Interpretación de resultados de laboratorio de patologías monitoreadas, análisis de las

muestras tomadas desde los RM (rastro municipal) para la toma de decisiones.

UNAN-LEON
Curso…
MÓDULO: MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO N° 4: Identificación y recuento de S. aureus.

1. Objetivo.
Establecer el método de recuento en placa de siembra por extensión en superficie para determinar el
número de células viables de S. aureus (ufc.) en muestras de carne y leche.

2. Introducción.
Staphylococcus aureus: Especie bacteriana perteneciente a la familia Micrococcaceae y al género
Staphylococcus, cuyos miembros tienen la forma de cocos que se agrupan formando racimos, inmóviles,
Gram positivos, aerobios y anaerobios facultativos, temperatura óptima 37 °C. Producen un pigmento
amarillo dorado, son halotolerantes. Poseen las enzimas coagulasa, fosfotasa y desoxirribonucleasa que
le distinguen de otros estafilococos. Producen exotoxinas: hemolisina y enterotoxina.

Recuento de Staphylococcus aureus: Es la determinación del número de células viables de

Staphylococcus aureus presentes en una muestra, utilizando medios selectivos.

Coagulasa: Enzima que coagula el plasma sanguíneo de conejo o humano.

La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus, se fundamenta en los siguientes pasos:

1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido: se utiliza el Agar Baird-Parker por su
capacidad de utilizar la lipoproteína de la yema de huevo y de reducir el telurito a teluro
2. Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus.
La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus en estas pruebas es la siguiente: La Presencia
de coagulasa
La sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa, utilizando el método de extensión de
superficie es de: 10 UFC/g.

3. Descripción del método de ensayo:

Equipos y materiales
MATERIALES
 Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml. graduadas en 0,1 ml. estériles
 Rastrillos de vidrio o de plástico autoclavable
 Placas Petri de vidrio o desechables (por lo menos 15 x 90 mm) estériles.
 Tubos de 13 x 100 mm con tapa rosca, estériles
 Tubos de 16 x 150 mm con tapa rosca, estériles
 Bolsas para stomacher.
 Asa bacteriológica
 Portaobjetos

EQUIPOS
 Incubadora regulada a 35 º C ± 2 ºC
 Contador de colonias
 Cabina de bioseguridad clase II.
 Microscopio óptico
 Balanza analítica

Soluciones, medios, reactivos, biológicos

 Agar Baird Parker
 Solución yema de huevo 50%.
 Telurito de potasio al 1%
 Agar soya triplicase pH 7,3 ± 0.2
 Caldo infuso cerebro corazón pH 7,4 ± 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm
  Plasma de conejo con EDTA (usar preferentemente plasma comercial)
 Agua peptona da
 Buffer fosfato salino
 Kit para tinción Gram

4. Preparación de la muestra analítica

En general, las muestras deben mantenerse en las condiciones adecuadas al producto, hasta el
momento del examen.

5. Realización del ensayo

Aislamiento selectivo.
1. Pesar 50.0g/50 ml de muestra.
2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher
3. Adicionar 450 ml solución amortiguadora de fosfatos 0.1M de pH 7.2.o agua peptonada al 0.1 %
4. Homogeneizar 30 segundos.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10ˉ3 en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 ml del
mismo diluyente.
6. De cada dilución transferir 1 ml de la suspensión a tres placas de agar Baird Parker distribuyendo 1 ml
equitativamente en las tres placas (0,3, 0,3 y 0,4 ml). Marcar en cada dilución el volumen a sembrar en
cada una de las placas Petri: 0,3 0,3 y 0,4 ml.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril,
iniciando a partir de la mayor dilución.
8. Mantener las placas en su posición hasta que el inoculó sea absorbido por el agar, entre 5 y 10
minutos aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 ± 2º C. durante 45 a 48 h.
10. Después de incubar, observar las colonias características de este microorganismo en el Agar Baird
Parker (BP).

