UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
ÁREA TECNOLÓGICA, SUBÁREA DE PROTECCIÓN DE PLANTAS
Dr. Edin Francisco Orozco Miranda
PRÁCTICA 10
METODOS DE EXTRACCIÓN Y MORFOLOGÍA DE NEMATODOS FITOPARÁSITOS
I. INTRODUCCIÓN
Los nematodos pertenecen al reino ANIMAL, fílum NEMATA o NEMATODA, tal como propuesto
por Cobb en 1991 y restablecido por Chitwood (1958). Tienen hábitat variado (viven en agua
marina, agua dulce, suelo, partes vegetales, entre otros) y poseen diferentes regímenes alimenticios.
La mayoría de nematodos es de vida libre, se alimentan de microorganismos, tales como bacterias
(bacteriófagos), hongos (micófagos), algas, protozoarios, pequeñas lombrices, nematodos, estos
últimos pueden ser llamados predadores y los que se alimentan de animales denominados
carnívoros. Algunos son parásitos de plantas superiores (fitoparásitos) y se encuentran en raíces,
rizomas, tubérculos, bulbos, hojas, frutos y semillas. Otros son parásitos de animales (zooparásitos),
ya sea de invertebrados como de vertebrados. Por lo tanto, el ambiente de los nematodos es variado
comparado a cualquier otro grupo de metazoarios, salvo los artrópodos.
Al estudiar los nematodos en ecosistemas, no se deben visualizar como un enemigo, son parte del
ecosistema. Por ejemplo, los nematodos de vida libre, poseen estructura y función que pueden ser
útiles como indicadores biológicos y así, se tornan importantes como comparadores de condiciones
ecológicas del suelo. Es conveniente estudiarlos detenidamente y de preferencia en poblaciones de
forma espacial y temporal.
En este laboratorio se enseñarán los métodos utilizados en la extracción de nematodos fitoparásitos
provenientes de diferentes sustratos. Existe abundante literatura sobre protocolos o métodos de
extracción de nematodos, así como modificaciones o adaptaciones de los ya existentes. En esta
práctica, se hará énfasis en los utilizados en laboratorios de nematología referidos en el ámbito
internacional y que presentan mayores ventajas.
Para definir el método de extracción es conveniente considerar el objetivo perseguido, equipo,
recursos que se tienen en el laboratorio, los hábitos alimenticios de los nematodos (fitoparásitos,
micófagos, bacteriófagos, predadores, omnívoros), morfología y movilidad del nematodo, índices
ecológicos (características biológicas o abióticas de los recursos en su nivel de organización), tipo
de sustrato (suelo, raíces, hojas), su gravedad específica y su propia actividad de vida. También, la
disponibilidad de tiempo, ventajas y desventajas de cada método son importantes. Para análisis
internacional, para este tipo de procedimientos de laboratorio y otros, aplican las normas DE LA
ORGANIZACIÓN INTERNACIONAL PARA NORMALIZACIÓN ISO/IEC 17025, es decir, los
laboratorios de Fitopatología deben regirse a dicha norma.
En la determinación de nematodos, se utilizan métodos morfológicos y por medio de técnicas
moleculares. Estos métodos no son excluyentes, se requiere de amplio conocimiento de la
morfología. En los laboratorios en Guatemala, prevalece la determinación de nematodos a través de
morfología.
II. OBJETIVO
Enseñar los métodos para extracción de nematodos fitoparásitos y observación de las principales
características morfológicas para su determinación.
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III. REFERENCIAL TEÓRICO
1. PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE LOS NEMATODOS
- Organismo multicelular, no segmentado con aspecto de gusano redondo.
- Simetría bilateral (algunos simetría radial).
- La cavidad del cuerpo es un psuedoceloma.
- Pared del cuerpo, cutícula e hipodermis.
- Lumen del esófago tri-radiado en sección transversal.
- Ano y gonoporo del macho unido (cloaca).
- No poseen sistema respiratorio ni circulatorio.
- Sistema excretor carece de células “flame”.
