asa micológica
1. Esterilizar el asa micológica en el mechero
2. Sumergir el asa en un tubo que contenga agua estéril para acelerar el enfriamiento del asa
3. Destapar la caja que contiene el cultivo y tocar la superficie en donde se encuentran las estructuras de
reproducción o bien cortar un fragmento de micelio
4. Sacar el asa con el inóculo y mantenerla en la zona de asepsia, cerrar la caja y colocarla en la mesa
5. Tomar la caja a inocular y abrirla en el área aséptica, introducir el asa y depositar el inoculo en el
centro del medio de cultivo, presionando ligeramente para no romper el agar
6. Retirar el asa, cerrar la caj y colocarla en posición invertida sobre la mesa
7. Esterilizar el asa antes de dejarla sobre la mesa de trabajo
Cuando se inocula en un medio inclinado el inoculo se deposita casi en el fondo del tubo en donde inicia la
inclinación haciendo una ligera presión sobre el medio.
Resultados obtenidos
Poner 2 imágenes de levaduras: 1.- preparación en fresco 2.-teñidas con Gram
Candida albicans
preparación en fresco con suero fisiológico
Candida albicans
preparación
Poner 3 imágenes de hongos filamentosos con tinción
de diferentes de Gram
géneros
Aspergillus
sp.
Penicillium sp.
Conclusiones
1- Pudimos identificar macroscópicamente las características de las diferentes especies de hongos
2- Concluimos que por medio de la tinción de gran se observa mucho mejor la estructura de las levaduras
mientras que con la tinción simple identificarlas es mas complicado
3- Por medio de los videos aprendimos 4 diferentes técnicas para la diferenciación e identificación de hongos
Recomendaciones: Indicar los puntos críticos de las preparaciones y observación al microscopio
1- Disponga cada solución durante el tiempo estrictamente estipulado.
2- Limpiar bien las lentes del microscopio luego de colocar el aceite de inmersión
3- Trabajar siempre cerca del mechero para mantener la zona aséptica
Bibliografía
1- https://www.youtube.com/watch?v=0SKNE6vqcPI
2- https://www.youtube.com/watch?v=BmEW3n3qSko
3- https://www.youtube.com/watch?v=wSZ77T5L6e8
4- https://www.youtube.com/watch?v=rH1mT_Q4u1U
5- http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo11.pdf
6- file:///C:/Users/Usuario/Downloads/S1138359300735283.pdf
