Taller de consulta PCR, conceptos y tipos de organización
1. Investigue acerca de otras variantes de la PCR tradicional. Por ejemplo: PCR anidada,
PCR inversa, PCR en tiempo real, PCR larga, PCR con adaptadores, RT-PCR, PCR
múltiple
PCR anidada: Es también llamada Nested PCR, se trata de una variante de PCR
convencional la cual comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de
cebadores para cada uno, esto con el fin de aumentar la sensibilidad y la especificidad de
la detección
Proceso:
Se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de
ADN más extensa que contiene el segmento diana
Luego este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR
con los cebadores internos para amplificar la región especifica
Especificidad:
Esta depende principalmente de la temperatura de la fase de hibridación y la
cantidad de iones divalentes que se incorporan en la reacción
Componentes:
ADN molde
Una enzima capaz de generar una copia de ADN a partir del ADN molde (ADN
polimerasa)
Un tampón apropiado para el buen funcionamiento de la ADN polimerasa
Cofactores como el MgCl2
Iniciadores de la reacción
Nucleótidos libres:
PCR inversa: Es también llamada reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
reversa, esta es una variante de la PCR comúnmente utilizada en biología molecular para
retrotranscribir una hebra de ARN en ADN complementario (ADNc) mediante la enzima
transcriptasa inversa
PCR en tiempo real:
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) es la capacidad de
controlar el progreso de la PCR a medida que ocurre (es decir, en tiempo real). Por lo
tanto, los datos se recopilan durante todo el proceso de PCR, en lugar de al final de la
PCR. Esto revoluciona por completo la forma en que uno aborda la cuantificación basada
en PCR de ADN y ARN. En la PCR en tiempo real (qPCR), las reacciones se caracterizan
por el punto en el tiempo durante el ciclo cuando se detecta por primera vez la
amplificación de un objetivo en lugar de la cantidad de objetivo acumulada después de un
número fijo de ciclos.
PCR larga: consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para
ello la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas. Su
objetivo es superar los límites de la PCR normal al utilizar mezclas de ADN polimerasas
Taq, carece de actividad correctora, pero es muy eficaz en la Elongación y Pfu, posee la
actividad correctora que evita la introducción de errores en la elongación de las cadenas
PCR con adaptadores: También puede amplificarse una región de ADN de secuencia
desconocida ligando a sus fragmentos de restricción unos adaptadores oligonucleótidos
sintéticos con extremos cohesivos compatibles con los generados en la muestra. A
continuación, una vez desnaturalizados, se añaden cebadores específicos para las
secuencias 3’ de los adaptadores. Se amplifica así el conjunto de adaptadores y
secuencia diana, pero debe señalarse que se amplifican por igual todos los fragmentos de
restricción presentes, no uno sólo.
PCR múltiple: La reacción en cadena de la polimerasa multiplex se refiere al uso de la
reacción en cadena de la polimerasa para amplificar varias secuencias de ADN diferentes
simultáneamente. Este proceso amplifica el ADN en muestras usando múltiples cebadores y
una ADN polimerasa mediada por temperatura en un termociclador.
Aplicaciones:
Identificación de patógenos
Genotipado SNP de alto rendimiento
Análisis de mutaciones
Análisis de eliminación de genes
Cuantificación de plantilla
Análisis de vinculación
Detección de ARN
Estudios forenses
Análisis de dieta
2. En el proceso de PCR a qué se hace referencia cuando se habla de especificidad,
capacidad de detección (Sensibilidad), Fidelidad y procesividad
Especificidad: Se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada
por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos
tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado.
Capacidad de detección (sensibilidad): Se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria
para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los
falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positiva, pero sea dada como negativa
porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Fidelidad: Se refiere a los errores que comete el ADN polimerasa durante la amplificación.
Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan
importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
Procesividad: Es la capacidad de la ADN polimearsa de llevar a cabo múltiples ciclos
catalíticos de forma progresiva sin disociarse de su sustrato polimérico (en vez de disociarse
tras cada reacción catalítica).
3. ¿Qué tipos de ADN polimerasas existen comercialmente y cuáles son sus
características de uso?
ADN-polimerasas, NOVAGEN®
Una gama completa de enzimas y kits para PCR
La ADN polimerasa KOD HiFi es una enzima de corrección única ya que se aísla
del Thermococcus kodakaraensis KOD1, extremadamente termófilo y con una
capacidad de procesamiento y fidelidad superiores que permiten una amplificación
por PCR más rápida y exacta que la lograda con las enzimas convencionales. La
ADN polimerasa KOD HiFi también existe en una versión de "Hot Start" para alta
especificidad y mayor longitud de lectura, y como mezcla (ADN Polimerasa KOD XL),
recomendada para moldes muy largos.
La ADN polimerasa NovaTaq™ es una enzima recombinante de alta pureza
adecuada para cualquier aplicación en la que se requiera una ADN
polimerasa Taq de la máxima calidad. Para mayor especificidad y adecuación a PCR
estándar, la ADN polimerasa NovaTaq Hot Start es una forma químicamente
modificada de la enzima, que se activa cuando se calienta a 95 °C durante 7-10
minutos.
Almacenamiento: -20 °C
La VWR® Taq DNA polimerasa es una polimerasa de DNA recombinante ultrapura y
termoestable, con la que se obtiene una PCR robusta en una amplia gama de
aplicaciones de PCR sin necesidad de invertir tiempo en la optimización. La enzima
se aísla de Thermus aquaticus y tiene un peso molecular de aproximadamente 94
kDa. La VWR® Taq DNA polimerasa tiene actividad polimerasa 5' - 3' y actividad
exonucleasa 5' - 3' de cadena doble. Deja un extremo de adenina libre, que hace que
la enzima sea ideal para la clonación TA
La mejor elección cuando se necesita una gran fiabilidad
Polimerasa de DNA termoestable de alto rendimiento
Óptima para clonación TA
Bibliografía:
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