2. El CUERPO DEL NEMATODO
A. TAMAÑO
Existe variación en tamaño de los nematodos fitoparásitos. El menor Paratylenchus 200 m, el
mayor Longidorus 4,000 m y tamaño medio entre 700 a 1,500 m, ver el tamaño relativo de otros
géneros en Agrios (2005), Siddiqi (2000). Nematodos parásitos de insectos miden algunos
centímetros. Nematodos parásitos de animales: Ej. Ascaris (nematodo intestinal en ganado y puerco)
15 a 20 cm, Placentonema (nematodo parásito de la ballena) más o menos 10 metros.
B. FORMA
La mayoría de los nematodos es vermiforme o fusiforme, el ancho del cuerpo disminuye
gradualmente en las dos extremidades. La cola varía de arredondeada a filiforme.
En la familia Heteroderidae, durante su desarrollo ocurre un notable aumento en el ancho,
resultando nematodos en forma de limón, pera o redonda. En las formas juveniles de Meloidogyne,
los nematodos son alargados, cuando adultos, las hembras tienden a ser obesas.
El cuerpo en hembras de Tylenchus semipenetrans y Rotylenchus reniformis es reniforme.
Los nematodos en la superfamilia Criconematoidea siempre poseen morfología de anillos
prominentes distintos, estos caracteres son utilizados para su determinación. Tienen cutícula muy
ornamentada y a la vez son lentos, casi no se mueven, se considera para definir el método de
extracción por utilizar. Los nematodos en la familia Hoplolaimidae tienen forma de espiral.
C. COLOR
Los fitonematodos en su mayoría son incoloros y transparentes. En ciertos nematodos, las células
intestinales contienen granulaciones de color castaño; en otros que se nutren de material verde, la
coloración del contenido intestinal es diferente. Estas diferencias son observadas en el microscopio
cuando se estudia la morfología del nematodo.
3. HÁBITOS DE ALIMENTACIÓN
Según Yeates et al., (1993), los nematodos están clasificados en grupos basados en sus hábitos de
alimentación, tal como se describe a continuación:
FITOPARÁSITOS se alimentan de plantas vasculares y poseen estilete tipo estomatoestilete,
odontoestilete u onquioestilete. Pueden ser polífagos o presentar hospederos específicos. Este grupo
puede ser dividido en ecto, endo y semiendoparásitos; sedentarios y migratorios. Se encuentran
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asociados a raíces, cortex, endodermis, periciclo y cilindro central. También en algas y líquenes,
flores, frutos y semillas, es decir nematodos de las partes aéreas dependiendo de su evolución.
ECTOPARÁSITOS no penetran en los tejidos de la raíz sino que se alimentan únicamente de las
células que se localizan cerca de la superficie de la raíz. Ej. Trichodorus, Longidorus, Xiphinema
(Dorylaimida). Ectoparásitos migradores, Ej. Helicotylenchus, Hoplolaimus, Criconemella
(Tylenchida).
ENDOPARÁSITOS: penetran en el hospedero y se alimentan de él.
Endoparásitos migratorios: Ej. Radopholus similis, Ditylenchus, Rhadinaphelenchus
cocophilus, Aphelenchoides, Pratylenchus (Tihohod, 1997; Agrios, 1997). Estos son importantes
en patosistemas complejos en Guatemala, por lo que se enfatizan en esta práctica.
Endoparásitos sedentarios viven parte de su ciclo libremente en el suelo, pero, una vez que han
penetrado en el hospedero permanecen fijos en sitios específicos. Algunos presentan polimorfismo
sexual (macho vermiforme, hembra globular a periforme). Ejemplo Meloidogyne, Nacobbus,
Tylenchulus. De estos, Meloidogyne es cosmopolita, el más importante y dentro de la familia a que
pertenece se considera el grupo más evolucionado. Existen especies de nematodos asociadas a
varios cultivos y ocasionan pérdidas, por lo tanto, su estudio es obligatorio en esta disciplina.
En Heteroderidae, géneros como Heterodera y Globodera forman cistos. En Heterodera las
hembras gordas (0.4-0.8 mm de longitud y forma de limón), con la madurez se tornan de color negro
a café, los huevos pueden ser retenidos en el cuerpo o depositados en una masa gelatinosa hacia
fuera. El cuerpo de la hembra se torna duro después de su muerte, forma un cisto, el cual actúa como
una estructura de protección de los huevos (Tihohod, 1997; Mai & Mullin, 1996).
MICÓFAGOS se alimentan de hifas de hongos, para ello utilizan su estomatoestilete u
odontoestilete.