Recuento Presuntivo

1. Seleccionar las placas que contengan entre 20-200 colonias típicas de S. aureus,
 2. Realizar recuento de todas las colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de diámetro,
de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado por zona opaca y
fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa cuando son tocadas con el asa de
inoculación. Ocasionalmente pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no
lipolíticas, salvo que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia están ausentes. Cepas
aisladas de productos deshidratados o congelados almacenados por largos períodos desarrollan
colonias menos negras que las colonias típicas y pueden desarrollar apariencia rugosa y textura
seca.
3. Si son observados muchos tipos de colonias con apariencia similar a S. aureus en todas las placas
sembradas, registre el número de colonias contadas de cada tipo separadamente.
4. Cuando placas de diluciones bajas tienen < 20 colonias, use este valor.
5. Si las placas contienen > 200 colonias de apariencia típica y en diluciones más altas no hay
colonias típicas, utilizar estas placas para el recuento y no cuente las colonias no típicas.
6. Seleccionar más de una colonia (3 a 5) para cada tipo de colonia contada y realizar test de
coagulasa.
7. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son características de este
microorganismo, utilizando asa bacteriológica recta estéril, en tubos que contengan caldo
infusión cerebro corazón.
8. Incubar a 35 ± 2º C durante 24 h.
9. De los tubos que presenten crecimiento, hacer un frotis y teñirlo por el método de Gram.
Verificar la presencia de cocos Gram positivos agrupados en racimo e inocular en agar TSA en
tubo, con un asa de la suspensión de BHI. Incubar 18-24 h a 35 ° C.
Pruebas bioquímicas.
El test de producción de coagulasa es específico para la especie. registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.

Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.

1. Con una pipeta estéril de 1 ml, tomar 0.5 ml de plasma de conejo con EDTA rehidratado en un
tubo de prueba de 13 X 100 mm en una gradilla.
2. Con una pipeta serológica estéril de 1 ml, agregar aproximadamente 0,05 ml de la suspensión del
microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón.
 3. Mezclar suavemente
4. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 4 h.
5. Examinar los tubos inclinándolos con suavidad. Evitar sacudir o agitarlos, ya que esto podría
causar la desintegración del coagulo y como consecuencia resultados de pruebas negativos falsos
o dudosos. muchas cepas productoras de enzimas débiles producirán una coagulación del plasma
solo después de una incubación de 24 h.
6. Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta, de acuerdo con los valores del cuadro 1.
7. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o
superior a 2 cruces.
CUADRO 1. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa
VALOR CARACTERÍSTICA
negativa No se observa formación de coágulo.
1+ (positiva) Formación de coágulos pequeños
desorganizados.
2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado
3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado
4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado.
Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el
fondo del mismo.

6. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

1. Si la prueba de la coagulasa resulta positiva, se considera el recuento presuntivo como
confirmativo de Staphylococcus aureus.
2. Si la prueba confirmativa resulta característica, se calcula la relación entre las colonias
confirmadas y el número total de colonias probadas, mediante la siguiente expresión:
Relación entre el número de colonias confirmadas y el número total de colonias
probadas: Recuento presuntivo x N° colonias confirmadas x fd
N° de colonias presuntivas ensayadas
fd: factor de dilución en que se realizó la confirmación de las colonias

El valor obtenido corresponde al recuento confirmado, se expresa como S. aureus UFC/g/ ml de muestra
3. Si no hay desarrollo de colonias o ninguna colonia de positiva a la coagulasa, los resultados se
expresan como: Staphylococcus coagulasa positivo:< 10 UFC/g.

7. Aseguramiento de la calidad

Controles de los métodos

1. Incubar los controles junto con las muestras y analizar estos de la misma manera que la
muestra.

2. Confirmar al menos una cepa de cada muestra de control positivo de Staphylococcus aureus.
 ANEXO 2

Tipos de reacciones a la prueba de coagulasa

Negativo = no hay indicio alguno de formación de fibrina

1+ = pequeños coágulos desorganizados

2+ = pequeños coágulos organizados

3+ = gran coagulo organizado

4+= coagulación total del contenido y no hay desplazamiento al invertir el tubo