BACTERIÓFAGOS son aquellos que se alimentan de cualquier fuente de alimentación procariote.
PREDADORES se alimentan de invertebrados tales como los protozoarios y otros nematodos.
OMNÍVOROS se alimentan en todos los niveles tróficos de la cadena alimentar. Pueden ser
herbívoros, consumidores de hongos, de bacterias y también de predadores de nematodos.
De acuerdo a Bernad (1992), el agrupamiento por hábitos alimenticios puede no estar claramente
definido. Así, no existe una clasificación arbitraria de los grupos tradicionales de clasificación de
nematodos de acuerdo a sus hábitos alimenticios. Por ejemplo, Yeates et al., (1993) realizaron
estudios ecológicos de nematodos y encontraron poblaciones de Tylenchus, Aphelenchoides,
Tylencholaimus y Ditylenchus como fitoparásitos, también como micófagos, así como predadores
del orden Mononchida que se multiplicaron usando bacterias como fuente de alimentación. Además
de eso, el hábito de alimentación de muchos nematodos ha sido supuesto por la manutención sobre
condiciones biológicamente definidas.
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En general, las proporciones de los diferentes grupos varían; abundan los bacteriófagos y en
proporciones bajas los fitófagos. Por ello, los nematodos constituyen problema en algunos cultivos
como café, caña de azúcar y banano, entre otros agroecosistemas, su importancia es relativa.
Por otro lado, las estructuras tróficas de las comunidades de nematodos dependen del ambiente y
pueden ser alteradas por varios factores tales como: establecimiento de cualquier cultivo, prácticas
agrícolas, empleo de pesticidas, fertilización, materia orgánica, entre otros.
4. MÉTODOS COMÚNMENTE EMPLEADOS PARA LA EXTRACCIÓN DE
NEMATODOS FITOPARÁSITOS
1. Obtención de hembras de Meloidogyne spp. y patrón perineal.
2. Embudo de baermann.
3. Método tamizado, también llamado de gravedad o de cobb.
4. Método tamizado y embudo.
5. Método centrifugado.
6. Método tamizado centrifugado.
7. Método de incubación.
8. Método de embudo de Fenwick.
El nombre de los métodos mencionados puede variar de acuerdo a la literatura. Entretanto, se
pueden analizar los principios físicos en que están basados. Es decir, los nematodos necesitan de una
película de agua para vivir, pueden migrar y tienen diferente morfología y movilidad.
OBTENCIÓN DE HEMBRAS DE Meloidogyne spp. Y PATRÓN PERINEAL
Este método es particularmente recomendado para extraer hembras de nódulos en raíces. Para este
caso, las muestras de raíces deben estar limpias de fragmentos, suelo y materia orgánica.
Posteriormente, con ayuda de estereoscopio, se hace observación cuidadosa. Para obtener los
nematodos del interior de la raíz, deberá dilacerar los tejidos en una caja de petri o en vidrio de reloj.
Disectar el nódulo bajo el microscopio estereoscopio con el auxilio de agujas de disección. Este
proceso se hace con cuidado para evitar destruir a las hembras. Se puede colectar también la masa
de huevos que queda adherida a la hembra en la parte posterior. Como complemento al proceso
anterior, se puede realizar corte de la región perineal de las hembras extraídas y estudio de
caracteres morfológicos para determinar el taxón a que pertenece (Tihohod, 1997; Agrios, 2005;
Manual de laboratorio UFLA, 2000; Plant-Parasitic nematode course, 2008.
MÉTODO DE EMBUDO DE BAERMANN (Baermann, 1917)
Se trata de los primeros métodos de extracción de nematodos. Adecuado para nematodos
endoparásitos migradores. Alternativamente, puede ser empleado en la extracción de ectoparásitos
en pequeñas porciones de suelo y complementarse al método tamizado. Se pueden extraer
nematodos del suelo y de partes vegetativas.
Es sencillo y no requiere de equipo sofisticado. La recuperación de juveniles de segundo estadio, se
facilita con este método porque los huevos eclosionan cuando el suelo es colocado en los embudos.
Tiene la desventaja que requiere de mucho tiempo, se necesita por lo menos de 2 días para obtener
resultados. Además, por este método no se pueden extraer nematodos sedentarios, formadores de
quistes, los poco activos y aquellos ornamentados pertenecientes a Criconematidae (Ej. Ogma,
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Criconema, Hemicriconemoides, Hemicycliophora). De los sedentarios formadores de quistes sólo
se podrán extraer juveniles o machos adultos.
Preparación del embudo de baermann
Se requiere de un embudo plástico o de vidrio, tubo de hule para insertar en la extremidad del
embudo, adaptado en ese tubo se usa una pinza mohr para cerrar el flujo de agua. Una "canasta" de
cedazo metálico o de pvc y un pedazo de papel filtro, soporte de madera o metal, Figura 1.
Papel filtro donde se coloca el
suelo o sustrato
Malla metálica
Embudo de vidrio o plástico
Anillo
soporte
Tubo de hule
Concentración de nematodos
Pinza mohr
Figura 1. Embudo de baerman y partes que la conforman.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE EMBUDO DE BAERMAN
1. Colocar el embudo en el soporte con todos los componentes que se muestran en la figura 1 y
llenar el embudo parcialmente con agua.
2. Cortar las raíces en pedazos de 0.5 cm y colocar en el papel filtro resistente que está encima de la
superficie de la tela metálica.
3. Con cuidado, agregar agua hasta completar el volumen del embudo (llenar hasta cubrir el
sustrato). Evacuar o sacar el agua del embudo presionando la pinza mohr con los dedos.
4. Reponer el agua siempre que su nivel este por debajo de la tela (permite mantener húmedo el
sustrato). Se recomienda que la operación se haga por las orillas para no romper el papel.
5. Después de 48 a 72 h, abrir la pinza mohr, colectar la suspensión en frascos de 50 ml o más,
colocar en las cajas de conteo, determinar los géneros y especies, contar los especímenes.
6. En el caso que se trate de suelo, de la muestra del campo homogenizada, tomar al azar 25 a 50g y
proceder con el proceso anteriormente indicado.
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MÉTODO DE TAMIZADO O MÉTODO DE COBB (Cobb, 1918)
Este es un método alternativo al de flotación y centrifugación, principalmente cuando no se dispone
de centrífuga. Es apropiado para extracción de ectoparásitos y endoparásitos. Es rápido, se extrae la
mayoría de nematodos que tengan movimiento lento. Tiene la desventaja que las muestras salen
sucias dificultando a veces la observación.
DESCRIPCIÓN
1. Colocar 200-300 g de suelo desterronado y tamizado en un balde plástico, adicionar agua,
calcular 8 a 10 veces el volumen del suelo. En el laboratorio se puede utilizar otros utensilios.
2. Mezclar bien hasta deshacer las partículas de suelo y dejar en reposo por 30 segundos.
3. Acoplar secuencialmente los tamices malla 35 (0.45 mm) y 325 (0.049 mm). Derramar en ellos el
líquido sobrenadante del balde. En los tamices de malla 35 (0.45 mm) y 100 (0.15 mm) quedarán
los detritos y partículas grandes de suelo. Algunos nematodos grandes pueden quedar retenidos
en el tamiz malla 100 (0.15 mm). La mayoría de nematodos quedarán en los tamices malla 200
(0.075 mm) y 325 (0.049 mm). Para juveniles o nematodos pequeños utilizar malla 400.
4. Con ayuda de una pizeta y agua recoger todo el material retenido en el tamiz de malla 200 en un
becker de 50 ml. Los nematodos grandes quedarán retenidos en ese tamiz, junto con detritos
orgánicos. Separar esos nematodos observando en el estereoscopio, identificar y contar.
5. Repita el procedimiento para tamiz de malla 325 o 400. Mayor densidad poblacional de varios
géneros y especies de nematodos quedarán retenidos en esos tamices. Los nematodos son
observados en el estereoscopio, colocar alícuotas de volumen conocido en caja de conteo,
identificar y contar. Si la suspensión estuviera muy turbia y se desea muestras más claras, se
recomienda usar el método de tamizado y embudo.
MÉTODO DE TAMIZADO Y EMBUDO
La suspensión turbia obtenida en el método de tamizado, es derramada en un embudo de baermann
para que quede limpia. Use el embudo conforme a la descripción para ese método. Deje que el agua
drene a través del papel filtro. Cubrir y colocar agua limpia y tomar la suspensión 24 y 72 h después.
Observe al estereoscopio, identificar y contar los nematodos.
MÉTODO DE CENTRIFUGADO
Este método tiene las ventajas de ser rápido, permite el procesamiento de varias muestras, la
suspensión es limpia y se pueden extraer nematodos de partes vegetativas o de suelo.
DESCRIPCIÓN
1. La cantidad de suelo a procesar (200 cc) se coloca en un recipiente plástico, adicionar agua de
chorro, calcular 8 a10 veces el volumen del suelo.
2. Revolver el suelo en el agua, agitar con la mano. Dejar reposar por 30 segundos.
3. Decantar la suspensión sobre un tamiz de malla 20 o similar que será ubicado encima de otro
tamiz de malla 325-400.
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4. Lavar los residuos de suelo del tamiz malla 325 o 400 y con esta suspensión llenar los tubos de la
centrífuga. En el proceso de centrifugación, todos los tubos de la centrífuga deben de tener el
mismo peso. Para esto se recomienda pesar los tubos o ajustar el nivel de los mismos. No llenar
los tubos para evitar derrame de líquido.
5. Centrifugar a 2-3 mil rpm durante 3 minutos.
6. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en aproximadamente 10 ml de una
solución azucarada 45% (1 libra de azúcar/litro de agua), de nuevo, asegúrese que todos los tubos
tengan el mismo peso.
7. Centrifugar por 1 minuto a 1700 rpm.
8. Verter con cuidado el sobrenadante (solución de azúcar con los nematodos) en el tamiz malla 325
ó 400 y eliminar el azúcar con agua del chorro. Lavar los nematodos con ayuda de una pizeta. El
tamiz es colocado en forma inclinada y el agua es aplicada dentro y detrás del tamiz.
9. Con el auxilio de una pizeta con agua se recuperan los nematodos en un beaker (+ 20 cc). Como
el volumen requerido es bajo, los nematodos deben llevarse en un punto del tamiz el cual debe
colocarse en forma inclinada.
10. Observar con la ayuda de un estereoscopio si la muestra tiene nematodos.
11. Determinar los géneros presentes en la muestra.
En el caso que el sustrato sea vegetal (tallo, raíz) se recomienda cortar en trozos de 1/2 cm y licuar a
una velocidad baja y por poco tiempo (+1 min). La cantidad a procesar depende de la disponibilidad
de raíces (10-30 g).
MÉTODO DE INCUBACIÓN
Se utiliza para analizar material vegetativo (tallos, ramas, flores, frutos y semillas) y se desea saber
si tiene nematodos asociados. Colocar el material en cajas de petri, en beaker u otro recipiente con
agua. Después de 24 h, observar si existen nematodos en el agua donde fue colocado el sustrato.
MÉTODOS PARA OBTENCIÓN DE QUISTES
Se usan para extraer quistes de suelo o de raíces, para ello se pueden utilizar varios procedimientos,
Ej. Flotador de Fenwick y el Descrito por Tihohod, (1993); ambos guardan el mismo principio.
DESCRIPCIÓN
A- OBTENCIÓN DE QUISTES DE SUELO
1. La muestra obtenida en el campo debe de ser secada en la sombra y pasar la muestra por un
tamiz malla 5 (4 mm).
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2. Las cantidades a procesar pueden variar 200-500 g. Colocar el suelo secado y tamizado, en beaker
de 1000 ml de capacidad o colocarlo directamente en el embudo. Adicionar agua y agitar
vigorosamente.
3. Los quistes presentes flotan con los detritos orgánicos y son colectados en tamices malla 20
(0.850 mm), y 60 (0.250 mm) y colectar quistes en agua.
4. También puede verter el sobrenadante en un embudo forrado con papel de filtro y después drenar
el agua. En el papel filtro se colocan los quistes y detritos orgánicos y pueden ser llevados al
estereoscopio para observación y separación (Tihohod, 1993).
MÉTODO DE OBTENCIÓN DE QUISTES DE SUELO EN FLOTACIÓN DE ACETONA
1. Realizar el proceso indicado en los incisos 1 al 3 del método anterior.
2. Verter el sobrenadante en un embudo forrado con papel de filtro y después drenar el agua.
3. Secar la muestra. Puede realizarse bajo una bombilla encendida.
4. Adicionar 25 ml de acetona un erlenmeyer de 50 ml, adicionar la muestra seca y agitar.
5. Llenar el erlenmeyer con acetona y recolectar los cistos con ayuda de un pincel.
B- RAÍCES
1. Retire cuidadosamente el suelo adherido en las raíces. Para eso, tomar las raíces y colocarlas en
un balde con agua.
2. Deje que la tierra se desprenda libremente.
3. Tome raíces, colocar en tamiz malla 20 (0.850 mm) y luego en malla 60 (0.250 mm), direccionar
la descarga del chorro para esas raíces, lo que hará que los quistes se desprendan de ellas.
4. Los quistes serán retenidos en el tamiz malla 60 (0.250 mm). Colectar y llevar al estereoscopio o
microscopio para observación y conteo.
4. DETERMINACIÓN DE NEMATODOS
Posterior a la extracción de los nematodos, utilizando cualquiera de los métodos descritos
anteriormente, se procede a su captura y determinación. Se recomienda que la determinación de
nematodos sea realizada con éstos vivos. En algunas ocasiones es necesario matar o fijar nematodos,
esto requiere de procesos especiales. También, se pueden hacer montajes a corto o largo plazo,
dependiendo del objetivo. Para matar nematodos se utilizan agua caliente o con soluciones
preparadas en el laboratorio. En ambos casos, se debe tener cuidado para no desintegrar el cuerpo
del nematodo.
Como todo ser vivo, los nematodos son sensibles a temperaturas altas, por lo que en este método se
incrementa la temperatura del agua que los contiene. En este proceso se debe tener cuidado para no
causar deformaciones a los nematodos. Se recomienda temperatura que oscile entre 40 ºC a 70 ºC
por uno a dos minutos. El beaker conteniendo los nematodos en suspensión es colocado en baño de
María. Mover el beaker de manera circular y horizontal para permitir que la temperatura de la
suspensión de nematodos se distribuya uniformemente.
Soluciones de químicos, como la Golden (Hopper, 1970); Gomes (1997).
Preparación: formalina 2.5%, 5%, solución de formaldehido 40% + ácido propiónico + agua (FP).
Se recomienda aplicar estas soluciones después de dejar los nematodos en refrigerador a temperatura
de 4-10 ºC por 3 a 24 horas, esto permite inmovilizar al nematodo.
Tal como indicado, para la determinación de nematodos, en algunos laboratorios se prefiere realizar
este proceso realizando montajes en agua con ayuda de portaobjetos y cubreobjetos con los
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nematodos vivos. Esta técnica tiene la ventaja que permite visualizar el nematodo sin
modificaciones. Se observa también, el movimiento y otras características importantes para su
determinación. En la identificación de géneros, se toma en consideración caracteres básicos que son
utilizados en las claves. En el laboratorio se utilizará el libro de Mai & Mullin (1996) y otras claves
para la identificación de nematodos parásitos de plantas.
CUANTIFICACIÓN DE NEMATODOS
Para realizar conteo de nematodos de una muestra, se hace el conteo de cada género a partir de un
ml (submuestra) y luego se multiplica por la cantidad de ml de la muestra extraída. Dividir el conteo
final por dos, si utilizó 200 cc de suelo. Con ello se obtiene el número de nematodos por cada 100 g
de suelo.
IV. MATERIAL Y MÉTODOS
1. Se le brindarán muestras de suelo y material vegetativo con presencia de nematodos. Se realizará
demostración de algunos métodos, usando el equipo que contempla cada uno.
2. Luego de la extracción, con ayuda de estereoscopio observe si las muestras tienen nematodos.
Proceda a la captura con utensilios que le serán proporcionados en el laboratorio.
3. Realice montajes con nematodos vivos. Colocar una gota agua en un portaobjetos en donde
ubicará los nematodos capturados y cubrir con un portaobjetos. Observar al microscopio.
4. Tomar una alícuota de 1 ml de una muestra de nematodos, determine los nematodos y realice
conteo. Escriba el número de nematodos presentes por cada 100 cc de suelo.
V. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué se utiliza azúcar (45%) en la extracción de nematodos en el método de centrifugado?.
2. ¿Qué ventajas y desventajas observó entre los métodos utilizados para extraer nematodos?.
VI. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
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